Nature:Sタンパク質と抗COVID19薬と癌化

社会の毒

記事
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発行：2021年6月3日
SARS-CoV-2のタンパク質と抗COVID-19薬が、がん化したウイルスの溶解再活性化を引き起こす

Jungang Chen, Lu Dai, [...]Zhiqiang Qin
コミュニケーション・バイオロジー第4巻、記事番号：682（2021） この記事を引用する

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メトリクスの詳細
アブストラクト
呼吸器疾患「コロナウイルスDisease-2019（COVID-19）」の原因ウイルスである新型コロナウイルス「SARS-CoV-2」の大流行により、2019年末以降、約1億人が感染し、200万人以上が死亡し、世界的な社会的・経済的混乱が発生しています。SARS-CoV-2が宿主細胞に感染して発症するメカニズムはまだほとんど解明されていないため、現在、有効性が証明された抗ウイルス剤はありません。重度の呼吸器症状や全身症状に加えて、いくつかの併存疾患が致命的な病気の転帰のリスクを高めます。そのため、COVID-19が、がんや他の感染症など、患者の既往症に与える影響を調査することが求められています。今回、我々は、SARS-CoV-2にコードされたタンパク質と、現在使用されているいくつかの抗COVID-19薬が、細胞内シグナル伝達経路を操作することで、主要なヒト発癌性ウイルスの1つであるカポジ肉腫関連ヘルペスウイルス（KSHV）の溶解再活性化を誘発することを報告した。今回のデータは、特に流行地域でCOVID-19にさらされたり、治療を受けたりしたKSHV陽性患者は、COVID-19から完全に回復した後でも、ウイルス関連のがんを発症するリスクが高まる可能性を示している。

序章
 COVID-19は、2019年12月に中国の湖北省武漢市で発生して以来、壊滅的なパンデミックになっています1,2,3,4。 ジョンズホプキンスコロナウイルスリソースセンター（https://coronavirus.jhu.edu/）からの更新された情報（2021年1月25日まで）に基づくと、現在、ほぼ1億人の世界的に確認された症例があり、200万人以上が死亡しています。 米国では、確認された症例と死亡はそれぞれ2500万人と42万人に達しています。 さらに、COVID-19のパンデミックは、必要なシャットダウンと検疫手順のために莫大な経済的損失を引き起こしました。 さらに、多くの国では、経済を再開した後、症例数が二次的に急増しています。 敗血症性ショックと多臓器不全は、重度のCOVID-19患者の最も一般的な直接の死因です。 これらの死亡は主に化膿性肺感染症、サイトカインストームの発症、および複数の臓器への直接攻撃によるものです5。 高血圧、心血管疾患、内分泌障害、糖尿病、肥満などのいくつかの併存疾患は、COVID-19感染による死亡の可能性を高める可能性があります6。 したがって、癌や他の感染症を含む既存の病気との関係を含め、COVID-19の影響を調査することは非常に意味があります。

 KSHVは、カポジ肉腫（KS）、原発性滲出液リンパ腫（PEL）、多中心性キャッスルマン病（MCD）7,8など、免疫抑制患者に主に見られるいくつかのヒトの癌の病因です。  KSは内皮由来の多中心性悪性新生物であり、PELとMCDは2種類のB細胞系列障害を表しています9。 この発癌性ウイルスは、ヒトγ-ヘルペスウイルスサブファミリーに属し、宿主細胞における一次感染後の2つの交互のライフサイクルプログラム、潜伏期と溶解期を持っています10。 潜伏期間中、ウイルスゲノムは、子孫ビリオンが生成されず、限られた数の潜伏関連遺伝子のみが発現される環状エピソームとして存続します。 溶解段階に入った後、ほとんどすべてのウイルス遺伝子が発現され、成熟したビリオンの複製と放出が続きます。 最近の発見は、ウイルス潜伏タンパク質と溶解タンパク質の両方が、ウイルス関連癌の開始と進行において極めて重要な役割を果たしていることを示しています11。 ここでは、COVID-19感染とその関連治療がKSHV複製に影響を及ぼし、ウイルス関連癌を発症するリスクを高めるかどうか、もしそうなら、これらのメカニズムがどのように機能するかを理解しようとしています。

