プレセニリン1/2コンディショナルダブルノックアウトマウスにおける尿中メタボロームと微生物叢に対する鍼治療の影響

2023年1月30日 10:02

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ORIGINAL RESEARCH（オリジナル研究）論文
Front. Microbiol.、2023年1月24日
第2部脊椎動物の消化器官における微生物
第13巻 - 2022年｜https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.1047121
プレセニリン1/2コンディショナルダブルノックアウトマウスにおける尿中メタボロームと微生物叢に対する鍼治療の影響
Jie Gao1,2† Nian Zhou3,4† Mengna Lu3,5† Qixue Wang3, Chenyi Zhao6, Jian Wang1*, Mingmei Zhou3* and Ying Xu6*
1上海中医薬大学リハビリテーション科学院，中国，上海
2南通大学附属病院リハビリテーション医学部（中国・南通市
3上海中医薬大学学際医学科学研究所（中国・上海市
4同済大学医学院上海十人病院がんセンター（中国・上海市
5上海中医薬大学薬学院（中国・上海市
6上海中医薬大学基礎医学院生理学教室（中国・上海市
目的：アルツハイマー病（AD）の治療は、病態が不明であること、有効な治療標的がないことから、現在も世界的に問題となっている。近年、AD患者におけるメタボロームや腸内細菌の変化が注目され、その病因の新たな仮説としてマイクロバイオーム-腸-脳（MGB）軸が提唱されている。電気鍼（EA）がADの認知障害を効率的に緩和すること、そのメカニズム、特に腸内細菌叢への影響についてはまだ十分に解明されていないことを考慮し、ADにおけるEA治療の腸内細菌叢への影響を観察し、影響を受けた腸内細菌叢と代謝物の関連を見つけるために、EA治療を行ったADモデルマウス（PS cDKOマウス）の尿メタボロームおよび微生物群プロファイリングを実施しました。

材料と方法 EA投与30日後、PS cDKOマウスの認識記憶能力をY迷路と新規物体認識課題により評価した。尿中メタボロームプロファイリングはアンターゲットGC-MS法で行い、微生物群集の解析には16S rRNA配列解析を適用した。さらに、尿中代謝物の差分と腸内細菌叢との関連をスピアマンの相関係数分析により明らかにした。

主な結果 PS cDKOマウスの尿中メタボロームと腸内細菌叢は、EA投与の結果、認知障害の逆転に加え、変化していた。特に、グリオキシル酸やジカルボン酸の代謝、グリシン、セリン、スレオニンの代謝に関与するイソバレリルグリシンの増加、PS cDKOマウスの尿中のグリシンやスリオン酸の減少がEA処理により回復した。また、EA処理により微生物群集の多様性と豊かさが著しく向上したことに加え、Mucispirillum属の存在量が著しく増加した。一方、PS cDKOマウスで変化した他の主要な腸内細菌叢、norank_f_Muribaculaceae、LactobacillusおよびLachnospiraceae_NK4A136群に対しては顕著な影響を示さないことが判明した。尿中代謝物の差と腸内細菌叢の差に有意な相関が見られた。

意義はある。電気鍼は腸内細菌叢と代謝産物を調節することでADの認知障害を緩和する。MucispirillumはEA治療の基礎的なメカニズムにおいて重要な役割を担っている可能性がある。MGB軸からの今後のAD治療の参考となる研究である。

1.はじめに
アルツハイマー病（AD）は、主に記憶障害、失行、失認、空間能力障害、計算能力障害、性格・行動変化などが現れる神経変性疾患である。ADは、高齢者における障害および死亡の原因として、心血管・脳血管疾患および悪性腫瘍に次ぐ第3位となっています（Du et al.、2018）。その病因については、神経細胞の細胞外にアミロイドβ（Aβ）が異常沈着する、神経細胞にタウタンパク質の接索線維が形成される、炎症、コリン作動性神経細胞の障害、酸化ストレスなど、さまざまな仮説がある。しかし、一つの仮説でこの病気を完全に説明することは難しい。過去10年以上、マイクロバイオームの変化が神経変性疾患と密接に関係していると広く信じられており、その中でもADは最も代表的な疾患の一つである。異なるADトランスジェニックマウスの腸内細菌叢は、年齢とともに変化し、疾患進行との関連を示唆することが報告されています（Zhang L. et al., 2017; Wang et al., 2019）。同様に、AD患者の糞便サンプルにおける微生物叢の組成と多様性も、健常者と比較して変化しています（Zhuangら、2018）。脳、腸、腸内細菌叢の間の直接的または間接的な関係を説明するために使用されてきたマイクロバイオーム-腸-脳（MGB）軸は、主に3つの異なるが並列のコミュニケーション経路「神経-免疫-内分泌」を介した双方向クロストークです（Duら、2018； Sun M. ら、2020年）。

最近のいくつかの研究は、ADの病因におけるMGB軸の変化の証拠を充実させ、腸内細菌叢の変化とともにADプロセスの様々な特性を説明する可能性がある。APPSWE/PS1ΔE9トランスジェニックマウスでは、抗生物質による腸内細菌の多様性の乱れが、Aβプラークの沈着と神経炎症に影響を与えることを示しています（Minterら、2016年）。また、Lactobacillus plantarumは、腸内細菌組成のリモデリング、腸内細菌の代謝物であるトリメチルアミン-N-オキシドの合成抑制、クラスタータンパク質レベルの低減により、APP/PS1マウスにおけるメマンチン治療の有益な効果の強化に寄与しました。また、この研究では、認知機能の低下が改善され、海馬のAβレベルが低下し、マウスの神経細胞の完全性と可塑性が保護されたことが確認されています（Wang et al.、2020）。さらに、腸内細菌叢を改変するプロバイオティクスの経口投与は、3xTg-ADマウスの酸化ストレスの低減（Bonfiliら、2018）およびグルコース恒常性の回復に有益であることが証明されており（Bonfiliら、2019）、グルコース代謝異常もADにつながる最も重要な臨床・生化学特性の一つである（Adlimoghaddamら、2019）。

