腸内細菌由来のセロトニンは生後早期の免疫寛容を促進する

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腸内細菌由来のセロトニンは生後早期の免疫寛容を促進する

https://www.science.org/doi/10.1126/sciimmunol.adj4775


キャサリン・Z・サニダード https://orcid.org/0000-0002-2689-3826, ステファニー・L. RAGER HTTPS://ORCID.ORG/0000-0003-1016-6138, [...], AND MELODY Y. ZENG HTTPS://ORCID.ORG/0000-0002-0031-4267 +17 authors著者情報&所属
科学免疫学
2024年3月15日号
第9巻 93号
DOI: 10.1126/sciimmunol.adj4775

編集者サマリー
要旨
はじめに
結果
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編集者の要約
常在細菌や食事性抗原に対する免疫寛容の確立は生後早期に起こり、腸内細菌叢の影響を受ける。腸は神経伝達物質の主要な産生場所であるが、これらの神経伝達物質がどのように生後早期の免疫寛容を制御しているのかは不明である。Sanidadらは、新生児マウスの小腸内の代謝産物をプロファイリングし、セロトニン（5-HT）が新生児腸内に高度に濃縮されていることを同定した。5-HTは選択的な腸内細菌によって産生され、T細胞の代謝を直接変化させることによって腸管制御性T細胞の分化を誘導し、食餌性抗原や常在細菌に対する耐性を促進した。これらの知見は、新生児期の免疫寛容において、新生児腸内細菌由来のセロトニンが重要な役割を果たしていることを示している。-ハンナ・アイルズ
要旨
腸内細菌叢は生後早期の免疫系の発達を促進するが、新生児期の腸内メタボロームと免疫細胞との相互作用はほとんど解明されていない。ここで我々は、新生児期の腸にはセロトニンを含む神経伝達物質が特異的に豊富に存在し、特定の腸内細菌がセロトニンを直接産生する一方、モノアミン酸化酵素Aをダウンレギュレートしてセロトニンの分解を制限していることを明らかにした。我々は、セロトニンがT細胞に直接シグナルを送り、細胞内のインドール-3-アセトアルデヒドを増加させ、mTORの活性化を抑制することで、制御性T細胞の分化を促進することを、新生児腸のex vivoとin vivoの両方で発見した。新生児マウスにセロトニンを経口投与したところ、食餌性抗原と常在菌の両方に対して、T細胞を介した抗原特異的免疫寛容が長期間認められた。この研究により、新生児期の腸内でセロトニンの利用性を高めるために特定の腸内細菌が重要な役割を果たすことが明らかになった。また、新生児期の免疫寛容を促進するために、食餌性抗原と常在細菌に対するT細胞応答を形成する腸内セロトニンの機能が同定された。
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はじめに
生後早期の腸内細菌コロニー形成は、腸の成熟と免疫系の発達の重要な原動力であり(1-3)、その一部は腸内メタボロームによって媒介される。成体腸とは異なり、成熟期の新生児腸は糖やミルクオリゴ糖に富み、ダイナミックに変化する腸内細菌叢にコロニー形成され、微生物や代謝シグナルの影響を受けて成熟期の免疫細胞が生息している。最近の研究では、食物アレルギー、喘息、神経発達障害を持つ子供において、腸内細菌叢とメタボロームが変化していることが報告されている(4-6)。また、幼児期は腸内常在菌や食事・環境抗原に対する免疫寛容が確立される重要な時期でもある(7, 8)。しかし、新生児期のメタボロームが生後早期の免疫寛容の発達に影響を及ぼすかどうか、あるいはどのように影響を及ぼすかについては、まだ十分に理解されていない。
腸は、主に上皮性エンテロクロマフィン細胞（EC）によって産生され、腸および中枢神経系（CNS）に局所的および全身的な作用を及ぼすドーパミンやセロトニンなどの神経伝達物質の主要な産生場所として浮上している（9）。無胚芽（GF）マウスは、ストレス反応や恐怖の消滅学習に異常を示すが（10-12）、その一因は、このプロセスを促進する重要な腸内細菌が存在しないため、神経細胞シグナル伝達のための代謝産物や神経伝達物質の利用可能性が変化するためである。近年、神経発達障害の根底にある神経炎症の重要な制御因子としての腸内細菌について、さらに多くの証拠が明らかになってきた（13-15）。しかしながら、発達初期における腸内神経伝達物質の制御に関する理解は、まだ限られている。
セロトニン（5-ヒドロキシトリプタミン、5-HT）は、腸管運動、血小板機能、気分調節を制御することが知られている必須神経伝達物質である。5-HTはまた、炎症性腸疾患（IBD）や炎症性腸症候群(8)などの腸の炎症性疾患にも関与しているが、その一因は、5-HTが腸ニューロンに対して間接的に作用するためである。しかし、5-HTと腸管免疫細胞との間に直接的なクロストークが存在するかどうかは依然として不明である。現在のところ、腸における5-HT合成についての理解は成体動物の研究のみに基づいており、新生児腸における5-HTの制御と免疫機能は未解明のままである。
本研究は、新生児の腸内メタボロームが生後早期の免疫応答をどのように形成するかを解明することを目的とした。我々は、マウスの新生児小腸（SI）において、腸内メタボロームが神経伝達物質に富んでいることを明らかにした。すなわち、5-HTを直接産生すること、宿主のトリプトファン水酸化酵素1（TPH1）を誘導してトリプトファンから5-HTへの変換を促進すること、モノアミン酸化酵素Aをダウンレギュレートして5-HTの分解を制限することである。さらに、われわれのin vitroおよびin vivo研究は、5-HTが細胞内のインドール-3-アセタアルデヒドを増加させ、哺乳類ラパマイシン標的（mTOR）の活性化を阻害することによって、T細胞の代謝を直接変化させることを示している。このことは、in vitroおよび新生児SIにおけるin vivoの両方で、ヘルパーT細胞の活性化を抑制する一方で、制御性T細胞（Treg）の分化を促進する。最後に、新生児腸管における5-HT曝露が、食餌性抗原と腸内常在菌の両方に対して長期的な免疫寛容を与える抗原特異的Tregをもたらすことを示す。これらの結果を総合すると、新生児腸におけるユニークな神経伝達物質濃縮メタボロームと、腸内細菌由来の5-HTが生後早期の経口免疫寛容を促進するメカニズムが明らかになった。
結果
新生児腸内では神経伝達物質が濃縮されている
腸内常在細菌が主に産生する代謝産物（低分子）を総称する腸内メタボロームは、腸内細菌が宿主細胞に及ぼす影響を媒介する。しかし、SI、特に新生児における微生物叢とメタボロームについては、十分に特徴付けられていない。我々は、新生児期の野生型（WT）B6マウス（生後14日；P14）のSIに、特異的病原体フリー（SPF）条件下で飼育された成体マウス（8週齢以上）と比較して多様性が減少した、明瞭な微生物集団を見出した（図S1、A〜E）。ラクトバチルス属は新生児SIの細菌の90％以上を占め、新生児SIではラクトバチルス・ムリヌス（Lactobacillus murinus）がより豊富であった（図S1、DおよびE、表S1）。新生児（P14）および成体マウスのSI内腔内容物の非標的メタボロームプロファイリングにより、新生児SIのメタボロームが成体SIのメタボロームと大きく異なることが示された（図1A）。新生児SIで濃縮された代謝物は、セロトニン、ヒポタウリン、アセチルコリンなどの神経伝達物質だけであった（図1、BおよびC）。一貫して、セロトニン作動性シナプスやコリン作動性シナプス、タウリンやヒポタウリン代謝、トリプトファン代謝など、特定のKyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）パスウェイが新生児SIでアップレギュレートされ、新生児SIにおける特異的な代謝状態が再び浮き彫りになった（図1D）。これらの結果から、新生児SIでは腸内細菌叢とメタボロームが特異的であり、神経伝達物質が濃縮されていることが明らかになった。

図1. 新生児腸における神経伝達物質の濃縮。
