野生の草食動物コアラにおいて、糞便接種が消化管マイクロバイオームを変化させ、食餌の拡大を可能にする。

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発行：2019年8月21日
野生の草食動物コアラにおいて、糞便接種が消化管マイクロバイオームを変化させ、食餌の拡大を可能にする。

https://animalmicrobiome.biomedcentral.com/articles/10.1186/s42523-019-0008-0

Faecal inoculations alter the gastrointestinal microbiome and allow dietary expansion in a wild specialist herbivore, the koala - Animal Microbiome

ミカエラ・D・J・ブライトン
ロッシェル・M・スー
...
ベン・D・ムーア
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動物マイクロバイオーム1巻、記事番号：6（2019）この記事を引用する
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メートル法詳細
アブストラクト
背景
個体間の胃腸内微生物の違いにより、特定の食餌で生き延びる能力に差が生じることがある。コアラはユーカリの葉だけを食べる食性の専門家ですが、多くの個体は飢餓に直面しても、他の個体にとって十分な餌である特定のユーカリ種を食べません。私たちは、コアラの胃腸（GI）マイクロバイオームが食性に影響を与えるかどうかを調べるために、糞便接種実験を行いました。好物のマンナガム（Eucalyptus viminalis）を食べていた野生のコアラを飼育下に移し、あまり好まないメスメイト（E. obliqua、処理）またはマンナガム（コントロール）を食べていたコアラの糞便から得たカプセル化物質を経口接種しました。
結果
マナガムを主食とする野生コアラの消化管マイクロバイオームは、メスメイトを主食とするコアラとは異なっていた。夜行性のコアラに一晩中メスメイトのみを与えても対照コアラのGIマイクロバイオームは変化しなかったことから、コアラの消化管マイクロバイオームは食事の変化に反応しないことを明らかにした。その結果、糞便接種によってコアラのGIマイクロバイオームが変化し、治療コアラのGIマイクロバイオームがメスメイトを摂取する野生コアラのGIマイクロバイオームとより類似することが示されました。メシマズの摂取量については、コントロールコアラとトリートメントコアラの間に全体的な差は見られませんでした。しかし、コアラのGIマイクロバイオームが変化するほど、接種後のメスメイトの摂取量は増加した。
結論
この結果は、食事の変化は、適切な微生物種が存在する場合にのみコアラの消化管マイクロバイオームの変化につながること、および/またはコアラの消化管マイクロバイオームが食事の選択に影響を与えることを示唆しています。
背景
食生活のニッチは、種の分布を決定する原動力として長い間認識されてきました。しかし、ニッチを形成する上で種の消化管マイクロバイオームが果たす役割については、最近になってようやく検討されるようになり、野生の研究システムから得られる経験則はほとんどありません[1]。消化管（GI）マイクロバイオームは、哺乳類の消化と栄養に深く関わっている[2,3,4,5]。異なる動物種は、宿主の食事の消化に特別に適応していると考えられる明確な微生物集合体を有しています [6]。実際、同じ動物種であっても、GIマイクロバイオームの違いは、例えば、その食餌に多く含まれる植物二次代謝産物（PSM）を解毒することによって、宿主が特定の食餌で生きていくことを助けるかもしれません[7,8,9]。したがって、食物の入手可能性、社会構造、生活史などの要因による制約に加えて、適切な微生物群を保有していない場合、動物の食事は制限される可能性がある。このような食餌ニッチの制限は、異なる生息地における種の存続に重要な影響を及ぼす可能性がある。さらに、動物のGIマイクロバイオームが宿主の食事の変化に適応できるかどうかは、動物が突然の食事の変化に直面する可能性がある、転地や飼育下繁殖などの保全活動に影響を与える可能性があります。このように、GIマイクロバイオームが宿主の食事に適応できる条件とできない条件、そしてその適応が宿主に与える影響について理解することは、幅広い利益をもたらす可能性がある。
このような疑問がすぐに解決できる種のひとつがコアラ（Phascolarctos cinereus）です。コアラはユーカリ属の樹木を食べる特殊な葉食動物で、コアラ個体は1種から10種を食べ、最も特殊な哺乳類の草食動物の1つとなっています[10]。コアラの食餌選択は、栄養成分（特にタンパク質）と、食餌の消化率や毒性に影響を与える植物の二次化学に強く影響される [11, 12]。2013年、オーストラリアのオトウェイ岬では、コアラの個体数密度が高く、コアラが好む餌木であるマナガム（E. viminalis）を乱獲し、広範囲に落葉と木の枯死を引き起こしました [13] 。その結果、70％以上のコアラが飢えと同情による安楽死によって死亡し[13]、野生生物当局による継続的な介入を促し、2015年には400頭以上の健康なコアラを移送しました[14]。重要なのは、コアラが飢えていたにもかかわらず、ほとんどのコアラが、隣接する別の豊富なユーカリ種であるメスメイト（E. obliqua）の林を食べなかったことです。しかし、メスメイトの森に住み着き、メスメイトを好んで食べるコアラも少なからず存在した。大多数のコアラが食性転換に失敗した理由の1つの仮説は、GIマイクロバイオームが適切でなく適応できなかったため、メシマコブの葉を食べることができなかった、または食べることを思いとどまったということです。
コアラのGIマイクロバイオームは、主に食物繊維やその他の難分解性物質を発酵させる役割を果たすと考えられている[15,16,17,18]。微生物による発酵は、小腸で単糖類やアミノ酸（タンパク質）などの栄養素が吸収された後、巨大化したコアラの後腸（盲腸と近位結腸）で起こる[19]。一方、牛のような草食性の前腸発酵動物（Bos属）では、GIマイクロバイオームが、真の酸による消化が行われる前に、腸の拡大領域で非常に難溶性の物質を分解する [20]。このような動物は、微生物とその代謝産物の消化により栄養を摂取する。したがって、前腸発酵動物は、GIマイクロバイオームがすべての食事成分を消化・無害化する能力の影響を受ける可能性が高い。これとは対照的に、GIマイクロバイオームは、主に食物繊維などの特定の食物分画を通して、後腸発酵動物の食事ニッチと相互作用する可能性がある。
メスメイトを食べるコアラのGIマイクロバイオームは、マンナガムを食べるコアラとは異なることが判明している [21] 。栄養面では、マナガムの葉は利用可能なタンパク質が多く、ユーカリの中では比較的消化が良いものの、特定の二次代謝物群によって防御されている [21, 22]。メスメイトの葉は、利用可能なタンパク質が少なく、繊維が多く含まれている [21]。したがって、メスメイトを食べるコアラは、マナガムを食べるコアラよりも、繊維の微生物発酵によって生成される短鎖脂肪酸をより多く利用していると考えられます。これを反映して、メスメイトを食べるコアラのGIマイクロバイオームでは、繊維分解菌の相対量が多く、遺伝子機能の多様性が高く、キシランなどより抵抗性の高い構造成分の分解に関わる遺伝子が豊富である [21, 23]. メスメイトを食べるコアラの腸内細菌叢は、マンナガムを食べるコアラとは異なる複合炭水化物（繊維）源を利用するように最適化されているようだ [23]。このことから、コアラの腸内細菌は特定のユーカリ種を最適に消化できるように細かく調整されており、食餌が変化した場合には腸内細菌群の適応が必要になる可能性があると考えられます。