腸内細菌叢に由来する代謝産物は、MGB軸において重要な役割を担っています。例えば、腸内細菌叢由来の短鎖脂肪酸、例えば、吉草酸、酪酸、プロピオン酸は、Aβ凝集を妨害することができる（Ho et al.、2018年）。同様に、3-ヒドロキシ安息香酸や3-（3′-ヒドロキシフェニル）プロピオン酸（Wangら、2015）などの健康な腸内の豊富な細菌から放出される代謝産物は認知機能をサポートするが、ADの炎症性細菌が放出する代謝産物は中枢神経系の炎症を悪化させた（Bostanciklioglu、2019年）。さらに、脳内グルコース代謝（Cisternas and Inestrosa, 2017; Adlimoghaddam et al., 2019）、脂質代謝（Han et al., 2011; Liao et al., 2017）、ドーパミンノレピネフリン経路におけるいくつかのアミノ酸の代謝（Kaddurah-Daouk et al., 2011）などのADの代謝における様々な変化が明らかにされている研究が増えてきている。メタボロームアプローチは、代謝プロファイルの定性的および定量的な分析に利用することができます。他の生体液と比較して、尿サンプルは非侵襲的に取得でき、豊富な代謝物を含み、体内のすべての生化学経路のアンバランスを反映します（Khamis et al.、2017）。尿メタボロミクスは、特定の疾患や治療介入における微妙な代謝の違いを検出することができます。

中国発祥の伝統的治療法である電気鍼治療（EA）は、今や世界中で受け入れられています。ADの認知障害に対するEAの有効性は、臨床研究および動物実験で広く報告されています（Pengら、2017；Caiら、2019）。神経炎症の抑制（Cai et al., 2019）、N-アセチルアスパラギン酸、グルタミン酸およびグルコース代謝の改善（Liu et al., 2017; Lin et al., 2018）、Aβ沈着物の減少（Li X. et al, 2014; Tang et al., 2019）、BDNFの発現上昇と神経新生の促進（Li X. et al., 2014; Lin et al., 2016）、PPAR-γの活性化（Zhang M. et al., 2017）、NOX2関連酸化ストレスの減衰（Wu et al., 2017）などが報告されています。しかし、その生物学的基盤は未だ不明であり、ADに対する効果と腸内細菌叢との関連はほとんど報告されていない。前述の通り、腸内細菌叢はADの進行に非常に重要な役割を担っています。したがって、ADにおけるEAの潜在的な役割を、特に腸内細菌叢とメタボロミクスから明らかにすることが非常に必要である。

プレセニリン1/2コンディショナルダブルノックアウト（PS cDKO）マウスは、ADの典型的な表現型を持つマウスとして広く受け入れられている（Sauraら、2004；Lee and Aoki、2012；Zhaoら、2019）。彼らは、初期から認知障害やシナプス可塑性障害、成熟期には明らかな神経炎症、後期には高リン酸化タウ、皮質および海馬の萎縮など、年齢依存的なAD様症状および病理を示す（Sauraら、2004; Chenら、2008; Zhaoら、2019)。さらに、私たちのこれまでの研究では、病気の進行に関連する代謝および微生物学的変化を示すことが証明されています（Gao et al., 2021b）。これらを考慮し、本研究では、PS cDKOマウスのメタボロームおよび腸内細菌叢に対するEAの影響を調べ、さらにEAが腸内細菌調節下で認知に作用する潜在的なメカニズムを見出すことを目的とします。

材料と方法
2.1. 動物
PS cDKOマウスの作製と遺伝子型は既報の通りである(Saura et al., 2004)。Cre、FPS1/fPS1、PS2-/-を導入したマウスをPS cDKOマウスとして、導入していないCre、FPS1/+、PS2+/+、PS2±を野生型（WT）群に割り当てた。すべてのマウスは、生まれたときから特定の病原体を含まない環境で飼育され、餌と水は自由に利用できた。12時間明暗サイクルの部屋は23±2℃に制御されていた。本研究におけるすべての動物プロトコルは、上海中医薬大学の動物実験（PZSHUTCM191025005）の承認を受け、関連するガイドラインと規則に従って実施された。また、すべての方法は、ARRIVEガイドラインに準拠している。

2.2. 電気鍼治療とサンプル採取
5ヶ月齢のPS cDKOマウスを、cDKO群とEA治療を伴うcDKO群（n = 6）に無作為に割り付けた。群間のマウスは、オスとメスが半分ずつになるように性別をマッチさせた。各群のマウスは、マイクロバイオーム移転によるケージの影響を回避するため、別々に飼育した。cDKO＋EA群では、使い捨て鍼（0.17mm×7mm、長春AIK医療器有限公司、中国長春市）を同側肢の神門（HT7）および太衝（KI3）の筋層に垂直に刺入した。神門のツボは前肢の手根横筋の尺側端にあり、太渓のツボはアキレス腱と内側踝の中間点にある。治療では両側のツボを交互に使用した。パルスジェネレーター（G6805，上海医科器械高科技有限公司，上海，中国）を接続し，鍼に電流を流した（連続波：2Hz，1mA，持続時間15分）。EA刺激は毎日午前8時から行い、30日間持続させた。cDKO群マウスとWT群マウスは、同じ種類の固定を等しい時間行った。その後、糞便を採取した。尿の採取は、各マウスを別々に代謝ケージに入れ、絶食状態で1日飼育した。また、全ての手順は、特定の病原体のない環境下で行った。糞便および尿のサンプルは、液体窒素でスナップ冷凍し、さらに分析する前に-80℃で保存した。

2.3. 行動試験
EAがPS cDKOマウスの認知障害に影響を及ぼすかどうかを観察するために、Y迷路とNovel物体認識課題（Gaoら、2021a）を3日間の間隔で連続的に実施した。マウスは事前に防音された行動室に入れ、状況に適応させた。操作者は、各マウスの行動試験時の状態を把握していなかった。

2.3.1. Y迷路
空間認識記憶能力の評価に用いるY迷路は、既述の通り実施した（Gao et al.、2021a）。まず、新規アームと名付けた1つのアームをブロックした。各マウスを開始アームに置き、中央の結合部位を向き、開いた2つのアームを8分間自由に探検させた。1時間後、新規アームを開放し、マウスを開始アームに戻して3本のアームを自由に探索させた。マウスが新規armに滞在した時間の割合と進入回数を算出した。