(A）ハイスループットなメタボロミクス解析による、SPF成体および新生児マウスのSI管腔内容物中の約500代謝物のヒートマップ。(B)成体マウスと新生児マウスのSI管腔内容物に豊富に含まれる代謝物の倍数変化を表したボルケーノプロット。(C)ハイスループットのメタボロミクスデータから得られた成体および新生児のSIにおける特定の代謝物の濃度。(D)成体マウスと新生児マウスのSI内腔代謝物に関連するKEGGパスウェイの倍数変化を表すボルケーノプロット。すべてのデータは、n = 4匹の成体マウス（A）とn = 4匹の新生児マウス（N）による1つの独立した実験を表している。統計学的検定：(C)では対応のないt検定。**p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001。成体マウス年齢＞8週、新生児マウス年齢＝P14。表S2も参照。
新生児腸におけるセロトニン（5-HT）生合成は腸内細菌叢によって駆動される
成体マウスにおける5-HT生合成は、選択的な腸内細菌によって、ECにおいてトリプトファンを5-HTに変換するTPH1のアップレギュレーションを介して促進される(16)。しかし、新生児腸管における5-HT生合成の制御機構は、まだ明らかにされていない。我々は、5-HTの前駆体であるトリプトファンの濃度が同程度であるにもかかわらず、新生児の腸管では成人の腸管と比較して5-HTの濃度が高いことを見いだした（図2A）。しかし、5-HTの代謝産物である5-ヒドロキシインドール酢酸（5HIAA）は、新生児SIではほとんど検出されなかった（図2A）。SPF WT P14新生児のSI管腔内容物および組織中の5-HTレベルは、GF WT新生児と比較して高く、結腸管腔内容物ではより低かった（図2、B〜D、および図S2A）。新生児のSIにおける5-HTのレベルは、P4からP18にかけて約5倍増加した（図S2B）。一方、SPFとGFの成体管腔内容物では、同程度の5-HTレベルが検出された（図2B）。さらに、新生児と成人の結腸組織、血漿、脳、および母乳においても、SPFとGFの両条件で同程度の5-HTが検出されたことから、これらの組織における5-HTの生合成には、年齢も腸内細菌叢も関係ないことが示唆された（図S2、A～D）。P2からP18まで、SPF母乳中の5-HTレベルの増加は見られなかった（図S2D）。P14の時点でも、SPFとGFの両ダムの母乳中に同様のレベルの5-HTが検出された（図S2E）。これは、SPFマウスとGFマウスの血漿中の5-HTレベルが同程度であることと一致していた（図S2C）。なぜなら、母乳中の5-HTは主に血漿から来る可能性が高いからである（17）。これらの結果から、初期発生におけるSI 5-HT生合成の制御において、腸内細菌叢が重要な役割を果たしていることが明らかになった。

図2. 新生児腸におけるセロトニン（5-HT）生合成は腸内細菌叢によって駆動される。
(A）腸における5-HT合成経路と、成体および新生児のSIにおけるトリプトファン（Trp）、5-HT、5HIAAの濃度。(BおよびC）SPFおよびGF成体（8週齢以上）および新生児（P14）マウスにおける5-HTの濃度を、（B）SIおよび（C）結腸の管腔内容物のLCMSで測定した。(D）SPFおよびGF新生児マウスのSIにおける5-HTの免疫蛍光染色。(E）SPF/GF成体および新生体マウスのSIにおけるTph1、Maoa、Slc6a4遺伝子発現のRT-qPCR解析。(F）SPF新生児マウスのSIにおけるTph1とTph2の相対遺伝子発現のRT-qPCR解析。(G)SPFおよびGF新生児マウスのSIにおけるMAO-Aのウェスタンブロット解析および(H)免疫蛍光染色。(I) 新生児マウスのSIから分離した細菌の上清で処理したHT-29結腸細胞におけるTPH1：MAOAの発現比。細菌無添加のコントロール（細菌上清で処理しなかった細胞）と比較して有意性を示す；#はin vivo実験に使用した単離株を示す。(JおよびK) (J)図2Iの指定分離株でモノクローナル処理したP16 GF新生児マウスのSIにおけるTph1:Maoa発現比のRT-qPCR分析。(K）図2Iの指定分離株でモノクローナル化したP16マウスのSI内腔内容物中の5-HT濃度をELISAで測定した。(A）n＝4匹の成体マウス（A）およびn＝4匹の新生児マウス（N）による1回の独立した実験。B）、（C）、（E）および（F）のデータは、SPF成体およびSPF新生児についてはn＝6、GF成体についてはn＝8、GF新生児についてはn＝7の2つの独立した実験からまとめたものである。(G)SPFとGFについてn=4の2つの独立した実験の代表。 (I)各細菌実験についてn=1から3の2つの独立した実験。(J)と(K)のデータは、GFについてはn = 6、R. heylii AB21についてはn = 10、E. faecalis CD2についてはn = 11の2つの独立した実験からまとめた。統計学的検定：(A)と(G)は対応のないt検定、(B)から(E)はTukeyの多重比較検定による二元配置分散分析、(F)はMann-Whitney検定、(I)はDunnettの多重比較検定による一元配置分散分析。*p＜0.05、***p＜0.01、***p＜0.001、***p＜0.0001。成体マウス年齢＞8週、新生児マウス年齢＝P14。白いスケールバー、50μm。fig. S1および表S3も参照。
新生児腸内細菌叢はモノアミン酸化酵素Aの発現を阻害し、5-HTの分解を抑制する。
腸内細菌叢が新生児腸内の5-HT生合成を制御するメカニズムをさらに明らかにするために、我々は、トリプトファンから5-HTを合成する律速酵素であるTPH1の発現が、SPF WT新生児のSIでは、GF WT新生児のSIと比較して約2.5倍高いことを見出した（図2E）。5-HTを5-HIAAに変換するモノアミン酸化酵素A（MAO-A）は、P14のSPF WT新生児のSIでは有意に低いレベルで発現しており、P14のGF新生児のSIと比べると約15倍低かった（図2E、図S2、FおよびG）。さらに、タンパク質レベルでは、MAO-AはSPF新生児のSIと大腸の両方で、GF新生児のそれと比較して大幅に減少していた（図2、GおよびH）。対照的に、腸内細菌叢は、新生児結腸におけるTph1の発現（図S2H）、およびセロトニン再取り込みトランスポーター（SERT）をコードする遺伝子であるSlc6a4のSIおよび結腸での発現には無関係のようであった（図2Eおよび図S2H）。SPF新生児マウスのSI管腔内容物で処理したヒト結腸オルガノイドは、GF新生児マウス（図S2I）またはSPF成体マウス（図S2J）のSI管腔内容物で処理したオルガノイドよりも高いTPH1：MAOA発現比を誘導した。これらの結果から、新生児期の腸内細菌叢は、TPH1の発現を増加させ、MAO-Aの発現を減少させることにより、新生児期のSIにおいて5-HTを促進し、発育初期に腸内で5-HTを最大限に利用できることが示された。
概念実証として、ヒト大腸上皮HT-29細胞におけるTPH1およびMAOA発現の調節について、P14 WT B6マウスSIから分離された細菌をスクリーニングした。Rodentibacter heyliiと同定されたAB21（図2I）を含むいくつかの細菌単離株は、TPH1：MAOA比を最も高く誘導し、TPH1アップレギュレーターと呼ばれた（図2Iおよび表S3）。GF WT B6新生児は、P3でダムを経口接種することにより、AB21を間接的に単コロニー化することに成功した（図S1K）。P14の時点で、これらの新生児は、MAO-Aをアップレギュレートする細菌単離株（CD2；Enterococcus faecalis）で同様にモノクローナル化した新生児と比較して、高いTph1：Maoa比を示し、SIの内腔5-HTの量が増加した（図2のIからL、および図S2のLとM）。これらの知見は、新生児SIの細菌が、TPH1とMAOAの発現を調節することによって、部分的に5-HTの腸内利用能に影響を及ぼすことを示している。
腸内細菌は新生児腸における主要な5-HT産生者である。
