多変量解析により明らかになったHIVおよび抗レトロウイルス療法が口腔内細菌叢に及ぼす独立した影響

2023年4月21日 10:30

18 2023年4月
多変量解析により明らかになったHIVおよび抗レトロウイルス療法が口腔内細菌叢に及ぼす独立した影響

https://journals.asm.org/doi/10.1128/mbio.00409-23#.ZEE5wwohky0.twitter

著者紹介 Clifford J. Beall https://orcid.org/0000-0002-2198-9124, Elizabeth A. Lilly, Carolina Granada, Kelly Treas, Kenneth R. Dubois III, Shahr B. Hashmi, Jose A. Vazquez, Michael E. Hagensee, Ann L. Griffen, Eugene J. Leys, Paul L. Fidel Jr. https://orcid.org/0000-0001-8066-5763 pfidel@lsuhsc.eduAUTHORS INFO & AFFILIATIONs
DOI: https://doi.org/10.1128/mbio.00409-23
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ABSTRACT
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結果
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謝辞
フットノート
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参考文献
ABSTRACT
口腔内マイクロバイオームは、健康と疾病の重要な予測因子である。我々は最近、HIV陽性者（HIV+）とそれにマッチしたHIV陰性者（HIV-）の大規模コホートにおいて、高活性抗レトロウイルス療法（ART）下のHIVが口腔マイクロバイオーム（細菌および真菌）に及ぼす有意だが緩やかな影響を報告した。口腔マイクロバイオームに対するHIVの影響にARTが加わるのか、それともマスクされるのかは不明であったため、本研究ではHIVとARTの影響を独立して解析することを目的とし、曝露前予防療法（PrEP）中のHIV-被験者も対象としました。ARTを欠いたHIVの影響（HIV+ ART-対マッチしたHIV-被験者）の断面解析では、他の臨床変数（Bray-Curtis異同の順列多変量分散分析［PERMANOVA］）をコントロールした後、バクテリオームとマイコバイオームの両方に対して有意な影響（P < 0.024）を示した。ARTの効果を評価する横断的分析（HIV+ ART+とHIV+ ART-の被験者）では、マイコバイオーム（P < 0.007）に有意な効果が見られたが、バクテリオームには見られなかった。並行して行われた縦断的な分析では、ART（ART開始前と開始後）は、HIV+およびHIV-PrEP被験者のマイコバイオームではなく、バクテリオームに有意な影響を与えた（それぞれP < 0.005 とP < 0.016）。これらの分析により、HIV-PrEP被験者（pre-PrEP）とHIV-matched HIV-グループとの間で、口腔内マイクロバイオームといくつかの臨床変数に有意差があることも明らかになりました（P < 0.001）。種レベルでは、細菌と真菌の両方の分類群において、HIVおよび/またはARTの影響内で少数の差異が確認された。口腔マイクロバイオームに対するHIVおよびARTの影響は、臨床変数の影響と同様であるが、全体的に控えめであると結論付けた。
重要性口腔マイクロバイオームは、健康と疾患の重要な予測因子となり得る。HIVとともに生きる人（PLWH）にとって、HIVおよび高活性抗レトロウイルス療法（ART）は、口腔マイクロバイオームに大きな影響を与える可能性がある。我々は以前、HIVとARTがバクテリオームとマイコバイオームの両方に大きな影響を与えることを報告した。しかし、ARTが口腔マイクロバイオームに対するHIVのさらなる影響を助長するのか、あるいは覆い隠すのかは不明であった。したがって、HIVとARTの影響を独立して評価することが重要であった。このため、ART開始前後のHIV+ ART+被験者、HIV+およびHIV-（曝露前予防薬［PrEP］）被験者を含むコホート内で、多変量横断的および縦断的口腔マイクロバイオーム解析（バクテリオームおよびマイコバイオーム）が行われた。口腔マイクロバイオームに対するHIVとARTの独立した有意な影響を報告する一方で、その影響は臨床変数の影響と同様であるが、全体として控えめであると結論づけた。
はじめに
HIV疾患は、世界的に健康や経済に影響を与え続けている。高活性抗レトロウイルス療法（ART）の登場により、HIVとともに生きる人々（PLWH）の寿命、特に生活の質は大きく向上し、日和見感染症の大幅な減少につながりました（1）。しかし、ARTが容易に利用できない地域もあり（2、3）、歯肉炎、歯周炎、う蝕、歯内感染、口腔咽頭カンジダ症（OPC）、口腔いぼ、口腔毛状白板症、カポジ肉腫など、様々な口腔疾患に対する脆弱性が多くの集団に残っています（1、4、5）。