 結果と考察
 ヒトiSLK.219細胞株は、ウイルスゲノムに構成的GFPレポーターとRTA誘導性RFPレポーターをコードする組換えrKSHV.219ウイルスを保有しているため、ウイルスの維持と溶解性の再活性化のモニタリングが容易になります12。  KSHV複製に対するSARS-CoV-2の潜在的な影響をテストするために、iSLK.219細胞に、SARS-CoV-2の2つの主要な構造タンパク質であるスパイクタンパク質（S）とヌクレオカプシドタンパク質（N）をコードするベクターコントロールをトランスフェクトしました。  、およびKSHV-RTA（溶解スイッチまでの潜伏期間を制御する重要なウイルスタンパク質、ポジティブコントロールとして使用）、および低用量のドキシサイクリン（0.1 µg / mLのDox）の有無にかかわらず72時間の誘導中に処理されました。  SARS-CoV-2 SまたはN、およびKSHV RTAタンパク質の異所性発現は、イムノブロットによって確認されました（補足図1a-b）。  Dox誘導がない場合、KSHV-RTAのトランスフェクションは、溶解性再活性化を受ける細胞のごく一部のみを誘導しました。 対照的に、低用量のDox誘導による誘導は、ベクターコントロールと比較した場合、SARS-CoV-2 SまたはNベクターのいずれかでトランスフェクトされた細胞の溶解再活性化を有意に増加させましたが、再活性化はKSHV-RTAトランスフェクトよりもわずかに少なかった（図 。1a）。 これらの結果を確認するために、TPA誘導の有無にかかわらず、同じベクターをKSHV + PEL細胞株であるBCP-1にトランスフェクトし、免疫ブロットによってPEL細胞におけるSARS-CoV-2タンパク質の異所性発現を確認しました（補足図1c  ）。 私たちのqRT-PCRデータは、SARS-CoV-2 SまたはNベクターのトランスフェクションが、ベクターコントロールと比較した場合、代表的な溶解遺伝子発現（前初期遺伝子、RTA;初期遺伝子、ORF59;および後期遺伝子、ORF17）を有意に増加させることを示しました。  TPA誘導に関係なく（図1b）。 我々の結果はさらに、SARS-CoV-2 SまたはNベクターのいずれかによるトランスフェクションが成熟ビリオンの産生を有意に増加させることを示しました。これは、トランスフェクトされた細胞の上清を使用してHEK293T細胞を感染させ、ウイルスゲノムレベルを定量化する感染力アッセイを使用して検出されました。  qPCRによる（図1c）。 一緒に考えると、これらのデータは、SARS-CoV-2が潜在的に感染した細胞からKSHV溶解性再活性化を誘発する可能性があることを示しています。  SARS-CoV-2は、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体との相互作用を介してヒト細胞に感染します13。 興味深いことに、免疫組織化学染色データ（図1d）は、ACE2の発現が正常な皮膚組織と比較してAIDS-KS組織でアップレギュレートされ、多くの「紡錘腫瘍細胞」（LANA +）がACE2を強く発現することを示しました。

次に、COVID-19患者の治療に現在使用されているいくつかの薬剤が、KSHVの溶解再活性化に影響を与えるかどうかを調べた。今回の研究では、アジスロマイシン、クロロキン二リン酸塩、ヒドロキシクロロキン硫酸塩、メシル酸ナファモスタット、レムデシビル、トシリズマブの合計6種類の薬剤を使用した14,15,16,17。これらの薬剤をスクリーニングするために，iSLK.219細胞をDox誘導の有無にかかわらず処理したところ，これらの薬剤のうち，アジスロマイシン（抗生物質）とメシル酸ナファモスタット（合成セリンプロテアーゼ阻害剤）の2つが，低用量のDox誘導でKSHVの溶解再活性化を用量依存的に誘導することがわかった（図2aおよび補足図2）。重要なことは、アジスロマイシンとメシル酸ナファモスタットの両方の処理が、成熟したビリオンの生産を促進したことである。図2bに示すように、HEK293T細胞のGFPシグナルは、感染性ビリオンの生産に成功したことを示している。これらの薬剤は、BCBL-1およびBCP-1という2つのKSHV + PEL細胞株でもテストされ、Tocilizumabを除く各薬剤は、高濃度で細胞の成長を阻害した（図3a）。非毒性濃度を用いると、アジスロマイシンとメシル酸ナファモスタットの両方が、両PEL細胞株からのウイルス溶解遺伝子（潜伏遺伝子ではない）の発現を有意に増加させることがわかった（図3b-cおよび補足図3）。驚くべきことに、レムデシビル（アデノシンアナログ）もPEL細胞株で同様の効果を示したが、iSLK.219細胞では見られなかった。さらに、これら3つの薬剤は、PEL細胞株からの感染性ビリオンの産生を有意に増加させた（図3d）。