腸クロム親和性細胞は成体腸における主要な5-HT産生細胞である(18)。しかし、新生児腸における5-HTの供給源は不明なままである。我々は、上皮細胞特異的Tph1欠損Tph1 fl/fl × Villin CreマウスとTph1 fl/fl同腹子P14マウスのSIと結腸の5-HTについて、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）と免疫蛍光染色により、同程度の5-HTレベルを検出した（図3、AおよびB、ならびに図）。このことは、成体腸とは対照的に、新生児腸ではECは主要な5-HT産生細胞ではないことを示唆している（図3C）。造血細胞は5-HT、特に肥満細胞を産生することが示されている(19, 20)。前膜（LP）肥満細胞（CD117+FcεRI+）は、SPFおよびGF WT P14新生児のSIにおいても同様に少なかった（図S3、BおよびC）。同様に、5-HTと肥満細胞マーカーであるアビジンに対する免疫蛍光染色では、SPFとGFのWT P14新生児のSIにおいて、5-HT+肥満細胞の数は同程度であった（図S3D）；このことは、5-HT産生肥満細胞がSPFとGFのSIの間の管腔5-HTの違いを説明しないことを示唆している（図2B）。同様に、P14 Tph1 fl/fl × Villin Creマウスとヘテロ接合体同腹マウスのSIには、同程度の数の5-HT+肥満細胞が見られた（図S3、EおよびF）。これらの結果から、成体腸とは異なり、ECや肥満細胞は新生児腸の5-HTレベルの上昇に寄与する5-HTの供給源ではないことが示唆された。

図3. 腸内細菌は新生児腸における主要な5-HT産生者である。
(A）Tph1fl/flVillincre新生児（2週齢）マウスまたはヘテロ接合体（Het）同腹仔マウスのSIにおける5-HTの免疫蛍光染色の代表画像と、5-HT染色細胞／組織の定量化。白いスケールバー、50μm。(BおよびC）Tph1fl/flVillincre成体マウスまたはHet同腹子のSI組織および管腔内容物中の5-HT濃度のELISA分析。(D）新生児マウスのSIから分離した細菌の上清中の5-HTのELISA分析。(E）5-HTを産生できる新生児マウスのSIから分離された細菌の割合。(F)抗生物質を投与していない健康な新生児の便から分離した細菌の上清中の5-HTのELISA分析。(G)抗生物質を投与していない新生児健常児の便から分離された細菌のうち、5-HTを産生できる細菌の割合。(H) 2週間後、AB25またはCD2分離菌でモノクローナル化したGF P2マウスのSI管腔内容物中の5-HT濃度のELISA測定。すべての実験のデータは、2回の独立した実験から集計した。(A)は各群n = 3。(B)では、Hetはn=7から12、Tph1fl/flVillincreはn=9から14。(C)では、各群n=5または6。統計学的検定：(A)は対応のないt検定、(B)は対応のないt検定およびWelchの補正を加えた対応のないt検定、(C)はMann-Whitney検定および対応のないt検定。**P < 0.01. 成体マウスは6週齢以上。新生児マウスは2週齢。fig. S2および表S3も参照。
大腸菌などの細菌がトリプトファンを代謝し、5-HTを生成することが以前に示されている(21)。新生児SIに5-HT産生細菌が存在する可能性を調べるため、我々はP14 SPF WT新生児から好気的および嫌気的に細菌を分離し、30を超える細菌分離株のライブラリーを作成した。規格化した細菌上清をELISA法で5-HTを測定したところ、ほぼ半数の細菌が5-HTを産生した（図3D）。5-HT産生細菌単離株の3分の1近くがR. heyliiで、さらに3分の1がEnterococcus gallinarumであった（図3Eおよび表S4）。以前の研究で、Rodentibacterはマウスの新生児腸内でP7からP14の頃に拡大し、急激に減少することが報告されている(22, 23)。5-HT産生Rodentibacterの時間的濃縮が、新生児腸内の5-HTレベルの上昇に寄与している可能性が高い。我々は、生後2週間の健康なヒト乳児（妊娠週数37週以上）の便検体から分離された細菌26株中16株が5-HTを産生することを示したが、これらの細菌は主に黄色ブドウ球菌、クロストリジウム・ペルフリンゲンス、クレブシエラ・グリモンティ、表皮ブドウ球菌、エンテロバクター・クロアカであった（図3、FおよびG）。比較すると、マウスの成体腸管腔内容物やヒトの成体便から分離された細菌では、5-HT産生菌の割合はより少なかった（図S3、G～I）。概念実証として、5-HT産生細菌がin vivoで新生児腸管内腔内の5-HTに寄与していることを示すために、TPH1を誘導しない5-HT産生細菌単離株（AB25）でGFマウスをモノクローナル化し（図2J）、これにより、5-HTを直接産生しないCD2でモノクローナル化したGFマウスと比較して、内腔の5-HTが増加することを示した（図3H）。これらの知見を総合すると、腸内細菌が新生児の腸における5-HTの主要な供給源であることが証明された。
5-HTは新生児SIにおいてin vitroおよびin vivoでT細胞応答を制御する
5-HTレセプターまたは5-HT再取り込みトランスポーター（SERT）は、造血細胞および非造血細胞を含む様々なタイプの細胞で発現している(20)。しかし、5-HTに関する臨床研究や動物実験のほとんどは成人を対象としており、幼少期における腸管由来の5-HTの生理的意義は、まだ十分に理解されていない。5-HTは以前、CNSにおけるTregの拡大を促進することが示された（24、25）。腸の5-HTが腸のT細胞反応に直接影響するかどうかはまだ不明である。我々は、P14 GFマウスのSIにおいて、SPF新生児と比較してLP Tregが選択的に減少していることを発見し（図4Aおよび図S5A）、新生児のSIにおけるTregの発生に腸内細菌叢が関与していることを示唆した。酪酸やプロピオン酸などの腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸（SCFA）は、Gタンパク質共役型受容体43（GPR43）依存的に大腸でTregを誘導することが知られているが（26）、新生児のSIでは成人のSIと比較してほとんど見られなかった（図4B）。同様に、SCFAシグナル伝達のためのGタンパク質共役型受容体GPR41およびGPR43を欠くトランスジェニックマウスであるSPF WTおよびFfar2-/-Ffar3-/-新生児マウスのSI（図4C）および大腸（図4Cおよび図S5B）において、Tregの数に差は見られなかったことから、新生児腸においてTregの発生を促進する腸内細菌叢のSCFA非依存的なメカニズムが示唆された。

図4. 5-HTは新生児SIにおいてin vitroおよびin vivoでTregの発達を促進する。
(A）SPF（n＝8）とGF（n＝9）の新生児（2週齢）マウスのSIと大腸のLPから単離したTregの代表的なフロープロット（上）とフローサイトメトリー解析（下）。(B）SPF成体（8週齢以上、n＝4）および新生児（2週齢、n＝4）マウスのSIにおける相対代謝物濃度のヒートマップ。(C) SPF WTマウス（n = 5）およびFfar2-/-Ffar3-/-新生児マウス（n = 5）のSIのLPから単離したTregのフローサイトメトリー分析。(D）PBSまたは5-HTを経口投与したGF新生児マウスの実験の概略図。(E）PBS（n＝10～12）または5-HT（n＝11または12）を経口投与したGF新生児マウスのSI LP細胞のフローサイトメトリー解析。(F）SSRI（フルオキセチン、1 mg/kg b.w.、n = 5）または水（n = 6）をP8からP18まで毎日ダムに経口投与したGF新生児マウスのSI LPから単離したCD4+細胞のフローサイトメトリー解析。(G) 5-HTで48時間刺激したマウス脾臓CD4+ T細胞のフローサイトメトリー分析（各群n = 3）。(H) in vitroで3時間5-HTで刺激したマウス脾臓T細胞の酸素消費率（左）と最大呼吸（右；AUCは40～60分の間で計算）のシーホースリアルタイム細胞代謝分析。 (I) 24時間5-HTで刺激したマウスナイーブCD3+ P-RPS6+脾臓T細胞のフローサイトメトリー分析（各群n = 4）。(J）5-HTまたはPBSで処理したマウス脾臓CD3+ T細胞の不偏代謝プロファイリングにより検出された細胞内代謝物の倍数変化を表すボルケーノプロット。(K) I3Aまたはビヒクルコントロールで24時間ex vivo刺激したmLN由来のP-RPS6+ナイーブCD3+またはナイーブCD4+ T細胞のフローサイトメトリー解析（各群n = 4または5）。(L）I3A（n＝3）またはビヒクルコントロール（n＝4）を経口投与したGF新生児マウスのSI LP細胞のフローサイトメトリー解析。(A)、(E)～(G)、(K)のデータは、2回の独立した実験から得られたものである。(C)、(H)、(I)、(L)のデータは2回の独立した実験の代表値。統計学的検定：(A)、(C)、(E)、(F)、(L)については、対応のないt検定、Welchの補正を加えた対応のないt検定、またはMann-Whitney検定。(G)、(I)、(K)については、Tukeyの多重比較検定またはHolm-Sidakの多重比較検定による一元配置分散分析。*p < 0.05, **p < 0.01, *** p < 0.001。新生児マウス年齢＝2週。fig. S3からS6も参照。