750種以上の細菌および真菌からなる口腔内細菌叢は、口腔内および全身の健康と疾患の重要な構成要素であると考えられています。このことは、歯周病（6-8）、う蝕（6、9）、そして最近ではHIV疾患（10-19）において、口腔マイクロバイオームの組成と多様性が変化することを示す研究によって例証されています。サンプルサイズや方法論に大きな違いがあるものの、大半の研究では、HIV（通常はART併用）が口腔内マイクロバイオームの全体的な組成に及ぼす影響は控えめながら一貫して有意であると報告しています。これには、細菌と真菌のコミュニティ間のいくつかの興味深い相互作用や関連性も含まれています（11-14、17、20-22）。
口腔マイクロバイオームの重要な調節因子であり、HIVおよびARTの効果を検討する際の潜在的な交絡因子となり得る臨床的要因や状態は多数存在する（すなわち、ウイルス負荷、CD4細胞、歯周病、う蝕、およびタバコ）。私たちが過去に発表した論文（11, 23）では、口腔内の細菌群集や真菌群集に大きな影響を与えるこれらの交絡変数の数と、距離ベースの冗長性解析（db-RDA）によってそれらを補正する方法について詳述しました。バクテリオームについては、カンジダの存在、歯の欠損、現在の喫煙、歯周病、抗菌薬、齲蝕の状態、オーラルセックスの習慣などが挙げられた（11、23）。マイコバイオームについては、齲蝕状態、オーラルセックスの行為、歯の欠損などが含まれる(11, 23)。他の多くの変数は分析において有意ではなかったが、有意であった変数のほとんどは、ART下のHIVと同等か、しばしばそれよりも有意なマイクロバイオームへの影響を有していた（11, 23）。興味深いことに、臨床変数を考慮した他の研究（12、24-27）のほとんどは、多変量解析によってそれらを組み込んでいない。しかし、我々の研究と他の研究に共通するのは、HIVとARTの効果を独立して評価する研究デザインがないことである。HIV陽性（HIV+）の被験者のほとんどはARTを受けており、ウイルス学的コントロールを達成していたため、ARTがHIVの独立した効果を覆い隠し、あるいは追加した可能性が高い（例えば、免疫調節効果がHIVの免疫抑制効果を打ち消す、あるいは追加する）。この問題を解決するために、私たちは、ARTを受けているPLWHのグループと、マッチさせたART未受験のグループとの横断的分析を行い、その後、最長で18ヶ月間、ARTの開始を縦断的に観察しています。さらに、HIV感染予防のためにテノホビル-エムトリシタビン（Truvada）ARTによる曝露前予防（PrEP）を希望するHIV陰性（HIV-）被験者の小規模コホートも登録し、同様に18ヵ月間縦断的にモニタリングしました。これらのデザインを通じて、(i)ARTを実施しないHIVが口腔内細菌叢と菌叢に及ぼす影響を明らかにし、(ii)HIVの有無による分析を通じてARTの独立した効果を同様に評価することができました。
結果
我々は最近、このコホートの口腔内細菌および真菌コミュニティの相対的な存在量および多様性、ならびにART下のHIVおよび多くの二次的臨床変数の影響について報告した（11、23）。以前の論文で分析したグループは、ART中のHIV+被験者と、人口統計学とHIV曝露のリスク（「ハイリスク」）をマッチさせたHIV-コホートでした。今回の研究では、ART開始前のHIV+被験者と、治療開始後1～6ヶ月（初期）および6～18ヶ月（後期）のHIV+被験者のグループを追加して調査しました。さらに、PrEPを希望するHIV-被験者の小規模コホートも登録し、同様にテノホビル-エムトリシタビンによるPrEP開始前と開始後に縦断的にモニターした。一般に、本研究のために新たに分析したサンプルにおける細菌および真菌のコミュニティは、我々の過去の論文（11、23）と同様であった。対象種のサンプル数データおよび付随する臨床メタデータは、補足資料の表S1で入手できます。
補足資料
TABLE S1
種数および臨床データ。個々の被験者のサンプル種データと付随する臨床メタデータを示す。Table S1、XLSXファイル、1.4 MBをダウンロードする。
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縦断的コホートでは、定量的なウイルス量が1,000コピー/mL未満である場合にARTが有効であると定義された（図S1）。ART前のウイルス量の中央値は43,685コピー/mLであったが、ART開始100日以上後の中央値は<20コピー/mLであった（P = 0.0002）。ART前のCD4数の中央値は426個/mm3であったが、ART開始100日以上経過後は525個/mm3まで増加した（P = 0.0002）。これらの結果から、ARTは良好なコンプライアンスで有効であることが示された。
補足資料
図 S1
ARTはウイルス量を大幅に減少させ、CD4カウントをわずかに増加させた。左側は、ARTを受けているHIV+研究対象者のCD4カウントの箱ヒゲプロット、右側はHIV+研究対象者のウイルス量を示しています。ウイルス負荷のアッセイの検出限界は20コピー/mLである。図S1をダウンロード（TIFファイル、2.4 MB）。
