新規受入牛の受入期におけるルーメン微生物群とその宿主の発達的特徴を明らかにすることは、的確な栄養戦略の策定に寄与する

2023年11月5日 12:54

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公開日： 2023年11月03日
新規受入牛の受入期におけるルーメン微生物群とその宿主の発達的特徴を明らかにすることは、的確な栄養戦略の策定に寄与する

https://microbiomejournal.biomedcentral.com/articles/10.1186/s40168-023-01682-z?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Yanjiao Li, Kang Mao, ...Mingren Qu 著者一覧を見る
マイクロバイオーム第11巻、記事番号：238（2023）この記事を引用する

指標詳細

概要
背景
多頭ストレスによる死亡損失を最小限に抑え、最大限のパフォーマンスを得ることは、新規受胎牛の生産目標である。近年、ワクチン接種とメタフィラキシー治療により、新規受入牛の死亡率は大幅に減少したが、治療により誘発される成長阻害は依然として明らかである。血中代謝物の評価と行動モニタリングは、病的な家畜を早期に特定する可能性がある。さらに、ルーミナル微生物のホメオスタシスは、肉用牛の成長と健康を保証するものである。新しく受け入れた牛にとって最も重要な時期は、輸送後1ヶ月目である。したがって、受け入れ期間中（輸送1日前、輸送後1/4、16、30日目）のルーメン・メタゲノミクス、ルーメン・メタボロミクス、宿主メタボロミクス、およびそれらの相互作用を解析することは、成長遅延のメカニズムを明らかにし、新規受け入れ牛の管理と栄養管理を策定するための鍵となる。

結果
血清ホルモン（CORおよびACTH）および炎症性因子（IL-1β、TNF-αおよびIL-6）のレベルは、到着後16日目に最も高く、30日目に最も低かった。一方、抗酸化能（SOD、GSH-Px、T-AOC）は到着後16日目に有意に低下し、30日目に上昇した。メタゲノム解析の結果、ルーメンの微生物、細菌、古細菌、真核生物は、4つの異なる時点で異なる傾向を示した。輸送後16日目では、牛のルーメン内細菌と古細菌の存在量は輸送前よりも高かったが、真核生物の存在量は輸送後30日目が最も高かった。輸送前、ほとんどの細菌は主に多糖類の消化に関与していた。輸送後4日目に、最も有意に濃縮されたKEGGパスウェイはヌクレオチド代謝（ピリミジン代謝とプリン代謝）であった。輸送後16日目では、エネルギー代謝（解糖／糖新生、ピルビン酸代謝）およびMCPとVFAのルーミナル含量が有意に増加したが、同時にメタン収量（Methanobrevibacter）と病原性細菌（Saccharopolyspora rectivirgula）によるエネルギー損失も有意に増加した。この時、最もアップレギュレートされたルーミナルのL-オルニチンは、ルーメン微生物とその宿主に酸化ストレスを引き起こす異化ポリアミンをより多く生成し、最もダウンレギュレートされたルーミナルの2',3'-cAMPは、病原性細菌に好都合な増殖条件を提供し、ダウンレギュレートされたルーミナルのビタミンB6代謝と血清PC/LysoPCは、免疫機能と炎症反応を混乱させた。輸送後30日目には、ルーミナルのL-オルニチンとその異化物（主にスペルミジンと1,3-プロパンジアミン）が減少し、血清のPC/LysoPCと2',3'-cNMPsプールが増加していた。このことは、宿主の酸化還元、炎症、免疫状態の変化とも一致している。

結論
本研究は、新規受入牛の受入期間中の健康と成績を調整するための新たなアイデアを提供するものである。特に、ルーメン内でのメタンとポリアミンの産生と有害細菌の繁殖を抑制し、新しく受け入れた牛の免疫力と成績を向上させることである。

ビデオ要約

背景
中国では、北方繁殖・南方肥育が肉牛産業の主要な生産モデルである。新しく受け入れた牛の健康と成績は、肉牛産業における動物福祉と経済的課題の大きな問題である。新規受入牛は、肥育場での受入期間中、その福祉と成績に影響を与える様々なストレス要因や健康上の課題にさらされる[1]。輸送中、子牛は脱水、絶食、組織損傷、煙の吸入、身体的・心理的ストレスを受ける。到着後、子牛は新しい飼料や環境への適応を経験し、飼料摂取量や飼料効率を妨げることが多い [2]。このような複数のストレスは、エネルギー供給不足を招き、牛の免疫反応を低下させ、新しく受け入れた牛の成長遅延や死亡を招き、肉牛産業に莫大な経済的損失をもたらす[3, 4]。近年、ワクチン接種とメタフィラキシー治療により、新規受入牛の死亡率は大幅に減少したが、治療により誘発される成長阻害は依然として明らかである[4]。したがって、新規受入牛の成長遅延のメカニズムを明らかにすることに大きな努力を払うべきである。消化と吸収は成長率と密接な関係があり、受け入れ期間中に変化する規則性を探ることは、生産量を向上させるための新しい栄養介入戦略の開発に役立つ。

ルーメン微生物は飼料の消化に不可欠である。細菌、原生動物、真菌、古細菌を含むルーメン微生物叢は、ヒトが消化できない植物塊の複雑な多糖類を揮発性脂肪酸（VFA）、微生物タンパク質、ビタミンに分解できる多様な酵素を備えている[5]。微生物発酵プロフィールは、宿主の1日のエネルギー要求量の最大70％を占めるため、牛の成長効率を変動させる重要な要因として認識されている [6]。ルーメン微生物叢の構造は、ルーメン発酵特性に直接影響する。複数の研究が、輸送ストレスが肉牛のルーメン微生物叢の存在量と多様性に影響し、それがさらに発酵プロファイルに影響することを示している [7,8,9]。とはいえ、これらの研究は、輸送前と輸送後の牛のルーメン細菌を評価したものであり、輸送期間中のメタゲノミクスによる総ルーメン微生物の変化のモニタリングは不可欠である。メタボロミクスは、遺伝子発現の最も下流に位置するため、細胞の機能をより完全に反映することができる。しかし、これまでの研究では、ルーメン微生物叢の分類学的組成が異なっていても代謝機能は類似していることが強調されており[10]、組成や分類学的レベルでの微生物叢の違いは、宿主に影響を与える代謝機能とは直接関係がない可能性が示唆されている[11]。したがって、ルーメン・メタゲノミクスとルーメン・メタボロミクス解析を併用することで、ストレスが新しく受け入れた牛のルーメン消化特性に及ぼす影響をより明確にし、その後、消化を改善するための的を絞った治療戦略を提供できるという仮説を立てた。

消化された栄養素は、消化管上皮を通して血液循環に入り、確実に成長する。肉牛を対象としたいくつかの研究から、血中代謝プロファイルが給餌効率 [12]、枝肉品質 [13]、生体重 [14] と関連していることが示されている。つまり、牛の成長速度はメタボロームと密接に関連している。さらに、血中メタボロームは個体差、栄養レベル、病気、環境の影響を迅速かつ客観的に反映することができます。輸送が血中代謝指標に与える影響に関する先行研究[7,8,9]では、ストレスホルモン、免疫、炎症のみが関与していたが、血中代謝産物の変化に関する系統的な分析はなかった。そこで我々はさらに、血中メタボロミクスは新しく受け入れた牛の受け入れ期間中の体内の変化をより包括的に反映することができ、それによって肉牛の成長成績を向上させるための新たな視点を提供することができるという仮説を立てた。本研究では、新規受入牛の1ヶ月以内の輸送前後におけるルーメン・メタゲノミクス、ルーメン・メタボロミクス、血清メタボロミクスを実施し、以下の基本的な疑問を解決した：受入期間中のルーメン微生物、代謝物、宿主代謝に対する様々なストレスの具体的な影響は何か？最も重大な影響は何か？そして、3つのオミクスの解析を通じて、新たに受け入れた牛の受入期間中の成長成績を向上させるための正確な戦略を開発した。新たに受け入れた牛の輸送1日前、輸送後1日目、4日目、6日目、30日目のルーメンマイクロバイオームとメタボローム、および宿主のメタボロームを比較し、上記3つのオミックス層の成長率への寄与を算出した。本研究は、導入牛の生産成績を向上させるための栄養管理戦略を開発するための新たな窓口を提供するものである。

結果
新規導入牛の受入期間中の血清パラメータとルーメン発酵特性
新規導入牛の受入期間中の健康状態を調べるため、血清中のストレス関連酵素とホルモン指数、抗酸化パラメータ、免疫グロブリン、炎症指数を分析した。クレアチンキナーゼ（CK）活性は輸送後1日目に上昇し、輸送後16日目には正常値に戻った。副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）およびコルチゾール（COR）含量は、輸送前および輸送後1日目には有意な変化はなかったが、輸送後16日目に上昇し、輸送後30日目に低下した（図1A）。抗酸化特性については、総抗酸化能（T-AOC）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-PX）の活性およびマロンジアルデヒド（MDA）含量は、輸送前および輸送後1日目に有意差は認められなかった。しかし、T-AOC、SOD、GSH-PXの活性は、輸送後16日目に低下し、30日目に上昇した。免疫グロブリンについては、IgAとIgMは投与期間を通じて有意な変化は認められなかった。また、IgG値は、輸血前から輸血後16日目までは差がなかったが、輸血後30日目に上昇した（図1C）。炎症性因子では、輸送前と輸送後1日目の間で、インターロイキン-1β（IL-1β）、IL-4、IL-6、腫瘍壊死因子-α（TNF-α）のレベルは有意差を示さなかった。IL-4レベルは輸送後16日目に減少し、30日目に増加したが、同時にTNF-αレベルは逆の傾向を示した。さらに、IL-1βとIL-6のレベルは、投与期間中の30日目に最も低くなった（図1D）。

図1
図1
新規受入牛の受入期間中の血清パラメータ。A ストレス関連酵素およびホルモン指標。B 抗酸化パラメータ。C 免疫グロブリン因子 D 炎症因子。BT、輸送1日前の対照群6頭、ACon、輸送後1日目の対照群6頭、A16Con、輸送後16日目の対照群6頭、A30Con、輸送後30日目の対照群6頭。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。LDH = 乳酸デヒドロゲナーゼ；CK = クレアチンキナーゼ；ACTH = 副腎皮質刺激ホルモン；COR = コルチゾール；T-AOC = 総抗酸化能；SOD = スーパーオキシドジスムターゼ；GSH-PX = グルタチオンペルオキシダーゼ；MDA = マロンジアルデヒド；IL-1β = インターロイキン-1β；IL-4 = インターロイキン-4；TNF-α = 腫瘍壊死因子α

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新規受入牛の受入期間中のルーメン発酵機能の変動を理解するため、ルーメン pH、NH3-N、微生物粗タンパク質（MCP）、および VFA を測定した。受入期間中、ルーメンナルpHは輸送後16日目に最も低く、MCP濃度は輸送後30日目に最も高く、その後、ルーメンナルpHは上昇し、MCP濃度はそれぞれ低下した。他の時点（輸送前、輸送 4 日目、輸送 30 日目）では、ルーミナル pH と MCP に統計的に有意な差は見られなかった（図 2A, C）。輸送前と比較して、ルーミナル NH3-N 含有量は輸送後 4 日目、16 日目、30 日目で増加し、輸送後 4 日目の値が最も高かった（Fig. 2B）。ルーミン MCP と同様に、ルーミン酢酸、プロピオン酸、および総 VFA 濃度は、輸送後 16 日目に最も高く、輸送後 30 日目に減少した。ルーミナルの酪酸レベルは、輸送後30日目に最も低くなるという特別な変化を示した（図2F）。

図 2
図2
新たに受け入れた牛の受け入れ期間中のルーメン発酵パラメータ。A ルーメン pH. B NH3-N C 微生物粗タンパク質（MCP）。D-G 個々の揮発性脂肪酸（VFA）および総 VFA。BT：輸送 1 日前の対照群 8 頭および 4 群 8 頭；ACon：輸送 4 日後の対照群 8 頭；A16Con：輸送 16 日後の対照群 8 頭；A30Con：輸送 30 日後の対照群 8 頭。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001

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ルーメンメタゲノムのプロファイリング
メタゲノム配列決定により、サンプルあたり78,370,716±1,088,897.87リード（平均±平均標準誤差[SEM]）の合計1,880,897,180リードが得られた（表S2）。品質管理および宿主遺伝子の除去後、合計1,835,810,282リードが保持され、サンプルあたり76,492,095.1 ± 1,076,103.59リードであった。de novoアセンブリー後、合計20,481,942コンティグ（N50長764±13.34 bp）が生成され、サンプルあたり853,414±17,886.04個であった。ルーメンのメタゲノム構成は、97.43%が細菌（501,166,067配列）、0.93%が真核生物（4,767,441配列）、1.16%が古細菌（5,957,407配列）、0.33%がウイルス（1,717,042配列）、0.14%が未分類（754,032配列）であった（図S1）。

微生物ドメインを 4 群のルーメンマイクロバイオーム間で比較したところ、細菌、古細菌、ウイルスが 4 群間で有意に異なっていた（図 3A、P < 0.05）。主座標分析（PCoA）では、細菌種（図3B）、古細菌種（図3C）、ウイルス種（図S2）に基づく4つのグループ間の分離が示された。ウイルス由来の配列はルーメンメタゲノム配列のごく一部を占めるに過ぎないため、統計解析は主に細菌と古細菌の構成について行った。

図3
図3
新規受入牛の受入期間中の微生物組成プロファイル。A BT、ACon、A16Con、A30Con牛の微生物ドメインの比較。有意に異なるドメインはウィルコクソン順位和検定で検定した。*p < 0.05、**p < 0.01。B 主座標分析（PCoA）を用いて可視化した、BT、ACon、A16Con、A30Conのルーメンサンプルの細菌およびC古細菌組成プロファイル。BT：輸送1日前の対照群6頭、ACon：輸送後4日目の対照群6頭、A16Con：輸送後16日目の対照群6頭、A30Con：輸送後30日目の対照群6頭。