LC-MS分析によって得られたSPF新生児のSI管腔内容物中の5-HT濃度（図2B）に基づき、P8とP9で7.8μgの5-HTをGF新生児に経口投与し、P14でSIと大腸からLP細胞を単離した（図4D）。一貫して、5-HTを投与したGF新生児のSIでは、Tregの数が増加し、インターロイキン-17A陽性（IL-17A+）またはインターフェロン-γ陽性（IFN-γ+）T細胞の数が減少していることがわかったが、5-HTを投与したGF新生児の大腸では、これらの免疫細胞は変化しなかった（図4、EおよびF、ならびに図S5、CからE）。さらに、セロトニン再取り込み阻害剤である抗うつ剤フルオキセチンをGF群に経口投与すると、P14新生児のSIと大腸の両方で5-HTレベルが上昇した。同様に、大腸ではなくSIにおいて、Tregは増加したが、IL-17A+またはIFN-γ+ CD4+T細胞は減少した（図4Fおよび図S7、B～D）。
腸管5-HTが成体においても同様の効果を有するかどうかを調べるため、GF成体マウスに5-HT（40μg、マウス体重に比例）を2日間連続で経口投与したところ、投与1週間後には、5-HTはSI Tregsに影響を及ぼさなかった（図S5F）。同様に、P8からP9における早期の5-HT経口投与は、成体期に分析した場合、SI Tregsに持続的な変化をもたらさなかった（図S5G）。これらの所見から、腸内Tregに対する5-HTの効果は年齢に依存することが示唆される。さらに、5-HTがT細胞に直接影響を及ぼすかどうかを調べるために、脾臓T細胞を試験管内で5-HTと48時間インキュベートした。5-HTは、CD4+ T細胞（図4Gおよび図S6A）およびCD8+ T細胞（図S6B）の両方において、IFN-γおよびIL-17A産生を減少させる一方で、Tregを増加させた。総合すると、我々のデータは、5-HTがT細胞に直接シグナルを送り、in vitroおよびin vivoの新生児SIにおいてTregの発生を促進することを示している。同様に、P14で5-HT/リン酸緩衝生理食塩水（PBS）処理したGF新生児のSI組織のRNA配列決定では、Tph1やMaoaの発現や、Il6、Il10、Il12a、Il12b、Tgfb1からTgfb3を含むT細胞分化を歪める可能性のある自然サイトカインの発現に変化は見られなかった（図S6Eおよび表S5）。
栄養素は、抗原提示細胞やサイトカインが提示する抗原とは無関係に、異なるT細胞サブセットの細胞運命コミットメントと応答を制御する(27)。トリプトファンは、インドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼによってトリプトファンがキヌレニンに変換されるキヌレニン経路を介して、T細胞のエフェクター機能に影響を与えることが知られている（28）。シーホース（Seahorse）アッセイによって、5-HTとのインキュベーションがマウス脾臓T細胞の酸素消費量を減少させることを見いだしたことから、5-HTがT細胞の代謝を直接変化させることが示唆された（図4H）。 mTORシグナル伝達は、T細胞が適切な維持と活性化のために、免疫シグナルと代謝の合図を統合するのに重要である。抗原認識はmTOR活性化の引き金となり、Tヘルパー1（TH1）、TH2、TH17エフェクター細胞の分化を促進する一方、Tregの発達を抑制する（29, 30）。我々は、5-HTと24時間インキュベートした脾ナイーブCD4＋またはCD8＋T細胞は、mTOR経路活性化のバイオマーカーであるリン酸化リボソームタンパク質S6（P-RPS6）のレベルが低いことを見出した（図4I、図S6、CおよびD）（31）。5-HTが哺乳類ラパマイシン標的複合体1（mTORC1）の活性化を阻害するメカニズムをさらに解明するために、20μMの5-HTとin vitroでインキュベートした3時間後のT細胞の細胞内代謝物を測定した。5-HTで処理したT細胞では、ビヒクル処理したT細胞と比較して50種類以上の細胞内代謝物が上昇し、中でもインドール-3-アセトアルデヒド（I3A）が最も有意な上昇を示した（図4Jおよび表S6）。細胞内I3Aの増加が、5-HTを介したmTORC1活性化の阻害を促進するかどうかを調べるため、試験管内でT細胞をI3Aとインキュベートしたところ、mTORC1活性化が減少することがわかった（図4K）。さらに、P8およびP9のGF新生児にI3Aを経口投与すると（5-HTについては図4Dと同様）、Tregが増加し、P14のSI（図4Lおよび図S6F）および大腸（図S6G）におけるmTORC1活性化が抑制された。このことから、5-HTはI3AによるmTOR経路の阻害を介してT細胞の代謝状態を変化させ、T細胞の活性化を低下させながらTregの拡大をもたらすことが示唆される。
幼少期における腸管5-HTへの曝露は、食事性抗原に対する長期的な経口免疫寛容に寄与する。
食事性抗原に対する経口免疫寛容は生後早期に確立されるが、これは腸管Tregによって一部促進される(32)。5-HTが新生児の食餌性抗原に対する経口免疫寛容に寄与しているかどうかを調べるために、GF新生児にP8およびP9で5-HTを経口投与し、P12、P15、P18、およびP21でダムにオバルブミン（OVA）を経口投与して感作し、5週齢でOVAを皮下投与し、7週齢で再チャレンジし、最後に3日後に安楽死させた（図5A）。5-HT処理マウスは、PBS処理マウス（感作もチャレンジも同様）および5-HT処理もOVA感作もしなかった対照マウスと比較して、血漿中の抗OVA免疫グロブリンG（IgG）抗体および抗OVA IgE抗体が低かった（図5B）。血漿中OVA特異的IgM抗体が5-HT投与マウスで低いという同様の傾向が見られた（図S8A）。OVAでチャレンジした5-HT処理マウスでは、脾臓のIFN-γおよびIL-4産生CD4+ T細胞、マクロファージ、好中球の減少（図5Cおよび図S8B）、および腸間膜リンパ節（mLN）のB細胞の有意な減少が認められた（図S8C）。

図5. 新生児腸管における5-HTは経口抗原に対する長期的な免疫寛容を促進する。
(A）OVAに対する経口耐性モデルマウスの模式図。(B）血漿中のOVA特異的IgGおよびIgEのELISA分析、（C）OVAに対する経口耐性モデルマウス（Ctrlではn＝3〜7、PBSではn＝5〜10、5-HTではn＝5〜9）の脾臓中の免疫細胞のフローサイトメトリー分析。(D）5-HTまたはPBSで処理したOVA感作マウスの脾臓およびmLNから単離したTreg（CD45+CD3+CD4+CD25+CD44hiCD62Llo）を、次にOVAにチャレンジさせた新しいGFマウスに養子移入したマウスモデルの概略図。(E）（D）に示したマウスモデルで使用したマウスの血漿中のOVA特異的IgGのELISA分析（1群あたりn＝5または6）。(F）5-HTまたはPBSで処理したOVA感作GFマウスにHAインフルエンザタンパク質をチャレンジしたマウスモデルの模式図。(G) (F)のマウスモデルで使用したマウスの血漿中のHA特異的IgGのELISA分析(n = 4/群)。(B)、(C)、(E)のデータは2つの独立した実験から得られた。(G)のデータは2つの独立した実験の代表値である。B）、（C）、（E）については、Tukeyの多重比較検定またはHolm-Šidákの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を行った。(G)については、未補正のフィッシャーのLSD多重比較検定を用いた二元配置分散分析を行った。*p<0.05、**p<0.01。fig. S7.