動物のGIマイクロバイオームが特定の食餌に適応する能力は、既存の分類群の相対的な存在量の変化で必要な変化を達成できるか、あるいは開始時のコミュニティには存在しない微生物を追加する必要があるかによって、部分的に決まる。確かに、相対的な存在量の変化は、食事の変更によって速やかに達成できることが多く、直面する消化器系の課題に対してGIマイクロバイオームの機能を最適化することができる [24]。しかし、場合によっては新しい特定の微生物の導入が必要であり [8, 25] 、新しい食餌への適応は、必要な微生物を同胞、環境、または食餌自体から容易に獲得できるかどうかに依存する。このような水平伝播は多くの種で起こることが知られているが [24, 26] 、特定の種類の細菌に限定され、垂直伝播（ある宿主世代から次の世代へ）が優勢になり [27] 、GIマイクロバイオームの適応能力を制限する可能性がある [28] 。コアラはジョイとして、袋が出現する頃に母親の糞便内容物（「パップ」）を摂取することにより、GIマイクロバイオームを獲得する [29]。したがって、この種ではGIマイクロバイオームの強力な垂直伝播があると考えられ、コアラのGIマイクロバイオームは母親のものと似ている可能性が高い。しかし、コアラが単独で樹上生活を営むことから、同種の感染、ひいてはGIマイクロバイオームの適応的な可能性は限定的である可能性があるため、水平伝播の程度は不明である。
コアラのGIマイクロバイオームが食性を制限しているという仮説を検証するため、ケープ・オトウェイのマンナガム林から飼育されたコアラに、メシマズを主食とする野生コアラ（処理）またはマンナガム（対照）から糞便由来の微生物を接種する実験を実施しました。実験中、コアラは他の食物源へのアクセスを制限することで、メスメイトを食べるように仕向けられました。その結果、コアラのGIマイクロバイオームが食餌の変化に対応できるかどうか、糞便接種がGIマイクロバイオームの食餌変化への対応を助けるかどうか、コアラのGIマイクロバイオームが食餌選択に影響を及ぼすかどうかを検証することを目的としました。糞便の経口接種は、以前、クロストリジウム・ディフィシル感染症の治療に成功するためにヒトで使用されたことがあります [30]。また、研究目的で、いくつかのげっ歯類のGIマイクロバイオームを変化させるために、抗生物質の有無にかかわらず使用されてきました[8, 31]。今回の実験では、極端な食の専門家である野生の後腸発酵哺乳類のGIマイクロバイオームに腸内細菌を導入し定着させるための糞便経口接種の有効性を、我々の知る限り初めて評価したものである。また、耐酸性カプセルに接種液を封入することで、特定の微生物をうまく導入できることを実証し、将来のプロバイオティクス開発の道筋を示すとともに、生態学的な疑問点の検証を成功させることができました。
研究成果
メスメイトまたはマナガムを摂取するコアラのGIマイクロバイオームについて
本研究の結果は、16 s rRNAプロファイルに基づき、メスメイトを食するコアラのGIマイクロバイオームとマナガムを食するコアラのGIマイクロバイオームが異なることを示したBriceら[21]の既報を確認した（PERMANOVA：F = 15.378, p < 0.001, R2 = 0.49 ）。本研究でマナガムの森で見つかったコアラのGIマイクロバイオームは、主成分分析の次元1（PC1）において、メシマズの森で見つかったコアラのものと分離していることがわかった（t = - 5.288, p < 0.001; 図1）。しかし、グループ間で重複が見られたことから、オトウェイ岬のコアラの食事とGIマイクロバイオームは連続性を持ち、メスメイトまたはマンナガムのみを食べる2つの集団を表しているわけではないことが示唆されました。この結論は、メスメイトの木で50％と61％しか発見されなかった2頭の治療ドナーコアラ（ID：LとR）のGIマイクロバイオームが、マンナガムを食べるコアラとメスメイトを食べる他のコアラの中間であるという観察からも裏付けられる。
図1
重み付けしたUnifrac距離の主成分分析の最初の2次元。薄いグレーと濃いグレーの円は、それぞれマンナガムとメスメイトの森にいるコアラを表す。対応する90%楕円を示す（楕円は、マナガムの森で捕獲された5頭のコアラから得た7サンプルと、メスメイトの森にいたドナーコアラを含む8頭のコアラから得た12サンプルから多変量t分布を仮定して算出した）。治療コアラは赤色、対照コアラは青色で表示されています。開いている菱形は捕獲時のコアラのGIマイクロバイオームを示し（ただし、捕獲サンプルが入手できず、メスメイト導入前のサンプルを使用した処理コアラ1頭を除く、*で示す）、閉じている菱形は実験終了時のコアラのGIマイクロバイオーム（早めにリリースしたコントロールコアラを除く、接種9日後の最終サンプルを示す、*で示す）。線は同じ飼育下のコアラの点を結び、実験期間中にGIマイクロバイオームがシフトした方向を矢印で示した。濃い紫色の円はコホート1の治療ドナーコアラのGIマイクロバイオーム、ピンク色の円はコホート2のGIマイクロバイオームを示しています。ごく薄い緑、薄い緑、中くらいの緑、濃い緑の四角は、それぞれ細菌層、粗層、溶質層、微細層を示す。薄紫の四角は、植え付けを示す。
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マナガムの森のコアラのGIマイクロバイオームとメスメイトの森のコアラのGIマイクロバイオームの間には、バクテロイデス門とファーミキューテス門の相対存在量の比に有意差があった（B:F平均マナガムコアラ=0.77、平均メスメイトコアラ=0.39、図2、p < 0.001）．また、すべてのマナガムコアラのB:F比は0.55以上であったが、すべてのメスメイトコアラのB:F比はこれより低かった。メスメイトで50〜61％の確率で発見された2頭のドナーコアラ（ID：LとR）のB:F比は、マナガムを食べているコアラのそれに近かった（L = 0.53, R = 0.58）. PC1スコアとB:F比の間には非常に強い相関があった（スピアマン順位相関＝0.97、p＜0.001）。
図2
コアラのBacteroidetes/Firmicutes（B:F）比 a boxplot of the Bacteroidetes to Firmicutes ratio of koalas found in manna gum (n = 5; MG Koala) and messmate forest (i.e.). 治療コアラ（赤）と対照コアラ（青）のBacteroidetes/Firmicutes（B:F）比を経時的に散布したものである。線で結ばれた閉じた円は、各処置の中央値を示す。開いている記号は各個体のB:F比を示し、記号が異なれば異なる個体を示す。コアラは緑色で示した期間にメスメイトを投与され、接種期間は灰色の網掛けで示した。サンプリングポイント1＝捕獲、2＝メスメイト導入直前、3＝メスメイト導入3日後、4＝接種完了直後、5＝接種完了9日後、6＝接種完了後18日後
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マナガムとメスメイトの森で見つかったコアラの間で、GIマイクロバイオームのα多様性に有意な差は見られなかった（Chao index、Shannon diversity、Feature count: p > 0.7）。しかし、PC1スコアとシャノン多様性（R = -0.37, p < 0.001）には有意な負の相関が見られたが、豊かさ（Chao indexおよびfeature count）はPC1スコアと相関がなかった。PC2スコアは、α多様性のすべての指標と有意な正の相関があった（R：Shannon = 0.4, Chao = 0.25, feature count = 0.3; p < 0.01）.