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ルーメンマイクロバイオームの組成プロファイルと4時点間の分類学的差異
優勢な細菌門はバクテロイデーテス属（52.20 ± 1.67%）、ファーミキューテス属（31.00 ± 1.44%）、分類不能_d_Bacteria属（9.46 ± 0.52%）、プロテオバクテリア属（1.50 ± 0.11%）であり、優勢な細菌属はプレボテラ属（22.85 ± 1.65%）、バクテロイデス属（4.06 ± 0.10%）、分類不能_f_Lachnospiraceae属（4.00 ± 0.22%）であった。 22%）、分類不明_f_Rikenellaceae (3.78±0.21%)であり、優勢な細菌種はClostridiales_bacterium (7.54±0.47%)、Bacteroidales_bacterium (6.58±0.28%)であった。 58±0.28%）、Rikenellaceae_bacterium（3.78±0.21%）、Prevotella_ruminicola（3.58±0.35%）、Prevotella_sp._ne3005（3.18±0.45%）であった。門レベルでの存在量の差比較分析では、Proteobacteriaの存在量はA30Con群でACon群およびA16Con群よりも高く、Actinobacteriaの存在量はA16Con群でBT群よりも高かった（P < 0.05；図S3）。属レベルでは、未分類の_f__Prevotellaceaeの存在量はACon群よりBT群で高く、未分類の_p__Firmicutesと未分類の_c__Clostridiaの存在量はBT群よりA16Con群とA30Con群で高かった；クロストリジウムの存在量はBT群およびA30Con群よりもA16Con群で高かった；未分類_f__ポルフィロモナド科の存在量はBT群およびACon群よりもA16Con群で高かった（P < 0. 05；図S3）。微生物種レベルの相対存在量の有意差を検出するために、線形判別分析効果量（LefSe）分析を用いた。4 群間で 43 種の細菌種に差があり、そのうち 7 種は BT 牛のルーメンで発現していた。その内訳は、Prevotella_sp__tf2_5、Prevotellaceae_bacterium、Lactobacillus_brevis、Bacteroides_sp__OF04_15BH、Paraprevotella_clara、Butyrivibrio_sp__INlla21、Paraprevotella_xylaniphila であった（LDA > 2.5、P < 0.05）。さらに、ACon 牛のルーメンからは 11 種（Lactobacillus sp.5、Weissella sp.3、Bacteroidetes sp.1、Lactococcus sp.1、Mogibacterium sp.1）が検出され（LDA > 2.5、P < 0.05）、A16Con 牛と A30Con 牛のルーメンからはそれぞれ 12 種と 13 種が検出された（LDA > 2.5、P < 0.05；図 4A）。

図 4
図 4
BT 牛、ACon 牛、A16Con 牛、A30Con 牛のルーメン細菌種（A）と古細菌種（B）の一対比較による差。有意差は、線形判別分析（LDA）スコアが 2.5 以上、P 値が 0.05 未満で、線形判別分析効果サイズ（LEfSe）分析により検定した。BT：輸送1日前の対照群6頭、ACon：輸送後4日目の対照群6頭、A16Con：輸送後16日目の対照群6頭、A30Con：輸送後30日目の対照群6頭。

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古細菌の存在量差比較分析では、Euryarchaeota門（93.98±0.85％、最も豊富な古細菌門）およびMethanobrevibacter属（79.06±1. 76％、最も豊富な古細菌門）は、A16Con群とA30Con群でBT群とACon群よりも有意に高かったが、Crenarchaeota門（1.34±0.15％）は逆の傾向を示した（P < 0.01、図S4）。さらに、Candidatus_Bathyarchaeota門はBT群でA16Con群およびA30Con群よりも高かった（P < 0.01, 図S4）。種レベルでは、BT、ACon、A16Con、A30Con 牛のルーメンで、それぞれ 19、9、4、6 種が有意に濃縮された（LDA > 2.5、P < 0.05；図 4B）。BT群ではCrenarchaeota_archaeon（1.09±0.14%、11番目に多い種、以下順位のみ記載）とCandidatus_Bathyarchaeota_archaeon（0.51±0.08%、18番目）、ACon群ではarchaeon（0.91±0.18%、13番目）とuncultured_archaeon（0. 81±0.19％、14位）、A16Con群ではMethanobrevibacter_olleyae（10.88±1.03％、4位）とMethanobrevibacter_ruminantium（9.34±0.67％、5位）、A30Con群ではMethanosphaera_sp._BMS（1.02±0.07％、12位）とSulfolobus_sp_A20（最も豊富な100種以上）であった。

ルーメン微生物叢の機能プロファイルと対照群間の機能差
KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）プロファイルと炭水化物活性酵素（CAZymes）をコードする遺伝子により、ルーメン微生物叢の機能を解析した。合計441の内因性第3レベル経路がKEGGプロファイルを通して観察された（表S3）。これらのパスウェイは、代謝（75.87 ± 0.56%）、遺伝情報処理（8.96 ± 0.07%）、環境情報処理（4.40 ± 0.11%）、細胞プロセス（3.99 ± 0.08%）、ヒト疾患（3.69 ± 0.19%）、および生物システム（3.10 ± 0.22%）を含む6つのレベル1カテゴリーに属していた。さらにレベル2の主要パスウェイをピックアップしたところ、45のカテゴリーが観察され、Global and overview maps (38.21 ± 0.29%), Carbohydrate metabolism (11.08 ± 0.08%), Amino acid metabolism (6.48 ± 0.05%), Replication and repair (4.55 ± 0.08%), Energy metabolism (3.79 ± 0.03%), Metabolism of cofactors and vitamins (3.42 ± 0.05%) が最も多かった。

同定されたKEGGパスウェイを比較したところ、LEfSe解析に基づくと、合計49の3レベルパスウェイが4つのグループ間で有意に異なっていた。このうち、主に 3 つの「遺伝情報処理」パスウェイ、2 つの「細胞プロセス」パスウェイ、5 つの「代謝」パスウェイを含む 10 の 3 段階パスウェイが BT 牛のルーメンで有意に濃縮され、10 の「代謝」パスウェイ、1 つの「遺伝情報処理」パスウェイ、1 つの「ヒト疾患」パスウェイを含む 12 の 3 段階パスウェイが ACon 牛のルーメンで有意に濃縮された； A16Con牛のルーメンでは、10個の「代謝」パスウェイと1個の「生体システム」パスウェイを含む11個の3階層パスウェイが有意に濃縮された。A30Con牛のルーメンでは、2個の「環境情報処理」パスウェイ、2個の「細胞プロセス」パスウェイ、4個の「生体システム」パスウェイ、6個の「ヒト疾患」パスウェイ、1個の「遺伝情報処理」パスウェイ、1個の「代謝」パスウェイを含む16個の3階層パスウェイが有意に濃縮された（LDA > 2, P < 0. 05; Fig.）炭水化物代謝」と「エネルギー代謝」に関しては、2つの下流経路（ko00052：ガラクトース代謝、ko00040：ペントース・グルクロン酸相互変換）がBT牛のルーメンで濃縮され、5つの下流経路（ko00650：ブタン酸代謝、ko00030：ペントースリン酸経路、ko00020：クエン酸サイクル（TCAサイクル）、ko00720：原核生物の炭素固定経路、ko00195：光合成）の6つの下流経路（ko00010：解糖/糖新生、ko00620：ピルビン酸代謝、ko00640：プロパン酸代謝、ko00680：メタン代謝、ko00710：光合成生物における炭素固定、KO00910：窒素代謝）がA16Con牛のルーメンで濃縮された。A30Con牛のルーメンでは、「糖質代謝」と「エネルギー代謝」関連経路の有意な濃縮は見られなかった。さらに、3つの「複製と修復」下流パスウェイ（ko03030： BT牛のルーメンでは、3つの「複製と修復」下流パスウェイ（ko03030：DNA複製、ko03440：相同組換え、ko03430：ミスマッチ修復）が濃縮され、2つの「ヌクレオチド代謝」下流パスウェイ（ko00240：ピリミジン代謝、ko00230： ACon牛のルーメンでは、2つの「核酸代謝」下流パスウェイ（ko00240：ピリミジン代謝、ko00230：プリン代謝）が濃縮されていた。A16Con牛のルーメンでは、2つの「グローバルおよび概要マップ」下流パスウェイ（ko01120：多様な環境における微生物代謝、ko05230：炭素代謝）が濃縮されていた。BT、ACon、A16Con グループとは有意に異なるが、A30Con グループで主に濃縮された 3 レベルのパスウェイは、真核生物の代謝に密接に関連していた（表 S4）。まとめると、BT 牛のルーメンで有意に濃縮された経路は、主に全ての細胞に共通する基本的な代謝プロセスを表し、ACon 牛のルーメンでは主に微生物の成長と繁殖を表し、A16Con 牛のルーメンでは主に栄養代謝を表し、一方で「メタン代謝」が有意に濃縮され、A30Con 牛のルーメンでは主に真核生物の代謝に関連していた（図 5B）。

図 5
図5
BT、ACon、A16Con、A30Con牛のKEGG機能の違い。A BT、ACon、A16Con、A30Con 牛のルーメン微生物 KEGG 第 3 レベルパスウェイの比較。有意差はLEfSe分析で検定し、LDAスコアは2.0以上、P値は0.05未満とした。B ルーメン微生物分類群、パスウェイ、ルーメン揮発性脂肪酸の結果の統合。BT：輸送1日前の対照群6頭、ACon：輸送後4日目の対照群6頭、A16Con：輸送後16日目の対照群6頭、A30Con：輸送後30日目の対照群6頭。

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炭水化物活性酵素（CAZyme）プロファイルについては、20の補助活性（AA）、73の炭水化物結合モジュール（CBM）、16の炭水化物エステラーゼ（CE）、263のグリコシドヒドロラーゼ（GH）、87のグリコシルトランスフェラーゼ（GT）、75の多糖リアーゼ（PL）に属するCAZymesをコードする合計534の遺伝子が同定された。その中で、GH2をコードする遺伝子（7.10±0.09%）が最も優勢で、CE1をコードする遺伝子（4.94±0.09%）、GT4をコードする遺伝子（4.36±0.10%）、CE10をコードする遺伝子（4.28±0.07%）、GT41をコードする遺伝子（3.40±0.06%）がそれに続いた（表S5）。同定されたCAZymesを比較したところ、合計31のファミリーレベルの酵素が、LEfSe分析に基づいて4つのグループ間で有意に異なっていた。このうち、BT 牛のルーメンでは 8 ファミリーレベルの酵素（GH 3 個、GT 4 個、CBM 1 個）が有意に濃縮され、ACon 牛のルーメンでは 8 ファミリーレベルの酵素（GH 3 個、GT 3 個、AA 1 個、PL 1 個）が有意に濃縮された； A16Con牛のルーメンでは、ファミリーレベルの酵素3種（GH 3種）が有意に濃縮されていた；A30Con牛のルーメンでは、ファミリーレベルの酵素11種（GH 11種、CBM 1種）が有意に濃縮されていた（LDA > 2. 5, P < 0.05; 図 S5）。

ルーメンと血清メタボロームのLC/MS分析
厳密な品質スクリーニングと同定を行った結果、4群から642の信頼できる代謝物がルーメン液中に得られた。このうち457代謝物がHuman Metabolome Database (HMDB)データベースにアノテーションされ、最も存在量の多いスーパークラス上位5レベルは、「脂質および脂質様分子（43.54%）」、「有機酸および誘導体（14.00%）」、「有機複素環化合物（13.13%）」、「有機酸素化合物（9.85%）」、「ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび類似体（7.44%）」であった（図S6）。直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）を使用して、代謝物データ間の差異を全体的に概観した（図S6）。スコアプロットのすべてのサンプルが95% Hotelling T2楕円内にあり、グループ間の明確な分離と識別が明らかになった。ルーメン代謝物の相対濃度（P < 0.05、VIP > 1）についてt検定と投影における変数重要度（VIP）フィルタリングを行った結果、ACon vs BT、A16Con vs BT、A30Con vs BT、A16Con vs ACon、A30Con vs ACon、A30Con vs A16Conの比較から、それぞれ188、225、229、184、209、206の差分代謝物が同定された（表S6）。異なるサンプル間での代謝経路変化のメカニズムをよりよく理解するために、差分代謝物の経路濃縮解析を行った。ACon対BT、A16Con対BT、A30Con対BT、A16Con対ACon、A30Con対ACon、A30Con対A16onから、それぞれ4、11、7、12、5、14の代謝濃縮パスウェイが検出された。同時に、これらの経路に関与する有意差のあるルーメン代謝物のACon/BT、A16Con/BT、A30Con/BT、A16Con/ACon、A30Con/ACon、A30Con/A16Conのフォールド変化もそれぞれ表示した（図6、図S7）。

図 6
図6
ACon対BT、A16Con対BT、A30Con対A16Conのルーメンメタボローム。A AConとBTのルーメン代謝濃縮経路の違い、およびこれらの経路に関与する代謝産物のACon/BT倍率変化。B A16Con vs BT。C A30Con vs A16Con。BT：輸送1日前の対照群6頭、ACon：輸送後4日目の対照群6頭、A16Con：輸送後16日目の対照群6頭、A30Con：輸送後30日目の対照群6頭。

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血清メタボロームについては、4群から信頼性の高い503代謝物が得られた。このうち、401代謝物がHMDBデータベースにアノテーションされており、存在量の多い上位5つのスーパークラスレベルは、「脂質および脂質様分子（48.38%）」、「有機酸および誘導体（20.95%）」、「有機複素環化合物（11.47%）」、「有機酸素化合物（6.23%）」、「ベンゼノイド（4.24%）」であった（図S8）。OPLS-DAスコアプロットによると、これら4群の血清代謝物は明らかに様々であることがわかる（図S8）。血清代謝物の相対濃度（P＜0.05かつVIP＞1）についてt検定およびVIPフィルタリングを行った結果、ACon vs BT、A16Con vs BT、A30Con vs BT、A16Con vs ACon、A30Con vs ACon、A30Con vs A16Conの比較から得られた差分代謝物はそれぞれ134、149、140、178、158、124であった（表S7）。ACon対BT、A16Con対BT、A30Con対BT、A16Con対ACon、A30Con対ACon、A30Con対A16Conの代謝濃縮経路の差は、それぞれ13、2、15、10、16、2であった。同時に、これらの経路に関与する有意差のある血清代謝物のACon/BT、A16Con/BT、A30Con/BT、A16Con/ACon、A30Con/ACon、A30Con/A16Conのフォールド変化もそれぞれ表示した（図7、図S9）。