食餌性アレルゲンに対する5-HT媒介長期免疫寛容におけるTregの役割をさらに証明するために、P8およびP9で5-HTまたはPBS対照を経口投与し、その後P12からP21の間に同じダムを介してOVAを毎日経口感作したP35 GFマウスからTreg（CD4+CD25+CD62L-CD44 high）を単離した（図5D）。これらのマウスから単離されたトレグ（その一部はOVAに特異的であると予想される）を、成体の非感作GFマウスに養子移入し、その後OVAを皮下投与した。Tregの養子移植とOVAチャレンジの17日後、5-HT処理したドナーマウスから単離したTregを移植したマウスでは、抗OVA血漿中IgGが有意に減少していることがわかった（図5E）。さらに、このことが5-HT処理マウスにおける全般的な免疫抑制を反映しているのか、あるいは5-HT処理直後に感作された食餌性抗原（この場合はOVA）に対する免疫反応の抗原特異的抑制を反映しているのかを検討するため、5-HT/PBS処理およびOVA感作GFマウスが成体になった時点で、インフルエンザヘマグルチニン（HA）を皮下チャレンジした（図5F）。血漿中の抗HA IgGは両群とも同レベルであった（Fig.） これらの所見を総合すると、生後間もない時期に腸管5-HTに暴露されると、Tregを介した長期的な食事性抗原に対する全身性抗原特異的免疫寛容がもたらされることが示唆される。
新生児期の腸管5-HTは腸内常在菌に対する免疫寛容を促進する
SIにおけるTregは、腸内常在菌に対する免疫寛容を促進する(8, 33, 34)。常在細菌に対する寛容の確立には、発生初期におけるTregの適切な誘導が重要である（35, 36）。新生児の腸内における5-HTの存在量の増加が、常在細菌に対する免疫寛容の確立に関与するかどうかを調べるために、5-HTをP8からP9までGF WT新生児マウスに経口投与した（図6A）。P14の時点で、ダムはSPF WT B6 P14新生児のSIおよび結腸腔内容物を経口投与され、腸内常在細菌のコロニー形成と、これらの細菌がダムと同居していたPBSまたは5-HT処理した同腹子への移行を可能にした。2週間後、両群の同腹子の細菌コロニー形成は同等であることが確認された（図S9A）。GFマウスおよびPBS処理同腹仔と比較して、5-HT処理同腹仔は、大腸においてTregの存在量が多く、TH17細胞の存在量が少なく（図6B）、mLNにおいてTH17細胞の存在量が少なかった（図6C）。さらに、サイトカイン産生T細胞、B細胞、樹状細胞を含む他の免疫細胞の存在量が、GFおよびPBS処置新生児マウスと比較して、5-HT処置新生児マウスの腸（図S9、BおよびC）およびmLN（図6Cおよび図S9D）では低いことがわかった。

図6. 新生児腸管における5-HTは腸内常在菌に対する免疫寛容を促進する。
(A）常在菌に対する免疫寛容における5-HTの役割を調べるための実験デザインの概略図。P8およびP9で、同じ産仔のGF新生児に5-HTまたはPBSを経口投与し、P28まで同居させた。P14で、生物学的母親にP14のSPF WT新生児の腸管腔細菌と糞便細菌を経口投与した（細菌を子孫に移行させるため）。すべてのマウスを同じケージに入れた。P28で、腸管免疫細胞とマイクロバイオームを解析した。(BおよびC）5-HTまたはPBSを投与され、常在菌でコロニー形成されたGFマウスの（B）SIおよび（C）結腸の薄層前膜から得られた免疫細胞のフローサイトメトリー解析。(D) PBSまたは5-HTを投与したマウスの腸内細菌叢の16S rRNAシーケンスデータのNMDS解析（各群n = 4または5）。(EおよびF）5-HTまたはPBSを投与したマウス（1群あたりn＝4または5）のSIおよび大腸における（E）属の相対存在量、（F）LDAおよび特定細菌の相対存在量（ラベルは最も相同性の高い細菌を示す）の16S rRNA配列決定データ。(G）T細胞性大腸炎モデルマウスの模式図。ナイーブT細胞（CD45+CD3+CD44loCD62Lhi）を脾臓およびmLNから単離した。(H)T細胞性大腸炎モデルマウス（各群n = 4）の大腸と大腸長。(I）T細胞性大腸炎モデルマウス（各群n = 4）のmLNからの免疫細胞のフローサイトメトリー解析。*p < 0.05, *p < 0.01。(B)と(C)のデータは2つの独立した実験から集計した。(D)から(F)、(H)、(I)のデータは2回の独立した実験の代表値。実施した統計検定：(B)と(C)はHolm-Šidákの多重比較検定またはDunnの多重比較検定による一元配置分散分析、(H)と(I)は対応のないt検定。図も参照。S8.
さらに、5-HT曝露による免疫応答の変化が腸内細菌叢に影響を及ぼすかどうかを調べるため、P28における腸管腔内容物の16SリボソームRNA（rRNA）配列決定を行った。その結果、P14で同じ生物学的堰から腸内細菌を獲得し、出生後P28まで同居させたPBS-と5-HT-処置の同腹子の間で、腸内細菌叢がSIと大腸の両方で異なっていることがわかった（図6、D～F）。菌種レベルでは、5-HT処理児の大腸では、Muribaculum intestinaleを含むMuribaculum sp.とParabacteroides goldsteiniがより豊富であり、Bacteroides acidifaciensとBacteroides uniformisはより少なかった（図6F）。Heminiphilus faecisの増加は、5-HT処理児の大腸とSIの両方で認められた（図6F）。
幼少期の微生物コロニー形成時に5-HTに暴露されることで、腸内T細胞が常在菌に対する免疫寛容につながるかどうかを調べるため、P35で5-HTまたはPBSを投与し、その後通常化したマウスから腸ナイーブT細胞を単離し、これをRag2-/-レシピエントマウスに養子移入した（図6G）。その9週間後、5-HT処理したドナーマウスのT細胞を導入したRag2-/-レシピエントマウスでは、結腸の短縮が抑制され（図6Hおよび図S9E）、mLNにおけるIL-17A+CD4+T細胞の数が減少した（図6I）。T細胞駆動性大腸炎のこのモデルを用いた我々の観察は、微生物のコロニー形成中に5-HTが存在することで、常在細菌に対してより寛容な性質を持つ腸T細胞が刷り込まれることを示唆している。これらの知見を総合すると、新生児腸管における常在細菌に対する免疫ランドスケープと免疫応答の形成において、5-HTが重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
考察
発育初期における腸内微生物のコロニー形成は、免疫系を形成する重要な原動力である(36, 37)。発育初期の腸内メタボロームと免疫細胞の相互作用を通じて、このプロセスがどのように促進されるのかについての理解は限られている。本研究では、神経伝達物質が豊富な新生児腸内メタボロームが明らかになった。5-HTやアセチルコリンを含むこれらの腸内由来神経伝達物質が、新生児腸内やそれ以降において免疫系に与える影響については、まだこれ以上解明されていない。これらの神経伝達物質のうち、5-HTの生合成の制御と、発育初期における腸管免疫細胞への影響については、まだほとんど解明されていない。我々は、新生児マウスの腸において、ECの代わりに腸内細菌が5-HTの主要な供給源であることを実証した。腸内細菌はさらに、MAO-Aをダウンレギュレートして5-HTの分解を制限することにより、新生児腸における5-HTの利用可能性を最大化する。我々の結果はまた、5-HTがT細胞の代謝を直接変化させ、Tregの分化を促進し、それによって食餌性抗原と常在細菌の両方に対する長期的な免疫寛容をもたらすことを示している。以上の結果から、新生児期の腸内細菌由来の5-HTは、食事性抗原や常在菌に対する代謝の改変を介してT細胞応答を形成し、生後早期の重要な免疫寛容を促進することが明らかになった。
栄養吸収の主要な部位として、SIはまた、糖、脂肪、タンパク質、ミネラルなど、SIで利用可能なユニークな栄養素で繁栄する多様な腸内細菌叢を保有している。糞便微生物叢とその健康および疾患における役割を特徴づける文献が増加しているにもかかわらず、ヒトのSIの微生物叢については、SIの内容物のサンプリングが困難であるため、依然として十分な研究がなされていない(38)。生後早期のSIの微生物叢は、さらに理解されていない。マウスの新生児SIにおける主要な神経伝達物質のユニークな濃縮の同定は、新生児の微生物叢とメタボロームを調査し理解するための独自の努力の必要性を強調している。近年の研究により、腸が神経伝達物質生成の主要な場であり、主に特殊な上皮ECによって生成されるという有力な証拠が得られている(9)。新生児期の腸内に豊富に存在する神経伝達物質は、腸内だけでなく腸外でも、発育初期におけるこれらの重要な神経伝達物質の需要を支えるために重要なのかもしれない。新生児腸内の神経伝達物質が増加することによる進化的な利点については、まだ調査中である。アセチルコリンは、我々が新生児腸内で増加していることを発見した神経伝達物質のひとつである。杯細胞上のムスカリン性Ach受容体4（mAChR4）に作用することで、アセチルコリンは新生児腸内で杯細胞関連抗原通路の形成を誘導し、Tregの誘導と食事性抗原に対する寛容をもたらす(39)。腸由来の神経伝達物質は通常、血液脳関門を通過できないが、血小板を介した5-HTの腸管外輸送など、様々なメカニズムで全身に循環することができる。腸管神経系（ENS）の発達は、幼少期の微生物コロニー形成と腸管免疫系の両方から影響を受ける(40)。ENSは、CNSとは独立して、腸の運動などの消化管行動を制御している(41)。ENSニューロンは生後早期に形成され、マウスではP21まで続くので、ENSの発達は新生児SIにおける神経伝達物質の利用可能性の増加の影響を受けている可能性がある。新生児期の腸における神経伝達物質利用能の向上が進化的にもたらす恩恵を理解することで、生後早期の主要な神経伝達物質の不均衡に起因する消化管障害に光が当てられるかもしれない。また、今回の研究結果は、発育初期の抗生物質への曝露が、新生児腸におけるこれらの重要な神経伝達物質の利用可能性にどのような影響を及ぼすかを調査する必要性を強調している。
