【論文を読む-5】DNA Extraction From Processed Wood: A Case Study for the Identification of an Endangered Timber Species (Gonystylus bancanus)
Abstruct
加工された木材サンプルから全ゲノムDNAを抽出するために、人間の法医学的手法を応用し、DNAシーケンス技術を用いて絶滅の危機に瀕した熱帯木材の種を特定する可能性を探りました。商業用木材2件と標本館の木材3件から、高収率で高品質なDNAサンプルを得ました。500〜800 bpの大きなPCRフラグメントを、5つのすべてのサンプルで2つの葉緑体領域と1つのミトコンドリア領域から成功裏に増幅しました。これは細胞ゲノムの分解が限定的であることを示しています。標本館の樹木からの幹の木材からのDNA抽出は、樹皮がそのまま残っている幹の木材や葉のサンプルよりも優れているようでした。trn領域からのDNA配列は、GenBank Blast検索に基づいて焦点となる種の簡単な同定を可能にしました。3つの領域ではほとんど配列変異が観察されず、ミトコンドリアのcox3領域は完全に保存されていました。高品質で大きな完全なDNAフラグメントの抽出により、乾燥した木材材料は指紋認証や歴史的アプローチを含むさまざまなDNAマーカーを利用した応用に適しています。幹材からのサンプリングにより、国際的な標本館に収蔵されている豊富な歴史情報を、分類学的に重要な特徴に最小限の損傷で探ることができます。
Introduction
最近の国際熱帯木材機構の「段階的認証アプローチ」に関する会議で、貿易関係者、森林管理者、保護団体らが種の同定と合法的な伐採の外部「第三者」による検証の必要性を強調しました（Simula, 2005）。このプロセスでの遺伝子マーカーの使用は、一般的には困難または費用がかかりすぎると見なされてきました（Dykstra et al., 2002）。しかし、分子DNA技術は急速に進歩しており、以前は実現不可能と思われていた多くの技術が現在は定期的に使用されています。
新興技術の登場を見越して、熱帯木材（Gonystylus bancanus）の絶滅の危機に瀕した種を対象にしたケーススタディの一環として、乾燥および加工された木材から全ゲノムDNAを抽出する基本的な手法を探索してきました。森林から市場まで木材資源を追跡する能力は、木材取引の成功管理と適切な規制にとって極めて重要です。そして、木材サンプルから協力的なDNAを信頼性を持って抽出できる能力は、遺伝子技術を木材取引に応用するための基本的なステップです（Deguilloux et al., 2003; Deguilloux et al., 2002; Gugerli et al., 2005）。
熱帯林種の研究では、肉組織から全ゲノムDNAを抽出することは日常的です（Cannon and Manos, 2003; Kajita et al., 1998）。オークの木材サンプルから商業的に利用可能なキットを使用して抽出されたDNAは、収率が低く高度に分解していました（Dumolin-Lapegue et al., 1999）。これらのキットの使用は、貴重な熱帯木材種の幅広い範囲で十分に実証されていませんでした。当研究室で以前行われた植物群の選択に関する前の研究では、高品質のDNAを得ることができませんでした。ここでは、大量で高品質かつ比較的に完全な全ゲノムDNAを得るための効果的な抽出プロトコルを説明します。アメリカ合衆国の最終消費者として購入された乾燥加工木材サンプルや、同じ植物群のヒートドライされた標本から、そのようなDNAが取得できることを示します。また、部分的な葉緑体DNA配列からラミン（Gonystylus bancanus）やクリ属（Lithocarpus sp.）の木材サンプルの分類学的同定を、一般公開されているGenBankで検証しました。
Materials and Methods
Plant material
次のサンプルから全ゲノムDNAを抽出しました：地元の工芸品小売店で購入したGonystylusの乾燥加工された棒材、種類や原産地が不明な家具材料の断片、ShoreaとLithocarpusの2つの標本（標本シートから茎の一部を切り取り、粉砕する前に樹皮を取り除きました）、マレーシアのパハン州（G2、G26）、インドネシアのスマトラ（LOC3、5）、ボルネオ（Lg2）から採取したGonystylusの4つの内部樹皮のサンプルです。
DNA extraction
全てのサンプルと機器は、汚染のリスクを減らすために処理前に70%エタノールで徹底的に清掃されました。内部樹皮サンプルからのゲノムDNAは、改変されたセチルトリメチルアンモニウム臭化物（CTAB）プロトコル（Doyle and Doyle, 1987）を用いて抽出されました。残りのサンプルは、CTAB、DNAeasy Mini Plant Kit（QIAGEN）、N-フェナシルチアゾリウム臭化物（PTB；Prime Organics）を使用して抽出されました。