図7
図7
ACon対BT、A16Con対BT、A30Con対A16Conの血清メタボローム。A AConとBTの血清代謝濃縮経路の違い、およびこれらの経路に関与する代謝産物のACon/BT倍率変化。B A16Con対BT。C A30Con対A16Con。BT：輸送1日前の対照群6頭、ACon：輸送後1日目の対照群6頭、A16Con：輸送後16日目の対照群6頭、A30Con：輸送後30日目の対照群6頭。

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ルーメン発酵特性、ルーメン微生物叢、ルーメン代謝産物間の相互作用
ルーメン細菌、ルーメン発酵特性、血清指標間のスピアマン相関分析を行った結果、75 の負の相関と 84 の正の相関を含む 159 の有意な相関（｜R｜> 0.5、P < 0.05）が明らかになった（図 8A）。159の相関のうち、リウミノコッカス属細菌P7はCKおよびLDHと負の相関を示し、アリスティペス属細菌CAG 435およびアリスティペス属細菌CAG 514はTNF-αに負の影響を及ぼし、リウミノコッカス・フラベファシエンスはCORおよびACTHと正の相関を示したが、血清抗酸化指数（SOD、GSH-PX、T-AOC）とは負の相関を示した。

図8
図 8
ルーメン細菌、ルーメン発酵特性、血清指標、ルーメンメタボローム、血清メタボローム間の相互作用。A ルーメン細菌叢とルーメン発酵特性、血清指標間のスピアマンの順位相関。B ルーメン微生物叢とルーメン代謝物間のスピアマンの相関。C ルーメン微生物叢と血清代謝産物間のスピアマンの相関。赤は正の相関、青は負の相関。""は有意な相関（｜r｜> 0.5, P < 0.05）、""は強い有意な相関（｜r｜> 0.5, P < 0.05）、""は極めて有意な相関（｜r｜> 0.5, P < 0.05）を意味する。

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一方、ルーメン細菌とルーメン代謝産物との相関分析も行ったところ、ヒートマップの結果は、316の負の相関と397の正の相関を含む、合計713の有意な相関（｜R｜> 0.5, P < 0.05）を示した（図8B）。397の正の相関のうち、Saccharopolyspora_rectivirgulaは有機窒素化合物（スペルミジン、スペルミン、1, 3-プロパンジアミン）、有機酸および誘導体（N-アセチル-L-グルタミン酸、N2-アセチル-L-オルニチン、L-オルニチン、L-グルタミン酸）と正の相関があった。

宿主とルーメン微生物叢の潜在的な関係を調べるため、ルーメン細菌と血清代謝物の間にスピアマン相関分析を行った。図8Cに示すように、464の負の相関と293の正の相関を含む757の有意な相関（｜R｜> 0.5、P < 0.05）があった。464の負の相関のうち、A16Con, A30Con群では、ルーメン細菌が脂質および脂質様分子（主にリゾホスファチジルコリン（LysoPC）とホスファチジルコリン（PC））と負の相関を示した。

考察
近年、肥育牛の最も経済的に重要な疾病として、BRDによる死亡率は著しく低下している。しかし、BRD治療によって引き起こされる発育不良は依然として明らかであり、その詳細なメカニズムについてはまだ解明されていない。ここでは、まず、新たに受け入れた牛の受入期間中の健康と成績の変化を特徴付けるために、基本的な血液指標（ストレスマーカー、抗酸化パラメータ、免疫グロブリン、炎症因子）とルーメン発酵パラメータを分析した。さらに、ルーメン・メタゲノミクスとメタボロミクスを通じて、ルーメン・マイクロバイオームが受入期間中のルーメン代謝産物の違いに重要な役割を果たしていることを明らかにした。最後に、宿主のメタボロミクス（血清メタボロミクス）とルーメン微生物およびその代謝物との相互作用を調べ、生物学的変化の根底にあるメカニズムを明らかにした。

血液学的パラメータは直感的に体の状態を反映することができる。輸送ストレスが血中ストレス酵素、ストレスホルモン、酸化、免疫・炎症に及ぼす影響については、数多くの実験で調べられてきた。しかし、新規受入牛の受入期間中のこれらの血中マーカーの変動については、まだ十分に報告されていない。そこで本研究では、輸送前1日目、輸送後1日目、16日目、30日目の牛の血液指標を分析した。LDHとCKは、ハンドリングや輸送中の肉体疲労や筋肉損傷時に、膜透過性の変化から生じる漏出によって血液中に放出される酵素である[15, 16]。長距離輸送によって誘発される血中CKおよびLDH酵素の高値は、輸送中の動物のストレスおよび生理学的反応の指標である[17]。輸送後1日目（到着から17時間後）の血清CK値の上昇は、今回の研究で牛が長距離輸送と輸送期間中に大きなストレスを経験したことを示している。別の研究では、648kmの輸送直後に牛の血清CK含量が増加したが、到着後24時間経過するとCK値は元の値に戻ったと報告している[18]。所見が食い違う理由は、輸送距離に関係している可能性がある。本研究の牛は3450kmを輸送し、筋損傷はより優れていた。そのため、輸送後17時間では血清CK値は正常値に戻らなかった。ストレスに応答して、視床下部-下垂体-副腎軸および／または交感神経系が活性化され、内分泌腺から分泌される対応するホルモンが調節される。これらのうち、ACTHとCORは牛のストレス反応においてしばしば上昇する。以前の研究では、肉牛の血清ACTHおよびCORレベルは、輸送（14時間、1000km）後1日目に有意に上昇し、到着3日目以降にベースラインレベルに回復することが示された[7]。しかし、本研究では、牛の血清ACTHおよびCORは、輸送前と比較して輸送後1日目では有意差を示さなかった。これらは、牛が長距離輸送と回復に適応したためか、あるいは本研究のストレス期間中にアドレナリン産生が枯渇したためと考えられる。同様の状況は Werner ら [19] でも報告されており、長時間の輸送（63 時間、1450 km）後 24 時間で COR レベルに差は見られなかったという。ある研究では、異なる輸送時間がCORレベルに及ぼす影響を調査した。その結果、3 時間輸送された去勢牛では COR 濃度が高いが、16 時間輸送された去勢牛では COR 濃度が高くないことが示され、これも輸送への適応を裏付けている [20]。受入期間の中間では、長時間輸送（63 時間、1450 km）後 2 週目 [19]、または短時間輸送（14 時間、1000 km）後 15 日目 [7]のいずれにおいても、COR 値は正常範囲内であった。本研究では、輸送後16日目に血清ACTHとCORが上昇し、30日目には正常値に戻った。仕上期の肉牛において、CORと飼料効率との間には直接的な関係があり [21]、COR値が高いほど飼料効率は低くなる。したがって、A16Con牛でACTHおよびCORレベルが上昇した理由を明らかにする必要がある。これまでの研究で、酸化ストレスは視床下部-下垂体-副腎（HPA）軸に影響することが分かっており [22]、血清ACTHおよびコルチコステロン濃度は酸化ストレスの程度と正の相関があった [23]。一般に、酸化バランスを維持するために、細胞は内因性の酵素的・非酵素的抗酸化物質と外因的に得られる抗酸化物質の組合せを用いて、酸化物質を水に還元して中和する [24] 。細胞内の主要な抗酸化酵素には、SOD、GSH-PX、カタラーゼがある。酸化物質と抗酸化物質のバランスが崩れると、酸化ストレスが強まり、炎症を引き起こし、ウシの健康と効率を損なう可能性がある [25]。本研究では、A16Con牛ではMDA濃度が高く、T-AOCが低く、SODとGSH-PXの活性が低下していたが、A30Con牛では指標は基礎レベルまで回復しており、新たに受け入れた牛が輸送後16日目に酸化ストレス状態にあったことを示している。従って、A16Con牛のACTHとCORの高値は、酸化ストレスと関連している可能性が推測される。さらに、炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、TNF-α）の傾向は、酸化ストレスの傾向とは逆に、抗炎症性サイトカイン（IL-4）と一致していた。これらの結果から、受胎中期における酸化ストレスが、新規受胎牛のACTHおよびCOR濃度、炎症、免疫機能不全の主な根本原因である可能性が示唆され、これらは牛によるエネルギーの分配を変化させ、生産効率をさらに損なう可能性がある。観察された酸化ストレスにどのような要因が寄与しているのかは、現在のところ不明である。そこで我々は、ルーメン・メタゲノミクス、ルーメン・メタボロミクス、血清メタボロミクスを実施し、この現象の根底にあるメカニズムを解明するため、輸送前と輸送後の1ヶ月間に新たに受け入れた牛のルーメン微生物叢と宿主の相互作用をさらに明らかにした。

これまでの研究では、一般的に輸送がルーメン細菌に及ぼす影響を調査してきたが、受け入れ期間中の全体的なルーメン微生物叢の変化に関する知見は不足していた[7,8,9]。本研究では、まずルーメン・メタゲノミクスにより、新たに受け入れた牛の輸送前から輸送後1ヶ月までのルーメン微生物の変動を調査した。その結果、BT、ACon、A16Con群では優占細菌の存在量は変化しなかったが、A30Con群では有意に減少し、優占真核生物の存在量は数値的に増加した。古細菌の優占量は、BT群からA30Con群にかけて徐々に増加した（図3A）。DNA複製はすべての生物の生殖に不可欠である[26]。細菌、古細菌、真核生物で観察された存在量の違いの背後にある理由を探るため、メタゲノミクスデータに基づき、DNA複製に関する代謝経路の差分解析を行った（図S10）。その結果、相対存在量が高く、細菌のDNA複製に関与するヘリカーゼDnaB（K02314）、プライマーゼDnaG（K02316）、一本鎖DNA結合タンパク質（SSB、K03111）が、BT群で最も高い発現量を示した。したがって、輸送前は細菌の生殖が古細菌や真核生物よりも活発であったと結論できる。さらに解析の結果、古細菌のDNA複製に関与するDNAポリメラーゼD（PolD）1（polB, K02323）およびPolD2（polC, K02322）、プライマーゼpriL（K18882）、クランプローダーRfcL（K04800）、フラップエンドヌクレアーゼ-1（Fen1, K04799）は、BT群からA30Con群にかけて徐々に遺伝子発現が増加していることが明らかになった。一方、A16Con群とA30Con群の間には有意な差は見られなかった。これらの結果から、古細菌の繁殖は受精期中期に比較的急速に進み、その後は緩やかに増加したことが示唆された。さらに、真核生物のDNA複製に関連する遺伝子では、DNAポリメラーゼα-プリマーゼ複合体（Pri1, K02684）、DNAポリメラーゼδ複合体（δ1, K02327; δ2, K02328）、DNAポリメラーゼε複合体（ε1, K02324； ε4、K03506）、ミニクロモソーム維持タンパク質（MCM）複合体（ヘリカーゼ）（Mcm2、K02540；Mcm4、K02212；Mcm7、K02210）、複製タンパク質A（PRA）（RFA1、K07466）、クランプローダーRFC1（K10754）は、4つのグループにおいて、これらの遺伝子量に一貫した変化パターンを示した。すなわち、最初の3群では有意な変化は見られなかったが、4群では有意な増加が見られ、真核生物は受精期の最終段階で増殖することが示された。総じて、バクテリア、古細菌、真核生物の繁殖は、それぞれBT群、A16Con群、A30Con群で顕著かつ代表的であった（図5B）。古細菌と真核生物のDNA複製における重要な酵素遺伝子の変化傾向は、その存在量の変化傾向と一致していたが、細菌の状況は一致していなかった。細菌のDNA複製では、イニシエータータンパク質DnaAと複製起点（OriC）が相互作用して二重鎖巻き戻しエレメント（DUE）領域の鎖がほどけると、ヘリカーゼ（DnaB）が一本鎖DNAにリクルートされ、第二段階に入ることができる。同時に、DnaAの細胞内濃度は増殖培地に関係なく一定であった[27]。このように、複製開始の頻度は主に原核生物におけるDnaAのレベルと活性によって決定される[28]。本研究では、細菌のDNA複製におけるヘリカーゼ（DnaB）とSSBの遺伝子レベルは、BT群からA30Con群まで徐々に減少していたが、細菌量は経時的に変化せず、A30Con群まで有意に減少しなかったことから、これは細胞内のDnaAレベルが一定であるためと考えられた。

ルーメン細菌の総量は最初の3群間で変化しなかったが、細菌種のバイオマーカーは変化した。BT 群で最も影響力のある異なる細菌種は、Prevotella sp. tf2-5 と Prevotellaceae_bacterium であった。以前の研究では、ルーメンに多糖類を分解するプレボテラ科細菌が多く存在するのは、食物繊維の消化を促進する必要性を反映している可能性が高いと報告されている [29, 30]。最近の研究では、大麦わらを多く含む飼料を与えた牛の全経路難消化性残渣（TTIR）を、同じ牛のルーメン微生物叢とインビトロで培養したところ、プレボテラ（Prevotella sp.tf2-5、Prevotella sp.tc2-28）を含む、TTIRで過剰発現した転写産物が最も豊富な分類群であることが示された［31］。Paraprevotella には、Paraprevotella clara と Paraprevotella xylaniphila の 2 種のみが含まれ、いずれも BT ウシのルーメンで濃縮されていた。トウモロコシの茎を食べた牛のルーメンに Paraprevotella が多く含まれることは、トウモロコシの茎の NDF 分解に寄与している可能性があると報告されている [32]。さらに、Lactobacillus brevis はキシロオリゴ糖を分解することが報告されており [33]、Bacteroides sp. OF04-15BH はCytophaga-Flexibacter-Bacteroides（CFB）グループ細菌（NCBI: txid2292281）のひとつであり、CFBグループ細菌はセルロース、キチン、ペクチンなどの様々な生体高分子を分解する能力がある [34]。本研究では、輸送前の肉牛は主に複雑な構造の多糖類を含む牧草を食べていた。そのため、繊維分解菌が優勢であった。到着後最初の5日間は、新たに受け入れた牛にプロバイオティクスとプロバイオティクス代謝産物（主に枯草菌、サッカロミセス・セレビシエイツ、およびそれらの代謝産物）を飲料水（10 g/L）に補充した。酵母由来成分および枯草菌プロバイオティクス[35]、酵母ベースのサプリメント・プロバイオティクス・プレバイオティクス・ブレンド[36]が、新規受胎肉牛の受胎期間中の治療および予防措置として使用されたことが報告されている。これまでの研究で、枯草菌と酵母培養の補充が肥育牛の乳酸菌のより良い増殖と繁殖を促進することが示されている［37］。本研究では、ACon 牛のルーメンに濃縮された細菌は主に乳酸菌で、5 種類の Lactobacillus sp.（L.panis、L. amylovorus、L. fermentum、L. plantarum、分類不能の Lactobacillus）、3 種類の Weissella sp.（W.confusa、W. paramesenteroides、W. cibaria）、および 1 種類の Lactococcus であった。Lactisであった。さらに、KEGGパスウェイ解析の結果、ACon牛のルーメンでは、ヌクレオチド代謝に関与するピリミジン代謝とプリン代謝が濃縮されており、この段階では微生物の繁殖が活発であることが示唆された。