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図1は、ART開始前のHIV+被験者（pre-ART）、マッチさせたHIV-高リスク被験者、およびPrEP前のHIV-被験者（pre-PrEP）（すべてのベースライン訪問）におけるブレイ・カーティス非類似度に基づく非計量多次元尺度法（NMDS）による口腔細菌および真菌コミュニティに対するHIVの独立効果を示した。口腔内細菌叢の多変量解析により、歯肉炎、カンジダの存在、現在の喫煙、年齢、歯周病、抗生物質の使用、HIVなど、いくつかの臨床変数が寄与する有意差が明らかになりました（図1A）。これらの影響は口腔内細菌叢の分散の約14%を占め、一方、HIVは同定された分散のわずか1.1%を占めた（P < 0.024）．NMDS分析におけるセントロイドの位置から、HIV-pre-PrEPの被験者は、HIV-ハイリスクおよびHIV+pre-ARTの両グループと異なる細菌コミュニティを有することが明らかである（P < 0.001）。これらの違いは、HIV- pre-PrEP群ではタバコの喫煙が少ない、う蝕が少ない、歯肉炎が少ないなど、人口統計学的/臨床的変数によって部分的に説明される。
図1
図1 HIVが口腔内細菌群集組成に及ぼす影響に関する多変量距離ベース解析。HIV感染者（ハイリスク[HR]）、ART開始前のHIV+感染者、HIV感染者pre-PrEP感染者の口腔内細菌（A）および真菌（B）群集間のブレイ・カーティス非類似度の非計多次元尺度による順序付けを示しています。スパイダーは、サンプルポイントを各グループのセントロイドに接続しています。添付の表は、多変量解析におけるHIV-とHIV+のART開始前のグループ間の有意差のPERMANOVAを示す。*, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.
口腔内マイコバイオームを評価する場合、HIV+のpre-ART被験者とHIV-高リスク被験者を比較すると、HIVが地域分散（2.7%）の主要な影響と考えられた（P < 0.024）（図1B）。他の臨床変数は有意な寄与者ではなかった。HIV-被験者の2つの集団を考慮した場合、セントロイド間の距離は、Pre-PREPグループとHIV-ハイリスクグループの口腔内マイコバイオームも区別されていることを示し（P < 0.001）、う蝕の存在が主要因として特定されている（P < 0.023）。
図2は、HIV+被験者の2つの別々のグループ、HIV+ ART+被験者（ベースライン訪問）とHIV+ ART-被験者（ART開始前のベースライン訪問）の横断的な比較を用いて、口腔内細菌叢とマイコバイオームに対するARTの独立効果に関するBray-Curtis異同のNMDS序列を示す。口腔内細菌叢の多変量解析では、ARTの有意な効果は示されなかったが、歯肉炎と現在の喫煙の有意な寄与が明らかになった（P < 0.001）（図2A）。口腔内マイコバイオームの多変量解析では、ARTの緩やかな効果（P < 0.007）に加え、現在の喫煙と口腔性行為の寄与が少ない（それぞれP < 0.027 と P < 0.02）ことが示された（図2B）。
図2
図2 HIV+者のマイクロバイオームに対するARTの効果の横断的分析。ART下に登録されたHIV+患者を、ART開始前のHIV+患者と比較した。口腔内の細菌（A）および真菌（B）コミュニティ間のBray-Curtis非類似度の非計量多次元尺度による順序付けが示されている。スパイダーは、サンプルポイントを各グループのセントロイドに接続している。添付の表は、多変量解析におけるグループ間の有意差のPERMANOVAを示す。HAART, highly active antiretroviral therapy; *, P < 0.05, **, P < 0.01, *, P < 0.001; NS, not significant.
HIV-ハイリスク被験者とHIV-pre-PrEP被験者との間の違いは、さらに、一般的な健康パラメータと口腔の健康パラメータを連続変数として評価することによって評価された。図3の結果から、HIV-高リスク群は、有意に高齢であり（P < 0.01）、有意に歯数が少なく（P < 0.01）、歯周炎、歯肉炎、齲蝕の発生率が高かった（P < 0.001）ことがわかった。HIV-pre-PrEP対象者は、う蝕修復のレベルが高かった（P < 0.01）。HIV- PrEP群におけるその他の有意差は、男性および白人の被験者の数が多く、アルコール摂取（P < 0.001）、マリファナ使用（P < 0.01）、オーラルセックス行為（P < 0.001）の割合が高かったが、タバコを吸う割合は低かった（P < 0.01 ）。
図3
図3 HIVハイリスク被験者とHIV pre-PrEP被験者との間の臨床変数の順序の比較。ボックス＆ウィスカープロットは、示された変数について示されており、ボックスは25、50、75番目の四分位を示し、ウィスカは四分位間の差の1.5倍または低い場合はデータの限界を示し、異常値は点として示されている。有意性はアスタリスクで示した（, P < 0.01; ***, P < 0.001）.