2.3.2. 新規物体認識課題
3回のセッションを含む新規物体認識課題も認識記憶能力を評価するために使用した。1回目の訓練では、同じ大きさ、形、色、材質の2つの物体を設置したオープンフィールドチャンバーを用意し、各マウスをその中に入れて探索させた。各マウスはその中に入って5分間探索した。1時間後と24時間後にマウスを再びチャンバーに入れたが、片方の物体を大きさ、色、形が異なる物体に交換した。各マウスが各物体を探索するのに費やした時間を記録した。マウスが両物体を探索した合計時間に対する、同じ物体(トレーニングセッション中)と新規物体(次の2セッション)のいずれかを探索した時間の比率を嗜好指数として計算した。

2.4. 尿中メタボロームシグネチャー
尿の代謝物は、以前に記載されたように、アンターゲットガスクロマトグラフィー-飛行時間型質量分析計（GC-MS）メタボロミクス法に従って行った（Maら、2018年）。簡単に言えば、まず尿サンプルを室温で解凍し、よく振った後、12,000rpmで10分間遠心分離した。100マイクロリットルの上清を取り、70IUウレアーゼと15分間混合して尿素変性を行い、メタノールとミリスチン酸を加えた。上清を遠心分離し、窒素気流を用いて乾燥させた。次に，調製したメトキシドに，ピリジンを溶解したメトキシアミンを加えてカルボニル基と結合させた。その後，NO-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamideを誘導体化試薬として作用させ，前処理を行った。試料分析には、Agilent 6890/5975B GC/MSD システムを使用しました。高純度ヘリウムをキャリアガスとするキャピラリーカラム (Agilent J&W DB-5ms Ultra Inert 30 m × 250 μm, i.d., 0.25 μm film thickness) に各 1 μL の分析対象物を 1.0 ml/min の一定流速で注入した。溶媒遅延時間は5分に設定した。GCの温度プログラムは、70℃で2分間、その後2.5℃/分のオーブン昇温で160℃、5℃/分の速度で240℃まで昇温し、その温度で16分間維持した。インジェクター、EI鉄源、界面の温度は、それぞれ280、230、260℃に設定した。測定は電子衝撃イオン化（70eV）を用い、フルスキャンモード（m/z 50-600）で収集した。

2.5. 微生物群集のプロファイリング
E.Z.N.A.® soil DNA kit (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, USA) を用いて、標準プロトコルに従って糞便内容物から全微生物DNAを抽出した。DNA抽出にはゲル電気泳動（0.8%アガロースゲル）を用い、その後、紫外線分光光度計（Thermo Fisher Scientific, Wilmington, USA）を用いてDNA濃度と純度を評価した。細菌16SリボソームRNA遺伝子の超可変領域（V3-V4）を増幅するために、プライマーのセット（338F：5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′および806R：5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）を使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅産物を2％アガロースゲル電気泳動で確認し、AxyPrep DNA Gel Extraction kit（AXYGEN Biosciences, Union City, CA, USA）により精製した。精製したアンプリコンを等モル比で結合し、マイクロプレートリーダー（BioTek, FLx800、米国）を用いて定量を行った。最後に、標準的な指示の下、Illumina MiSeqプラットフォームでペアターミナルシーケンスを行った（Majorbio Biopharm Technology Co.Ltd., Shanghai, PRC）。

2.6. データ解析
まず、GC-MS で分析した生データを Agilent MSD ワークステーションで NetCDF 形式に変換した。その後、XCMS toolkit スクリプトおよび R 2.13.2 (Lucent Technology, Reston, VA, USA) パッケージを前処理に使用し、続いて Simca 14 ソフトウェア (Umetrics, Umea, Sweden) をさらなる処理に使用しました。生のFASTQファイルは、我々が以前に記載したように（Gaoら、2021b）、fastpバージョン0.20.0によって脱多重化および修飾し、FLASHバージョン1.2.7によって併合された。300bpのリードは、50bpのスライディングウィンドウで平均品質スコアが20以下になった部位で切断された。10 bp以上のオーバーラップ配列のみをアセンブルし、オーバーラップ領域の最大ミスマッチ比率は0.2とした。また、バーコードとプライマーでサンプルを区別し、プライマーのマッチングでは2塩基のミスマッチのみを許容する。類似度97%のカットオフで選んだ操作型分類単位（OTU）は、UPARSE version 7.1を使ってクラスタリングした。各OTUの代表的な配列の分類は、RDP Classifier version 2.2により信頼度閾値0.7で解析した。α-diversityの差はShannon指数とChao指数で計算した。β-多様性は、主座標分析（PCoA）プロットで可視化し、グループ間の群集構造の違いまたは類似性を推定するために行った。統計的な有意性は部分最小二乗判別分析（PLS-DA）により評価した。グループ間の細菌分類の違いは、線形判別分析（LDA）の効果量（LEfSe）により推定した。

統計解析は，SPSS 25.0による一元配置分散分析，両側Studentのt検定，またはPearsonの多変量線形回帰分析で行った．摂動した尿中メタボロームと腸管分類群とのスピアマンの相関係数はヒートマップで表示した。すべての数値データは、平均値±標準偏差（SD）で示した。P < 0.05を統計的に有意とした。腸内細菌の各ウェルコリレーションメンバーの代謝的関連性（｜r｜＞0.4）は、相互相関図として考慮した。

結果
3.1. 鍼治療はPS cDKOマウスの認知障害を改善する
PS cDKOマウスは、一般に認知障害を特徴とするADモデルであり、我々の研究とも一致する。マウスが新しいものを好むことはよく知られている。Y迷路では、PS cDKOマウスはWTコントロールと比較して、新規アームでの継続時間と回数が有意に減少し、最初はブロックされていた。これは空間認識記憶の低下を示している。しかし、EAを投与すると、新規アームで観察される持続時間と頻度が改善された（図1A, B）。興味深いことに、新規物体認識課題でも同様の事例が起こった。訓練期間中、マウスは2つの類似物体に対して群間で異なる嗜好性を示さなかった（Fig.1C）。一方、PS cDKOマウスは新規物体への探索にあまり時間をかけなかった（図1C, D）。しかし、その後の24時間の試験（長時間記憶）では、WTマウスにもPS cDKOマウスにもそのような傾向は見られなかったことから、PS cDKOマウスは短時間の新規物体認識記憶が損なわれていることが示唆された。しかし、1時間テストでは、EA投与により新規物体探索に費やされる時間が逆転した。