A16Con牛のルーメンでは、受入期間中期の上位5菌種のうち3菌種がルミノコッカス科細菌P7、ルミノコッカス・フラベファシエンス、プレボテラ・ブリアンティであり、いずれも植物細胞壁多糖の効率的な分解に極めて重要な役割を果たしていた。ルミノコッカス科は、ヘミセルロースやセルロースの分解を可能にする様々なグリコシダーゼを産生する糖分解菌として知られている [38]。ルミノコッカス科の中で、最もよく研究されているセルロース分解菌は、ウシのルーメンから単離されたRuminococcus flavefaciensであり、ルーメン内の3大セルロース分解菌の1つである [39]。Prevotella bryantiiは、構造性（キシラン）と非構造性（デンプン）の両方の炭水化物を発酵させる可能性がある [40]。これに対応して、A16Con ウシのルーメンでは、炭素代謝、解糖／糖新生、ピルビン酸代謝が豊富であった。さらに、ルーメン発酵パラメータ、MCP および VFA の含量は全て、A16Con 群で最も高かった。この結果によれば、到着後 16 日目には宿主に十分なエネルギーが供給され、さらに健康状態が向上しているはずである。しかし、この予想に反して、A16Con牛は炎症性サイトカイン（IL-1β、IL-6、TNF-α）が最も高く、抗炎症性サイトカイン（IL-4）が最も低かった。さらに分析したところ、A16Con群ではメタン代謝も有意に亢進していた。メタンの産生は食餌エネルギーの損失をもたらすことが知られており、反芻動物の2～12%を占める[41]。Methanobrevibacter はルーメンで最も優勢なメタン生成菌であり、古細菌群集の最大 70%を占める [43]。以前の研究では、飼料効率の低いヒツジやウシは、飼料効率の高いヒツジやウシと比較して、Methanobrevibacter olleyae や Methanobrevibacter ruminantium がより多く存在することが示されており、これは飼料効率の低い反芻動物におけるエネルギー損失を部分的に説明している可能性がある [44,45,46]。Kaplan-Shabtaiら[47]は、乳牛の間で自然変異を示す3つの異なる細菌-古細菌コホート（メタン生成系統）の共存を発見した。ルミノコッカス-メタノブレバクター、プレボテラ-サクシニブリオナセア-メタノスファエラ、クロストリジウム-メタノバクテリウムである。このうち、RuminococcaceaeとLachnospiraceaeに属する緩速発酵菌は、Methanobrevibacterのような水素栄養メタン生成菌とコホートを形成し、CH4収率の高い表現型の牛に存在する[48]。本研究では、古細菌の中で 4 番目と 5 番目に豊富な種として、Methanobrevibacter olleyae (10.88 ± 1.03%) と M. ruminantium (9.34 ± 0.67%) が、A16Con ウシのルーメン内の最初の 2 種の分化古細菌であった。また、A16Con 牛のルーメンでは、Ruminococcaceae bacterium P7 と Ruminococcus flavefaciens の相対量が最も高かった。従って、A16Con 牛のルーメンに含まれるルミノコッカス科メタノブレビバクター属のコホート（ルミノコッカス属細菌 P7、ルミノコッカス属細菌 flavefaciens、メタノブレビバクター属細菌 olleyae、メタノブレビバクター属細菌 ruminantium）は、より多くのメタンを産生し、その結果、エネルギーの浪費につながる可能性があると結論付けられる。これらの細菌と古細菌に加えて、Saccharopolyspora rectivirgula（2番目に多い細菌）と、病原性細菌として報告されている3つの軟体動物細菌（Erysipelotrichaceae bacterium NK3D112、Mollicutes bacterium、Mycoplasma sp. CAG 877）もA16Con牛のルーメンで優勢であった。Saccharopolyspora rectivirgula（以前は Micropolyspora faeni として知られていた）の暴露は、ウシとウシ農家の両方で肺感染症を引き起こす可能性がある [49]。Saccharopolyspora rectivirgulaの存在は、炎症細胞をリクルートするサイトカイン（IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17A）およびケモカインの産生を介して、炎症性微小環境を誘導する [50]。免疫原性のうどんこ病菌は、消化管の炎症関連疾患に豊富で、TNF-αレベルと正の相関があることが判明している [51] 。マイコプラズマはよく知られた病原体であり、マイコプラズマ属のほとんどはヒトや動物に病気を誘発する [52]。したがって、エネルギー代謝（解糖／糖新生、ピルビン酸代謝）は亢進していたものの、メタン収量の増加と病原性細菌によって誘発されたエネルギー損失が、A16Con牛に炎症と酸化ストレスを引き起こした。

本試験の後期投与期間において、最も顕著な特徴は、A30Con牛のルーメン微生物における真核生物のリード数が著しく増加したことであり、活発なルーメン真核生物群集では繊毛虫が優勢であった。同時に、KEGGパスウェイ解析により、差分パスウェイのほとんどが真核生物のシグナル伝達経路と関連していることが示された。ルーメン繊毛虫は、栄養素の利用可能性を含む外部刺激に迅速に反応し、適応することが知られている [53]。Wangら[54]は最近、ルーメン内の優勢な繊毛虫種であるEntodinium caudatumの大核ゲノムとトランスクリプトームに、多くのシグナル伝達経路（MAPK、mTOR、PI3K-Akt、AMPK、Wnt、カルシウム、ホスホリパーゼDシグナル伝達経路を含む）が表れていることを報告した。このシグナル伝達経路により、E. caudatumはルーメン内の栄養や環境の変動に迅速に対処することができる[55]。その上、多くの転写産物は、貪食、ファゴソーム、リソソーム、微生物細胞の飲み込みと消化に関与するプロセスや構造的・機能的構成要素にアノテーションされている[54]。本研究では、A30Con ウシのルーメン微生物遺伝子機能については、AMPK シグナル伝達経路とリソソームが上位のサブカテゴリーであった。膜輸送、細胞骨格の再編成、受容体を介したエンドサイトーシス、エキソサイトーシス、細胞移動の制御に関与するホスホリパーゼ D シグナル伝達経路 [56] も、A30Con 牛で上位であった。これらはすべて、原虫の成長と代謝の基本であることが証明された。さらに、数的にはルーメン細菌よりもはるかに少ないが、ルーメン繊毛虫はルーメン微生物バイオマスの 25 ～ 50% を占めると推定されている [57, 58]。ルーメン繊毛虫は、大量の分解酵素を通じて植物細胞壁の分解を担っていた [59]。本研究では、A30Con ウシのルーメンにおける繊毛虫門の存在量が増加したことで、繊維の消化と飼料の利用が促進された可能性がある。さらに、Porphyromonadaceae 細菌は、A30Con 牛のルーメンにおける違いの原因となる最初の主要種であった。Porphyromonadaceaeのメンバーは、様々な多糖類を発酵させることができ、主に酢酸とプロピオン酸を産生する [60]。ポルフィロモナド科の植物はまた、大腸炎症の緩和と関連している [61, 62]。一方、いくつかの研究では、アリスティペスの存在量は炎症性サイトカインレベルと負の相関があることが確認されている [63, 64]。本研究では、相関解析の結果、アリスティペス属CAG 435とアリスティペス属CAG 514はTNF-αに負の影響を及ぼすことが示された（図8A）。したがって、A30Con 牛の炎症と酸化ストレスのレベルの低下は、ルーメン繊毛虫と抗炎症性細菌の量が多いことと関連している可能性がある。

ルーメンメタボロミクスは微生物機能ゲノムの解釈をサポートした。血清メタボロミクスは、ルーメン宿主と微生物およびその代謝物の相互作用メカニズムを明らかにすることができる。まず、AConとBTのルーメン代謝物を比較した結果、オロチジル酸濃度がAConで高いことがわかった。オロチジル酸（オロチジン-5'-リン酸またはオロチン酸一リン酸（OMP）としても知られる）はデノボピリミジン生合成経路の中間体であり、オロチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼによってオロチン酸と5-ホスホリボシル-1-ピロリン酸（PRPP）から変換される。ジヒドロオロチン酸のオロチン酸への脱水素は、ジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼ([EC:1.3.98.1])によって触媒されるピリミジン生合成経路の4番目の律速段階である[65]。一貫して、ACon 牛のルーメン微生物ジヒドロオロテートデヒドロゲナーゼの遺伝子発現が最も高かった（図 S11）。オロチジル酸の増加とは対照的に、チミンの含量は減少していた。これらは、チミンがヌクレオシドデオキシリボシルトランスフェラーゼ（[EC:2.4.2.6]）によって触媒されてチミジンに変換され、チミジンがDNA生合成に導かれるためと考えられる[66]。ヌクレオシドデオキシリボシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現は、アコン牛のルーメン微生物でも最も高く（図 S11）、乳酸菌にはヌクレオシドデオキシリボシルトランスフェラーゼが豊富に含まれていることが報告されている[67]。このことは、ACon 牛のルーメンに乳酸菌が豊富であることと優れた一致を示している。A16Ccon vs BT から検出されたルーメン代謝物の差は、L-オルニチンのアップレギュレーションが最も顕著であり、その合成前駆体（L-グルタミン酸およびN-アセチル-L-グルタミン酸）および異化ポリアミン（スペルミジン、1,3-プロパンジアミン、スペルミン）レベルも A16Ccon 群で高かった。これらの代謝物は主にアルギニンの生合成、アルギニンとプロリンの代謝に関与している。L-オルニチンはアルギニンの異化とde novo生合成に由来する。L-オルニチンの生合成経路はα-ケトグルタル酸から始まり、2段階に分けられる。第1段階はL-グルタミン酸の合成で、第2段階はオルニチンの合成である。L-グルタミン酸からN-アセチル-L-グルタミン酸への変換は、N-アセチルグルタミン酸シンターゼ（ArgJ）によって活性化され、その後、一連の酵素反応を経て、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（ArgB）によって触媒されるL-オルニチンが形成される、 N-アセチル-γ-グルタミル-リン酸レダクターゼ（ArgC）、アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（ArgD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（ArgE）によって触媒される。ポリアミンは、オルニチン脱炭酸酵素によるL-オルニチンのプトレシンへの脱炭酸から始まり、スペルミジン、1,3-プロパンジアミン、スペルミンに変換される。反芻動物は血漿中アミンオキシダーゼを発現しており、スペルミジンとスペルミンが全身血液循環に入ると、アミンオキシダーゼによってアルデヒドと過酸化水素に酸化される [68] 。アルデヒドと過酸化水素は真核細胞に酸化ストレスを引き起こすことが知られており、A16Con牛の血清MDAとCOR濃度は上昇した。興味深いことに、以前の研究では、血中CORがオルニチン脱炭酸酵素（ポリアミン合成の第一律速酵素）の活性を増強することにより、腸管ポリアミン合成を促進することが報告されている[69, 70]。つまり、A16Con牛では、ポリアミンを介した酸化ストレスにより血清COR濃度が上昇すると、ポリアミン産生が増加する可能性がある。ルーメンには過酸化水素を分解するカタラーゼが欠乏しているため、スペルミジンとスペルミンによって誘導される過酸化水素の蓄積は、循環系に有毒であるだけでなく、ルーメン微生物にも有害である可能性がある。興味深いことに、アデノシン-リン酸-リボース（ADPR）は、NAD加水分解から生成される高反応性分子であり、過酸化水素によって刺激される可能性がある[71]。バクテリアにおいて、NAD はエネルギー供与体として DNA のライゲーションに重要な役割を果たす。A16ConにおけるルーミナルのADPR濃度の増加は、NADの過剰消費と細菌のDNAライゲーション障害を示唆しているのかもしれない。加えて、ADPR はタンパク質の非酵素的糖化を引き起こし、タンパク質の不活性化を促進する可能性がある [73]。これらの研究を総合すると、ADPR はルーメン代謝に悪影響を及ぼすことがわかる。本研究では、相関分析により、A16Con ウシのルーメン中で、Saccharopolyspora rectivirgula とスペルミン、スペルミジン、1,3-プロパンジアミン、N-アセチル-L-グルタミン酸、N2-アセチル-L-オルニチン、L-オルニチン、L-グルタミン酸の間に正の相関があることが示された（図 8B）。以前の研究では、Saccharopolyspora は合成ポリアミンを含まない 199 培地で培養してもスペルミジンを産生することが報告されている [74]。前述のSaccharopolyspora rectivirgulaの炎症促進菌と組み合わせると、Saccharopolyspora rectivirgulaはポリアミンの血中への放出を促進することによって肉牛の酸化ストレスを引き起こし、炎症を引き起こすと推測できる。A16ConとBTの比較では、アルギニン生合成、アルギニンおよびプロリン代謝に加えて、ビタミンB6代謝も有意に濃縮された経路であり（図6B）、3つのダウンレギュレート代謝物ピリドキサミン、4-ピリドキシン酸、P-サリチル酸と、1つのアップレギュレート代謝物D-リブロース-5-リン酸が含まれた（表S6）。D-リブロース-5-リン酸はアップレギュレートされたとはいえ、ペントースとグルコロン酸の相互変換、ペントースリン酸経路、リポ多糖生合成、メタン代謝などにも関与していた。このことは、A16Con牛のルーメンにおけるビタミンB6代謝が低下したことを示唆しているのかもしれない。ビタミンB6は、ピリドキシン、ピリドキサール、ピリドキサミン、およびそれぞれのリン酸エステル体という6種類のビタマーを含み、細胞内で幅広い生化学反応の補酵素として必須の役割を果たし [75]、細胞性免疫と体液性免疫の両方を通じて宿主の免疫反応にも影響を与える [76]。通常の生理学的条件下では、ルーメン微生物は大量のビタミンB6を合成することができ、反芻動物は食事によるビタミンB6の補給を必要としない。したがって、A16Con ウシでは、ルーメン微生物群のビタミン B6 代謝が低下しているため、宿主の代謝と免疫機能が阻害されている可能性がある。最後に、アデノシン-2',3'-サイクリック・リン酸（2',3'-cAMP）のVIP値が、制御された微分代謝物の中で最下位であったことは注目に値する。セカンドメッセンジャーであるcAMP（3',5'-cAMP）の位置異性体として、2',3'-cAMPも真核生物と原核生物の両方でセカンドメッセンジャーとして働くことができる[77]。病原性細菌（大腸菌）では、2',3'-cAMPが枯渇するとバイオフィルム産生が促進されるが、2',3'-cAMP濃度を上昇させるとバイオフィルム形成が抑制される[77]。バイオフィルムの形成は病原性細菌の病原性にとって極めて重要であり、主にヌクレオチド代謝と環状二量体-3',5'-GMP（c-di-GMP）シグナルによって支配されている。2',3'-環状ヌクレオチド一リン酸（2',3'-cNMPs）レベルの摂動は、de novoピリミジンヌクレオチドまたはプリンヌクレオチド生合成を調節することから、2',3'-cNMPsがヌクレオチドプールを調節し、c-di-GMPシグナル伝達を擾乱することが示唆され、これがバイオフィルムに関連した微生物の病原性を媒介すると考えられる[77]。したがって、A16Con牛では、ルーミナルの2',3'-cAMPおよび関連するヌクレオチド代謝産物（cAMP、cGMP、アデニン）の含量が減少しており、病原性細菌にとって好都合な増殖条件となっていた。興味深いことに、A16Con対BT（図6B）とは正反対に、A30Con対A16Conでは、ルーミナルのL-オルニチンと2',3'-cAMPが、それぞれ最も低下および上昇した代謝物であった。これは、L-オルニチンとその関連代謝物であるスペルミジン、1,3-プロパンジアミン、L-グルタミン酸、N-アセチル-L-グルタミン酸、L-4-ヒドロキシグルタミン酸セミアルデヒド、N2-アセチル-L-オルニチンがダウンレギュレートされたことと一致している。2',3'-cAMPと同様に、2',3'-cNMPsプールのもう一つの種であるシチジン2',3'-環状リン酸（2',3'-環状CMP）もアップレギュレートされた。同時に、2',3'-cNMPsの生成に関与するcGMP、アデニン、cAMPのレベルも上昇した。A16Con牛と比較したA30Con牛のルーメン内代謝物の変化は、L-オルニチンの減少に伴い、L-オルニチンの異化物（主にスペルミジンと1,3-プロパンジアミン）によって誘発される酸化ストレスが緩和されたこと、2',3'-cAMPに基づく2',3'-cNMPsプールの増加に伴い、病原性細菌のバイオフィルム形成が抑制されたことを示唆していると考えられる。これは、酸化還元、炎症、宿主免疫状態の変化とも一致する。