図4は、35人のHIV+被験者について、ART前のベースラインとART開始後の2回の訪問（1～6ヶ月および6～18ヶ月）の3回の訪問でそれぞれサンプリングした、口腔内細菌叢に対するARTの経時的効果を示しています。その結果、ARTの効果は全体的に緩やかではあるが有意であり（P < 0.005）、全体として細菌組成の2.5%の変化を占めた。NMDSの順序付けでは、線分のクラスタリングと非線形性から、同じ被験者からの経時的なサンプルは、異なる被験者からのサンプルよりも類似していることが示唆されました。このことは、被験者を変数とした順列多変量分散分析（PERMANOVA）により確認された（R2 = 0.58; P < 0.001）．ネスト解析の結果、有意差は主にベースラインとART後1～6ヶ月の間（P < 0.022）、ベースラインとART後6～18ヶ月の比較は有意ではなく、1～6ヶ月と6～18ヶ月の比較は有意（P < 0.001 ）でした。
図4
図4 HIV+者の口腔内細菌叢に及ぼすARTの影響に関する縦断的解析。HIVの診断後、ARTを開始した。サンプルは、ART開始前、ART開始後1～6カ月、6～18カ月に採取された。口腔内細菌群集間のBray-Curtis非類似度の非計量多次元尺度による順序付けを示す。楕円は、集団のセントロイドの95％信頼領域を表す。線分は、経時的に収集された各被験者の3つのNMDSオーダリング点を結ぶ。添付の表は、全体的なPERMANOVA比較と、時間ポイント間のポストホックペアワイズ比較を示しています。
図5は、ベースライン時、テノフォビル-エムトリシタビン開始後1～6ヶ月および6～18ヶ月に同様にサンプリングした17人のHIV-PrEP被験者セットにおける、口腔内細菌叢に対するART/テノフォビル-エムトリシタビンの経時変化を示す。その結果、テノホビル-エムトリシタビンの全体的な効果は、同様に緩やかではあるが有意であり（P < 0.016）、細菌組成の3.4％の変化を占めた。ネスト解析では、ベースラインとART後6～18カ月間で有意差があり（P < 0.041）、ベースラインとART後1～6カ月間で有意になる傾向があった（P < 0.051）。HIV+縦断グループと同様に、HIV- PrEPグループのNMDS序列は、個人からのサンプルの同様のクラスタリングを示し、これは、被験者を変数とするPERMANOVAによって確認された（R2 = 0.65; P < 0.001 ）。
図5
図5 HIV-PrEP被験者におけるARTの口腔内細菌叢への影響に関する縦断的分析。PrEPプログラムのもと、HIV陰性の被験者の要望に応じてARTが開始された。サンプルは、ART開始前（Pre-PrEP）、ART開始後1～6カ月および6～18カ月に採取された。口腔内細菌群集間のBray-Curtis非類似度の非計量多次元尺度による順序付けを示す。楕円はグループセントロイドの95％信頼区間を表す。線分は、経時的に収集された各被験者の3つのNMDSオーダリング点を結ぶ。添付の表は、すべての時点間のPERMANOVA比較を示している。
図6は、治療開始前と治療開始後のHIV+とHIV-PrEPの両被験者の口腔内マイコバイオームに対するART/テノフォビル-エムトリシタビンの経時的効果を示している。その結果、ベースラインとART/tenofovir-emtricitabine療法開始後1～6カ月または6～18カ月との間に有意差は認められませんでした。同一被験者からのサンプルとそれらを結ぶ線の位置関係から、真菌コミュニティでは細菌コミュニティよりも同一被験者からのサンプルの集積が少ないように見え、これは、有意ではあるものの、被験者を変数とするPERMANOVAによって導かれるR2値が低いことで確認された（R2 = 0.020; P = 0.002）.