CTAB extraction
→元論文参照
PTB extraction
PTBは、主に古生物学的研究において、古代の骨からのDNA抽出に使用されてきました（Gugerli et al., 2005; Kelman and Kelman, 1999）、ネアンデルタール人の遺骨から（Krings et al., 1997）、および絶滅した地上ナマケモノ Nothrotheriops shastensis の糞から（Poinar et al., 1998）。ここでは、メーカーの指示（Prime Organics）に基づいて修正を加えた、植物組織からDNAを抽出するためのPTBベースのDNA抽出プロトコルを説明します。
Protocol
以下は、処理された木材の組織1グラムと標本館サンプル0.5グラムを、ミルサーIFM 66D（イワタニ）と液体窒素を用いて粉末状に挽きました。細かい粉末を5 mLの0.5 M EDTAに移し、室温で48時間浸漬し、木材組織の無機質化を行いました。無機質化後に、500 μL（3 mg/mL）のプロテアーゼK（フィッシャーバイオテック）と1.0 mLの0.1 M PTB（プライムオーガニクス）を添加しました。混合物を徹底的に混ぜ、成分を均一にしました。サンプルは65℃で水浴中に12時間インキュベートされました。抽出はフェノールとクロロホルムの等量で行い、その後クロロホルムとイソアミルアルコール（24:1）の等量で2回の追加抽出を行いました。DNAは冷たい絶対エタノールの2倍量と500 μLの7.5 M酢酸アンモニウムを加えることで沈殿させました。この溶液は-40℃で12時間保存され、5000 rpm（2300g）で20分間、4℃で遠心分離されました。ペレットは80%エタノールで2回洗浄され、80%エタノール中で一晩放置されました。ペレットは5000 rpm（2300g）で遠心分離され、室温で乾燥させました。
Purification of genomic DNA
3つの抽出プロトコルで抽出されたすべてのDNAサンプルは、さらにHigh Pure PCR Template Preparation Kit（Roche）で精製されました。
DNA quantification
ゲノムDNAは、NanoDrop分光光度計で波長260 nmにおけるサンプルの吸光度を測定することで定量されました。この装置は非常に感度が高く、少量のDNA（2 ng/μL）を測定することができます。DNAの品質と量を確認するために、1 μLのDNAサンプルが使用されました。また、DNAはアガロースゲル電気泳動によっても定量されました。PTBで抽出されたDNAの10 μL（200-500 ng）が1.2%のアガロースゲル上で電気泳動され、エチジウムブロマイドで染色され、UV蛍光で視覚化されました。DNAの量は、バンドの強度を標準量のDNA（Hi-Lo DNA marker; Minnesota Molecular）と比較することで測定されました。
PCR amplification and sequencing
私たちはミトコンドリアDNA（mtDNA）1つとクロロプラストDNA（cpDNA）の非コーディング領域（テーブル1にプライマー配列あり）を増幅することを選択しました。PCR反応はサーモサイクラー（Eppendorf）で行われ、以下の条件で実施されました：94℃で4分間の変性後、atpbE、rbcL、trnE、およびtrnFでは1分間55℃でアニーリングし、cox3では58℃で、さらに72℃で90秒間の伸長を行いました。最後に72℃で5分間の最終伸長を行いました。合計のPCR反応体積は50μLで、50 ngのゲノムDNA、10 pmolのプライマー（それぞれ）、1倍濃度のPCR反応バッファ、1.5 mMのMgCl2、0.5 UのTaqポリメラーゼ（Eppendorf）を含んでいました。PCR生成物は1.2%のアガロースゲル上で可視化されました。各プライマー対ごとに、予想されるサイズの生成物が増幅されました。PCR生成物はそれぞれのプライマーを使用して両端からシーケンスされました。これらのアンプリコンはQIAGEN MinElute PCR purification kitを用いて精製され、Beckman CEQ 2000上でCEQダイエンターミネーターサイクルシーケンスキット（www.beckmancoulter.com）を使用して直接シーケンスされました。シーケンスファイルはLasergeneソフトウェア（DNA*DNASTAR）で編集され、CLUSTAL Wソフトウェアバージョン1.6でアラインメントされました。
Results and Discussion
