どうもPCRに関して正しい知識が浸透していないような気がする

AKIRAです。
今日は、改めてPCRについて「はっきりと」言っておかなければならないと思いましたので、ここで書き残しておこうと思います。

PCRの原理について

PCRはサンプル中に含まれるDNAを大量に複製するための「実験法」です。どの程度DNAがあるのかを正確に知りたいときは、定量PCR（quantitative PCR, qPCR）という方法を使い、ただただ増幅したい場合は普通にサーマルサイクラーという温度を上げ下げする機械でPCRをやります。

PCRに必要な試薬は以下の通り。

• DNAサンプル（調べたいサンプル）

• プライマー

• dNTP

• DNAポリメラーゼ

• バッファー

です。
おそらく、よくわからないのは、「プライマー、dNTP、DNAポリメラーゼ、バッファー」の4つでしょうから、それぞれ解説します。

プライマー

DNAを人工的に増やそうとすると、問題となることがあります。それは、「この部分だけを増やしたい！」と思っても、目印がなければ増やせないということです。

というわけで、増やしたい部分の両端に目印となる短いDNA断片を入れておきます。これをプライマーというのです。
プライマーは、増やしたい配列の端の配列と一致しているDNA断片であり、これがくっつくことで、DNAの伸長のスタート地点となります。

つまり、反応条件が悪くない限りは、プライマーを入れることで特定の部分を認識してDNAを増やすことができます。

dNTP

NTPというのは、ヌクレオチドのことで、先頭文字のdは反応上の理由で化学的な構造変化を起こしていることを指しているのですが、要はdNTPはDNAを伸長するための「パーツ」だと考えてください。

ビーズを想像していただけるとわかりやすいのですが、ビーズ一個一個がdNTPでつながったビーズ全体がDNAです。

DNAポリメラーゼ

DNAを伸長するための酵素です。
これがないと、DNAはできません。最適な温度にすることで伸長作用が働き、温度を変更するとその機能が一時的に中断されます。

車でいうところのエンジンです。

バッファー

上記のポリメラーゼが最適な環境で働くようにするための液体です。
文字通りのバッファーですね。

PCR反応

以上が、PCRの組成です。
では、次に具体的な反応について述べていきます。

PCRは温度を変更することでDNAの鎖が伸長していくということを述べました。DNAはそもそもが2本の鎖の合体版なので、これを一時的に1本にしなければなりません。そのために必要なものが「温度条件」です。

平たく言うと、
2本が1本になる温度→ポリメラーゼが働く温度→反応をやめてもう一度2本一組になる温度→……を繰り返すのです。

すると、最初は2本一組だったものが分かれて1本が2つになり、それぞれの鎖で伸長反応が起こるので4本になって、再び2本一組になるので二組のDNAになります。
その次は、1本のDNAが4つあるので、倍の8本になって四組のDNAができることになります。

そうなると、DNAの増え方は、1→2→4→8→16…と倍、倍に増えていきます。すると、いつの間にかとんでもない量のDNA増幅が完了している、ということですね。

PCR検査の原理はqPCRに基づく

世にいうPCR検査は、定量PCRの技術を使っています。
つまり、ただただDNAを増やして「DNAあった！」とは言っていないのです。

DNAがある！というための基準が必要になります。それがCt値です。
Ctは増幅回数を指しています。つまり、「この数のDNAになるのに何回分増幅を行いました」の「何回分」に相当する値です。

例えば、10回増幅したDNAと5回増幅したDNAの数が同じだったとします。前者をA、後者をBと呼称するとします。
この時、Aは10回も増幅を行っているのに対してBは5回で同じ数のDNAになっています。AとBでは5回分増幅回数に差がありますね？

5回分の増幅がどれくらいの差になるか、というと、1回分の増幅でDNAは2倍になるので単純計算で2を5回掛け算すると、32倍という差がありますね。
つまり、AとBは増幅する前に32倍のDNAの数の差があったということがこれでわかります。