図6
図6 HIV+およびHIV-PrEP被験者におけるARTの口腔内マイコバイオームへの影響に関する縦断的解析。ARTは、HIV+の被験者についてはHIV診断後に、HIV-の被験者についてはPrEPプログラムの要請に応じて開始された。サンプルは、ART/tenofovir-emtricitabineの開始前（prePrEP）、治療開始後1～6ヶ月および6～18ヶ月に採取されました。口腔内真菌群間のBray-Curtis非類似度の非計量多次元尺度による順序付けを示す。真菌コミュニティの非類似度は、qPCRで調整された存在量を用いて算出された。楕円はグループセントロイドの位置に対する95％信頼区間を表す。線分は、経時的に収集された各被験者の3つのNMDSオーダリング点を結ぶ。各経時的実験の全体的なPERMANOVA P値を示す。
分析を拡張するために、負の二項線形モデルを用いて、種レベルの分類群における変化を評価した。解析は3つの状況について行われた：個々の分類群に対する薬物療法の効果を評価するための抗レトロウイルス治療前と治療中の2つの縦断コホート、薬物療法を行わないHIVの役割を検討するためのHIV+ART前グループとHIV-高リスクグループの横断的比較である。HIV+縦断群では、細菌または真菌のいずれの分類群も、多重検定で調整した後、有意な差は見られなかった。HIV-縦断群では、真菌分類群は有意ではなかったが、4つの細菌分類群が薬剤予防により増加した：Streptococcus salivarius種群、Fusobacterium nucleatum subsp.fusiforme, Prevotella denticola, Catonella morbi. HIV+のART前群とマッチしたHIV-群の断面比較（HIV単独の効果）では、細菌Porphyromonas pasteriと真菌Candida dubliniensisの存在量がそれぞれHIV+群で少なかったです。
考察
我々は以前、ARTを受けているHIV+被験者グループと人口統計学的にマッチしたHIV-被験者グループの口腔内細菌および真菌コミュニティの特徴について、全口うがい・すすぎサンプリングを用いて報告した（11、23）。主な結論は、複数の臨床因子が、ART下のHIVの存在を含め、口腔内の細菌および真菌コミュニティの構成と多様性に大きな影響を与えるというものであった。しかし、HIV/ARTの影響は予想よりもはるかに小さかった。これらの分析における重要な疑問は、ARTが口腔マイクロバイオームに対するHIVのより重大な影響を付加しているのか、あるいは覆い隠しているのか、ということでした。本研究では、HIVの影響とARTの構成要素の独立した評価を可能にする2つの方法で解析を拡張することで、この問題に対処しました。1つは、ART開始前のHIV+被験者のグループを募集し、ART中のHIV+被験者（以前の報告で調査したグループ）と横断的に比較することができました。第二のアプローチは、ART開始前後のHIV+被験者の縦断的解析と、HIV感染予防のために特定のART、すなわちテノホビル-エムトリシタビンを開始したHIV- PrEP被験者グループとの同様のデザインであった。これらの縦断的研究では消耗が激しいため、これらのグループは横断的グループよりも小規模であったが、より限定的な交絡変数があるケースコントロール分析という重要な利点がある。
HIV+のプレART群とHIV-ハイリスク対照群の口腔内細菌および真菌コミュニティを比較評価したところ（HIVの独立効果を測定するため）、HIVは口腔内微生物叢に有意な影響を与えたが（両ケースともP = 0.024）、その効果はR2値（1～3％の分散）によって控えめと見なされた。注目すべきは、このPLWHのコホートは比較的免疫力が高いということです（補足資料のFig.S1参照）。バクテリオームについては、分散パーセントは、歯肉炎、カンジダ陽性、現在の喫煙、年齢、歯周病の状態、抗生物質の使用などの他の臨床変数によってもたらされる分散よりも概して低かった。一方、HIVは、マイコバイオームに対して唯一有意に寄与する変数であった。このように、HIV+ART+の被験者の分析（11, 23）と同様に、ARTを行わないHIVがバクテリオームとマイコバイオームに及ぼす全体的な影響は、控えめではあるが有意であることが示された。これらの結果は、元の分析におけるARTの存在が、HIVのより大きな効果を加えたり、覆い隠したりしていないことを示すと解釈しています。これらの結果に基づき、我々は、口腔内細菌叢と菌叢に対するARTの独立効果も同様に、比較的緩やかであろうと仮定した。
口腔内マイクロバイオームに対するARTの独立効果は、確かに緩やかであった。このことは、ARTの有無でHIV+の被験者を比較した横断的な口腔内バクテリオームおよびマイコバイオーム解析で初めて示された。実際、横断的なバクテリオーム解析では、2つの臨床変数（歯肉炎と喫煙）が有意な効果をもたらしたにもかかわらず、ARTの有無が有意な効果を示すことはなかった。マイコバイオームについては、ARTの効果は、やはり控えめであったが、喫煙やオーラルセックスの習慣を含む臨床変数による有意な寄与よりも大きいものであった。縦断的解析でも同様に、ARTの影響はわずかであったが、横断的解析とは若干の相違があった。口腔内細菌叢で示された有意な効果は、ART後の早い時期（1～6カ月）に限られていたが、菌叢では効果が示されなかった。これらの違いは、いくつかの要因によるものと思われます。横断的解析では、サンプルサイズが大きいため、統計的な検出力は高いが、より多くの交絡変数が存在する可能性がある。縦断的解析は、ケースコントロールデザインであるため、交絡変数からの影響ははるかに少ないが、サンプルサイズによる制限がある。しかし、このような格差があるにせよ、また格差のある結果をより反映しているにせよ、口腔内細菌叢および真菌叢に対するARTの影響はかなり小さいと考えることができる。