AConとBTの比較血清メタボローム解析により、134種類の代謝物が同定された。これらの代謝物は主にプリン代謝、D-グルタミンおよびD-グルタミン酸代謝、アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸代謝、アルギニンおよびプロリン代謝、アルギニン生合成などに濃縮された。これらの経路は総称して骨格筋の異化とエネルギー代謝の一部である。長距離輸送中、肉牛は飢餓と骨格筋の分解に苦しみ、細胞機能をサポートするためにL-グルタミンとL-アラニンを血液中に放出する[78]。筋肉は繰り返し激しく収縮し、筋肉中の大量のアデノシン三リン酸（ATP）を分解し、イノシン、ヒポキサンチン、キサンチンを血液中に放出する。クレアチンキナーゼは、ホスホクレアチンとアデノシン二リン酸の可逆的な変換を触媒して、それぞれクレアチンとATPを形成する。その結果、ACon牛の血清中では、プリン代謝（イノシン、グアニン、キサンチン、グアノシン、ヒポキサンチン）、L-グルタミン、クレアチンがBT牛よりも高かった。ACon牛とBT牛の血清中代謝産物の比較では、5-ヒドロキシ-6-メトキシインドールグルクロニドがVIP値で最も低下した代謝産物であった。グルクロニドはグルコースの主要代謝物であり、肝臓でさまざまな有害物質と結合することにより、重要な解毒の役割を果たす [79]。5-ヒドロキシ-6-メトキシインドールグルクロニドは、5-ヒドロキシ-6-メトキシインドールのグルクロン酸化産物である。インドールの内因性代謝物は、通常トリプトファン代謝から産生される [80] 。血清中の5-ヒドロキシ-6-メトキシインドールグルクロニドは、ACon牛ではBT牛に比べて有意に減少しており、ACon牛では解毒・グルクロン酸化が弱まっていることが示唆された。さらに、ACon vs. BT、A16Con vs. BT、A30Con vs. A16Conのすべてにおいて、PC種、LysoPC種、ホスホコリンの不均衡が検出されたが、これはストレスや活性化に対する細胞応答を反映している可能性がある。PCは、抗炎症性または抗酸化性のリン脂質として知られ、膜構造の形成と細胞シグナル伝達に関与している [81]。LysoPCは、ランズサイクルにおけるホスホリパーゼA2によるPCの加水分解によって産生される生理活性リゾリン脂質である [82] 。全身性炎症におけるLysoPCの役割については議論があり、炎症促進作用と抗炎症作用の両方が報告されている。敗血症、ヒトの糖尿病、アテローム性動脈硬化症では、LysoPCの濃度が低いことが知られており、LysoPCの全身投与は、敗血症や脳虚血を含む炎症モデルにおいて治療効果を示している[83]。乳牛では、熱ストレスが乳汁中のLysoPCを有意に減少させ、これは乳牛における熱ストレスの脂質マーカーであるようである [84]。研究者らは、LysoPCの減少は、熱ストレス下で生合成経路におけるコリン/ホスホコリンの生成が阻害されたことに起因すると説明した [84]。コリンキナーゼは、PC合成の律速段階である、コリンとATPからのホスホコリンの生成を触媒する。ストレス条件下でATPが枯渇すると、ホスホコリンの生合成が阻害され、PC産生が阻害される可能性がある。本研究では、ホスホコリンもACon対BTで減少した。ACon牛とBT牛におけるPCおよびLysoPC種の減少は、本研究における輸送ストレスによるものと推察される。ACon牛の血液サンプルは到着の1日後に採取されたため、PCおよびLysoPC生合成のアップストリームステップはストレスから完全には回復していなかった。驚くべきことに、A16Con vs. BTおよびA30Con vs. A16Conの両者における血清中の差分代謝物は、ほとんどPCおよびLysoPCであった。しかし、A16Con対BTでは代謝物が低下し、A30Con対A16Conでは代謝物が上昇しただけであった。この現象を説明するために、まずPCの合成過程を簡単に紹介する。すなわち、ホスファチジルエタノールアミン-N-メチル基転移酵素（PEMT）とケネディ経路である。PEMTは、S-アデノシルメチオニンをメチル供与体として、ホスファチジルエタノールアミン（PE）をPCに変換するために、3つの連続したメチル化反応を行う[85]。ケネディ経路では、セリンが脱炭酸されてエタノールアミンが生成され、このエタノールアミンがS-アデノシルメチオニンから3つのメチル基を得てコリンを生成する。PC合成は、メチル供与体としてのS-アデノシルメチオニンと切っても切れない関係にあることがわかる。一方、A16Con および A30Con ウシのルーメンで最も顕著に変化した代謝産物として、L-オルニチンはオルニチン脱炭酸酵素によって脱炭酸されてプトレシンを生成し、さらに S-アデノシルメチオニンと反応してスペルミジンとスペルミンを生成する [86]。ポリアミンは生合成前駆体であるS-アデノシルメチオニンに対してPCと競合することから、A16Con牛ではL-オルニチンからのポリアミン産生が多く、PCの生合成が阻害された可能性が推測される。その結果、A30Con牛では、ルーミナルのL-オルニチンとポリアミンが減少し、血清PCとLysoPCが増加した。最後に、アルギニンを分解するルーメン原虫の能力は細菌よりもはるかに遅いと考えられ、アルソーメン原虫はルーメン細菌よりもシトルリンからオルニチンへの分解活性が低かった。従って、A30Con 牛のルーメン中の L-オルニチン濃度の減少は、部分的にルーメン原生動物比率の増加と関連している可能性がある [87]。

結論
本研究により、新規受入牛の受入期間中のルーメン微生物組成、機能、代謝物は、宿主の代謝および健康状態と共に、有意差があることが確認された。新たに受け入れた牛の炎症と酸化ストレスは、輸送後 16 日目に最も深刻で、輸送後 30 日目に緩和した。そのメカニズムは、ルーメン微生物叢、代謝、宿主代謝に関連していた。エネルギー代謝（解糖/糖新生、ピルビン酸代謝）は亢進し、MCPとVFAsのルーメン含量は最も高かったが、より高いメタン収率（Methanobrevibacter）と病原性細菌（Saccharopolyspora rectivirgula）によって誘発されたエネルギー損失が、A16Con牛に炎症と酸化ストレスを引き起こした。この時、最もアップレギュレートされたルーメンのL-オルニチンは、より多くの異化物ポリアミンを産生し、ルーメン微生物とその宿主に酸化ストレスを引き起こした。ダウンレギュレートされたルーメンのビタミンB6代謝と血清のPC/LysoPC（生合成前駆体S-アデノシルメチオニンのためにポリアミンと競合する）は、免疫機能と炎症反応を混乱させた。これらのルーメンと血清の代謝物は、合わせて宿主の健康状態をさらに説明する（図9）。この研究は、新規受入牛の受入期間中の健康と成績を調整するための新しいアイデアを提供する。特に、メタンやポリアミンの生成、ルーメン内の有害細菌の繁殖を抑制し、新規受入牛の免疫力と成績を向上させることが重要である。

図9
図9
概要の全文ルーメン微生物種、ルーメン微生物の機能、ルーメン代謝産物、血清代謝産物を4群間で解析した。異なる量の微生物種上位5種と主なKEGG機能の差異が示された（LDAスコアは2.0以上、P値は0.05未満）。ルーメンと血清の代謝は、主にACon対BT、A16Con対BT、A30Con対BTで解析された。代謝物は、VIP > 1およびP < 0.05で選択された。輸送前、ほとんどの細菌が多糖類の消化に関与していた。輸送後1日目では、血清中で上昇した代謝物は主に骨格筋の異化とエネルギー代謝に関連していた。輸送後4日目では、ルーメン微生物は急速に繁殖し、ルーメン微生物の機能の中でピリミジン代謝とプリン代謝が濃縮され、この段階でルーメン微生物の代謝産物からより高いオロチジル酸濃度によって回復した。輸送後16日目には、エネルギー代謝が亢進し、MCPとVFAのルーメン含量が最も高くなったが、A16Con牛では、高いメタン収量と病原性細菌によって誘発されたエネルギー損失が、炎症と酸化ストレスを引き起こした。この時、最も上昇したルーメンのL-オルニチンは、ルーメン微生物とその宿主に酸化ストレスを引き起こす異化物ポリアミンをより多く産生し、最も低下したルーメンの2',3'-cAMPは病原性細菌に好都合な増殖条件を提供し、低下したルーメンのビタミンB6代謝と血清のPC/LysoPCは免疫機能と炎症反応を混乱させた。輸送後30日目には、L-オルニチンの減少と原虫の増加により、酸化ストレスは緩和され、抗炎症性細菌の増加により、身体の炎症反応を緩和することができる。

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実験方法
動物処理および実験飼料
本研究では、同一の飼養環境条件下で飼育され、同様の遺伝的背景を持つ、生後6ヶ月の雄の中国産シンメンタール交雑牛32頭を使用した。各群は8頭で構成された。グループ1は一般的な管理を行う対照群。グループ2、3、4は、それぞれ出発日、出発日＋輸送後15日、出発日＋輸送後30日の様々な日数、飲料水クレアチンピルビン酸（CrPyr、1頭あたり30g/日）を補充した。CrPyrは新しい多機能栄養剤であり、我々の以前の研究で、CrPyrが肉牛の暑さと輸送ストレスを緩和できることが示されている[9, 88]。実験には 4 つの処理グループが含まれるが、4 つの異なる時点でサンプリングした各グループには、グループ 1（対照グループ）とグループ 4 の 3 つのメタオミクス分析が含まれる。この論文では主に、対照群をベースとした、輸送前（1日）と輸送後（1日目または4日目、16日目、30日目）の肉牛のルーメン・メタゲノミクス、メタボノミクス、血液メタボノミクスに焦点を当てており、ピルビン酸クレアチンの影響については本研究では詳しく紹介していない。

これら32頭の実験牛は、他の68頭と共に、キルトマットレスとカバーを装備した長さ13.5m、幅2.3m、高さ4.2mの二層車（Zhumadian CIMC HuaJun Vehicle Co. 32頭の実験牛は上段に配置され、残りの牛はランダムに配置され、各ダブルデッキに50頭ずつ、1頭あたりの平均面積は0.63㎡であった。牛の輸送は、2021年9月13日20時に新疆ウイグル自治区アルタイ市の生体動物・飼料取引市場から河南省汝州市へ向かい、9月16日15時に河漢省許昌市の汝州龍岳畜産有限公司に到着した。これは、移動時間67時間、高速道路と市道を最高速度70km/hで走行した距離3450kmに相当する。