指標種分析では、メシマズ食と有意に関連する26の微生物特徴を特定した（表1）。このうち、16の特徴が固形物門に分類され、2つを除くすべてがClostridiales目に分類された。Clostridiales目では、10個の特徴がLachnospiraceae科に属し、残りの4個はRuminoccacease科に属した。12個の特徴はメスメイトコアラにのみ検出されたが、それぞれはメスメイトドナーコアラの37.5〜50％にのみ検出された。これらの微生物の特徴を合わせた相対量は、メスメイトコアラでは平均10.5％であったが、マナガムコアラでは1％と有意に低かった（z = - 3.329, p = 0.001）．メスメイトコアラでは、7つの特徴が平均相対存在量1%以上で見つかった（表1）。
表1 指標種分析で明らかになったメスメイト食と有意に関連した特徴のリスト
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処理用植菌剤
ドナー糞便を遠心分離してできた細菌層と微粒子層から作られ（Additional file 2: Figure S1）、耐酸性カプセルを介してコアラの経口投与された処理用接種物の微生物組成を評価した。処理用接種物および層はいずれもPC1上で処理用ドナー糞便サンプルとクラスター化し、B:F比は0.55未満であった（図1および図2）。しかし、接種試料と層のうち2つの試料（コアラ1頭から採取した微粒子層とコアラ混合糞便試料から採取した粗粒子層）は、PC2において処理ドナー糞便試料より高い値を示した（図1）。これは、これらの試料が5種類のコアラの糞便をプールしたものであるため、α多様性が高いことに起因していると思われる。シャノン多様性、Chao1α多様性、検出された特徴の数は、いずれもメスメイトの森で見つかったコアラの糞便サンプルよりも接種サンプルの方が有意に高かった（ウィルコクソン順位和検定：それぞれp = 0.009, 0.036, 0.009）．
糞便接種の成功率
糞便接種実験のために捕獲した12頭のコアラのうち10頭は、16 s rRNAプロファイルに基づき、捕獲時にマナガムコアラのものと類似したGIマイクロバイオームを有していました。これらのコアラのGIマイクロバイオームは、PC1のスコアが高く（図1）、B：F比が0.55以上であった（図2）。残りの2頭のコアラ（ID：VとW）は、捕獲時のGIマイクロバイオームがPC1（図1）で治療（メスメイト）ドナーのコアラとクラスター化し、B：F比は0.55未満であった。しかし、これらのコアラは、メスメイトコアラと比較して、実験開始時の指標となる特徴の相対量が低かった（2％と0.1％）。これらのコアラはマンナガム林で捕獲されたが、メスメスも食べていた可能性がある。これらのコアラは、GIマイクロバイオームの特性を調べる前に、いずれも対照群にランダムに割り当てられました。
メスメイトコアラだけに見られる指標的特徴（すなわちA = 1）は、捕獲時には処理コアラでは検出されませんでしたが、接種後には検出され、相対的な存在量が増加しました（図3）。残りの指標特徴についても、捕獲時に2頭のコアラで低頻度で検出された以外は同様のパターンであった。A=1の指標となる特徴は、接種前の対照コアラで低頻度で検出されたが、これらの特徴も他の指標特徴も実験期間中に相対的な存在量が増加することはなかった（図3）。治療コアラでは、接種後7.8～14％の間に、これらの指標となる特徴が複合的に検出された。対照的に、増殖がない場合に洗浄によって糞便中に検出されると予想される指標機能の最大相対存在量は0.09%である（以下の情報に基づく： i. 指標機能は、処理用接種物中の微生物群集の平均6.7%を占める ii. 各コアラに2カプセルまたは1日最大1470 mgの接種物を9日間投与 iii. 体重6kgのコアラの平均的な消化物プールの大きさは約1kgである[32]）。このことから、少なくともいくつかの微生物種は、治療コアラのGIマイクロバイオームへの導入に成功し、少なくとも一時的に定着したことが示唆されます。接種後（時点5および6）の指標種の存在量には、処理群および対照群のいずれにおいてもコホート間で有意な差は見られなかった（t-test、p > 0.8）。
図3
指標種の相対存在量の合算値。開いている丸と点線はすべての指標種を表し、閉じている丸と実線はA = 1となる指標種を表す。治療コアラは赤色、対照コアラは青色で表示した。線で結ばれた点は各治療の平均値を、エラーバーは標準偏差を示す。コアラは、緑色で示した期間にメスメイトを投与され、灰色の網掛けで接種期間を示した。サンプリングポイント1＝捕獲、2＝メスメイト導入直前、3＝メスメイト導入3日後、4＝接種完了直後、5＝接種完了9日後、6＝接種完了後18日後
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治療コアラの指標となる特徴の相対的な存在量の増加は、主に2つの特徴に起因していると考えられる。1つ目はAkkermansia科に属するもので、ドナーの37.5%でしか検出されなかったが、すべての治療コアラで定着し存在量が増加した。2つ目は、Lachnospiraceae UCG-001という属のメンバーでした。この特徴は、ドナーの50％に見られ、最も豊富な指標特徴（メスメイトドナーでは4.5％）であり、またすべての治療コアラで定着した。また、Lachnospiraceae NK4A136に属する2つの追加的な特徴があり、ドナーにおける平均相対存在量が2.5%を超え、それぞれ2匹の治療コアラに移された（ID：E、D、G）。Gastranaerophilales目（門：Cyanobacteria、綱：Melainabacteria）に属する微生物の特徴は、3匹の処理コアラ（ID：D、E、G）に移植された。ドナーコアラで1％以上の相対量で見つかった残りの3つの特徴のうち2つは、いずれもルミノコックス科に属し、どの治療コアラにも移植されなかった。
コアラを捕獲してからメスメイトを投与するまでの間、コアラのGIマイクロバイオームのα多様性に大きな変化はなく（Chao1：t = 1.272, p = 0.209; 微生物群の数：t = 1.4, p = 0.168, Shannon diversity：t = 1.20, p = 0.237 ）、飼育がコアラのGIマイクロバイオームの多様性に影響を与えていないことが実証されました。実際、実験期間中、トリートメントコアラもコントロールコアラも、GIマイクロバイオームの豊かさに大きな変化はありませんでした（Chao1： F = 0.04, p = 0.947、微生物群の数： F = 0.304, p = 0.583）、これはコホート間で差はありませんでした（Chao1: F = 1.05, p = 0.309; Number of microbial groups: F = 0.86, p = 0.358）．しかし、接種後、処理コアラと対照コアラの両方でシャノン多様性値が増加した（すなわち、時点4,5,6の方が時点1,2,3よりもシャノン多様性が高かった）。この増加はコホートMG1でのみ有意だった（MG1； t = - 4.92, p < 0.001; MG2； t = - 0.67, p < 0.504）．これは、接種によってこれらのコアラのGIマイクロバイオームに追加の微生物が導入されたためと考えられる。