すなわち、5-HTの直接産生、TPH1の誘導（GF新生児SIの約2.5倍）、5-HTの分解を阻害するMAO-Aのダウンレギュレーションである。我々の研究で示されたように、RodentibacterはP14新生児における主要な5-HT産生菌の一つである。5-HT産生菌が新生児腸内に濃縮され、新生児腸内の5-HTレベルの上昇に寄与しているという我々の考えを支持するものとして、以前の研究で、マウスの新生児腸内ではP7からP14の頃にRodentibacterが特異的に濃縮されることが示された(22)。対照的に、成体腸における5-HTは主にTPH1を介してECによって産生され、MAO-Aの発現は新生児腸よりもはるかに高く、後者が成体腸における5-HTレベルの低下に寄与していると考えられる。われわれの研究では、腸内細菌叢は成体マウスのSIと結腸の両方で5-HT合成に必要でないことがわかった。先行研究では、腸内細菌叢がECにおけるTPH1の発現を誘導し、成体マウスの結腸における5-HTを促進することが報告されている(16)。これらの知見を総合すると、新生児の腸における5-HTの利用可能性を高めるために、新生児特有の腸内細菌がより深い役割を担っていることが、メカニズム的に説明され、強調されている。
これまでの研究で、多発性硬化症（MS）患者やMSの動物モデルにおいて、5-HTがIFN-γとIL-17の産生を減少させ、Tregを促進することが報告されており（41, 42）、5-HTが中枢神経系におけるT細胞応答を調節する直接的な役割を担っていることが示唆されているが、そのメカニズムはまだ不明である。我々の発見は、5-HTの免疫調節機能が新生児の腸にまで及んでいることを示唆しており、そこでは5-HTのレベルは成人の腸や脳におけるレベルをはるかに上回っている。我々は、新生児に5-HTを経口投与した後にOVA感作を行うと、成体になってからのOVAに対する長期的な免疫寛容が促進されることを見出したが、これは抗原特異的な方法でTregに依存しているようである。同様に、5-HTで処理したGF新生児由来の腸内T細胞をP14腸内細菌で感作した後、Rag2-/-マウスに養子移入すると、腸の炎症がより少なく誘導された。このことは、これらのT細胞が腸内常在菌に対してより寛容な状態にあることを示唆している。さらに、5-HTを投与した通常化マウスでは、新生児の腸内細菌叢が著しく変化していることがわかった。これは、腸内細菌に対するT細胞の応答が偏っていることが一因かもしれない。5-HTは新生児の腸内細菌にも直接影響を与える可能性があり、おそらく特定の腸内細菌によって直接利用されることで、これらの細菌の体力や存在量が変化するのかもしれない。この可能性については、今後の広範な調査が必要である。
成体マウスの腸管トレグに対する5-HT処理の効果は見られなかったことから、新生児腸管で観察された免疫寛容を促進する5-HTの効果は、発生初期に限定されるようである。成体腸では、短鎖脂肪酸のような他の代謝産物がTregを促進する冗長な機能を持っている可能性が高い。Clostridiales属やBacteroidales属のような繊維素発酵細菌は、マウスでは少なくとも生後16日目までは結腸（そしておそらくSIにも）強固にコロニー形成することができない(43)。このことは、新生児の腸内細菌叢、メタボローム、免疫細胞間のユニークな相互作用をさらに強調するものである。
5-HT処理T細胞におけるmTORC1の活性化と酸素消費量の減少、および5-HT処理T細胞内の細胞内代謝産物の変化、特にI3Aは単独でin vitroおよびin vivoにおけるmTORC1の活性化を阻害することができる。mTORの活性化を阻害すると、Foxp3+ Tregが分化し、TH1、TH2、TH17の分化が抑制される(27, 44)。われわれの研究は、5-HTシグナル伝達をT細胞内のmTORC1阻害に結びつける5-HT媒介性T細胞細胞内代謝産物、すなわちI3Aを同定した。腸内細菌は新生児腸内の5-HTの主要な供給源であるようなので、われわれの発見は、免疫寛容を促進するために新生児腸内でT細胞の代謝と活性化を変化させる腸内細菌主導のメカニズムを明らかにするものである。I3Aは腸内細菌によっても誘導することができ、腸内細菌異常症と上皮漏出を抑制し、腸内細菌叢を変化させることが示されている(45, 46)。AhRリガンドであるI3Aをin vivoで投与すると、上皮細胞など他の細胞にも影響を与え、それが腸T細胞に間接的な影響を与える可能性がある。5-HT系T細胞内の細胞内代謝物の代謝プロファイリングから、T細胞はI3Aを内在的に産生することが示された。このことは、T細胞由来のI3AがT細胞に対してオートクライン様式で作用を及ぼす可能性を示唆している。I3AとmTORC1との分子的関連、およびこの文脈におけるAhRの役割を解明するためには、さらなる研究が必要である。
5-HT1、5-HT2、5-HT2、5-HT7クラスのセロトニン受容体がT細胞に発現している(20)。T細胞に対する5-HTの作用を媒介する上で、これらの受容体の間に冗長性がある可能性がある。我々は、5-HTで処理したT細胞において、細胞内の5-HTが劇的に増加していることを見いだしたが、これは5-HTが、まだ同定されていないトランスポーターを介してT細胞に取り込まれる可能性を示唆している。T細胞に対する5-HTの作用を媒介する5-HT受容体、あるいはおそらくトランスポーターを同定するためには、今後の研究が必要である。さらに、我々の知見は、新生児SIと結腸におけるTregの誘導に本質的な違いがあることを示唆している。代謝の変化は、新生児SIにおけるTregにより大きな影響を及ぼす可能性があり、Tregの発達は、新生児結腸における腸内細菌叢と抗原提示により依存する可能性がある。新生児SIと大腸におけるT細胞の代謝調節に差がある可能性を支えるメカニズムについては、さらなる調査が必要である。最後に、我々はSIと結腸の両方で、新生児の微生物叢に劇的な変化を発見した。腸内常在菌であるTuricibacter sanguinisは、5-HTを直接取り込むことが以前に示された(47)。新生児期の腸内細菌の中には、5-HTを直接利用できるユニークな細菌が存在し、そのコロニー形成や存在量が変化する可能性がある。この重要な疑問を解決するには、今後広範な研究が必要であろう。
生後早期に確立された経口免疫寛容は、一部は腸管トレグによって媒介されるが、食餌性抗原に対する局所的および全身的な免疫無反応性を維持するために重要である（33, 36, 48, 49）。我々の研究で示されたように、5-HTが口腔抗原に対する抗原特異的免疫寛容を長期的に促進する効果は、部分的にはTregの誘導を通じたものであり、新生児期の腸内細菌によって促進される、生後早期の腸内5-HTの利用可能性の増大が進化的にもたらす利点の一例を示している。新生児腸内のSIと大腸のT細胞に対する5-HTの効果の差は、新生児腸内の異なる区画におけるT細胞の制御における本質的な違いを示唆しているのかもしれない。新生児のSIと結腸におけるT細胞の代謝制御の差異を解明するためには、今後の研究が必要である。最後に、5-HTが誘発する新生児腸内細菌叢の変化は、新生児腸管免疫細胞の発達を独立して形成する可能性があるが、さらなる調査が必要である。総合すると、我々の研究は、新生児腸におけるユニークな神経伝達物質濃縮メタボロームを実証し、免疫寛容を促進する新生児腸における5-HTの免疫機能を解明した（図S9の提案モデル）。われわれの結果は、おそらく発生初期には、腸はそれ自体で十分な5-HTを作る能力を十分に備えており、新生児特有の腸内細菌が5-HTを供給する重要な役割を果たしていることを示唆している。今回の知見は、5-HTを含む新生児期の腸内細菌異常による神経伝達物質の不均衡と、その後の人生における腸炎症性疾患およびおそらくは全身性自己免疫の発症との間に潜在的な関連性があることを示唆するものであろう。
材料と方法
研究デザイン
本研究の目的は、新生児期の腸内メタボロームが生後早期の免疫応答をどのように形成するかを調べることである。新生児および成体マウスのSIの代謝物をアンターゲットプロファイリングし、新生児SIに濃縮された代謝物とその細胞源を同定し、in vitro試験によってそれらの免疫機能を評価し、最後に経口抗原（OVA）または腸内常在菌に対する免疫寛容モデルマウスを用いてin vivoでの免疫への影響を検証した。
マウス
WT C57BL/6マウスは、もともとJackson Laboratoryから購入し、Zeng研究所でGFまたはSPFの両条件下で維持・拡大した。Tph1fl/flマウス（C57BL/6バックグラウンド）はD. Artisから提供された（50）。Villincreマウス（C57BL/6バックグラウンド）はJackson Laboratoryから購入した。Tph1fl/flVillincreマウスはTph1fl/flとVillincreを交配して得た。Faar 2 -/- Faar -/-マウスはB. T. Layden（University of Illinois at Chicago）から提供された。すべての実験に同数の雌雄マウスを用いた。すべての動物実験はWeill Cornell MedicineのInstitutional Animal Care and Use Committeeの承認を得た。
ヒトの便検体
生後2週間で、抗生物質による治療を受けたことがなく、NewYork Presbyterian/Weill Cornell MedicineのWell Baby Nurseryに入院していた満期乳児の便検体は、NewYork Presbyterian-Weill Cornell Medicine Institutional Review Board（#20-04021833）によって承認された研究の一部であった。
MAO-Aのウェスタンブロット