ARTの効果のもう1つの指標は、HIV-PrEP被験者の縦断的分析において、ARTレジメンの一般的な構成要素であるテノホビルとエムトリシタビンの影響である。ここでも、この抗レトロウイルス療法（トゥルバダ）が口腔内のバクテリオームとマイコバイオームの両方に及ぼす影響は最小限であった。したがって、これらの結果は、口腔マイクロバイオームに対するARTの影響は最小限であるという仮説を引き続き支持するものである。PrEP対象者は、ARTの効果を評価する上で重要なHIV感染者グループである。HIV感染におけるあらゆる異種生物症を評価する手段として、膣および直腸マイクロバイオームに対するPrEPの効果を評価する限られた数の報告が始まっているが（28、29）、これはPrEP被験者の口腔マイクロバイオームに関する最初の報告である。
ARTの有無にかかわらず、HIV-およびHIV+被験者の口腔マイクロバイオームに対する臨床変数の効果は、我々が以前に報告したものと一致しており（11、23）、患者がARTを受けている間は、臨床変数の寄与は時間の経過とともにかなり一定であることが示唆された。これらには、連続変数とカテゴリー変数の両方が含まれる。ARTで変化した変数には、CD4 T細胞の増加（P < 0.0002）とHIV負荷の減少（P < 0.00002）があり、「有効な」ARTを示すものである。我々は以前、CD4数やHIV量を変化させても、口腔内マイクロバイオームに顕著な影響がないことを報告した（11、23）。
HIV+の被験者において、ARTが口腔内マイクロバイオームに及ぼす影響を縦断的に評価した研究は限られており（25、30）、HIV-の被験者では今のところない。私たちの観察と同様に、これらの過去の縦断的研究（主にART後6ヶ月）では、比較的小さな違いが示されました。ある研究では、ARTの効果は主に被験者の免疫状態と相関していた（25）。もう1つの研究では、ARTの腸内細菌叢への影響は、口腔内細菌叢への影響よりも顕著であった（30）。残念ながら、これらの研究では、HIVの独立した効果に関する逆解析のためのHIV-対照群を含んでいなかった。我々の解析は、臨床的交絡因子の多変量解析やPrEP被験者を含むなど、全体的に包括的であったが、これらの研究はすべて、ARTが口腔マイクロバイオームに対して比較的小さな影響を与えるという点で概ね一致している。これは、HIVやARTの影響に対する種の変化が比較的少ないことも裏付けています。実際、同定された上位50の細菌分類群および25の真菌分類群のうち、HIVの影響による変化は、単一の細菌分類群（Porphyromonas pasteri）と単一の真菌分類群（Candida dubliniensis）のみで、両者はHIV感染者で減少した。C. dubliniensisの減少は、ARTを受けているHIV+の被験者が、マッチさせたHIV-グループと比較した場合にも示されています（11、23）。ARTの影響については、確認された唯一の変化は、PrEPを服用しているHIV感染者において増加した4つの細菌分類群であった。
縦断的コホートでは、異なる被験者からのサンプルと比較して、同じ被験者からのサンプルの類似性が比較的高いことが確認されました。口腔マイクロバイオームのこのような安定性は、他の研究でも指摘されている（31、32）。被験者内の類似性の程度は、特に細菌群集で顕著であり、R2値は、サンプル間の変動の半分以上が被験者変数に起因する可能性があることを示す。真菌コミュニティの場合、被験者に起因する変動が小さい（R2値が低い）のは、口腔内真菌の多様性が低く、種数が少ないこと、および被験者が独立して2～3種の優勢種を保有する傾向があることによると思われる。
HIV-群（ハイリスク群とPrEP群）は、口腔内マイクロバイオーム組成と臨床変数の状態の両方に基づいて、明確に区別されていた。具体的には、口腔マイクロバイオーム組成が異なることに加え、HIV-ハイリスク群はPrEP群と比較して、歯肉炎が多く、喫煙率が高く、カンジダが多く存在し、う蝕が多く、歯の欠損数が多いことがわかった。一方、口腔衛生行動は、歯の清掃、フロス、ブラッシング、マウスウォッシュの使用頻度など、両群間でかなり類似していた。したがって、口腔衛生行動が類似しているにもかかわらず、また、PrEP対象者のサンプルサイズは小さいものの、HIVハイリスク群よりも口腔内の健康状態が良好であるように見受けられた。コホートの人口統計学的構成も異なっており、HIV-PrEP被験者は主に若い白人男性で構成されているのに対し、HIV-ハイリスク群では主に年配の黒人男性でした。娯楽行動に関しては、HIV-PrEP対象者はアルコールとマリファナの使用頻度が高く、オーラルセックスの回数も多かったが、喫煙と炭酸飲料の飲用は少なかった。行動におけるいくつかの違いは、PrEP対象者がHIV+パートナーとはいえ一夫一婦制の関係にあることを反映しているのかもしれません（PrEP参加の条件）。その他の違いは、両群の年齢差が10歳程度であったことに起因している可能性がある。