PC1上の処理コアラのGIマイクロバイオームの位置は、実験期間中、メスメイトコアラ（ドナーコアラ）の位置に向かって移動した（図1、図4）。この変化は、対照コアラで見られた変化よりも有意に大きく（t = - 2.55, p = 0.029）、糞便接種後も対照コアラは平均してPC1で同様のスコアを維持しました（図4）。この変化の大きさはコホート間で差がなかったが（F = 0.063, p = 0.81）、変化の大きさは個々の処理コアラ間で異なっていた（図1および4）。この反応のばらつきと、捕獲したGIマイクロバイオームのコアラ間のばらつきを考慮すると、実験終了時のPC1上のGIマイクロバイオームの位置には、処理群と対照群の間に有意差はなかった（t = - 0.49, p = 0.417 ）。これらの結果は、B:F比の調査結果によって確認されました。治療コアラのB:F比は、両コホートとも接種後に減少した（タイムポイント1-3と4-6の比較；図2）。この減少は、対照群と比較して有意に異なっていた（B:F比のタイムポイント1と6の差で測定した変化；t = 2.55, p = 0.029）。
図4
試験期間中の治療コアラと対照コアラのGIマイクロバイオームのPC1スコアの変化。治療コアラは赤色、対照コアラは青色で示す。線で囲まれた閉じた円は、各治療の平均値を示しています。開いている記号は、各個体のGIマイクロバイオームの変化を示し、異なる記号は異なる個体であることを示しています。コアラは、緑色で示した期間にメスメイトを投与され、接種期間は灰色の網掛けで示した。サンプリングポイント1＝捕獲、2＝メスメイト導入直前、3＝メスメイト導入3日後、4＝接種完了直後、5＝接種完了9日後、6＝接種完了後18日後
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総乾物摂取量
1日の総乾物摂取量（TDMI）はコアラ間で151gから349gの範囲であり、マナガムの1日平均摂取量（ADI）は捕獲体重とともに増加した（t = 3.973, p = 0.002; 調整後R2 = 0.573）。TDMIは、実験の異なるフェーズ間で有意に変化することがわかった（F = 5.25, p < 0.001）。メスメイト導入前のTDMI（平均249g）は、接種時（平均207g；t＝4.01、p＜0.001）や定着期（接種後10～18日；平均237g；t＝2.10、p＝0.037）よりも著しく高い。また、TDMIは接種中よりも洗浄期（接種後1～9日目、平均＝251g）の方が有意に高かった（t＝-3.80、p＜0.001）。コアラのGIマイクロバイオームが試験期間中にメスメイトコアラのものに似てくるほど、接種中のTDMIは低くなった（バクテロイデーテスとファーミキューテスの比率（B：F）の変化： F = 18.06, p = 0.013、PC1スコアの変化： F = 32.27, p = 0.004）。また、接種中のTDMIは、コントロールコアラと比較してトリートメントコアラの方が低い傾向が見られた（p = 0.07）。糞便接種後（ウォッシュアウト期と定着期）、メスメイトコアラのようなマイクロバイオームに変化しなかったコアラではTDMIが低下したが、GIマイクロバイオームが変化したコアラではTDMIが安定した（B：F比の変化とDay.の交叉項： F=8.87、p=0.003、PC1スコアとDayの交互作用項： F = 7.01, p = 0.009）。
接種前のメシマズの摂取状況
メスメイトの導入は、飼育下のコアラに慣れるまでの期間、マンナガムのみを摂取させた後に行った。その結果、糞便接種前にコアラが食べたメスメイトの量は、導入後3日間で減少することがわかりました（F = - 15.411, p = 0.029; 図5）。また、食べたメシマズの量にもコアラの個体間で有意差があった（F = 7.415, p < 0.001）。捕獲時とメスメイト導入直前のコアラのGIマイクロバイオームは、接種前のメスメイト摂取量を有意に説明しなかった（それぞれt = 0.044と0.110、p > 0.9）．また、マナガムの1日平均摂取量（ADI）およびコホートも有意な説明変数ではなかった（それぞれp = 0.752および0.378）。
図5
メスメイト導入直後のコアラの夜間の乾物摂取量（グラム）。点は個々のコアラの摂取量を示し、線は同じコアラの摂取量を結ぶ。
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接種中と接種後のメスメイトの摂取量について
9日間の糞便接種後、メスメイトはコアラの1日の乾物摂取量の平均28.4％を占めた（範囲＝13.5～47.7％）。コアラのメスメイト摂取のほとんどは、マナガムが手に入らない夜間に行われた。最初の糞便接種から27日間、夜間のメスメイト摂取量（NMI）およびTDMIに占めるメスメイトの割合（PM）に、処理群と対照群の間に全体的な違いは見られなかった（NMI：t = 0.119, p = 0.909; PM：F = 0.05, p = 0.836）．また、実験グループと最初の糞便接種からの日数との間の交互作用も見られず（NMI：t = 0.557, p = 0.578, PM：F = 1.67, p = 0.199） 、治療グループにおいてメシマズの摂取量が対照グループと異なる形で経時変化しないことが示された。これらの結果は、実験の各段階（糞便接種時、ウォッシュアウト：糞便接種後1-9d、定着後）の分析でも確認された： 糞便接種時、ウォッシュアウト：糞便接種後1～9日、定着後：接種後10～18日）。
しかし、夜間のメシマズ摂取量とメシマズ比率は、試験期間中にGIマイクロバイオームが変化してメシマズコアラに近づいたコアラでは経時的に有意に増加し、GIマイクロバイオームの測定項目が変化せずメシマズコアラに近づかなかったコアラでは経時的にメシマズ摂取量は安定または減少した（B：F比率変化と日の交雑項： NMI：t＝3.702、p＜0.001、PM．F＝5.01、p＝0.027、PC1スコアの変化とDayとの交互作用項： NMI：t＝-2.101、p＝0.037、PM．F = 4.533, p = 0.035; 図6a）。つまり、実験の異なるフェーズを個別に評価すると、実験の最後の9日間（接種後10～18日間）のメスメイト摂取量は、GIマイクロバイオームがメスメイトコアラに似た集合体に大きくシフトしたコアラで有意に高いことがわかりました（B：F比の変化：t = - 3.30, p = 0.010; PC1スコアの変化：t = - 2.32, p = 0.044; 図6b）。しかし、GIマイクロバイオームの変化の程度は、接種中やウォッシュアウト期のメシマズ摂取量を説明するものではありませんでした。また、接種後（1～18日）のTDMIのうちメシマズの割合は、B：F比の変化の程度が大きいコアラで有意に高かったが（F = 5.647, p = 0.040）PCoA の第1軸におけるコアラのGIマイクロバイオームの位置は有意ではなかった（F = 2.18, p = 0.1719 ）。
図6
コアラのGIマイクロバイオームの変化の程度に応じた夜間のメシマズDMI（g）変化の予測。a）は研究全体にわたる変化、b）は接種終了後の変化を示す。GIマイクロバイオームの変化は、バクテロイデーテスとファーミキューテスの比率の変化で表され、負の値はバクテロイデーテスへのシフトを、正の値はファーミキューテスへのシフトを示す。網掛けは90%信頼区間を表す。最終的な線形混合効果モデルから得られた予測値
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コアラのGIマイクロバイオームは、フェーズ直前とフェーズ後の両方で、メスメイト摂取の予測因子として同様に高い有意性を示した（B：F比、前：t = - 4.055, p < 0.001, 後：t = - 4.090, p < 0. 001; PC1スコア、前：t = - 3.890, p < 0.001, 後：t = - 3.884, p < 0.001; delta AIC: B:F ratio = 0.201, PC1スコア= 0.068), 一方、捕獲時のコアラのGIマイクロバイオームはそうではなかった（PC1スコア：t = - 0.522, p = 0.618）.