輸送中、牛は水を与えられず、麦わらを食べることができた。麦わらは荷を積む際に麦わらの束の形で荷車の側面に置かれた。輸送前の飼料中の濃厚飼料と麦わらの比率は 30：70 であった。濃厚飼料は商業会社から購入したもので、粗タンパク質≥17%、粗繊維≤10%、粗灰分≤9%、水分≤14%、全リン≥0.4%、カルシウム0.5～1.2%、塩分0.8～1.5%である。到着後、実験牛は同じ肉牛用牛舎にグループ順に繋留された。最初の2日間は主に麦わらを与え、その後の実験では全混合飼料（TMR）を与えた。TMRの組成と栄養価は表S1に示し、TMRは1日2回給餌した。肉牛の飲水量は到着後 5 日間は厳密に管理した。水温は約37℃で、1日3回、1回につき約3Lを与え、その後の実験では常温の水を自由に利用できるようにした。また、到着後5日間は、新たに受け入れた牛に、Shandong Helai Biotechnology Co., Ltd（中国山東省）から入手したプロバイオティクスおよびプロバイオティクス代謝産物（主に枯草菌、Saccharomyces cerevisiaeitsおよびそれらの代謝産物）を飲料水（10 g/L）に添加した。

サンプル採取および測定
血液およびルーメン液は、輸送前の 1 日目、輸送後 1/4 日目、16 日目、30 日目の朝、給餌前に採取した。対照群の新規受入牛を、サンプリング時間により 4 つのサブグループに分けた： BT = 輸送前 1 日目、血液とルーメン液を同時採取；ACon = 輸送後 1 日目または 4 日目、輸送後 1 日目に血液を採取、輸送後 4 日目にルーメン液を採取；A16Con = 輸送後 16 日目、血液とルーメン液を同時採取；A30Con = 輸送後 30 日目、血液とルーメン液を同時採取。ルーメン液は経口胃チューブを用いて採取した。装置はサンプル採取の合間に温水で十分に洗浄し、唾液の混入を最小限に抑えるため、最初のルーメン液 50 mL は廃棄した。その後、各動物から採取したルーメン液サンプル 50 mL を直ちにポータブル pH メーター（HANNA Instruments, Cluj-Napoca、ルーマニア）を用いて pH を測定した。その後、サンプルを滅菌した部分に分け、直ちに液体窒素で凍結し、さらに分析するまで-80℃で保存した。血液サンプル（10 mL）を牛の頸静脈から非抗凝固性チューブに採取した。血液サンプルを3000gで遠心分離し（10分、4℃）、血清サンプルを得た後、指標とメタボロームプロファイルを測定するために-80℃で保存した。

化学分析
ルーメン液サンプル中の VFA 濃度は、キャピラリーカラム（Stabilwax, Restek, Bellefonte, PA, USA）を装備したガスクロマトグラフィー（Shimadzu GC-2014, 日本）を用いて測定した。NH3-N 濃度は、Broderick and Kang [89]の方法に従い、TU-1901 分光光度計（Beijing Purkinje General Instrument Co.］ MCP産生は、Coomassie Brilliant Blue [90]の方法に従って測定した。血清乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）、クレアチンキナーゼ（CK）、コルチゾール（COR）、副腎皮質刺激ホルモン（ACTH）、総抗酸化能（T-AOC）、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）、グルタチオンペルオキシダーゼ（GSH-PX）、マロンジアルデヒド（MDA）、IgA、IgG、IgM、インターロイキン-1β（IL-1β）、IL-4、IL-6、腫瘍壊死因子α（TNF-α）は、市販のキット（南京建成生物工学研究所、南京、中国）を用いて測定した。

ルーメンメタゲノミクス
DNA 抽出、ライブラリー構築、およびメタゲノム配列決定
FastDNA™ Spin Kit for Soil（MP Biomedicals、米国）を用い、製造者の指示に従い、ルーメン液から全ゲノム DNA を抽出した。抽出 DNA の濃度と純度は、それぞれ TBS-380 と NanoDrop2000 で測定した。DNA抽出物の品質は1%アガロースゲルで確認した。Covaris M220 (Gene Company Limited, China)を用いてDNA抽出液を平均約400 bpのサイズに断片化し、ペアエンドライブラリーを構築した。ペアエンドライブラリーはNEXTflex™ Rapid DNA-Seq（Bioo Scientific, Austin, TX, USA）を用いて構築した。配列決定プライマーのハイブリダイゼーション部位をすべて含むアダプターを断片のブラントエンドにライゲーションした。ペアエンドシーケンスは、PE150を用いたIllumina NovaSeq 6000（Illumina Inc. (Ltd.（中国、上海）にて、メーカーの説明書（www.illumina.com）に従ってNovaSeq Reagent Kitsを用いて行った。このプロジェクトに関連する配列データはNCBI Short Read Archiveデータベースに寄託された（BioProject ID: PRJNA943223）。

シーケンス品質管理およびゲノムアセンブリ
メタゲノムシーケンスから得られた生リードは、Majorbio Cloud Platform (cloud.majorbio.com)の無料オンラインプラットフォーム上で、fastp [91] (https://github.com/OpenGene/fastp, version 0.20.0)を用いて、アダプター配列の除去、トリミング、低品質リード（N塩基、最小長閾値50 bp、最小品質閾値20のリード）の除去を行い、クリーンリードを作成した。リードはBWA [92] (http://bio-bwa.sourceforge.net, version 0.7.9a)によってBos taurus (cattle) ゲノムにアライメントされ、リードとその組み合わせリードに関連するヒットは除去された。これらの高品質なリードを、MEGAHIT [93] (parameters: kmer_min = 47, kmer_max = 97, step = 10) (https://github.com/voutcn/megahit, version 1.1.2)を用いてコンティグにアセンブルした。長さが300 bp以上のコンティグが最終的なアセンブル結果として選択された。

遺伝子予測、分類、機能アノテーション
コンティグ中のオープンリーディングフレーム（ORF）は、MetaGene [94] （http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/）を用いて同定した。100bp以上の長さを持つ予測されたORFを検索し、NCBI翻訳テーブル(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/taxonomyhome.html/index.cgi?chapter=tgencodes#SG1)を用いてアミノ酸配列に翻訳した。

配列同一性90%、カバレッジ90%のCD-HIT [95] (http://www.bioinformatics.org/cd-hit/, version 4.6.1)を用いて非冗長遺伝子カタログを構築した。品質管理後のリードをSOAPaligner [96] (http://soap.genomics.org.cn/, version 2.21)を用いて95%の同一性でnon-redundant gene catalogにマップし、各サンプルの遺伝子量を評価した。

非冗長遺伝子カタログの代表配列は、DIAMOND v0.9.19に実装されているblastpを用い、e-value cutoffを1e-5として、Diamond [97] (http://www.diamondsearch.org/index.php, version 0.8.35)を用いて分類学的アノテーションを行い、NCBI NRデータベースに基づくアノテーションを行った。KEGGアノテーションは、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomesデータベース(http://www.genome.jp/keeg/, version 94.2)に対して、Diamond [97] (http://www.diamondsearch.org/index.php, version 0.8.35)を用い、e-value cutoff 1e-5で行った。炭水化物活性酵素のアノテーションは、CAZyデータベース（http://www.cazy.org/）に対してhmmscan（http://hmmer.janelia.org/search/hmmscan）を用い、e-value cutoffを1e-5として行った。

ルーメンと血清のメタボロミクス
ルーメンと血清サンプルを LC-MS プラットフォーム (Thermo, UHPLC -Q Exactive HF-X) を用いて分析した。このプロジェクトに関連する配列データはMetaboLightsに寄託されています（ID: MTBLS7520）。

代謝物抽出
ルーメン液（30 mg）を正確に秤量し、粉砕ビーズ（直径6 mm）を入れた遠心チューブ（2 mL）に移した。0.02mg/mLの内部標準物質（L-2-クロロフェニルアラニン）を含む400μLのメタノール：水（4：1、v/v）溶液を用いて代謝物を抽出した。混合物を-10℃で沈降させ、ハイスループット組織破砕機Wonbio-96c（Shanghai wanbo biotechnology co.LTD）で50Hz、6分間処理した後、40kHzの超音波を5℃で30分間照射した。サンプルを-20℃で30分間静置し、タンパク質を沈殿させた。13,000g、4℃で15分間遠心した後、上清をLC-MS/MS分析用のサンプルバイアルに注意深く移した。

血清（100 µL）を遠心チューブ（1.5 mL）に正確に移し、0.02 mg/mLの内部標準物質（L-2-クロロフェニルアラニン）を含むメタノール：アセトニトリル（1：1、v/v）溶液400 µLを加えた後、各サンプルを30秒間ボルテックスし、40 kHzの超音波を5℃で30分間かけた。サンプルを-20℃で30分間静置し、タンパク質を沈殿させた。4℃で13,000g、15分間遠心した後、上清を注意深く移し、窒素で乾燥させ、120μLのアセトニトリル：水（1：1、v/v）溶液に溶解した。その後、サンプルを30秒間ボルテックスし、5℃で5分間40kHzの超音波をかけた。13,000g、4℃で15分間遠心した後、上清をLC-MS/MS分析用のサンプルバイアルに注意深く移した。

LC-MS/MS分析
代謝物のクロマトグラフィー分離は、ACQUITY BEH C18 カラム（100 mm × 2.1 mm i.d.、1.8 µm、Waters, Milford, USA）を用いて行った。移動相は、水:アセトニトリル(95:5, v/v)中の0.1%ギ酸(溶媒A)およびアセトニトリル:イソプロパノール:水(47.5:47.5:5, v/v)中の0.1%ギ酸(溶媒B)であった。サンプル注入量は2 µLで、カラム温度は40 °Cに維持した。分析期間中、これらのサンプルはすべて4℃で保存した。スペクトロメーターは、ポジティブまたはネガティブイオンモードで動作するエレクトロスプレーイオン化（ESI）源を装備した。最適条件は次のように設定された：スキャンタイプ、70-1050 m/z；シースガス流量、50 arb；Auxガス流量、13 arb；ヒーター温度、425 °C；キャピラリー温度、325 °C；イオンスプレー電圧フローティング（ISVF）、ネガティブモードでは-3500 V、ポジティブモードではそれぞれ3500 V；正規化コリジョンエネルギー、MS/MSでは20-40-60 Vローリング。データ取得はデータ依存取得（DDA）モードで行った。システムの再現性に関する情報を得るため、すべてのルーメン液/血清抽出アリコートを混合して調製した品質管理（QC）サンプルを、分析実行中、一定の間隔（6サンプルごと）で注入した。

メタボロミクスデータ解析
生データを Progenesis QI 2.3 (Waters Corporation, Milford, USA) にインポートし、ピーク検出とアライメントを行った。前処理の結果、保持時間（RT）、質量電荷比（m/z）値、ピーク強度からなるデータマトリックスが生成された。任意のサンプルセットで少なくとも50%検出された代謝物の特徴が保持されました。フィルタリング後、代謝物レベルが定量下限を下回った特定のサンプルについて代謝物の最小値をインプットし、各代謝物の特徴を合計値で正規化しました。データのQC（再現性）には内部標準を使用し、QCの相対標準偏差（RSD）が30％を超える代謝機能は破棄した。正規化手順とインピュテーションの後、対数変換したデータで統計解析を行い、比較群間の代謝物レベルの有意差を同定した。これらの代謝の特徴のマススペクトルは、Human metabolome database (HMDB) (http://www.hmdb.ca/) や Metlin database (https://metlin.scripps.edu/) などの信頼できる生化学データベースで検索し、正確な質量、MS/MSフラグメントスペクトル、同位体比の差を用いて同定した。具体的には、測定したm/z値と目的成分の正確な質量との間の質量許容差は±10ppmとした。MS/MSで確認された代謝物については、MS/MSフラグメントのスコアが30を超えるものだけを確信を持って同定されたとみなした。それ以外の代謝物は暫定的な同定にとどめた。

多変量統計解析
多変量統計解析は、Majorbio Cloud Platform (https://cloud.majorbio.com) 上の Bioconductor の ropls (Version1.6.2, http://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/ropls.html) R パッケージを用いて行った。代謝データの概要、一般的なクラスタリング、傾向、異常値を可視化するために、教師なし手法による主成分分析（PCA）を適用した。すべての代謝物変数は、PCAを実施する前に単位分散にスケーリングされた。直交部分最小二乗判別分析（OPLS-DA）を統計分析に使用し、比較群間のグローバルな代謝変化を決定した。OPLS-DAを実施する前に、すべての代謝物変数をパレートスケーリングにスケーリングした。モデルの妥当性はモデルパラメータR2とQ2から評価され、それぞれモデルの解釈可能性と予測可能性の情報を提供し、オーバーフィッティングのリスクを回避した。投影における変数の重要度（VIP）は、OPLS-DAモデルで計算された。P値は、一次元統計解析の対Studentのt検定で推定した。

代謝物の差分解析
VIP 値が 1 以上かつ P 値が 0.05 未満で、統計的に有意な群を選択した。合計で642のルーメン代謝物と503の血清代謝物が同定された。データベース検索（KEGG, http://www.genome.jp/kegg/）に基づく代謝濃縮およびパスウェイ解析により、2群間で差のある代謝物をまとめ、生化学パスウェイにマッピングした。これらの代謝産物は、それらが関与するパスウェイまたはそれらが果たす機能に従って分類することができる。エンリッチメント解析は通常、機能ノードに代謝物群が出現するか否かを解析するものであった。scipy.stats (Python packages) (https://docs.scipy.org/doc/scipy/) を利用し、フィッシャーの正確検定を用いて統計的に有意にエンリッチされたパスウェイを同定した。

統計解析
上記のデータはすべて、SPSS (version 17.0, IBM, Armonk, NY, USA) を用いた一元配置分散分析により解析した。処理間の有意差はTukeyの多重範囲検定で比較した。P値＜0.05を統計的に有意とみなした。結果は平均値および平均値の標準誤差で示した。ルーメン細菌、ルーメン発酵特性、血清指標、ルーメンメタボローム、血清メタボローム間の相関分析は、スピアマンの順位相関を用いて行い、R (Version 3.3.1, R Core Team, Vienna, Austria) "pheatmap package" を用いてヒートマップ形式で可視化した。相関係数の絶対値（｜r｜> 0.50、P < 0.05）を有意とみなした。

データおよび資料の入手可能性
本研究で分析したデータセットは、合理的な要求があれば対応する著者から入手可能である。

略語
ACTH
アドレナリン皮質刺激ホルモン

CAZymes：
糖質活性酵素

CK：
クレアチンキナーゼ

COR：コルチゾール
コルチゾール

GSH-PX：
グルタチオンペルオキシダーゼ

IL-1β
インターロイキン-1β

KEGG：
京都遺伝子百科事典

LDH
乳酸脱水素酵素

LEfse：
線形判別分析の効果量

LysoPC：
リゾホスファチジルコリン

MCP
微生物粗タンパク質

MDA
マロンジアルデヒド

PC：ホスファチジルコリン
ホスファチジルコリン

SOD
スーパーオキシドジスムターゼ

T-AOC
総抗酸化能

TNF-α：
腫瘍壊死因子α

VFA
揮発性脂肪酸

VIP：揮発性脂肪酸
投影における重要度

参考文献
de Souza KA, Cooke RF, Schubach KM, Brandao AP, Schumaher TF, Prado IN, et al. 飼料用抗生物質または代替飼料成分を添加した離乳したばかりの肥育牛の成績、健康、生理的反応。Animal. 2018;12(12):2521-8.