図1
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図1. PS cDKOマウスの認知障害を改善する電気鍼治療。Y迷路の新規アームへの進入時間（A）と進入頻度（B）。記号"°"は個体を意味する。(C,D) 新規物体認識課題における嗜好性指標。一元配置分散分析、*P < 0.05, **P < 0.01、N = 6。

これらのことから、EAが短期記憶障害を改善することが示された。

3.2. PS cDKOマウスにおける鍼治療による尿中メタボロームの変化
主成分分析（PCA）およびPLS-DAのパターンを確立することで、グループ間の全体的なクラスタリングと傾向を観察した。図2Aに示すように、PCAスコアプロットではWT、cDKO、cDKO＋EA群の間で有意な分離が見られた（R2X = 0.821, Q2 = 0.508）。さらに、PLS-DAスコアプロット（図2B）では、cDKO群がWT群およびcDKO＋EA群から分離した（R2X = 0.864, R2Y = 0.982, Q2 = 0.959 ）。この結果から、モデルの構築は成功し、EA投与はcDKOによって引き起こされる尿の代謝交代を改善するようであることが示された。OPLS-DAプロット（補足図1A、B）において、WT群とDKO群は有意な偏差を示した（R2X = 0.689, R2Y = 0.992, Q2 = 0.918 ）。また、補足図1Cでは、cDKO＋EA群はcDKO群と比較して特徴的な代謝プロファイルを示した（R2X = 0.639, R2Y = 0.956, Q2 = 0.798）。

図2
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図2. 尿中代謝物に関する多変量統計解析のスコアプロット。WT、cDKO、cDKO＋EA群のPCAスコアプロット（A）およびPLS-DAスコアプロット（B）。N = 6.

OPLS-DAのSプロットおよびVIP（投影における変数の重要度）を用いた差分代謝物のスクリーニングおよび同定（VIP＞1）、さらにペアワイズt検定で検証した（P < 0.05）（Xue et al、2021）。図3Aに示すように、cDKO群と比較してWT群では合計11種類の差分代謝物が確認され、WT群ではm-クレゾールとイソバリルグリシンが減少し、他の9種類の差分代謝物が増加した。同時に、cDKO＋EA群では、これら11種類の差分代謝物の存在量も観察された（補足図1E）。cDKO群と比較して、cDKO＋EA群では、イソバリルグリシンが明らかに減少し、グリシンとスリオン酸が増加し、他の8つの代謝物はほとんど変化しなかった（補足図1Eおよび図3B）。さらに、cDKO群とcDKO＋EA群では合計7種類の代謝物が同定され、そのうち3種類の代謝物がcDKO＋EA群で減少していた（図3B）。これらの代謝物の詳細を補足表1, 2に示す。

図3
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図3. cDKO群とWT群（A）、cDKO群とcDKO＋EA群（B）における代謝物の差分ヒートマップ、N = 6.

3.3. 電気鍼による代謝経路への影響とネットワーク解析
KEGGデータベースとHMDBデータベースを用いて、尿中微量代謝物と潜在的な関連経路を関連付け、さらにMetaboAnalyst 3.0を用いて、その影響値を決定した。その結果、cDKO群とWT群を比較すると、最も関連性の高い8つの代謝パスウェイが阻害されていることがわかった（インパクトファクター≧0.1）。それらは、グリオキシル酸およびジカルボン酸代謝、クエン酸サイクル（TCAサイクル）、アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸代謝、グルタチオン代謝、アルギニン生合成、ペントースおよびグルクロン酸相互変換、グリシン、セリンおよびスレオニン代謝、d-グルタミンおよびd-グルタミン酸代謝であった（図4A）。さらに、cDKOおよびcDKO＋EA群では、主に2つの代謝経路が影響を受けていることが観察された。それらは、グリオキシル酸およびジカルボン酸代謝とグリシン、セリン、およびスレオニン代謝である（図4B）。また、3つのグループで同一の代謝経路が2つ存在したことから、この2つの経路がADの病態過程およびEA治療の経過に重要な役割を担っている可能性が示唆された。

図4
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図4. metaboanalystを用いた尿中代謝物のパスウェイ解析（インパクトファクター≥0.1）。(A) PS cDKOマウスの代謝経路の乱れ。(B）鍼治療後のPS cDKOマウスの影響された代謝経路。(1）グリオキシル酸およびジカルボン酸代謝、（2）クエン酸サイクル（TCAサイクル）、（3）アラニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸代謝、（4）グルタチオン代謝、（5）アルギニン生合成、（6）五糖およびグルクロン酸相互変換、（7）グリシン、セリンおよびスレオニン代謝、（8）d-グルタミンおよびd-グルタミン酸代謝。N = 6.

3.4. PS cDKO マウスにおける鍼治療による腸内細菌叢の変化
我々の以前の研究では、PS cDKOマウスにおいて腸内細菌叢が変化していることが確認されているが（Gao et al., 2021b）、EAがそれに及ぼす影響についてはまだ不明である。3群におけるコミュニティの多様性と豊かさを反映するために、ShannonとChao1を含むα-diversity indexを実施した。Shannon指数では、PS cDKOマウスは微生物群集内の多様性が低下しているが、PS cDKOマウスにEAを投与すると元に戻ることがわかった（図5A）。Chao1指数でも同様の傾向が見られ（図5B）、EAがPS cDKOマウスの群集の豊かさを改善していることが示された。さらに、PcoAとPLS-DAでは、PS cDKOマウスとWTマウスの腸内細菌叢の群集構造が明らかに異なり、PS cDKOマウスにEAを投与すると群集構造が変化した（図5C, D）。特に、PcoAでは、cDKO＋EA群の群集構造がWT群に近くなっていることが確認された。さらに、微生物群集の組成を直感的に示すことができる3群の腸内細菌群の群集存在比を調査した。属の微生物群集は、Lactobacillus、Bacteroides、Dubosiellaが3群で最も顕著であり、次いでLachnospiraceae_NK4A136_group、Prebotellaceae_UGG-001であり、PS cDKOマウスではこれら3種の微生物群集の存在量が増加した（図5E）。EA後、それらの総量は減少し、LactobacillusとBacteroidesの存在量は混乱した変動を示した。また、PS cDKOマウスでは、Lachnospiraceae_NK4A136_groupとPrevotellaceae_UGG-001が減少していることが確認された。これらの相対量は、PS cDKOマウスにEAを投与することで逆転したが、あまり顕著ではなかった。これらの結果は、PS cDKOマウスにおいて、EAが微生物群集の多様性と豊かさを向上させ、群集構造を変化させ、変化した主要微生物群の存在量が緩和されたことを示唆するものであった。