また、実験の異なるフェーズを個別に評価したところ、糞便接種を行った期間中にメスメイトの摂取量が減少し、この減少は対照コアラよりも処理コアラで大きいことがわかりました（DayとTreatmentの交互項：t = - 2.558, p = 0.013 ）。しかし、メスメイトの摂取量は、接種終了直後に増加することが確認された（平均調整乾物メスメイト摂取量：接種時42.3g、接種後57.2g、t = 2.569; p = 0.026）．
また、接種中および接種後のコアラの夜間のメスメイト摂取量は、接種前のメスメイト摂取量が多いコアラやマンナガムADIが高いコアラほど多かった（マンナガムADI：t = 2.449, p = 0.038; 接種前のメスメイト摂取量：t = 2.5, p = 0.033）. メスメイトの摂取量にコホート間の差はなかった（t = 0.951, p = 0.362）。
考察
数多くの研究により、GIマイクロバイオームは宿主の食事によって形成される可能性があり [3, 33]、場合によってはGIマイクロバイオームは短期間の食事変化に迅速に適応できることが示されている [24]. しかし、盲腸に入る物質が主にリグニン化した繊維やその他の難燃性物質であると考えられる後腸発酵草食動物では [5] 、GIマイクロバイオームの構成に対する食事の影響はより限定的であると考えられる。さらに、ヒトの腸管型など、GIマイクロバイオームのいくつかの側面は、短期間の食事変化に対して回復力があるという証拠もあります [34]。我々は、コアラのGIマイクロバイオームが1ヶ月間の食事変化に対して比較的無反応であると思われることを示しました。これは、野生動物が不適切な食物源に対する行動的嫌悪を形成する期間を超えていると考えられる（[29, 50]）。また、本研究では、糞便接種により、食餌の変化に伴うコアラのGIマイクロバイオームの変化を支援できることを実証した。本実験の処理コアラのGIマイクロバイオームは、試験期間中、メスメイトコアラのGIマイクロバイオームと類似するようになり、接種終了後9日から18日の間に安定したようです。一方、対照コアラのGIマイクロバイオームには同じような変化は見られませんでした。これは、治療コアラと対照コアラの両方が、マンナガムのみから25％以上のメスメイトを含む食事に移行したにもかかわらずです。この結論をさらに裏付けるように、対照コアラの1頭（ID = U）は比較的高い割合（TDMIの36.5%）のメスメイトを摂取していましたが、彼のGIマイクロバイオームは捕獲時のマナガムコアラのものと似ており、試験期間中にメスメイトコアラのものと似ていくことはありませんでした。
コアラが摂取したメスメイトの量がコアラのGIマイクロバイオームの変化の程度と関連し、この変化が主に治療コアラで見られた理由については、相互に排他的でない2つの説明が可能です。1つ目は、メシマコブ食に関連する微生物の導入により、コアラのGIマイクロバイオームが変化したと考えられるが（上述）、GIマイクロバイオーム全体の構成に変化が生じたのは、メシマコブを食べたコアラだけである（これにより、メシマコブ食によく適応した微生物が選択されたため）。この説明を裏付けるように、指標種の導入に成功したにもかかわらず、治療コアラの1頭（ID = X）のGIマイクロバイオームはメスマニアコアラのものに変化しなかった。このコアラは、接種前と接種後に比較的少量のメスマタを摂取していた（TDMIの13.5％）。このことから、この系でGIマイクロバイオームが変化するには、食餌の変化と適切な微生物の存在の両方が必要であることが示唆されます。興味深いことに、これはすべてのシステムで当てはまるわけではないようです。例えば、マウスにプロバイオティクスを使用すると、食事に変化がなくてもGIマイクロバイオームが変化することがあります[35]。この説明を検証するために、メスメイトのコアラの糞便をコアラに接種し、メスメイトを食べさせないという実験を行うことも可能である。
この結果を説明するために私たちが提案する2つ目の説明は、接種によってGIマイクロバイオームが変化し、その変化によってコアラがメスメイトの摂取量を増やすことができたというものです。GIマイクロバイオームの変化が大きいコアラでは、メスメイトの摂取量が経時的に増加したという結果は、この説明が妥当であることを示唆しています。また、GIマイクロバイオームの組成が変化した後、コアラの食事の嗜好にタイムラグが生じる可能性も示唆されます。しかし、GIマイクロバイオームと食事の間に自然循環的な関係があることを考えると、この2つの説明を分けることは困難である。
コアラでは、メシマズの消化を促進する特定の微生物の機能や正体を明らかにすることは、メシマズの摂取割合が個体間で異なることや、コアラのGIマイクロバイオームが連続体を形成していることから困難である。メスメイトとマナガムの両方を食べる野生のコアラは、中間のGIマイクロバイオームを示し、ある例では指標となる特徴を持たないことがわかった（コアラID=R）。このことは、偏在する分類群の相対的な存在量の変化が、メスメイトの食餌に対する何らかの適応をもたらす可能性を示唆しています。これらのコアラが、長期間にわたってメスメイトだけで持続できるかどうかは不明である。
純度の高い食餌を持つ個体に焦点を当てることで、メシマコブ食に関連する指標的な特徴の存在を確認することができた。これらの指標を投与したコアラでのみGIマイクロバイオームの変化が観察されたことから、コアラがメシマコブのみで生活するためには、特定の微生物分類が重要である可能性が示唆された。特に、LachnospiraceaeとRuminococcaceaeのメンバーは、メシマコブ食に関連していた。Briceら[21]は、メシマズを食べるコアラにはこれらの科がより多く存在し、Ruminococcaceaeのゲノムには、Parabacteroides属（マンナガムのGIマイクロバイオームで高濃度に発見）のメンバーよりも、難分解性のセルロースの分解を標的とする酵素遺伝子が多く存在することを発見しました。Lachnospiraceaeは主に哺乳類のGI管に関連しており[36]、両科とも以前は繊維分解性であることが確認されている[37]。このことから、これらの分類群は、繊維発酵を改善することで、コアラがメシマズの葉から十分なエネルギーを獲得するのを助ける可能性があると考えられます。しかし、メスメイトとマンナガムを食べるコアラの両方が、これらの科のメンバーを保有していることを認識する必要がある。したがって、指標となる微生物を分類学的にさらに細かく特定し、その固有の機能特性を明らかにするためのさらなる研究が必要である。特に、Lachnospiraceae NK4A136属とLachnospiraceae UCG-001属は、治療コアラに移行することが判明し、マナガムを食べるコアラには非常に少ないか存在しなかったため、注意を払う必要がある。