結論として、本研究は、HIV+およびHIV-の大規模コホートにおいて、HIVおよびARTが口腔マイクロバイオーム（細菌および真菌の両方）に及ぼす独立した影響について、横断的および縦断的解析を含む強固な包括的解析を行ったものです。全体として、口腔マイクロバイオームに対するHIVとARTの独立効果は有意であり、臨床変数と同様であるが、全体として緩やかであり、ARTを受けているHIV+被験者に関する我々の以前の結果と一致している（11、23）。本研究は、サンプルサイズが大きく、包括的なものであったが、いくつかの限界もあった。例えば、複数の登録・収集施設（人員、地理的位置、物理的空間）があり、これは多様性をもたらす一方で、口腔マイクロバイオームの違いに影響を与える交絡因子として繰り返し確認されている（11, 23）。縦断的解析のもう一つの限界は、ほぼ50％の脱落率であり、縦断的解析の検出力を低下させた。最後に、使用したアンプリコンシークエンスのアプローチでは、種に近いレベルまでしか同定できない。そのため、細菌株と真菌株の間のより特異的な違いが見落とされた可能性があります。しかしながら、本研究の限界の範囲内で、HIV、ART、および評価した臨床変数の寄与は、コホート内の比較分析によって、口腔内細菌叢/マイコバイオームの変化全体の15%を占めた。したがって、口腔内細菌叢またはマイコバイオーム組成の全変動のうち、残りの85%は説明されていない（residual）。コホート内の口腔内微生物組成の全体的なばらつきに、歯以外の要因（遺伝、食事、環境、社会経済、確率的影響など）がさらにどのように寄与しているかを明らかにするための追加研究を行うことが重要であろう。
材料と方法
臨床的な方法
募集、臨床データの収集、無症候性酵母の検出、OPCの診断、および口腔洗浄液のサンプル収集は、以前に記述したように実施した（23）。オリジナルのコホート（23）は、470人の被験者、すなわち、121人のHIV-被験者と349人のHIV+被験者で構成されていた。前回のバクテリオーム解析では、ARTを受けている257人のHIV+被験者と89人のマッチしたHIV-ハイリスク被験者が含まれていた（23）。前回のマイコバイオーム解析では、ART中のHIV+被験者149名とマッチングしたHIV-被験者88名を対象とした(11)。今回の研究では、HIV+の被験者には、ART前に登録され評価された人（n = 71）（男性54人、女性17人、黒人55人、白人10人、特定できない人種6人、年齢中央値40.7歳）、ART中に登録され評価済みの人（n = 257）（23歳）も含まれていた。また、行動に基づいてHIV曝露のリスクが高いマッチングHIV-被験者（n = 93）も含まれた（23）。ART前に登録されたHIV+患者は、ベースライン評価/検査後にARTに移行し、最長18ヶ月間縦断的にモニタリングされ、1～6ヶ月間（早期）（n = 58）、6～18ヶ月間（後期）（n = 42）に再度サンプルが採取された。抗レトロウイルスレジメンは作用機序によって分類され、逆転写酵素阻害剤（RTI）、インテグラーゼ阻害剤、非核酸系逆転写酵素阻害剤（NNRTI）、受容体拮抗剤などが含まれました。ART中に登録された人の場合、ほとんどが3つのレジメンのうち1つを服用していた： RTI単独、RTIにインテグラーゼ阻害剤を加えたもの、RTIにNNRTIを加えたものです。これらのレジメンのいずれにおいても、微生物群集の構成に有意な差は認められなかった（データは示さず）。さらに、HIV+パートナーと一緒にいるHIV-被験者のHIV感染を予防することを目的とした確立されたプログラムの一環として、PrEP（n = 29）を実施したHIV-被験者のグループ（男性26人、女性3人、白人19人、黒人8人、特定できない人種2人、年齢中央値30.1歳）があった。PrEP被験者も同様にモニターされ、テノホビルとエムトリシタビン（Truvada）を含む治療後の早期評価（n = 21）と後期評価（n = 17）が行われました。マイコバイオーム解析には、バクテリオーム解析の被験者の一部が含まれ、ART/tenofovir-emtricitabine投与中のHIV+被験者56人とHIV-被験者29人、マッチしたHIV-被験者87人、ART中のHIV+被験者115人からなる。解析は、完全なデータセットを持つ被験者に対してのみ行われた。HIV+被験者については、ART後の最終的な縦断的解析には35名の被験者が含まれた。HIV- PrEP被験者については、最終的な縦断的分析には17人の被験者が含まれた。
DNAの抽出と配列決定
DNAは、細菌または真菌の配列決定に使用するかどうかに基づいて変化させながら、以前に記載されたように（11、23、33）、全口うがい/すすぎサンプルから調製されました。
シーケンスライブラリーは、イルミナの16Sプロトコル（11、23、34）に基づく2段階の手順で調製し、インデックス配列は2番目の増幅ステップで追加した。二重インデックスのセットは、もともとKozichらによって開発されたものである（35）。最低限、各プレートにノーテンプレートコントロールとモックコミュニティコントロールが1つずつ含まれていた。模擬コミュニティサンプルは、含まれるゲノムから予想される配列を普遍的に与え、一方、ノーテンプレートコントロールは、通常、少数のランダム配列を与えた。