組織をプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を加えたRIPA緩衝液中でホモジナイズし、組織溶解液を回収した。ライセート中のタンパク質濃度は、Pierce BCA Protein Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて測定した。ライセートを正規化し、SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動ゲル（Invitrogen）を用いて分解し、ポリフッ化ビニリデン膜（Bio-Rad Laboratories）に転写した。膜は3％脱脂乳を用いて室温で1時間ブロッキングし、ウサギ抗マウスMAO-A抗体（1：500、Abcam）で4℃で一晩プローブした。膜をヤギ抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）抗体（1:1000, Invitrogen）で室温で1時間プローブした。SuperSignal West Pico PLUS化学発光基質（Thermo Scientific）をメンブレンに添加し、ChemiDoc XRS+ 分子イメージャー（Bio-Rad Laboratories）を用いてブロットを画像化した。ローディングコントロールとしてβ-アクチンを用いた。タンパク質バンドのデンシトメトリー解析は、ImageJソフトウェアを用いて行った。
5-HTのELISA
組織中の5-HTを測定するために、ヤギ抗5-HT抗体（Abcam、1:500）を96ウェルELISAプレート（Nunc MaxiStopフラットボトム96ウェル、Thermo Scientific）に4℃で一晩コートした。マウスの組織またはヒトの便については、サンプルを1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含む滅菌PBS中でホモジナイズし、15,000rpmで1分間遠心分離した後、ペレットを除去することにより、残骸／マウス細胞から分離した。細菌からの上清については、培養液を108 CFU/mlに標準化し、6000 rpmで5分間遠心した後、0.22μmフィルターを用いて通過させた。上清（100μl）を各ウェルに4℃で一晩添加した。洗浄後、1%BSA含有PBSで希釈したラット抗5-HT抗体（Novus Biologics、1:1000）100μlを各ウェルに添加し、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、ヤギ抗ラット HRP 標識 IgG（Bethyl Laboratories、1:10,000）をプレートに添加し、室温で 1 時間インキュベートした。洗浄後、One-step Ultra TMB ELISA 基質（Thermo Scientific）を添加し、プレートを 5 分間インキュベートした後、停止液（Invitrogen）を添加した。吸光度はSpectraMaxプレートリーダーを用いて450nmで測定した。
細菌の単離とサンガー配列決定
SPF WT新生(2週齢)マウスの腔内内容物を嫌気槽内で採取し、PBSに溶解した。その後、内容物を溶解し、BHI、コロンビア培地、または5％ヒツジ血添加トリプシン大豆、MRSブロスに連続希釈し、それぞれの寒天培地にプレーティングした。嫌気性菌の分離には、プレートを37℃の嫌気チャンバーに入れた。好気性細菌の分離には、プレートを37℃のインキュベーターに入れた。細菌を一晩または最長72時間まで増殖させ、単一コロニーを摘出し、それぞれの増殖培地に入れた。細菌はその後対数相まで増殖させ、下流の用途に使用した。細菌DNAは、E.Z.N.A Stool DNA kit（Omega Bio-Tek Inc）を用いて、製造業者の指示に従って単離した。16S rRNA遺伝子は、8Fおよび1492Rユニバーサルプライマー(51)を用いてポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で増幅した。PCR産物をGENEWIZ（Azenta Life Sciences）に提出してサンガー配列決定を行い、Microbial Nucleotide BLAST（NCBI）を用いて細菌分離株を同定した。
細菌単離上清によるHT-29細胞の処理
HT-29細胞を24ウェルプレートに10,000細胞/ウェルで播種し、5％CO2雰囲気下、37℃のインキュベーター内で、10％FBS（ギブコ）と1％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加したMcCoy's 5A（改変）培地（ギブコ）に溶解した22μm濾過上清（107CFU相当）で処理した。24時間後、細胞を洗浄し、Trizol試薬（Invitrogen社製）を用いて、製造者の指示に従って全RNA単離のために細胞を採取した。
GF新生児／産婦における分離細菌のコロニー形成
AB21、AB25およびCD2は、SPF P14マウスSIから分離したものである（図2Iおよび表S3）。AB21およびAB25はBHI液体増殖培地で好気的条件下で増殖させた。CD2はコロンビア液体ブロス培地で37℃、一晩嫌気培養した。翌日、細菌を滅菌PBSに再懸濁し、106個の細胞をP2のGFダムに経口投与した。2週間後、さらなる分析のために新生児を安楽死させた。
マウス腸管LP細胞の単離
マウス腸を摘出し、残存する脂肪組織から洗浄し、氷冷PBS（Corning）で洗浄した。腸を縦に開き、氷冷PBSで洗浄した。上皮細胞の解離は、5mM EDTA（Thermo Fisher Scientific）、1mMジチオスレイトール（DTT）（Sigma-Aldrich）、および2％熱不活性化ウシ胎児血清（FBS）を含むHanks' balanced salt solution（Sigma-Aldrich）中、37℃で15分間、撹拌しながらシェーカー上でインキュベートすることにより行った。解離した細胞を70μmのセルストレーナーで濾過し、1回洗浄した後、組織を小片（～2mm）に切断し、ディスパーゼ（0.4U/ml；Thermo Fisher Scientific）、コラゲナーゼIII（1mg/ml；Worthington）、デオキシリボヌクレアーゼ（DNase）I（20μg/ml；Sigma-Aldrich）を含むバッファー中、10％FBSを含むRPMI培地（Sigma-Aldrich）で37℃、20～30分間酵素消化した。40/75％パーコール勾配遠心（Cytiva社製）により、20分間、2000rpmで、ブレーキをかけずに、白血球をさらに濃縮した。
GF新生児マウスにPBSまたは5-HTを経口投与した。
GF WT新生児マウスに、P8およびP9で50μlの5-HT（12.5μg/ml）またはビヒクル（PBS）を経口投与した。その後、P14でマウスを安楽死させ、LP免疫細胞のさらなる解析のためにSIと結腸の組織を採取した。細胞はフローサイトメトリー（以下の方法）を用いて分析した（図4Dの模式図）。
マウス脾臓細胞の非標的代謝物プロファイリング
SPF WT B6マウスを安楽死させ、脾臓を採取した。脾臓細胞を単一細胞懸濁液に処理し、ACK溶解バッファーで赤血球を溶解し、PBSですすいだ。細胞を抗CD3-APC抗体（Invitrogen）と氷上で20分間インキュベートし、PBSですすいだ。次に細胞を抗APC MACS Microbeads（Miltenyi Biotec）と氷上で10分間インキュベートし、PBSですすいだ。製造元の指示に従って、細胞をMACSビーズカラムに通した。残ったCD3+ T細胞を、PBS（ビヒクルコントロール）または20μM 5-HTとともに、10% FBS添加RPMI培地中、37℃、5% CO2雰囲気下で3時間培養した。3時間後、細胞をPBSで洗浄し、2000rpmで5分間遠心した。この洗浄ステップを5回以上繰り返した。最後の洗浄後、細胞ペレットをWeill Cornell Proteomics & Metabolomics Core Facilityに渡し、サンプル調製と非標的代謝物プロファイリングを行った。代謝物は親水性相互作用クロマトグラフィー（HILIC）で分離し、高分解能質量分析計で検出し、代謝物の同定は既述の方法で行った（52）。
GF新生児マウスへのI3A経口投与
GF WT新生児マウスに、P8およびP9で50μlのI3A（300μM）またはビヒクル（重亜硫酸ナトリウム）を経口投与した。その後、P14でマウスを安楽死させ、LP免疫細胞のさらなる解析のためにSIおよび結腸組織を採取した。細胞はフローサイトメトリーを用いて分析した（以下の方法）。
OVAに対する経口耐性
GF WT新生児マウスに、P8およびP9で50μlの5-HT（12.5μg/ml）またはビヒクル（PBS）を経口経管投与した。その後、新生児がP12、P15、P18、P21のときに、200μgのOVA（Sigma-Aldrich）を200μlのPBSに溶解したものを経口投与し、新生児マウスを母乳を介してOVAに感作させた。P28でマウスはダムから離乳した。マウスが5週齢になったとき、フロイント完全アジュバントに溶解した100μgのOVAを足蹠皮下注射でチャレンジした。マウスが7週齢になったとき、フロイント不完全アジュバントに溶解した50μgのOVAを足蹠皮下注射で再チャレンジした。再チャレンジの3日後、マウスを安楽死させ、血液と脾臓を採取し、それぞれOVA特異的抗体とフローサイトメトリーによる免疫細胞の特徴をさらに解析した。
Treg養子移入とOVAチャレンジ
GF WT新生児マウスに、P7およびP8で50μlの5-HT（12.5μg/ml）またはビヒクル（PBS）を経口経口投与した。その後、新生児がP12、P15、P18、P21のときに、200μgのOVA（Sigma-Aldrich）を200μlのPBSに溶解したものを経口投与し、新生児マウスが母乳を介してOVAに感作されるようにした。マウスはP35で安楽死させた。トレグ（CD45+CD3+CD4+CD25+CD44hiCD62Llo）は、BD Melodyを用いた蛍光活性化細胞選別（FACS）によって脾臓およびmLNから収集した（以下の方法を参照）。その後、Treg（～50,000細胞）を腹腔内注射で新しいGF WT成体マウスに養子移入した。移植当日、マウスはフロイント完全アジュバントに溶解した100μgのOVAを足蹠皮下注射でチャレンジした。養子縁組から2週間後、フロイント不完全アジュバントに溶解した50μgのOVAを足蹠皮下注射で再チャレンジした。再チャレンジの3日後、OVA特異的抗体のさらなる分析のために血液を採取した。