KSHVの溶解再活性化は、MAPKやNF-κB8などの細胞内シグナル伝達経路の活性化によって制御されていることが報告されている。アジスロマイシンを投与すると，MAPKシグナル活性が上昇し（JNK，ERK，p38キナーゼのリン酸化が増加），メシル酸ナファモスタットを投与すると，KSHV＋PEL細胞のNF-κB活性が低下する（p65のリン酸化が減少）ことがわかった（図4a）。これらのシグナル伝達経路が、抗COVID-19薬によって誘発されるウイルスの溶解再活性化を媒介しているかどうかを調べるために、iSLK.219細胞を特異的MEK/ERK阻害剤であるU0126で前処理した。その結果、アジスロマイシンで誘発されたウイルスの溶解再活性化が、U0126によって劇的に阻害されることがわかった（図4b）。次に、iSLK.219細胞にNF-κB p65を発現するコンストラクト（pcFLAG-p65、それぞれ0.1または0.4μg）をトランスフェクトしたところ、ベクターコントロールと比較して、メシル酸ナファモスタットによるウイルス溶解反応活性化が用量依存的に効果的に阻害された（図4c）。U0126とpcFLAG-p65のトランスフェクションがシグナル伝達経路の活性化に及ぼす影響は、イムノブロットで確認した（図4d）。さらに、強力なNF-κB活性化剤であるTNF-αで処理すると、メシル酸ナファモスタットによって誘発されるウイルスの溶解再活性化も減少した（補足図4）。以上のことから、抗COVID-19薬は、細胞内シグナル伝達経路の活性化を調節することにより、潜伏感染細胞からKSHVの溶解再活性化を誘導することが明らかになった。

本研究では、SARS-CoV-2にコードされたタンパク質と、現在使用されているいくつかの抗COVID-19薬（アジスロマイシンやメシル酸ナファモスタットなど）が、ヒトの主要ながんウイルスの一つであるKSHVの溶解再活性化を誘導することを初めて報告した。これらの事象は、COVID-19に暴露され、治療を受けたKSHV+患者、特に免疫抑制された患者において、KSHVの拡散を促進し、ウイルスの発癌を開始する可能性があります。したがって、これらの患者は、COVID-19から完全に回復した後も、KSHVのウイルス量とウイルス関連悪性腫瘍の発症リスクを監視する必要があります。今回の研究には、いくつかの限界と未解決の問題がある。まず、我々はSARS-CoV-2の生ウイルスを入手できないため、細胞に感染させていない。しかし、Sタンパク質とNタンパク質はSARS-CoV-2の主要かつ豊富な構造タンパク質であるため、生きたウイルスがKSHVの誘導に同様の効果を示すことが期待される。第二に、COVID-19の患者ではKSHV検査が日常的に行われていないため、今回の結果を裏付ける臨床データはまだ得られていない。さらに、米国の一般人口におけるKSHV感染の血清有病率は10％未満であるが、サハラ以南のアフリカの大部分では、全体の血清有病率は50％以上である18。唾液を介したKSHVの母子感染が最も一般的な感染経路であることから、一部の地域では幼児期のKSHV感染率が高いとされている19,20,21。さらに、KSは現在、アフリカの中央、東部、南部地域全体で、小児がん全体の中で最も多いがんの一つとなっています22。周知のように、小児はSARS-CoV-2にも感染しやすいが、症状はより軽く、死亡率も低い23。さらに、HIV感染者、同性愛者、臓器移植を受けた人など、他の集団においてもKSHVの感染率が非常に高くなっています18。興味深いことに、最近の症例報告では、少数のCOVID-19患者において、いくつかのヘルペスウイルスの再活性化が認められており、この可能性を裏付けている24,25,26。第三に、KSHVがSARS-CoV-2感染に影響を与えるかどうかは不明である。KSHVはヘルペスウイルスの一種であり、宿主に生涯感染することが容易である。我々は、SARS-CoV-2の主要な受容体であるACE2の発現がAIDS-KS組織で増加していることを報告したが、KSHVが感染細胞内のACE2をどのように制御しているかはまだ不明である。私たちは以前、KSHVが新規に感染すると、多機能な糖タンパク質であるCD147（EmmprinまたはBasiginとも呼ばれる）の発現が増加することを明らかにした27,28。興味深いことに、CD147は最近、SARS-CoV-2の侵入と宿主細胞への浸潤を促進する共同受容体の1つであることが判明した29。したがって、KSHVとこれらのSARS-CoV-2受容体や共同受容体との関連性を、さまざまな種類の宿主細胞で調べることは興味深いことである。

メソッド
細胞培養と試薬
ヒトiSLK.219細胞は、ドン・ガネム博士の研究室が構築し命名したドキシサイクリン（Dox）誘導型RTAを含む組換えrKSHV.219ウイルスに潜伏感染している12。rKSHV.219ウイルスは、KSHV lytic PANプロモーターの制御下で赤色蛍光タンパク質（RFP）を、また、伸長因子1プロモーター（EF-1α）の制御下で緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する30。HEK293T（Human embryonic kidney 293T）細胞およびKSHV＋PEL細胞株であるBCP-1およびBCBL-1は、American Type Culture Collection（ATCC）から購入し、メーカーの推奨に従って培養した。抗COVID-19剤であるAzithromycin, Chloroquine diphosphate, Hydroxychloroquine sulfate, Nafamostat mesylate, Remdesivir, TocilizumabはSelleck Chemicals社から購入した。その他の化学物質はSigma-Aldrich社から購入した。