論文

PubMed

Google Scholar

Cooke RF. Invited paper: nutritional and management considerations for beef cattle 1081 experiencing stress-induced inflammation. Prof Anim Sci. 2017;33(1):1-11.

論文

Google Scholar

Duff GC, Galyean ML. Board-invited review: Recent advances in management of highly stressed, newly received feedlot cattle. 2007;85(3):823-40.

論文

PubMed

Google Scholar

ガリアンML、ダフGC、リベラJD。Galyean appreciation club review: revisiting nutrition and health of newly received cattle -What have we learned in the last 15 years? J Anim Sci. 2022;100(4):skac067.

論文

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

Thomas M, Webb M, Ghimire S, Blair A, Olson K, Fenske GJ, et al. 飼料添加物が肥育牛の腸内マイクロバイオームおよび抗生物質レジストームに及ぼす影響のメタゲノム解析。Sci Rep.

論文

PubMed

PubMed Central

グーグル奨学生

Lima J, Auffret MD, Stewart RD, Dewhurst RJ, Duthie CA, Snelling TJ, et al. 牛の食欲、成長、飼料転換効率に関連する経路に関与するルーメン微生物遺伝子の同定。Front Genet. 2019;10:701.

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Deng L, He C, Zhou Y, Xu L, Xiong H. Ground transport stress affects bacteria in the rumen of meat cattle: a real-time PCR analysis. Anim Sci J. 2017;88(5):790-7.

論文

PubMed

Google Scholar

Li F, Shah AM, Wang Z, Peng Q, Hu R, Zou H, et al. 陸上輸送ストレスが異なる品種の牛におけるルーミナル微生物の多様性と免疫機能の変動に及ぼす影響。Animals (Basel). 2019;9(9):599.

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Mao K, Lu G, Li Y, Zang Y, Zhao X, Qiu Q, et al. ルーメン保護クレアチンピルビン酸が輸送肉牛の血液生化学パラメータとルーメン液特性に及ぼす影響。BMC Vet Res. 2022;18(1):35.

論文

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

Taxis TM, Wolff S, Gregg SJ, Minton NO, Zhang C, Dai J, et al. The players may change but the game remain: Network analyses of ruminal microbiomes suggest taxonomic differences mask functional similarity. Nucleic Acids Res. 2015;43(20):9600-12.

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Xue MY, Sun HZ, Wu XH, Liu JX, Guan LL. マルチオミクスにより、ルーメンマイクロバイオームとそのメタボロームが宿主のメタボロームとともに乳牛の個体別成績に寄与することが明らかになった。Microbiome. 2020;8(1):64.

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

肉牛の残留飼料摂取量およびその他の生産性成績形質に関連する血漿代謝産物。Livest Sci. 2014;165:200-11.

論文

Google Scholar

コノリー S、ドナ A、ウィルキンソン-ホワイト L、ハンブリン D、ドッキオ M、ゴンザレス LA。肥育和牛交雑種去勢牛における血中メタボロームとその後の屠畜時の枝肉形質との関係。Sci Rep.

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Sikka P, Sethi RK, Tomer AKS, Chopra SC. 水牛の若い子牛の年齢および生体重と血中代謝物レベルとの関係。Asian Austral J Anim. 1994;7:201-5.

論文

Google Scholar

子宮内膜炎の指標としての牛のクレアチンキナーゼとアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ。J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 2004;51(3):132-7.

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

Wickham SL, Collins T, Barnes AL, Miller DW, Beatty DT, Stockman C, et al. 輸送経験のないヒツジと輸送経験のあるヒツジの定性的行動評価。2012;90(12):4523-35.

論文

PubMed

Google Scholar

屠畜牛の福祉指標としてのクレアチンキナーゼと乳酸脱水素酵素の活性。In： 59th International Congress of Meat Science and Technology. Izmir： Ege University; 2013.

バングラデシュのジェソール（インド国境）からチッタゴンまでの長距離（約 648 km）を移動する牛の輸送ストレスの評価。Vet Rec Open. 2018;5(1):e248.

論文

Google Scholar

Werner M, Hepp C, Soto C, Gallardo P, Bustamante H, Gallo C. チリ南部で離乳したばかりの交雑種の肉用子牛における長距離輸送の影響とその後の回復。Livest Sci. 2013;152(1):42-6.

記事

Google Scholar

Tadich N, Gallo C, Bustamante H, Schwerter M, Schaik GV. チリにおけるフリース種交雑種去勢牛の血液成分に及ぼす輸送と飼養期間の影響。Livest Prod Sci. 2005;93(3):223-33.

論文

Google Scholar

グルココルチコイドおよび血液学的指標と仕上期肉牛の飼料摂取量、成長および効率との関係。J Anim Sci. 2016;94(1):275-83.

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Schiavone S, Jaquet V, Trabace L, Krause KH. 重度の生活ストレスと脳の酸化ストレス：動物モデルからヒトの病理学へ。Antioxid Redox Signal. 2013;18(12):1475-90.

論文

PubMed

パブメドセントラル

グーグル奨学生

ラットの視床下部-下垂体-副腎活動の酸化ストレスと加齢による上昇とビタミンeによる予防。

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Spiers JG, Chen HJ, Sernia C, Lavidis NA. 視床下部-下垂体-副腎ストレス軸の活性化は細胞酸化ストレスを誘導する。Front Neurosci. 2014;8:456.

PubMed

グーグル奨学生

Aae A, Yl B, Mgl B, Jjl B. 乳牛の効率性の構成要素としての抗酸化ネットワークとマイクロバイオーム。Livest Sci. 2021;251:104656.

論文

Google Scholar

Japaridze A, Gogou C, Kerssemakers J, Nguyen HM, Dekker C. 大腸菌における独立して動くレプリソームの直接観察。Nat Commun. 2020;11(1):3109.

論文

PubMed

パブメドセントラル

グーグル奨学生

細菌におけるDNA複製の制御。2013;5(4):a12922。

論文

Google Scholar

片山智史、尾崎将之、鍵村和彦、藤光和夫：複製サイクルの制御：DnaAとoriCの保存された多様な制御システム。Nat Rev Microbiol. 2010;8(3):163-70.

論文

パブコメ

Google Scholar

Singh KM, Jisha TK, Reddy B, Parmar N, Patel A, Patel AK, et al. タグ付き16S rRNA遺伝子パイロシーケンスによる、緑粗飼料および乾燥粗飼料を給与したバッファローのルーメンにおける液体および固体画分に関連する生体物質の微生物プロファイル。Mol Biol Rep. 2015;42(1):95-103.

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

テリーSA、バダンA、ワンY、チャベスAV、マカリスターTA。Fibre digestion by rumen microbiota-a review of recent metagenomic and metatranscriptomic studies. Can J Anim Sci. 2019;99(4):678-92.

論文

グーグル・スカラー

Badhan A, Low KE, Jones DR, Xing X, Milani M, Polo RO, et al. Combinatorial high-resolution glycomics and transcriptomic analyses using the complex dietary fibre digestion of the rumen microbiota using combinatorial high-resolution glycomics and transcriptomic analyses. Comput Struct Biotechnol J. 2022;20:148-64.

論文

パブコメ

Google Scholar

乳牛のルーメン微生物叢、ルーメン発酵および生体アミンに及ぼす飼料給与源の影響。J Sci Food Agric. 2014;94(9):1886-95.

論文

PubMed

グーグル奨学生

Moura P, Barata R, Carvalheiro F, Gírio F, Loureiro-Dias MC, Esteves MP. ビフィズス菌と乳酸菌株によるトウモロコシ穂軸の自己加水分解からのキシロオリゴ糖の試験管内発酵。LWT-Food Sci Technol. 2007;40(6):963-72.

論文

CAS

Google Scholar

Manz W, Amann R, Ludwig W, Vancanneyt M, Schleifer KH. 自然環境におけるシトファーガ-フラボバクター-バクテロイデス門の細菌を調査するために設計された16S rRNA特異的オリゴヌクレオチドプローブ群の応用。微生物学（読書）。1996;142(Pt 5):1097-106.

論文

パブコメ

Google Scholar

Colombo EA, Cooke RF, Brandao AP, Wiegand JB, Schubach KM, Sowers CA, et al. プレおよびプロバイオティクス成分を添加した新規受入肥育牛の成績、健康、および生理学的反応。Animal. 2021;15(5):100214.

論文

パブコメ

Google Scholar

ホモルカMN、スミスWN、フスツTC、パウルスコンパートDM、ジェニングスJS。肥育場到着後 21 日間または 42 日間にプロバイオティクスとプレバイオティクスのサプリメントを摂取した肉牛の成績評価。2023;270:105096。

論文

Google Scholar

(1)畜産業におけるプロバイオティクスとプレバイオティクスの効果(2)畜産業におけるプロバイオティクスとプレバイオティクスの効果(3)畜産業におけるプロバイオティクスとプレバイオティクスの効果(4)畜産業におけるプロバイオティクスとプレバイオティクスの効果(5)畜産業におけるプロバイオティクスとプレバイオティクスの効果(6). Feed Res. 2022;45(18):10-3 (In Chinese).

Google Scholar

新規ウシ消化管トレポネーマ分離株の特性とウシ趾皮膚炎トレポネーマとの比較。Appl Environ Microbiol. 2011;77(1):138-47.

論文

パブコメ

Google Scholar

ルミノコックス：腸内生態系の重要な共生生物。J Microbiol. 2018;56(3):199-208.

論文

PubMed

グーグル奨学生

Purushe J, Fouts DE, Morrison M, White BA, Mackie RI, Coutinho PM, et al. Prevotella ruminicolaとPrevotella bryantiiの比較ゲノム解析：その環境ニッチへの洞察。Microb Ecol. 2010;60(4):721-9.

論文

パブコメ

Google Scholar

ジョンソンKA、ジョンソンDE。牛からのメタン排出。1995;73(8):2483-92.

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

飼料残留摂取量の異なる未経産牛のメタン排出量、体組成、ルーメン発酵形質。2013;91(12):5789-800.

論文

パブコメ

Google Scholar

ルーメンの古細菌群集の組成シフトは、食事によって誘発される酸化還元電位の変化によるものである。Environ Microbiol. 2017;19(1):174-84.

論文

CAS

PubMed

グーグルスカラー

Mcloughlin S, Spillane C, Claffey N, Smith PE, O'Rourke T, Diskin MG, et al. Rumen microbiome composition is changed in sheep divergent in feed efficiency. Front Microbiol. 2020;11:1981.

論文

PubMed

PubMed Central

グーグル奨学生

Shabat SK, Sasson G, Doron-Faigenboim A, Durman T, Yaacoby S, Berg MM, et al. 反芻動物のエネルギー収穫効率を支える特異的微生物群依存メカニズム。ISME J. 2016;10(12):2958-72.

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Xie Y, Sun H, Xue M, Liu J. メタゲノム解析により、残餌摂取量の異なる乳牛のルーメンにおける微生物組成と代謝機能の違いが明らかになった。Anim Microbiome. 2022;4(1):19.

論文

PubMed

パブメドセントラル

グーグル奨学生

Kaplan-Shabtai V, Indugu N, Hennessy ML, Vecchiarelli B, Bender JS, Stefanovski D, et al. 構造方程式モデリングを用いたルーメン内の細菌・古細菌集団と揮発性脂肪酸割合の相互作用の解明。Front Microbiol. 2021;12:611951.

論文

パブメドセントラル

Google Scholar

Pitta D, Indugu N, Narayan K, Hennessy M. シンポジウムレビュー：乳牛の腸内メタン緩和と生産性におけるルーメンマイクロバイオームの役割の理解。2022;105(10):8569-85.

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

Gershwin LJ, Himes SR, Dungworth DL, Giri SN, Friebertshauser KE, Camacho M. 牛呼吸器合胞体ウイルス感染が吸入したMicropolyspora faeniに対する過敏症に及ぼす影響。Int Arch Allergy Immunol. 1994;104(1):79-91.

論文

PubMed

グーグル奨学生

Riquelme E, Zhang Y, Zhang L, Montiel M, Zoltan M, Dong W, et al. 腫瘍マイクロバイオームの多様性と組成は膵臓癌の転帰に影響する。Cell. 2019;178(4):795-806.

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

グーグル奨学生

Kaakoush NO. ヒト宿主におけるうどんこ病菌の役割に関する知見。Front Cell Infect Microbiol. 2015;5:84.

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

ジョブリンKN、ネイラーGE。ruminal のマイコプラズマ: 検討。J Appl Anim Res. 2002;21(2):161-79.

記事

Google Scholar

Diaz HL, Karnati SK, Lyons MA, Dehority BA, Firkins JL. Dhemotaxis towards carbohydrates and peptides by mixed ruminal protozoa when fed, fasted, or incubated with polyunsaturated fatty acids. J Dairy Sci. 2014;97(4):2231-43.

論文

パブコメ

Google Scholar

Wang L, Abu-Doleh A, Plank J, Catalyurek UV, Firkins JL, Yu Z. The transcriptome of the rumen ciliate Entodinium caudatum reveals some of its metabolic features. BMC Genomics. 2019;20(1):1008.

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

グーグル・スカラー

嫌気性繊毛虫Entodinium caudatumの大核ゲノムを解析し、ルーメン環境に適応した生物学的特徴を明らかにした。Genomics. 2021;113(3):1416-27.