メスメイトとマナガムの葉の繊維含有量と組成は、コアラのGIマイクロバイオームとメスメイトを食べる能力または意思に決定的に関係していると思われます。また、コアラの年齢や歯の摩耗、植物二次代謝産物の消化・吸収、解毒、代謝、排泄に関する内因性の能力の違いなど、マイクロバイオームとは別に、コアラの食嗜好に影響を与える要因があるのかもしれない。メスメイトの摂食を制限する要因として考えられるのは、2種のユーカリの二次代謝産物組成の違いです。マナガムは葉にホルミル化フロログルシノール化合物（FPC）を含み [22]、メスメイトは非置換B環フラバノン（UBF; [38]）を含む。これらの化合物群はいずれもコアラの摂食を阻害することが確認されている（Marsh et al.未発表；[39]）。しかし、テルペンやフェノール化合物の多くは後腸に至る前にコアラに吸収されるため、これらがコアラのGIマイクロバイオームとどの程度相互作用するかは不明である [40]。対照的に、ヒツジ、ウシ、および（より少ない程度ではあるが）ウッドラット（Neomtoma spp.）などの前腸発酵動物は、摂取した毒素の微生物代謝からより多くの利益を得る可能性がある（Foleyら1999、Dearingら2005年）。タンニンはメシマコブの含有量が多い別の化合物群であり、一部は食物タンパク質と結合し、小腸での消化を妨げる [41] 。タンニンはまた、ムチンを含む内因性タンパク質と結合し、タンパク質の損失を増加させ [42]、微生物酵素複合体と結合して機能を低下させる [43]。これらのタンニンタンパク質複合体の少なくとも一部は、ユーカリの葉を食べた他のフェイルオーバーの後腸に到達する[44]。コアラのGIマイクロバイオームには、これらのタンニンタンパク質複合体を分解できる細菌が時々含まれている[45,46,47]。しかし、これらの細菌は相対的な存在量が少なく[17, 18]、本研究では検出されなかった。さらに、アミノ酸は小腸でのみ吸収されるため、コアラは後腸の細菌によって解放されたアミノ酸を利用することができない[5]。したがって、ユーカリ種の二次代謝産物とコアラの後腸内細菌群の相互作用が、コアラの栄養や食餌の選択に影響を与えるかどうかは不明です。
他の研究系では、肥大した前腸に生息する既知の微生物種が分解できる単一の同定可能な二次代謝物または毒素を通じて、GIマイクロバイオームが食餌選択に影響を与えることが直接示されている。例えば、オーストラリア牛は、ミモシンを分解する細菌をルーメンに導入した場合にのみ、Leucaena leucocephalaを食べる [7, 48] 。さらに、キツツキ（Neotoma spp.）の前腸袋に、ジュニパーやシュウ酸を多く含むサボテン類を食べる動物の微生物を接種すると、接種前はほとんど食べずに痩せていたのが、対応する食事で体を維持できるようになる [8, 9]。
今回の発見は、不適切なGIマイクロバイオームが、2013年にマナガムを落葉させた後に飢餓状態に陥ったコアラが、個体群の大部分がメスメイトを摂取できるにもかかわらず、食事をメスメイトに切り替えなかった理由の一端を説明する仮説に一定の支持を与えるものです。さらに、メスメイトが導入された当初、コアラはメスメイトをより多く食べていたという観察結果は、コアラがメスメイトを食べることに対する強い行動的嫌悪感をあらかじめ持っていなかったことを示唆しています。むしろ、導入後3日間でメスメイトの摂取量が減少したことから、コアラは消化後のフィードバックによって嫌悪感を抱くようになった可能性があると考えられます[49, 50]。また、コアラの個体差によってメスメイトを最初に受け入れるかどうかが異なり、それが接種後の摂取量に影響するという結果は、コアラがメスメイトを食べようとする意欲に影響を与える、過去の経験、遺伝、生理の違いがある可能性を示唆しています。植物の二次代謝産物の多くは肝臓で解毒され、解毒能力には個体差が見られます[40]。また、代謝率やエネルギー要求量も個体によって大きく異なることがある[32]。このような違いが、観察された嗜好性の違いの原因である可能性がある。したがって、この種の食餌選択は、コアラの生理学とGIマイクロバイオームとの間の複雑な関連によって決定される可能性がある。
コアラのGI管に腸内細菌を導入し、定着させることができる糞便接種の開発は、コアラの保護に広く応用できるツールになると考えています。コアラはオーストラリア連邦政府によって脆弱動物に指定されており、その地理的範囲において様々な問題に直面しています。オーストラリア北東部では、生息地の喪失と病気により、最近コアラが減少しています [51, 52]。毎年、大量のコアラがリハビリテーションクリニックに持ち込まれ[53]、胃腸の不調を引き起こす可能性のある抗生物質で治療されることが多い[54]。私たちが開発した経口糞便接種カプセルは、このようなコアラのプロバイオティクスとして使用することで、腸内細菌異常症を予防し、機能的な腸内細菌叢を回復させることができると考えられます。オーストラリア南部では、コアラの多くの個体群が増えすぎており [55, 56]、地域の密度を下げるために転移している個体もいます [55, 57, 58]。このような場合、糞便接種を応用して、コアラのGIマイクロバイオームが放流先で利用できる食樹種に適応するのを助けたり、コアラがその場で食餌を移行するのを助けたりして、移動の必要性をなくすことができるかもしれない。しかし、このような用途では、カプセルの寿命と生産効率を向上させるために、さらなる改良が必要である。
まとめ
本研究により、GIマイクロバイオームは、たとえ種や集団全体にそのような適応があったとしても、個体内の食事変化に必ずしも適応しない場合があることが明らかになった。特定の微生物種の水平伝播が限られているため、個々の動物の食事ニッチが制約され、共生するGIマイクロバイオームの消化能力が異なるために、種内で食事が分離することがある。このようなニッチ分割は、種の生態や生息地の選択に大きな影響を与える。
研究方法
研究デザイン
ケープ・オトウェイ（38° 50′ 8.07" S, 143° 31' 7.00" E）の3.5km2にわたるマンナガム（E. viminalis）の成木林から12頭の野生コアラを捕獲し、ビクトリア州ケープオトウェイのConservation Ecology Centreで飼育する（追加ファイル2：図S2；追加ファイル3：表S1）。コアラは6頭（オス3頭、メス3頭）の2つのコホートで捕獲された。最初のコホートは2017年10月から12月にかけて、2番目のコホートは2018年1月から3月にかけて飼育された。追加ファイル 2 を参照： 研究デザインの概要については、図S3を参照。
コアラは、コバルトエチレンジアミン四酢酸（Co-EDTA）を1kg（体重）あたり400mg、クロム媒染植物繊維粒子（500〜1000μm）を1kgあたり800mg投与する前に、最低4日間囲いに慣れることができた。コアラによるこれらの不活性消化マーカーの滞留時間を調べるため、その後14日間糞を採取した（原稿準備中）。この間、コアラにはマンナガムの葉のみを与えた。
滞留時間調査終了後、コアラにメスメイト葉を導入し、すべてのコアラにメスメイト葉とマンナガム葉の両方を3晩（コホート1）、8晩（コホート2）提供しました。このコホート間の違いは、あくまでも物流上のやむを得ない理由によるものである。それでも、両コホートのGIマイクロバイオームは、メスメイトの導入から3日後にサンプリングされました（下記参照）。