図5
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図5. PS cDKOマウスの腸内分類群に対する電気鍼の影響。腸内細菌叢のShannon（A）およびChao1（B）のα-多様性指数。*P < 0.05. WT、cDKO、cDKO＋EA群の腸内細菌叢組成をOUTレベルでPCoA（C）およびPLS-DA（D）したもの。(E）3群の腸内細菌叢の相対的存在量、および属レベルで着色、N＝6。

3.5. PS cDKOマウスにおける鍼治療による腸内細菌群の構造の変化
腸内細菌叢の構造の正確な変化を明らかにするために、LEfSe分析を行い、異なるグループの腸内細菌叢を多様な分類レベルで比較した。LEfSe解析の結果、PS cDKOマウスは主に門から属までg_Lactobacillus、f_Lactobacillaceae、o_Lactobacillales、c_Bacilli、f_Peptostreptococcaceae、g_Romboutsia、g_Ralstonia（LDAスコア3以上）の濃縮度が高く（図6A）、一方WTマウスは他の27種の微生物叢が高いことが大きな特徴となることが明らかとなった。さらに、PS cDKOマウスと比較して、EAを投与したPS cDKOマウスは、f_Marinifilaceae、g_Odoribacter、f_Deferribacteraceae、g_Mucispirillum、c_Deferribacteresの高い濃縮によって特徴づけられた。p_Deferribacteres、o_Deferribacterales、g_未分類_f_Ruminococcaceae、f_Clostridiaceae_1、g_Candidatus_Arthromitus、g_未分類_f_Atopobiaceae（LDAスコア3以上）(Figure 6B)．各グループの濃縮分類群間の階層的な関係は、クラドグラム上で明確に示された（図6C、D）。PS cDKOマウスで最も濃縮された3つの分類群、g_Lactobacillus、f_Lactobacillaceae、o_Lactobacillalesはいずれもc_Bacilliのサブセットであり、g_Lactobacillusはf_Lactobacillaceaeの次の階層にある(図6C)。また、PS cDKOマウスのEA処理による主要な分類群の関係は、g_Mucispirillumからp_Deferribacteresまでがよく示された（図6D）。さらに、グループ間の腸内細菌叢の変化を属レベルで解析した。図5Eに示すように、WT群と比較した場合、cDKO群では11の腸内分類群が変化していた。Norank_f_Muribaculaceae、Lactobacillus、Lachnospiraceae_NK4A136_gruop、Mucispirillumが主に異なる分類群で、Lactobacillus以外は明らかに減少していた。さらに、cDKO＋EA群では、5つの分類群の割合が有意に異なっていた。その結果、Mucispirillum、未分類の植物、Ruminiclostridium_5の割合が有意に増加し、支配的な分類群であることがわかった。これらのことから、PS cDKOマウスのEAが腸内細菌群に大きな影響を与え、Mucispirillumがその変化の手がかりとなる微生物群である可能性が示唆された。

図6
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図6. 鍼治療により影響を受けた腸内細菌叢の分類群。WT群とcDKO群（A）、cDKO群とcDKO＋EA群（B）における門から属レベルまでのLEfSe解析。3群に濃縮された分類群をLDAスコアで示す（WT群は緑、cDKO群は青、cDKO＋EA群は赤）。LDAスコアの閾値は3以上。 (C,D) 門から属レベルまで濃縮された分類群のクラドグラム。WT群とcDKO群（E）、cDKO群とcDKO＋EA群（F）における属レベルの分類群の存在量の差分解析。Student's t-test, *P < 0.05, **P < 0.01, N = 6.

3.6. メタボロームシグネチャーと微生物群集プロファイリングの相関解析
尿中差分代謝物と属レベル差分腸内細菌群集の共変量関係は複数あり、ヒートマップで表され（図7A、C）、よく予測される細菌の代謝接続は図6B、Dに示した（｜r｜ > 0.4 ）。WT群およびcDKO群において、ムリバクテリアはm-クレゾール（r = -0.657, P < 0.05）およびイソバレリルグリシン（r = -0.797, P < 0.01）と負の相関があり、グリシン（r = 0.713、 P < 0.01）と正の相関があることがわかった。 713, P < 0.01）, cis-aconitate（r = 0.671, P < 0.05）, citric acid（r = 0.643, P < 0.05）, galactonic acid（r = 0.762, P < 0.01）, and glutamate（r = 0.713, P < 0.01）, と正の相関を示した。乳酸菌は、グリシン（r = -0.497）、コハク酸（r = -0.469）、キシリトール（r = -0.538）、クエン酸（r = -0.629, P < 0.05）、ガラクトン酸（r = -0.413）と負の相関があります。Lachnospiraceae_NK4A136_groupは、m-cresol（r = -0.608, P < 0.05）およびイソバレリルグリシン（r = -0.538）と負の相関があり、グリシン（r = 0.671, P < 0.05）, コハク酸（r = 0.559）, スリオン酸（r = 0.,040）とは正の相関があった。 685, P < 0.05), グルタミン酸 (r = 0.776, P < 0.01), インドール-3-メチルアセテート (r = 0.462), キシリトール (r = 0.706, P < 0.05), cis-aconitate (r = 0.769, P < 0.01), クエン酸 (r = 0.573) およびガラクトン酸 (r = 0.713, P < 0.01), と相関していた。Mucispirillumはm-クレゾール（r = -0.720, P < 0.01）およびイソバレリルグリシン（r = -0.685, P < 0.05）と負の相関があるが、グリシン（r = 0.741, P < 0.01）, コハク酸（r = 0.650, P < 0.01）と正の相関がある。 05）、スリオン酸（r = 0.601, P < 0.05）、グルタミン酸（r = 0.804, P < 0.01）、キシリトール（r = 0.748, P < 0.01）, cis-アコン酸（r = 0.783, P < 0.01) 、クエン酸（r = 0.762, P < 0.01）およびガラクトン酸（r = 0.853, P < 0.01) と正の相関を示した。さらに、cDKOおよびcDKO＋EA群では、ムリヤス菌は酪酸（r = 0.706, P < 0.05）, グリシン（r = 0.531）, スロン酸（r = 0.559）, およびグリセリン酸（r = 0.05）と正の相関があった。 706, P < 0.05），イソバレリルグリシン（r = -0.706, P < 0.05），D-fructose（r = -0.790, P < 0.01），Glycolic acid（r = -0.678, P < 0.05）と負の相関があることがわかった。Atopobiaceaeは、酪酸（r = 0.458）、グリシン（r = 0.430）、スリオン酸（r = 0.401）と正の相関があり、イソバレリルグリシン（r = -0.754, P < 0.01）, D-フルクトース（r = -0.697, P < 0.05）およびグリコール酸（r = -0.599, P < 0.05 ）と負の相関関係があります。Ruminiclostridium_5は、酪酸（r = 0.685, P < 0.05）, グリシン（r = 0.476）, スレン酸（r = 0.503）と正の相関があり、イソバリルグリシン（r = -0.671, P < 0.05）, D-フルクトース（r = -0.741, P < 0.01) およびグリコール酸（r = -0.699, P < 0.05) とは負の相関が見られた。これらの結果から、腸内細菌叢の差は尿中代謝物の差と相関していることが示された。