CTABおよびQIAGENキットから得られたDNAは品質が低く、量も少なかったです。これらのサンプルは検出可能な（<15 ng/μL）DNAが存在していたにもかかわらず、増幅することができませんでした。PTBで抽出されたサンプル1および2からのDNAは、エチジウムブロマイドで染色したアガロースゲル上で可視化できました（20 ng/μL）。一方、乾燥木材サンプルからは多量のDNA（50 ng/μL）が得られました。全てのサンプルでDNAは分解されており、フラグメントサイズは50 bpから10.0 kbpに及んでいました。これらのサンプル間の違いは、抽出に使用されたサンプル量が少なかったことが主な要因かもしれません。EDTAで木材組織を浸すことで、水溶性の木材成分や鉱物成分が溶出し、バッファーの色の変化からも明らかでした。以前の試みでは、植物標本の葉からDNAを抽出しようとしましたが（CTABおよびQIAGENキットを使用しましたが、データは示されていません）、高度に分解されて酸化されたDNAが得られ、その後のPCR増幅に失敗しました。樹皮を取り除いた幹の木材からのDNA抽出では、全ての3つの領域で成功裏に増幅されたサンプルが得られました。葉組織に比べ、幹の木材中のDNAはより良く保存されている可能性があります。なぜなら、葉は乾燥過程で幹の木材よりも劇的かつ急速な変化を経験するためです。
CTABやQIAGENキットを使用して得られた低いDNA収量やPCR増幅の失敗は、DNAエキスからのメイラード生成物の存在や、テルペン、ポリフェノール、多糖類などの不純物に起因している可能性があります（Shepherdら、2002年）。ただし、DNAの酸化はタンパク質と炭水化物のメイラード反応の重要な副産物です（Evershedら、1997年）。メイラード生成物は還元糖と第一級アミン（タンパク質）の縮合物であり、これらは抽出されたDNAの品質と収量を著しく低下させる可能性があります（Poinarら、1998年）。PTBによるDNA抽出は、グルコース由来のタンパク質間架橋を切断し、糖から生成された縮合物内に閉じ込められていたDNAを解放するのに役立ちます。
PCR増幅はPTBで抽出されたサンプルでは成功しました（図1）。cpDNAおよびmtDNA領域の両方が成功裏に増幅されました。葉緑体ゲノムの1つの非コーディング領域（atpbEとrbcL）は800 bpのアンプリコンを生成し、長いDNA鎖がまだ完全であることを示しました。以前の報告では、乾燥木材からのDNA抽出は300 bpの増幅フラグメントのみが得られたとされています（Dumolin-Lapegueら、1999年）。50年以上前の木製の机からの私たちの抽出では有用なDNAが得られませんでしたが、これは使用された木材の年齢に起因するかもしれません。
古代のDNAや比較的に損傷があるDNAの潜在的な問題点は、増幅中にDNA修復やポリメラーゼの誤りのアーティファクトを含む配列が増幅される可能性です（Dumolin-Lapegueら、1999年）。trnEおよびtrnFのcpDNA配列領域に基づいてサンプルを比較した結果、すべてのラミンサンプルから得られたDNA配列が互いに同一であり、GenBankに登録されているものと非常によく一致していることが示されました（表2）。また、Lithocarpusサンプルの幹の木材から得られたDNA配列は、すでに行われた大規模な地理系統研究（Cannon and Manos、2003年）でシーケンスされたものと同一でした。さらに、同じ乾燥木材サンプルからのPCRコントロールと2つの異なる反応のシーケンス解析では、同じ配列が得られたため、結果がPCR増幅過程のアーティファクトである可能性は除外されました。
様々な植物分類のさまざまな木材サンプルから有用なDNAを成功裏に抽出し、PCR増幅およびDNAシーケンスに使用することは、熱帯木材取引の監視と管理のためのDNAフィンガープリント技術を開発するための必要不可欠な最初のステップです。長いおよび短いDNA領域の両方を増幅できる能力は、標準DNA配列ローカスだけでなく、従来のマイクロサテライトローカスも遺伝子データベースに含めることを可能にします。東南アジア市場で経済的に価値のある多くの木材種に対するDNAフィンガープリントの十分なデータベースの構築（Danimihardja and Gandawidjaja、1998年；Soerianegara and Lemmens、1994年）は、大規模な国際的な標本館コレクションから直接得られたDNAが取り込まれることで大幅に促進されます。これにより、木材収穫前の条件に関する客観的な知識が提供されます。幹の木材の小さな一部を使用することで、標本シートの分類情報に影響を与えることはほとんどありません。したがって、私たちの手法は館長やコレクションマネージャーにより受け入れられるべきでしょう。人間の遺骨に通常使用される法科学的なDNA抽出プロトコルを木材サンプルに適用することは、木材認証プロセスにおける検証ツールとしてのDNAフィンガープリントデータベースの作成における可能性のショートカットを示しています。高品質で大量の全ゲノムDNAを木材サンプルおよび様々な種の標本から得ることができ、木材取引認証プロセスにおける検証ツールとしてDNAフィンガープリントデータベースの作成における可能性のあるショートカットを提供しています。
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