OVA感作とHA-インフルエンザタンパク質によるチャレンジ
GF WT新生児マウスに、P7とP8で50μlの5-HT（12.5μg/ml）またはビヒクル（PBS）を経口経管投与した。その後、新生児がP12、P15、P18、P21のときに、200μgのOVA（Sigma-Aldrich）を200μlのPBSに溶解したものを経口投与し、新生児マウスが母乳を介してOVAに感作されるようにした。P28でマウスはダムから離乳した。マウスが5週齢になったとき、マウスに適応したH1N1インフルエンザのA/Puerto Rico/8/1934（PR8）株（F. Krammerの研究室から提供された）の組換えHAタンパク質4μgをフロイント完全アジュバントに溶解し、足蹠皮下注射でチャレンジした。マウスが7週齢になった時、Freundの不完全アジュバント中に溶解した2μgの組み換えHAを足蹠皮下注射で再チャレンジした。再チャレンジの3日後、HA特異的抗体のさらなる分析のためにマウスの血液を採取した。
常在菌に対する経口耐性
GF WT新生児マウスにP7とP8で50μlの5-HT（12.5μg/ml）またはビヒクル（PBS）を経口経口投与した。新生児がP14のとき、そのダムはP14 SPF WTマウスのSIおよび結腸腔内容物（PBSに溶解）200μlを与えられた。2週間後、細菌を定着させるためにマウスを安楽死させ、フローサイトメトリーによるLP免疫細胞解析のためにSIと結腸を採取した。SI腔内内容物および糞便ペレットも16S rRNA配列決定のために採取した。
フローサイトメトリー
マウスの腸からLP細胞を前述のように単離し、37℃のインキュベーター（5％CO2）中で、フォルボール12-ミリスチン酸13-酢酸（PMA；100ng/ml；Sigma-Aldrich）、イオノマイシン（1μg/ml；Sigma-Aldrich）、およびゴルジプラグ（1：1000、BD Biosciences）で生体外で3〜4時間刺激した。細胞を冷PBSで洗浄し、Fcブロックで15分間ブロックし、FACSバッファー（1％BSA入りPBS）に再懸濁し、表面マーカーと生存率について20分間染色した（使用した抗体はすべて表S7に記載）。細胞内染色では、eBioscience Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Setを用い、製造元のプロトコールに従って細胞を固定・透過処理した（eBioscience）。その後、染色した細胞をFACSバッファーで1回洗浄し、Cytek Aurora（Cytek社）で解析した。データはFlow Jo（Becton Dickinson）を用いて解析した。
T細胞大腸炎モデルと細胞選別
GF WT新生児マウスに、P7およびP8で50μlの5-HT（12.5μg/ml）またはビヒクル（PBS）を経口経管投与した。新生児がP14のとき、そのダムはP14 SPF WTマウスのSIおよび結腸腔内容物（PBSに溶解）200μlを与えられた。2週間後、細菌をコロニー形成させた後、マウスを安楽死させた。ナイーブT細胞（CD45+CD3+CD25+CD44loCD62Lhi）をBD Melodyを用いたFACsソーティングにより脾臓とmLNから回収した（下記の方法を参照）。選別された細胞（40万個）は、腹腔内注射によりレシピエントであるSPF Rag2-/-成体マウスに養子移入された。9週間後、レシピエントマウスを安楽死させ、結腸長体重を測定し、フローサイトメトリーにより結腸およびmLN免疫細胞を解析した。
GF新生児マウスにおけるフルオキセチン曝露
P8からP18まで、GF WT新生児マウスの母親にSSRI［フルオキセチン、1 mg/kg体重（b.w.）］またはビヒクルコントロール（水）を毎日経口投与した。その後、マウスはP18で安楽死させた。SIおよび結腸内腔内容物を、上記のように5-HTのELISA分析のために採取した。SIと結腸の組織は、LP免疫細胞のさらなる分析のために採取された。腸管LP細胞はフローサイトメトリーを用いて分析した。
統計解析
統計解析は、GraphPad Prism 7.0（GraphPad Software）を用いて行った。2群間の差は、対応のないt検定（パラメトリック）、Welchの補正を加えた対応のないt検定、またはMann-Whitney U検定（ノンパラメトリック）を用いて評価した。3つ以上の群間の差は、一元配置分散分析（ANOVA）（パラメトリック）またはKruskal-Wallis検定（ノンパラメトリック）を用い、多重比較検定（Tukey's、Dunn's、Dunnett's T3、Holm-Šidák's）を用いて調整P値で評価した。P値＜0.05の差を有意とみなした。
謝辞
原稿の批評をしてくれたG. F. Sonnenberg、Tph1-creマウスを提供してくれたD. Artis、gnotobiotic動物実験に協力してくれたWeill Cornell Gnotobiotic Animal FacilityのR. PinedoとSarah Paisner、フローサイトメトリーに協力してくれたT. Miller、インフルエンザHAタンパク質とモノクローナル抗体を提供してくれたF. Krammerに感謝する。
資金提供 この研究は、National Institute of Child Health and Human Development助成金R01HD110118（M.Y.Z.）、National Heart, Lung, and Blood Institute助成金R01HL169989（M.Y.Z.）、National Cancer Institute助成金R21CA270998（M.Y.Z.）、National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases助成金K01DK114376（M.Y.Z. M.Y.Z.）、Hartwell Foundation Individual Biomedical Research Award（M.Y.Z.）、Starr Cancer Consortium（M.Y.Z.）、Gale and Ira Drukier Institute for Children's Health at Weill Cornell Medicine（M.Y.Z.）、Children's Health Council at Weill Cornell Medicine（M.Y.Z.）、Center for Immunology and Office of Academic Integration of Cornell University（M.Y.Z.）。 Y.Z.）、Center for IBD Research at Weill Cornell Medicine（M.Y.Z.）、National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS) grant 2TL1TR2386 of the Clinical and Translational Science Center at Weill Cornell Medical College（K.Z.S.およびJ.A.B.）、Biocodex Microbiota Foundation（J.A.B. J.A.B.）、米国国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所トレーニンググラントT32DK116970（J.A.B.）、米国国立小児保健・人間発達研究所トレーニンググラントF32 HD112151（J.A.B.）、ハートウェル財団ポスドクフェローシップ（K.Z.S.）、米国国立小児保健・人間発達研究所グラント1DP2HD101401（C.-J.G.）。 J.G.）、National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant DK135816（C.-J.G.）、National Institute of Allergy and Infectious Diseases grant AI172027（C.-J.G.）、National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases grant DK132244（C.-J.G.）、Kenneth Rainin Foundation（C.-J.G.）、W.M. Keck Foundation（C.-J.G.）。
著者貢献： 構想： 方法論： 調査：K.Z.S.、M.Y.Z： K.Z.S.、S.L.R.、H.C.C.、A.A.、R.C.、L.R.H.、T.L.、P.R.、J.A.B.、M.A.、J.C.J.、A.R.S.、R.L.、F.M.R.、M.L.M.、R.B.S.、C.-J.G.、N.I. 形式分析： 資金獲得： 監修：M.Y.Z： ソフトウェア：N.I： N.I. 可視化： K.Z.S.、N.I.、M.Y.Z. リソース： 原稿執筆：M.Y.Z： 査読および編集：全著者。
競合利益： 著者らは、競合する利益はないことを宣言する。
データおよび資料の入手： 本論文の結論の評価に必要なデータはすべて論文または補足資料に掲載されている。本研究で作成した16S rRNAシーケンスおよびメタボロームデータ（図1、A～D、図6、D～F、図S5E）のGEOアクセッション番号はGSE248694。すべての図の基礎となる集計データはデータファイルS1にある。さらに詳しい情報、リソースや試薬のリクエストは、主担当のM.Y.Z. (myz4001@med.cornell.edu)までお願いします。
補足資料
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材料と方法
図S1からS10
表S1からS9
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