図7
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図7. 属レベルの腸内細菌叢と尿中代謝産物の差分との関連性。(A-C) Spearmanの相関ヒートマップ：赤は正の相関を、緑は負の相関を示す。色が濃いほど相関が大きいことを意味する（*P < 0.05, **P < 0.01）。(B-D) 代謝の変動（｜r｜ > 0.4）から予測される属レベルの腸内細菌叢に、同様の値のラベルを貼付した。代謝物と結ぶ線は、各属の微生物との関連性の方向を赤（正）または青（負）で示し、N = 6.

4.考察
腸内細菌群の乱れは、神経変性疾患、特にADの病態を促す重要な因子である。腸内細菌が、認知障害、海馬Aβプラーク、破壊された神経細胞の完全性、可塑性と炎症など、ADの複数の特徴に関与していると報告する研究が増えている（Fangら、2020；Ma J. ら、2020；Wangら、2020）。ADの病態における有効な標的治療薬がない中、EAはAD関連症状を減弱させる有望な方法と考えられていました。現在、広く受け入れられている理解は、EAが抗神経炎症を介して認知障害を軽減するというものですCaiら（2019）。しかし、EAが腸内細菌叢に及ぼす影響に関してはほとんど知られていない。そこで、ADモデルマウスであるPS cDKOマウスの認知障害に対するEAの効果を、微生物叢の調節の根底に探るために、16S rRNA遺伝子配列の解析を行った。中国伝統医学の神明療法に由来するHT7とKI3というツボが記憶力向上に必要であり、臨床実践量も多い。

アミノ酸は神経伝達や受容体機能に重要であり、神経毒性に関係し、アミノ酸代謝の変化はADの神経変性の早期指標となりうる（Fonteh et al.、2007）。神経伝達物質は、生体の学習・記憶能力と密接に関連する神経系の重要な部分です。最近の研究では、ADにおけるアミノ酸代謝の変化が指摘されています（Kaddurah-Daouk et al.、2011；González-Domínguez et al.、2014）。グリシンは、その欠乏がADの病因を促進する還元型グルタチオンの合成のための成分の一つである（Wuら、2004；Peter and Fau-Braidy、2015）。

N-メチル-d-アスパラギン酸グルタミン酸受容体（NMDAR）のアゴニストとして、グルタミン酸は哺乳類の中枢神経系（CNS）における主要な興奮性神経伝達物質である（Niciuら、2012年）。また、グルタチオンメンタリズムに由来する。脳内では、エネルギー形成と抑制性メディエーターであるγ-アミノ酪酸（GABA）の生合成に使用されます（Patel et al.）グルタミン酸とその受容体、主にリガンド依存性のイオン性グルタミン酸受容体（iGluR）は、シナプス可塑性とともに、学習と記憶の分子機構の基礎となる役割を担っています（Chang et al.、2020年）。哺乳類CNSにおける興奮性神経伝達のほとんどを媒介する。研究により、AD患者における血漿グルタミン酸濃度の低下は、認知障害と関連することが示されています（Lin et al.、2017）。さらに、別の研究では、軽度認知障害およびADの患者における海馬のグルタミン酸の減少は、エピソード記憶のパフォーマンスと関連することがわかりました（Wongら、2020年）。L-スレオネート（スレオニック酸）は天然に存在する糖酸で、約10％が尿中に排泄されます（Sun et al.、2016）。スリオン酸が中枢神経系に作用することは広く報告されている。例えば、L-スリオン酸マグネシウム塩（L-TAMS）の経口投与は、NMDARシグナルをアップレギュレートし、シナプスの損失を防ぎ、高齢ラットの記憶障害を逆転させ、APPswe/PS1dE9マウスのシナプス密度と記憶を改善することができる（スルツキーら、2010；リーW.ら、2014）。さらに、L-TAMSを含む化合物を12週間経口摂取した認知障害のある50～70歳の高齢者は、認知機能の回復を示しました（Liu et al.、2016年）。重要なことは、他のMg（2+）アニオンの摂取では、同じ結果が得られなかったことである。我々の研究では、PS cDKOマウスはWT対照と比較して有意にスリオン酸の減少を示したが、EAはスリオン酸のレベルを有意に逆転させた。したがって、EAはスリオン酸を増加させることにより、ADマウスの症状を緩和させる可能性がある。我々の研究では、EAがPS cDKOマウスの尿中のイソバレリルグリシン濃度の上昇を抑制することが示されたが、イソバレリルグリシンとADとの関連は明らかではない。興味深いことに、慢性腎臓病患者では、イソバレリルグリシンの腎臓クリアランスが低いことが長期的な認知機能の低下と関連すると報告されているが、その血清濃度は認知能力の低下と関連することを示さなかった（Cunnane et al.、2011）。