論文

パブコメ

Google Scholar

Foster DA, Xu L. 細胞増殖と癌におけるホスホリパーゼD。細胞増殖とがんにおけるホスホリパーゼD。

CAS

PubMed

グーグル奨学生

Sylvester JT, Karnati SK, Yu Z, Morrison M, Firkins JL. リアルタイムPCR法を用いた牛のルーメン繊毛原虫バイオマスの定量アッセイの開発。J Nutr. 2004;134(12):3378-84.

論文

PubMed

Google Scholar

ニューボールドCJ、デ・ラ・フエンテG、ベランチA、ラモス-モラレスE、マセワンNR。ルーメンにおける繊毛虫原生動物の役割。Front Microbiol. 2015;6:1313.

論文

PubMed

パブメドセントラル

グーグル奨学生

ルーメン繊毛虫の系統とバイオマス分解酵素に関するゲノム学的知見。Isme J. 2022;16(12):2775-87.

論文

パブコメ

Google Scholar

ポルフィロモナド科．原核生物：細菌の他の主要系統と古細菌. で： Rosenberg E, DeLong EF, Lory S, Stackebrandt E, Thompson F, editors. New York： Springer Berlin Heidelberg; 2014. p. 811-824.

Kverka M, Zakostelska Z, Klimesova K, Sokol D, Hudcovic T, Hrncir T, et al. Parabacteroides distasonis抗原の経口投与は、免疫と微生物叢組成の調節を介して実験的マウス大腸炎を減衰させる。Clin Exp Immunol. 2011;163(2):250-9.

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Donaldson GP, Lee SM, Mazmanian SK. 細菌叢の腸内生物地理学。Nat Rev Microbiol. 2016;14(1):20-32.

論文

PubMed

グーグル奨学生

郭C、王Y、張S、張X、杜Z、李M、ら。Crataegus pinnatifida多糖は腸内細菌叢とSCFAs代謝の調節を介して大腸炎を緩和する。Int J Biol Macromol. 2021;181:357-68.

論文

パブコメ

グーグル奨学生

大麦若葉不溶性食物繊維は腸内細菌叢を調節することによりデキストラン硫酸ナトリウム誘発マウス大腸炎を緩和した。Nutrients. 2021;13(3):846.

論文

PubMed

パブメドセントラル

グーグル奨学生

癌の治療標的としてのジヒドロオロチン酸デヒドロゲナーゼの役割を再考する。Pharmacol Ther. 2019;195:111-31.

論文

CAS

PubMed

グーグル・スカラー

Marliere P, Patrouix J, Doring V, Herdewijn P, Tricot S, Cruveiller S, et al. 細菌ゲノムの化学進化。2011;50(31):7109-14。

論文

パブコメ

Google Scholar

チャウドリRF, ハッチンソンDW, リチャーズAO. 乳酸菌におけるヌクレオシドデオキシリボシルトランスフェラーゼおよびイノシンホスホリラーゼ活性。Arch Microbiol. 1991;155:409-11.

穀物飼料が乳牛のルーメンの健康に及ぼす影響を明らかにするためのメタボロミクスアプローチ。J Dairy Sci. 2012;95(11):6606-23.

論文

パブコメ

Google Scholar

フリンNE、バードJG、ガスリーAS. 小腸におけるアミノ酸およびポリアミン代謝のグルココルチコイド制御。Amino Acids. 2009;37(1):123-9.

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

Wu G, Flynn NE, Knabe DA. コルチゾール処理子豚におけるプロリンからのポリアミンの腸内合成促進。Am J Physiol Endocrinol Metab. 2000;279(2):E395–402.

論文

パブコメ

Google Scholar

TRPM2：酸化ストレスと新規セカンドメッセンジャーADP-リボースによって制御されるカルシウム流入経路。Pflugers Arch. 2005;451(1):212-9.

論文

PubMed

グーグル奨学生

Sorci L, Ruggieri S, Raffaelli N. DNA/RNA損傷に対する細菌応答におけるNAD恒常性。DNA修復（Amst）。2014;23:17-26.

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Jacobson EL, Cervantes-Laurean D, Jacobson MK. ADP-リボースによるタンパク質の糖化。Mol Cell Biochem. 1994;138(1–2):207–12.

論文

パブコメ

Google Scholar

グラム陽性真正細菌中のクロストリジア，酢酸菌性嫌気性菌，放線菌，桿菌，ヘリオバクテリアおよびハロ嫌気性菌のポリアミン分布カタログ-好熱菌と好塩菌におけるスペルミンとアグマチンの分布-．Microbiol Cult Coll. 1999;15(12):6325-34.

Google Scholar

ビタミンB6と細胞代謝および生理学におけるその役割。Cells. 2018;7(7):84.

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Bierwirth J, Ulbricht KU, Schmidt RE, Witte T. Common variable immunodeficiencyとビタミンB6欠乏症の関連。欧州臨床栄養2008;62（3）：332-5。

論文

CAS

PubMed

グーグル奨学金

Duggal Y, Kurasz JE, Fontaine BM, Marotta NJ, Chauhan SS, Karls AC, et al. グラム陰性菌における2',3'-環状ヌクレオチド一リン酸塩の細胞内作用。J Bacteriol. 2022;204(1):e20821.

論文

グーグル奨学生

Chang TW, Goldberg AL. 骨格筋におけるアミノ酸の代謝運命とグルタミンの形成。J Biol Chem. 1978;253(10):3685–93.

論文

CAS

パブコメ

グーグル奨学生

Ho A, Sinick J, Esko T, Fischer K, Menni C, Zierer J, et al. 血中グルクロン酸はヒトとマウスにおいて健康寿命と長寿を予測する。Aging (Albany NY). 2019;11(18):7694–706.

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Qi Y, Li S, Pi Z, Song F, Lin N, Liu S, et al. 超高速液体クロマトグラフィーと四重極飛行時間質量分析法を用いたアジュバント誘発関節炎ラットにおける五虎湯煎じ薬の代謝学的研究。J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2014;953-954:11-9.

論文

PubMed

グーグル奨学生

ホスファチジルコリンの抗炎症作用（Treede I, Braun A, Sparla R, Kuhnel M, Giese T, Turner JR, et al. J Biol Chem. 2007;282(37):27155–64.

論文

パブコメ

Google Scholar

リゾホスファチジルコリン代謝のヒト疾患への応用。An Updated review of Lysophosphatidylcholine metabolism in human diseases. Int J Mol Sci. 2019;20(5):1149.

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

グーグル奨学生

Meikle PJ, Formosa MF, Mellett NA, Jayawardana KS, Giles C, Bertovic DA, et al. コレステロールではなくHDLリン脂質が急性冠症候群と安定冠動脈疾患を区別する。J Am Heart Assoc. 2019;8(11):e11792.

論文

グーグル・スカラー

Liu Z, Ezernieks V, Wang J, Arachchillage NW, Garner JB, Wales WJ, et al. 乳牛の熱ストレスは乳汁の脂質組成を変化させる。Sci Rep.

論文

CAS

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

コーディルMA. KKC。ヒト栄養の生化学的、生理学的、分子学的側面。4th ed; 2018.

Liu Q, An X, Chen Y, Deng Y, Niu H, Ma R, et al. Auricularia auricula polysaccharides effects of gut microbiota and metabolic phenotype in mice. Foods. 2022;11(17):2700.

論文

PubMed

パブメドセントラル

グーグル奨学生

Sultana H, Hussain-Yusuf H, Takahashi T, Morita T, Onodera R. A quantitative study on arginine catabolism by mixed ruminal bacteria, protozoa and their mixture in vitro. Anim Sci J. 2003;74(1):11-6.

論文

CAS

Google Scholar

クレアチンピルビン酸の給与は、熱ストレスを受けた肉牛のルーメン微生物群のタンパク質機能を変化させる。Front Microbiol. 2021;12:715088.

論文

PubMed

PubMed Central

グーグル奨学生

Broderick GA, Kang JH. ルーミナル液および試験管内培地中のアンモニアおよび総アミノ酸の自動同時定量。J Dairy Sci. 1980;63(1):64-75.

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Zinn RA, Owens FN. プリン体測定の迅速な手順と、正味のルーミナルタンパク質合成の推定への利用。Can Vet J. 1986;66(1):157-66.

CAS

Google Scholar

Fastp：超高速オールインワンFASTQプリプロセッサ。Bioinformatics. 2018;34(17):i884-90.

論文

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

Burrows-Wheeler変換を用いた高速で正確なショートリードのアライメント。Bioinformatics. 2009;25(14):1754-60.

論文

パブコメ

パブメドセントラル

グーグル奨学生

李D, 劉CM, 羅R, 貞兼K, ラムTW. MEGAHIT: 簡潔なde Bruijnグラフによる大規模かつ複雑なメタゲノム解析のための超高速シングルノードソリューション。Bioinformatics. 2015;31(10):1674-6.

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

野口英樹、朴淳一、高木孝明：MetaGene：環境ゲノムショットガン配列からの原核生物遺伝子探索。2006;34(19):5623-30。

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

傅玲（Fu L）、劉薇（Niu B）、朱瑞（Zhu Z）、呉錫（Wu S）、李和（Li W）。CD-HIT：次世代シーケンシングデータのクラスタリングを加速する。Bioinformatics. 2012;28(23):3150-2.

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

李亮(Li R)、李毅(Li Y)、クリスチャンセン(Kristiansen K)、王毅(Wang J.) SOAP: short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics. 2008;24(5):713-4.

論文

パブコメ

Google Scholar

ブッフフィンクB, 謝C, ヒューソンDH. DIAMONDを用いた高速かつ高感度なタンパク質アラインメント。Nat Methods. 2015;12(1):59-60.

論文

PubMed

Google Scholar

参考文献ダウンロード

謝辞
同僚および共同研究者の協力に感謝する。

資金提供
本研究は、中国MOF・MARA農業研究システム（CARS-37）、中国国家自然科学基金（No.32160814）の支援を受けた。

著者情報
著者情報
Yanjiao LiとKang Maoは同等に本研究に貢献した。

著者および所属
江西農業大学畜産科学技術学院動物栄養学・飼料安全イノベーションチーム、江西省動物栄養学重点実験室、中国南昌市

Yanjiao Li, Kang Mao, Yitian Zang, Guwei Lu, Qinghua Qiu, Kehui Ouyang, Xianghui Zhao, Xiaozhen Song, Lanjiao Xu, Huan Liang & Mingren Qu.

貢献
YLとKMが本研究の構想およびデザインに関与した。YLとKMがデータ抽出と結果の解釈を担当し、KMとGLが統計解析を行った。YLとMQは研究プロジェクトの資金を獲得した。YZ、XZ、QQ、KO、XS、LX、HLが研究活動を監督した。YLとKMは主に原稿作成を担当した。YL、KM、MQは原稿の修正に携わった。最終原稿は著者全員が読み、承認した。

対応する著者
Yanjiao LiまたはMingren Quまで。

倫理申告
倫理承認と参加同意
動物の飼育および実験手順は、江西農業大学（中国・南昌）の動物飼育委員会（JXAULL-2021-10）により承認され、同大学の動物研究に関するガイドラインに従った。

論文発表の同意
該当なし。

競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。

補足情報
追加ファイル1：
表S1. 実験飼料の組成と栄養レベル（空気乾燥ベース、％）。

追加ファイル 2：
表 S2. 輸送前 1 日、輸送後 4 日目、16 日目、30 日目の新規受入牛から得られた配列データの要約。

追加ファイル 3: 表 S3.
KEGGの第一レベルと第二レベルの機能に基づく代謝パスウェイの構成。

追加ファイル4：表S4.
LEfSe解析に基づく代謝3階層パスウェイの差異の詳細結果。

追加ファイル5：表S5.
クラスレベルとファミリーレベルの酵素に基づくCAZymesの構成。

追加ファイル 6: 表 S6.
4群間の一対比較から同定されたルーメン代謝物の詳細な差異。

追加ファイル 7: 表 S7.
4群間の一対比較から同定された血清代謝物の詳細な差異。

追加ファイル 8: 図 S1.
新規受入牛のルーメン微生物組成のプロファイル。

追加ファイル 9: 図 S2.
主座標分析（PCoA）を用いて可視化した、新規受入牛のルーメンサンプルの（A）真核生物と（B）ウイルスの微生物組成プロファイル。

追加ファイル 10：Fig.
細菌門と属の比較。細菌門（A）と属（B）はクラスカル・ワリスH検定で検定した。

追加ファイル11：図S4.
古細菌門と属の比較。古細菌門（A）と属（B）をクラスカル・ワリスH検定で検定した。

追加ファイル12：図S5.
BT、ACon、A16Con、A30Con牛のCAZymの違い。

追加ファイル 13: 図 S6.
BT 牛、ACon 牛、A16Con 牛、A30Con 牛のルーメン代謝物を HMDB に従って分類したもの（A）と OPLS-DA に基づいて比較したもの（B）。

追加ファイル14: 図S7.
A30Con対BT、A16Con対ACon、A30Con対AConのルーメンメタボローム。

追加ファイル 15: 図 S8.
HMDBによるBT、ACon、A16Con、A30Con牛の血清代謝物分類（A）とPLS-DAによる比較（B）。

追加ファイル16: 図S9.
A30Con対BT、A16Con対ACon、A30Con対AConの血清メタボローム。

追加ファイル17：図S10。
メタゲノミクスデータに基づくDNA複製に関する代謝経路差分解析。

追加ファイル18: 図S11.
メタゲノミクスデータに基づくピリミジンの代謝経路差分解析。

権利と許可
オープンアクセス本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを閲覧するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記に別段の記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。

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この記事の引用
Li, Y., Mao, K., Zang, Y. et al. Revealing the developmental characterization of rumen microbiome and its host in newly received cattle during receiving period, contributes to formulating precise nutritional strategies. Microbiome 11, 238 (2023). https://doi.org/10.1186/s40168-023-01682-z

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受領
2023年3月13日

受理
2023年9月27日

発行
2023年11月03日

DOI
https://doi.org/10.1186/s40168-023-01682-z

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新入荷牛
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ルーメンとホストのクロストーク
ルーメンメタゲノミクス
ルーメンメタボロミクス
血清メタボロミクス
輸送
マイクロバイオーム
ISSN: 2049-2618

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投稿に関するお問い合わせ: lyndie.manicani@springernature.com
一般的なお問い合わせ: info@biomedcentral.com
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