これらの情報と、すでにDNAの数が分かっているサンプルを同じように増幅して得られるデータを比較することでAやBのDNAの数を求めることができます。

またCt値については、10回よりも5回のほうがDNAの量は多いので、Ct値は少ないほうがDNAが多いことを示していることになります。

PCRをウイルス検出に使うと、ノイズが多くなる

さて。これまでPCRの原理と検査でどのように利用されるのかという観点から解説をしてきましたが、本記事の本題のお話をさせていただきます。

先述の通り、PCRはどれだけ少ないDNA量でもプライマーと酵素さえあれば、難なく増やすことができます。あと気を付けなければいけないポイントは温度くらいのものですが、それも機械の温度設定を弄ればいいだけの話なので大した問題ではありません。

では、何が問題なのかというと、まさしく「どれだけ少ないDNAでも増幅できてしまうこと」に問題があるのです。

PCRで検出しているのは、あくまでもDNAの存在／非存在なので、ウイルスのゲノムが存在しているか否かを測っているだけにすぎません。
しかし、そんなことを言い出せば、ウイルス粒子1粒だけでも細胞に入ってしまえば、PCRで検出された検体は陽性になってしまいます。

一方で、抗原検査は何をしているのかというとウイルスのタンパク質が体から検出されるかどうかを調べるものなので、陽性であった場合、ウイルスのタンパク質が検出されているわけだからウイルスが細胞の中から体を作って出てきていることが証明されます。
つまり、抗原検査に関しては体の中でウイルス粒子が増幅されていることが証明されるわけです。

他方、PCRはただ、ウイルスのDNAを検出しているだけです。
もしかしたら、そのプロウイルス（DNAの状態で体を作っていないウイルスのこと）は細胞性免疫（免疫細胞が直接細胞を破壊することで侵入されている細胞を破壊する免疫系）で発病前に殺されるかもしれませんよ？

それを陽性とするのであれば、日常生活を送っているほとんどの人が感染陽性として扱われてしまいます。

そもそもPCRは標的と「される」DNAを「増やして」検出しているだけ

”C”という遺伝子を増やしたいとします。
一方で、よく似た配列の”C’（シーダッシュ）”があったとします。

この二つをCを増幅するためのプライマーを用いて増やしたらどうなるでしょうか。
…まあ、一定確率で両方とも増幅されるでしょうね。

そうなんです。
実は、プライマーの配列が「似ている」配列があると、qPCRの機械は「増えている」と誤認してしまうことがあるのです。
機械がDNAの量を測る方法は主に二つあって、一つは蛍光色素を使う方法。もう一つはプローブを使う方法です。

前者はDNAの二本鎖の間に入り込む蛍光色素で検出する方法です。二本鎖が増えれば増えるほど蛍光の強さが大きくなるので、便利な手法であり一般的に研究でも使われる方法ですが、二本鎖が形成された場所であればどこでも入り込むので、先ほどの「似ている配列」の二本鎖でも検出することから偽陽性のリスクがあります。

後者は、増やしたい配列と同じ配列のDNAに色素がくっついているプローブと呼ばれるもので検出する方法です。
配列が同じなので、関係のない部分の増幅を検出するリスクが低いという利点がある一方、増幅したい配列に一致した配列をいちいち作らないといけないため、お金がかかることと専用のポリメラーゼを使用しなければならないという欠点があります。

なので、科学的（偽陽性のリスク）にも、経済的（プローブ法はお金がかかる）にも検査に向かない手法なのです。
これならば、抗原検査のほうがまだコスパがいいといえるでしょう。

おわりに

というわけで、少し長くなりましたが、PCRについて書いてみました。
どう考えるかは読む皆さん次第です。

あるいは、「もうそんなこと知っとるわ！」という方の場合は、申し訳ありませんが、時間の無駄だったということになりますね（笑）

では、このあたりで失礼します。
機会がありましたらまた。