プラスミドのトランスフェクション
ヒトiSLK.219細胞に，SARS-CoV-2スパイクタンパク（S），ヌクレオキャプシドタンパク（N）（いずれもSino Biological社から購入），pCR3.1-RTA（ペンシルバニア大学のYan Yuan博士からの寄贈）31，pFLAG-CMV2-p65（カリフォルニア大学ロサンゼルス校のRen Sun博士からの寄贈）32の組換えベクター，またはベクターコントロールを，LipofectamineTM 3000試薬（Invitrogen社）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクション効率は，lacZレポーターコンストラクトの共導入と，市販のβ-ガラクトシダーゼ酵素アッセイシステム（Promega社）を用いたβ-ガラクトシダーゼ活性の測定によって正規化した。

qRT-PCR
RNeasy Mini kit（Qiagen社）を用いてTotal RNAを単離し，SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix Kit（Invitrogen社）を用いてcDNAを合成した。標的遺伝子の増幅に用いたプライマーを補足表1に示す。増幅は，iCycler IQ Real-Time PCR Detection Systemを用いて行い，各実験において目的の遺伝子ごとにサイクル閾値（Ct）の値を二重に集計した。バックグラウンド汚染を最小限に抑えるため、「鋳型なし」（水）のコントロールを使用した。各遺伝子について集計した平均Ct値と、ローディングコントロールとしてのβ-アクチンの対になるCt値を用いて、自動化されたiQ5 2.0ソフトウェア（Bio-Rad）を用いて、割り当てられたコントロールに対する実験群の倍数変化を算出した。

細胞増殖アッセイ
細胞増殖は、WST-1 Assay（Roche社）を用いて測定した。細胞を処理した後、細胞増殖試薬WST-1（4-[3-(4-Iodophenyl)-2-(4-nitro-phenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzene disulfonate）を96ウェルマイクロプレートに10μL/ウェル添加し、37℃、5% CO2中で3時間インキュベートしました。マイクロプレートリーダーを用いて490nmの吸光度を測定した。

ウェスタンブロット
全細胞ライセート（20μg）を10％SDS-PAGEで分解し、ニトロセルロース膜に移し、SARS-CoV-2 SまたはN（Abcam）、KSHV ORF45（Novus Biologicals）に対する抗体でイムノブロットした。p-p65 (Ser536)/t-p65、p-ERK (Thr202/Tyr204)/t-ERK、p-JNK (Thr183/Tyr185)/t-JNK、p-p38 (Thr180/Tyr182)/t-p38、FLAG、ローディングコントロールとしてGAPDHまたはβ-Actin（Cell Signaling社）を用いた。免疫反応バンドは、強化化学発光反応（Perkin-Elmer）を用いて同定し、オートラジオグラフィーで可視化した。また、補足図5および6には、トリミングしていない完全なブロット/ゲル画像をそれぞれ示した。

HIV+患者のKS腫瘍組織と免疫組織化学
HIVに感染した患者のKS組織は，ルイジアナ州立大学健康科学センター（LSUHSC）のHIV外来（HOP）クリニックと生物資源バンクから提供された。本研究は，LSUHSCのInstitutional Review Board for Human Research（承認番号8079）によって承認された．すべての被験者が書面によるインフォームド・コンセントを得た。ホルマリン固定、パラフィン包埋の組織を4μmの厚さにミクロトームで剥離し、電磁石で帯電させたスライド（Fisher Scientific社）に置いた。免疫組織化学は前述31のように行い、ACE2抗体はAbcamから購入した。画像は、高解像度のDP72カメラとCellSenseイメージキャプチャーソフトウェアを装備したオリンパスBX61顕微鏡を用いて収集した。

統計と再現性
すべての統計はGraphpad Prism v.8.0を用いて行った。統計解析を行う前に、正規性と分散を評価した。実験群と対照群の間の差異の有意性は、両側スチューデントのt検定を用いて判断した。繰り返し実験の回数は、図の凡例に記載した。繰り返し実験を行った結果、同等の結果が得られたことから、再現性があると判断した。

報告書の概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この記事にリンクされているNature Research Reporting Summaryでご覧いただけます。

データの有無
すべての関連データは、原稿とその補足ファイルに含まれています。図のソースデータは補足データ1にあります。また、本研究で得られた知見を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて対応する著者（Z.Q.）から入手可能です。

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