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Y1H assay

ChIP-qPCR

①DNAとその領域に結合しているタンパク質(ヒストンとか転写因子とか)をホルムアルデヒドで架橋固定
②超音波処理や酵素処理により可溶性の断片化クロマチンにする
③タンパク質に対する特異的抗体を加えて免疫沈降
④タンパク質をはがしてqPCRすると結合量が分かる

→既知のゲノム上のタンパク質結合部位でのタンパク質-DNA相互作用の有無を定量的に評価できる手法。

ルシフェラーゼレポーターアッセイ

→遺伝子の発現がどれくらい活発かを数値化する方法。
遺伝子はプロモーターやシグナル応答配列などの「転写調節領域」によって転写量が調節されている。転写調節領域の後ろにルシフェラーゼコード領域をくっつけて蛍光測定する。

Y1H assay

サイトより引用

まずDNA結合タンパク質の候補となる未知の“prey(獲物)”タンパク質をGAL4 ADに融合して発現させる。宿主ゲノムに組み込まれた既知の“bait(おとり)”配列(標的DNA配列)に結合すると、preyタンパク質に融合したGAL4 ADによりAbA耐性レポーター遺伝子(AUR1-C)が活性化され、宿主酵母株がAbA選択培地で生育可能になる。

 Y1Hの利点は、ルシフェラーゼレポーターアッセイとは異なり、Y1Hは実際には転写を活性化していないタンパク質-DNA相互作用を検出することができることです。目的のタンパク質を強力な活性化ドメインに融合させることで、Y1Hは、転写に直接機能しないタンパク質(複製タンパク質、DNA修復タンパク質、リプレッサータンパク質など)を含む、様々なDNA結合タンパク質を検出することができる。
 また、ChIP-qPCRは結局のところタンパク質を免疫沈降させるための抗体が必要になるので、抗体が手に入らない場合に有用になります。

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