クエン酸、シスアコニット酸、コハク酸は、グルコース代謝に関与するTCAサイクルの重要な構成成分である。AD患者において、グルコース代謝は重要な役割を担っています。AD患者では神経細胞のグルコース代謝が20～25％低下し、細胞の代謝能力が制限され、酸化ストレスにつながることが報告されている（Cunnaneら、2011；Butterfield and Halliwell、2019）。ADマウスのこれら3つの代謝物のレベルはWTマウスよりもはるかに低く、ADマウスではグルコース代謝が低下していることが示唆されました。残念ながら、EAではcDKOマウスのグルコース代謝は改善されませんでした。フルクトースも重要なエネルギー物質であり、ADの発生・進展には全く異なる役割を担っている。AD患者における3倍から5倍高い脳内ソルビトールとフルクトースレベルは、内因性フルクトースの産生に関係している可能性があるという証拠がある（Xuら、2016）。脳内フルクトース代謝の過剰な活性化は、ミトコンドリア酸化ストレスと局所炎症を引き起こし、ミトコンドリアエネルギー産生は神経細胞の不十分な解糖によって妨げられ、結果として神経細胞が機能と生存を維持するために必要な脳内エネルギーレベルが徐々に失われていきます（Johnson et al, 2020）。酪酸は、β酸化経路を用いたエネルギー源としての利用やヒストン脱アセチル化酵素の阻害剤として、宿主のエネルギー代謝や免疫機能を調節する多機能分子の一種です（Ferranteら、2003；Kimら、2009；Govindarajanら、2011；Stingingら、2016）。さらに、酪酸は、NF-κBおよびシグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子3（STAT3）経路の活性を低下させ、T調節細胞の分化を促進することによって腸の炎症を抑制することも報告された（Chen et al.、2019年）。図3Bにおいて、cDKO＋EA群ではcDKO群と比較して酪酸レベルが有意に上昇していたことから、EAによるAD関連症状の改善は酪酸の増加に関連している可能性が推察されました。同様に、修正地中海食-ケトジェニック食はADに効果があり、軽度認知障害の被験者では糞便プロピオン酸と酪酸が増加し、酪酸は脳脊髄液中のAβ-42と負の相関がありました（Nagpalら、2019）。さらに、in vitroの研究では、アミロイドβ（Aβ）誘発BV2細胞に酪酸を前処理すると、ミクログリア活性化の抑制、シクロオキシゲナーゼ2（COX-2）の発現低下、NF-κB p65のリン酸化の逆転が認められた（Sun J. et al.、2020年）。この知見は、着目した目的は異なるが、我々の研究と一致している。

私たちの以前の研究では、PS cDKOマウスが微生物叢と代謝産物に変化を示すことが実証されました（Gao et al.、2021b）。さらに、本研究では、行動テスト（Y迷路、Novel object recognition task）により、EA投与後のPS cDKOマウスの認知障害が改善されることが示された（図1）。さらに、EAはPS cDKOマウスの腸内細菌叢のアンバランスを調節し、微生物群集の豊かさと均一性を増加させることができました（図5）。

我々の以前の研究と同様に、PS cDKOマウスは、研究においてnorank_f_Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、およびMucispirillumの濃縮が減少していることを示した。重要なのは、norank_f_Muribaculaceaeは腸内粘液層の形成とバリア機能に正の関連があり（Volk et al., 2019）、発酵最終生成物として糞便中にプロピオン酸を生成すると予測されることである。さらに、norank_f_Muribaculaceaeとプロピオン酸はともに、過去の研究において、腸の健康やマウスの長寿を伸ばすことと関連している（Sibai et al., 2020; Smith et al., 2021）。敗血症関連肝損傷（SLI）に関する他の研究では、メトホルミンが、老化したSLIラットの肝損傷を改善し、結腸バリア機能障害を調節し、炎症を軽減し、ムリバクテリアの割合が増加することを実証した（Liangら、2022年）。Lachnospiraceae_NK4A136_groupも短鎖脂肪酸（SCFA）生産菌の一種で、腸管バリア機能の亢進と相関があると考えられた（Ma L. et al.、2020年）。また、食事誘発性肥満マウスでは減少し、その後スペルミジンによって増加することが観察された（Ma L. et al., 2020）。Deferribacteres門に属するMucispirillumは、免疫誘導細菌群であるが（Herpら、2021）、免疫担当宿主の健康も促進する。研究（Zhangら、2021年）では、リポポリサッカライド（LPS）誘発性の腸管損傷を受けたC57BL/6マウスでは、ムチスピリラムの存在量が増加することを発見しました。しかし、グリシン投与によりToll様受容体4（TLR4）、炎症性サイトカイン、ケモカインのmRNAレベルの上昇など空腸や大腸の炎症反応が減弱すると、Mucispirillumの相対量が増加した。さらに、Mucispirillum属に属するMucispirillum schaedleriは、嫌気性電子受容体と競合的に結合することでSalmonella typhimuriumによる大腸炎から部分的にマウスを保護し、腸の恒常性に重要であると報告された（Herp et al.、2019）。また、トリプトファン代謝酵素インドールアミン2、3-ジオキシゲナーゼ1（IDO1）を過剰発現させたトランスジェニックマウスでは、コントロールマウスに比べて腸管粘液層が2倍厚く、Mucispirillum schaedleriの割合が増加しました（Alvarado et al.、2019年）。PS cDKOマウスでMucispirillumの存在量が減少していることは説明しがたいが、EAによってその存在量が有意に改善され、ADの進行を妨げていると考えられる（図6E、図F）。一方、PS cDKOマウス以外にも、機能性便秘の患者ではMucispirillumの存在量が有意に低下することが報告されている（Sugitani et al.、2021）。乳酸菌はGRAS（一般に安全と認められている）であるため、魅力的な宿主である（Peiroten and Landete, 2020）。ラクトバチルスとその誘導体は、抗バイオフィルム、抗酸化、病原体抑制、および免疫調節活性の効果を有する（Slatteryら、2019年；Cheeら、2020年）。PS cDKOマウスにおける乳酸菌の増加の合理的な説明は、それが免疫調節活性に対する反応であることが考えられ、タウオパチーマウスモデルであるP301Lマウスは同様に糞便サンプルで乳酸菌の増加を示した（Sun et al.、2019年）。

