いんよう！第250回の補足という名の論文紹介

いんよう！の第250回で、曜先輩が上げておられたZygotic Genome Activation (ZGA)の論文。たしかに2022らしからぬ発見でワクワクして論文を読んでみた。

Zygotic genome activation by the totipotency pioneer factor Nr5a2
https://www.science.org/doi/10.1126/science.abn7478

ZGAは専門ではないものの、発生学・マウス・ゲノミクスのバックグラウンドで育っているので、どうして2022年末に発見されたのかという観点でこの論文を紹介してみる。

論文の骨組みとしては、転写因子Nr5a2 (とEsrrb)がZGAのターゲット遺伝子上流にエンリッチしていることを発見する(Fig1)、実際にNr5a2の阻害でZGAがおかしくなる (Fig1-2)、これらの因子の結合サイト探索と確認 (Fig3-4)、パイオニアファクターであることの生化学的な確認 (Fig5-6)という流れになっている。後半も大変そうだけれども、やはり発見に至るデータと解析が気になるところ。

ZGA研究の大変なところは、マウスでZGAがおこる2細胞期には、当たり前だが1個体あたり4コピーしかDNAがないところである。あれだけ細胞体が大きいのにゲノムDNAが少ない。ゼブラフィッシュだともう少し後の時期（だったはず）なので機能ゲノミクスが比較的やりやすそうだが、マウスで1-2細胞期の変化を追えるようになったのはおそらく近年のシングルセルATAC-seqや高感度なChIP-seq (本論文ではCUT&TAG)のおかげであろう。一方でRNAは山ほどとれる。実際に著者らはRNA-seqから初めて、ZGAでオンになる遺伝子の上流8kb配列を集め、de novoでモチーフのエンリッチを調べる。そしてSINEリピートが見つかる。ここまではわりと既存のパッケージやらを使ってたどり着けるはず。論文に挙げられているスーパーモチーフはサイズが大きいけれど、まぁ実際の配列なんかをブラウザで確認しているうちに気づくであろう。SINEなんてものはゲノム中に溢れているので、多くの人はここで断念すると思う。ラボミーティングはお通夜。なのでここから根気よく探したのがすごい。もしかしたらSINEが関わっていそうというところまでは事前に仮説としてあったのかもしれない。SINE配列のうち、CAに置換されているバリアントが遺伝子発現量と相関している。そこで詳しくモチーフをみてみると、くだんのNr5a2やらのモチーフがCA置換版で見つかる。マイナーな転写因子ながら結合モチーフがわかっているのは、近年充実した網羅的なChIP-seqのおかげである。JASPARのデータベースに公開されているし、MEMEなんかでモチーフ検索をかけるのも比較的簡単である。

RNA-seqで面白い点として、マウスの2種類の系統で交配してサンプルをとったところであろう。西ヨーロッパ/アメリカ亜種由来の系統B6どうしの交配に加えて、東南アジアの亜種に由来する系統CASTとB6のF1を使っている。本文中では注意書きがないが、もしかするとSINEのバリアント（あるいはSINEの有無そのもの）が系統間で異なることを利用して実験ノイズを減らしているのではなかろうか。あるいは系統間のSNPを使って父親由来・母親由来のアレルを区別したかったのかもしれない。とにかく、この実験もNr5a2発見のキモなのではないかと思う。実際にNr5a2の発現上昇はB6xB6ではいまいちながら、B6xCASTではめちゃくちゃ上がる (Fig1B)。ちなみに以降の実験ではB6-CBAのF1どうしを交配したりしている (たぶん、卵がたくさん取れるから)。

以降の実験でインヒビターやらsiRNAを使うのはもちろんZGAの時間軸に沿うためだと思うが、そのせいかデータはわりとノイジーである。というかやはりここでも4コピーしかゲノムが無いというのが効いてくるのだろう。ChIP-seqも大変そうである。CUT&TAGのマテメソを読んでいたら "Polar bodies in 2-cell embryos were carefully removed by a micromanipulator combined with a piezo drive unit" なんてことがさらりと書いてある。本文以上に高度な技術背景がありそうで、セミナーで聴いてみたくなる見事な仕事である。

なお、最初の投稿が2021年12月で、アクセプトが2022年の11月。2022年5月にbioRxivでプレプリントが公開されている。プレプリントを読む限りはだいたいのメインデータがこの時点で揃っているのだけれど、Scienceへの初回投稿時にどのデータがあったのかは気になるところ。