塩基配列データの処理
配列リードは、mothurを使用してコンティグに結合し、BLASTnを使用してCOREデータベースにアライメントした。さらに、pythonとphpスクリプトを使用して、以前に記述したように処理を行った（11, 36-38）。
細菌および真菌の全DNAのqPCR。
Bio-Rad iCyclerリアルタイム検出システムを用いて、細菌DNAの濃度を定量化した。DNAの1マイクロリットルを、1×SsoFast EvaGreen supermix（Bio-Rad）およびプライマーEub338F（ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG）およびEub518R（ATT ACC GCG GCT GCT GG）の20-μL反応混合物に含ませた。熱工程は98℃2分、98℃5秒、64℃5秒の45サイクルであった。精製Porphyromonas gingivalisゲノムDNAを標準として使用した。
真菌DNAは、ITS2（internal transcribed spacer 2）領域の定量PCR（qPCR）により測定した。使用したプライマーは、5.8s-F（TCG ATG AAG ARC GCA GC）とシークエンスに使用した28Sリバースプライマーである。サイクリング条件および装置の設定は、細菌qPCRに使用したものと同じであった。精製したCandida albicansゲノムDNAを標準として使用した。
統計解析。
臨床データは、以前に記載したように収集し、計算した（11、23）。交絡因子分析のために、微生物群集組成に対する臨床変数の独立した寄与を、ノンパラメトリックの並べ替えベースの分散分析（ANOVA）であるPERMANOVA（veganのadonis関数）により決定した。
距離ベースの冗長性分析（db-RDA）は、capscale（vegan）を使用して行った。変数は、段階的なdb-RDAモデル選択プロセス（ordiR2step；vegan）に含まれた。残りの変数の限界有意性は、制約された順序付けのための順列ベースのANOVA（anova.cca; vegan）によって検証された。統計的検定は、他の有意な変数の存在下でのHIVの限界効果について行われ、変数間の可能な相関の問題を回避した。多重比較の調整後に微生物群集組成の変動に有意に寄与した臨床変数のみが、db-RDA序列化のためのモデル選択に入力された（39）。縦断的データセットの場合、veganのadonis関数のstrataパラメータを被験者識別子に設定し、被験者内の類似性を調整するためにパーミュテーションを適切に制限した。
細菌分類群における統計的に有意な変化は、負の二項線形モデルを用いて決定した。ART/PrEPに関する縦断的研究の場合、被験者は混合効果分析におけるランダム効果として使用された。モデルはRのglmmTMBライブラリを用いて実装した（40）。細菌集団については、相対存在量が最も高い上位50種レベルの分類群を、真菌集団については上位25種を含めた。モデルには、同じ被験者グループのコミュニティ全体に有意な影響を及ぼす測定されたすべての臨床変数を含めた。有意な分類群は、Benjamini-Hochberg 偽発見率法（39）で調整した後、q値が<0.05となるように選択した。
反復測定を考慮しながらART後のCD4カウントとHIV負荷の変化の統計的有意性を決定するために、ART前とART後の被験者（CD4カウントはn = 28、HIV負荷はn = 26）から測定値のペアを選択し、ペアのウィルコクソン検定（Rのstatsパッケージのwilcox.test関数を使用）を実行しました。
統計解析に使用したコードは、OSUコードリポジトリ（https://code.osu.edu/beall-3/hiv_longitudinal）に寄託されています。
データの利用可能性
本研究で生成された配列ファイルは、BioProjectアクセッション番号PRJNA530161でNCBI Sequence Read Archive (SRA) (22)に寄託されました。
謝辞
ルイジアナ臨床・トランスレーショナル科学（LA CaTS）センター、米国国立衛生研究所（NIH）の助成金U54 GM104940、LSUHSC Clinical and Translational Research Center（CTRC）による支援の一部に感謝します。本研究は、米国国立衛生研究所National Institute of Dental and Craniofacial ResearchのMPI R01-DE22815 (P.L.F., M.E.H., A.L.G., and E.J.L.) から資金提供を受けています。
脚注
本論文は、米国微生物学会のフェローであるPaul L. Fidelが直接投稿したもので、Patricia Diaz（University of Buffalo School of Dental Medicine）とAaron Weinberg（Case Western Reserve University）のレビューを手配して確保した。
補足資料
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