尿中代謝物の差異を腸内細菌叢と属レベルで統合し、特にPS cDKOマウスにEAを投与した場合の腸内細菌と宿主の代謝の関係を指摘した（図7）。図4に示すように、グリシン、セリン、スレオニン代謝と、グリオキシル酸およびジカルボン酸代謝が、EAによって撹乱される2つの主要な代謝経路であった。EA処理後に有意に増加したグリシンおよびスレオニン酸のレベルは、Lachnospiraceae_NK4A136_groupおよびMucispirillumといずれも正の相関があり（図7）、Mucispirillumの存在量も有意に改善したが、その免疫調節活性はまだ複雑だと考えられていた。前述のように、Lachnospiraceae_NK4A136_groupは腸管バリア機能の増強と相関しており、L-TAMSの摂取はNMDARシグナルをアップレギュレートし、シナプス密度を改善し、認知障害を回復させることが分かっている。したがって、EAによって増加したMucispirillumはADの回復に有益であり、酪酸は宿主-微生物クロストークの重要なメディエーターとして、高脂肪食によって誘発された腸粘膜損傷を回復し、小腸のzonula occluden-1の発現が増加し、さらに血清および肝臓の腸管エンドトキシンのレベルが減少したと推測できる（Zhouら、2017；Tianら、2019）。さらに、乳酸菌は酪酸を産生することができ、何とも好循環である。いずれにせよ、神経疾患や関連バイオマーカーとの関連はさらに調査する必要がある。

5.まとめ
メタボローム解析および微生物群集解析に基づき、本研究では、EAがPS cDKOマウスの認知障害を緩和し、尿中代謝物および腸内細菌叢を変化させることを明らかにした（図8）。EA投与は、主に2つの代謝経路を撹乱した。グリオキシル酸およびジカルボン酸の代謝グリシン、セリン、スレオニンの代謝。PS cDKOマウスでは、群集の多様性と豊かさの減少だけでなく、主要な腸内細菌群の存在量もEAに影響されていた。さらに、尿中代謝物の差分と腸内細菌叢は相関していた。PS cDKOマウスにおけるイソバレリルグリシンの増加、グリシンおよびスレオニンの減少を含む尿中代謝物の差は、腸内細菌叢の差と同様にEAによって回復された、Mucispirillum。これまでの研究から、グリシンは炎症反応の抑制に有効であり、その欠乏はADの病態を促進するグルタチオンの合成に必要な要素であることが分かっています。同時に、スレオニンは、シナプス密度の改善、NMDAR発現のアップレギュレーション、認知機能の回復など、ADの病態を阻害することが証明されています（表1）。本研究では、ムチシスリールはグリシンおよびスレオニン酸と正の相関を示し（図7）、腸の炎症を抑えることができました（表1）。MGB軸の双方向クロストークは免疫系の経路を含んでおり、ADの神経炎症は全身免疫の調節により緩和される可能性がある。これらは、EAがPS cDKOマウスの認知能力を改善する潜在的なメカニズムである可能性がある。残念ながら、ADの病態に関与するこれらのマーカーの発現は測定していないが、今後の研究課題である。

図8
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図8 PS cDKマウス PS cDKOマウスの尿中メタボロームとマイクロバイオータに対する電気鍼の効果、および腸内細菌叢と尿中メタボロームの相関を表す模式図。

表1
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表1. PS cDKOマウスの鍼治療による代謝物およびマイクロバイオームの変化、およびADの病理学的症状との関連。

データ利用可能性に関する声明
本研究で発表したデータセットは、オンラインリポジトリで見ることができる。リポジトリ名とアクセッション番号は、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA923176, PRJNA923176で確認できる。

倫理に関する声明
この動物実験は、上海中医薬大学動物実験委員会（許可番号：PZSHUTCM191025005）の審査・承認を受けたものである。

著者の貢献
JW、MZ、YXは研究の構想、設計を行い、最終版の原稿を承認した。JG、NZ、ML、QW、CZは実験を行った。JGとNZは図表を作成し、データの解析と解釈を行った。JG、NZ、MLは原稿を作成した。MZは原稿を編集・修正した。最終原稿は全著者が読み、承認した。

資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金会総合計画（YXへの助成金82174003）および上海中医薬大学学部生革新プロジェクト（202110268240）の助成金により実施されたものである。

利益相反について
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係のない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.1047121/full#supplementary-material に掲載されています。

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キーワード：鍼治療、PS cDKOマウス、アルツハイマー病、メタボロミクス、腸内細菌叢

引用元高捷（Gao J）、周暢（Zhou N）、呂睦（Lu M）、王琪（Wang Q）、趙慈（Zhao C）、王捷（Wang J）、周睦（Zhou M）、徐毅（Xu Y） (2023) Presenilin1/2 conditional double knockout mouse における尿の代謝物と微生物叢に対する電気鍼の効能. Front. Microbiol. 13:1047121. doi: 10.3389/fmicb.2022.1047121.

Received: 17 September 2022; Accepted: 23 December 2022;
掲載：2023年1月24日

編集者

Guoxiang Xie、ハワイ大学がんセンター、米国
レビューした人

Jiajia Song, Southwest University, 中国
Zhenmin Liu, 中国、酪農生物工学国家重点実験室
Copyright © 2023 Gao, Zhou, Lu, Wang, Zhao, Wang, Zhou and Xu. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセスな記事です。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。

*Correspondence: Jian Wang, www.frontiersin.org wangjiantcm@126.com; Mingmei Zhou, www.frontiersin.org zhoumm368@163.com; orcid.org/0000-0002-2552-4754; Ying Xu, www.frontiersin.org yingxu612@shutcm.edu.cn; orcid.org/0000-0003-3563-4233

これらの著者は、この研究に等しく貢献している。

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしもその関連組織、または出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または承認されるものではありません。

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