9日間という期間は、コアラの溶質消化マーカーの通過速度が異常に長い（微生物の滞留時間を示すと考えられている）ことから選択されたものです。Cork and Warner [59]は、飼育下のコアラで溶質に関連するCr-EDTAの平均滞留時間を約9日間と測定したが、Krockenberger and Hume [32]は、野生コアラの溶質滞留時間の平均を4.5日間とし、この違いは野生と飼育下の対比によるとのこと。本研究のコアラは飼育下において飼育されていたため、コアラの腸内全体を確実に接種するためには9日間の接種が必要であると保守的に予想された。
治療コアラには、メスメイトの葉を食べる野生の無線捕獲コアラを接種源とした（下記のドナーコアラの項を参照）。対照コアラには、自分自身とそのコホート内の他の対照コアラの糞便を混合したものを接種した。このコントロールは、投与による影響と、外因性微生物への暴露による確立されたGIマイクロバイオームへの潜在的な混乱を再現するものである。
コアラは接種後さらに18日間飼育され、定着しなかった微生物がコアラの胃腸管から排除される9日間の「洗浄」期間と、その後の9日間でコアラの摂食行動と定着後の胃腸内細菌叢を評価しました。この18日間を通して、コアラの摂食が最も多く行われる20:00～08:00の間は、メスメイト葉のみをコアラに提供しました[60]。メスメイトとマンナガムの葉は、メスメイトを食べたがらないコアラや食べられないコアラにも栄養が行き渡るように、日中も利用できるようにした。定着時間研究のため、最後の接種から4日後に2回目の消化管マーカーを投与した。
コアラのGIマイクロバイオームの構成は、実験期間中に追跡調査されました。マイクロバイオーム解析のための糞便サンプルは、以下のタイミングで採取した： 1）捕獲時、2）メスメイトの初回導入直前、3）メスメイト導入3日後、4）最終接種直後、5）9日後、6）18日後。コアラの摂食嗜好は、試験期間中、コアラの日中および夜間のメスメイトとマナガムの摂取量を測定することで追跡した（下記参照）。コアラは実験終了後、捕獲した地点でリリースした。ただし、コントロールコアラ1頭は体重減少が許容できないレベル（捕獲体重の10％以上）だったため、接種終了後9日目にリリースした。その他のコアラは、飼育開始後1週間で体重が減少した後、実験期間中も体重を維持した（Additional file 2: Figure S4）。
捕獲されたコアラ
コアラは、標準的な縄と旗を使った手法で捕獲した[61]。コアラは捕獲後、イソフルラン（Isoflurane, Delvet Pty, Ltd.）で麻酔し、健康状態、年齢、性別を評価し、袋小路を持つかどうかを確認するために拘束された。本研究で使用した動物には、子袋を持つものはおらず、観察可能な病気や怪我もなかった。オトウェイ岬半島の雌の大半は、ビクトリア州政府がこの場所でのコアラの過剰繁殖を抑制するために、避妊用インプラント（Levonorgestrel：Elorn Projects Pty Ltd., Southport, Queensland, Australia）を以前に装着していた。妊娠しているコアラが研究に参加する可能性を最小限にするため、避妊された雌のコアラを優先的に選んだ。全てのコアラは良好な状態（コンディションスコア7以上）[62]で、4歳から12歳に相当するクラス3から5までの歯の摩耗を示した[63]。
飼育方法
コアラは2×2.5mのヤードで個別に飼育された。各ヤードには、2つの休息用フォークと2つの給餌ステーションが設置され、休息用フォークの下には2×1.5mの人工芝が敷かれている。残りの床面は芝生で構成されている。各庭の一部は遮光布で日差しと雨を防いだ。コアラに与えるユーカリの葉はすべて、オトウェイ岬のマナガムとメスメイトの木から大きな枝を切り出したものである。乾燥防止のため、枝は常に水に浸しておいた。コアラには自由行動で水を与えた。糞尿は毎日、人工芝と枝から取り除かれた。
提供されたコアラ
オトウェイ岬のメスメイトツリー（E. obliqua）のパッチ（追加ファイル2：図S2）を占有する健康な成体コアラを、飼育下処理コアラの糞便ドナーとして使用した（追加ファイル3：表S1）。研究開始時に、これらのコアラは捕獲され、VHF無線発信器の首輪を装着し、捕獲地点で解放されました。その後、糞便接種前の少なくとも2週間と、糞便接種中および接種後の2〜6ヶ月間、コアラの無線追跡を行った。この間、コアラの日中の位置と休息木の種類を26回から78回記録した。
コホート1およびコホート2では、それぞれ5頭のコアラをドナーとして使用した。コホート1では、メス2頭、オス3頭のコアラがドナーとして使用された。これらのコアラのうち2頭は、少なくとも78％の頻度でメスメイト・ストリンギーバーク（E. obliqua）の木で観察され、さらに2頭のコアラは50％と61％の頻度でメスメイトで発見された。これらのコアラがメスメイトで観察されないときは、通常マナガムで観察されるが、ブラックウッド（Acacia melanoxylon）のような非食用樹で観察されることもある（0-14％）。5番目のコアラは、非食用木や地面にいることが多く（18％）、メスメイトにいることが63％であったが、地面や非食用木の場所を除くと76％に増加することがわかった。コホート2では、同じコアラのうち3頭がドナーとして使用された。しかし、メスメイトツリーで最も観察されなかった2頭のコアラを2頭のオスに変更し、第2コホートのドナーはメス1頭とオス4頭で構成されるようになった。代わりのオス2頭は、82％と94％の確率でメスメイトツリーで観察されました。
いくつかの研究では、糞便微生物群構造の変化は、生産後最初の24時間以内では最小であると結論付けている[64, 65, 66, 67]。そのため、接種日の前日の午後遅く（通常は17時以降）にドナーコアラを探し、処理用接種液の調製に必要な糞便の採取を行った。ドナーコアラの糞便は、コアラの下の地面に遮光布を敷いて一晩かけて採取した。翌朝早く、この糞便をドロップシートから回収し、手袋を使用してプラスチック製ジップロックバッグに入れ、回収後1時間以内に新しい接種液を処理する。ドナーコアラの糞便のサブサンプルはマイクロバイオーム解析のために保管された。
糞便採取期間終了後、コアラを捕獲し、首輪を外して捕獲地点で解放した。
糞便の植え付け
コホート1および2のコアラには、9日間の接種期間中、毎日、新鮮な糞便を処理したカプセルを2個ずつ接種した。これに加えて、コホートMG2のコアラには、乾燥した粉砕糞便を含むカプセルを1日1〜2個（接種の1週間前に製造）接種しました。コアラの糞便微生物群は、消化管内の微生物群とは異なることが知られている[17]。しかし、糞便材料は、この研究のための唯一の実用的/倫理的なGI微生物の源であり、他の研究で成功裏に使用されている [8, 30]。
カプセルは、ヘシアンサックに入れられたコアラを調査員が拘束した状態で、「ピルポッパー」を用いてコアラに投与された。カプセルの投与は、コアラ1頭あたり5～10分以内（捕獲時間を含む）であった。抗生物質は接種した微生物の定着を必ずしも改善せず、微生物の多様性を持続的に低下させる可能性があるため、コアラには抗生物質を投与しなかった[31]。
投与用の新鮮なカプセルを調製するために、最大5頭のメスメイトドナーコアラの新鮮なペレットをプールした（追加ファイル3：表S2）。また、飼育下の対照コアラから採取した新鮮なペレットも別々にプールした。次に、Hirschら[30]の修正プロトコルにしたがって糞便接種物を調製した。糞便ペレットを1/4リンゲル液と混合し、最初は手作業で、次にボルテックスミキサーを使用してスラリー状にした。このスラリーを15分間遠心分離し、上清をピペッティングで除去した。ペレットの3つの層は通常、大きな繊維状の断片からなる下部ペレット、微粒子層、細菌と想定される白い層が形成された（追加ファイル2：図S1）。上部の微粒子層と細菌層を集め、プールし、Clements（GS 150）遠心分離機で3 700 rpm、60分間遠心分離した。その後、上清を除去し、得られたペレットを接種剤としての使用のために混合した。接種剤をサイズ0の耐酸性ヒプロメロースカプセル（DRCaps、Capsugel®）に分注した。このカプセルをシェラック溶液（37% w/vシェラック、61.5% v/vエタノール、1.5% v/v Tween 20）でバンドし、その後サイズ00の耐酸性ヒプロメロースカプセルに入れ、シェラック溶液を薄くコーティングした。カプセルは乾燥させた後（約15分間）、1時間以内にコアラに投与した。
糞便接種試験に先立ち、in vitroでカプセルの性能を試験し、細菌が酸（pH1.7-1.9）存在下で10時間以上（コアラの胃における消化物の通過時間を超える）カプセル内で生存できること、中・後腸の環境に似た中性溶液中に置くとカプセルが分解することを示した（追加ファイル1）。ペレット各層および最終接種物から、マイクロバイオーム評価のためのサンプルを採取した。
投与用のドライカプセルを調製するため、コントロールおよびトリートメントドナーの糞便を、茶色の紙袋の中で24〜48時間、周囲温度で風乾させた後、家庭用コーヒーグラインダーを使用してペレットを微粉末にした。この粉末をサイズ00の耐酸性ヒプロメロースカプセルに充填し、シェラック溶液で薄くコーティングした。乾燥した糞便は、製造後2週間以内にコアラに投与した。
GIマイクロバイオーム評価
マイクロバイオーム評価のために、合計98個の糞便サンプルが採取されました。これには、研究期間中の飼育コアラからの70サンプル、ドナーコアラからの10サンプル、メスメイトの森で見つかった他のコアラからの2サンプル、マナガムの森にいた他のコアラからの6サンプル（MG2で飼育コアラになった1頭を含む）、3つの処理接種剤サンプル、ドナー糞便サンプルの遠心分離中にできた層からの7サンプル（単一のドナーコアラからの3つと混合サンプルからの4つ）が含まれています。6つのサンプルのフルセットは、飼育下のコアラのうち10頭から採取されました。早期にリリースした対照コアラ（ID=B）の最終サンプルは採取できず、治療コアラ（ID=G）の捕獲サンプルは輸送中に紛失してしまった。
各糞便サンプルについて、糞便ペレットの中心部から採取した約50～70mgの材料から全ゲノムDNAを抽出した。この材料を、0.1mm径のジルコニア・シリカビーズを含むMoBioビーズチューブ内で、MoBio PowerLyzer24を用いて2,000rpmで5分間叩きました。ジルコニア/シリカビーズと750ulのTLAバッファー(Promega)を入れた。その後、Maxwell 16ロボットシステムおよび対応するTissue DNAキット（Promega）を用いて、製造元の説明書に従って上清150ulからDNAを抽出した。各抽出キットにはネガティブコントロールが含まれていた。
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix（New England Biolabs）を使用した以外は、イルミナ（#15044223 Rev.B）のワークフローに従って、DNA抽出物から803Fおよび1392Rプライマー［68］を用いて16 s rRNA遺伝子の589 bpセクション（V5～V8領域）を増幅した。PCR産物は、Illumina Nextera XT 384 sample Index Kit A-D（Illumina FC-131-1002）を用いてユニークな8bpバーコードでインデックス付けされました。インデックスされたアンプリコンは、Qiagen QIAquick Gel Extraction Kitを使用して、製造元の指示に従って単離した。ペアエンドシーケンスはAustralian Centre of Ecogenomicsで、Illumina Miseqを用い、バージョン3試薬キットを用いて300サイクルで実施した。
フォワードリードを処理し、SILVA 128データベース[70, 71]を用いてQIIME 2 (v. 2017.10; [69])によって分類学的指定を割り当てた。得られたサンプル別微生物特徴表は、R（バージョン3.5.0; [73]）のveganパッケージ[72]を用いてサンプルあたり10 000リードに希釈された。すべてのコミュニティ組成分析は、希薄化されたデータセットで実行された。マイクロバイオームの豊かさは、希薄化後にサンプルごとに回収されたユニークな特徴のカウントと、RのパッケージFossil [74]を使用してアルファ多様性のChao Indexを計算することで推定しました。コアラ内のマイクロバイオーム多様性は、veganパッケージを使用して計算したシャノン多様性指数を使用して推定した。サンプル間の重み付けUnifrac距離はQIIME 2で計算し、微生物群の相対的存在量の変動は、veganパッケージを使用して重み付けUnifrac距離から生成した主座標分析（PCoA）で説明した。微生物組成におけるグループ間の有意差は、veganパッケージを用いて重み付けされたUnifrac距離からPERMANOVAによって決定した。その他の差は、線形回帰モデル、t検定、残差が正規性に適合しない場合のウィルコクソン順位和検定を用いて検定した。
Rのindicspeciesパッケージ[75]を用いて指標種分析を行い、どの微生物の特徴がマナガム食と比較してメスメイト食に有意に関連しているかを調べた。マナガムの森で発見されたコアラ（後に飼育コアラとなるコアラを除く；n＝5）および捕獲時の飼育個体（GIマイクロバイオームが典型的なマナガムコアラのものとは似ていない2頭の飼育コアラを除く；n＝9；結果：糞便接種の成功を参照）は、分析のためにマナガム群に含められた。各処理提供者（50％の確率でメスメイトで発見されたコアラを除く；n＝6）とメスメイトの森で発見された他の2匹のコアラから1つのサンプルをメスメイトグループに含めた。この分析では、特定された特徴（指標種）ごとに2つの統計量が返されました： A = その特徴が発見されたメスメイトコアラのサンプルである確率、B = メスメイトコアラからその特徴が発見される確率。indicspeciesパッケージの文書に記載されている推奨パラメータを使用し、Aが80％以上、Bが35％以上の微生物特徴を真の指標種とみなしました。
食事評価
コアラに提供する直前と、提供した枝を取り除いた直後の重量を測定し、メスメイトとマナガムの葉の乾物摂取量（DMI）を測定し、総乾物摂取量を算出した。総湿分摂取量は、コアラのペンの外で保管されていた対照枝の質量変化で補正した。各コントロール枝の葉のサンプル（20～60g）を80℃で24時間乾燥させ、葉の乾物（DM）含有量を算出し、これをコアラの総DMIの算出に使用した。また、コアラは摂食中に定期的に葉を地面に落としていた。これらの葉は、枝をペンから取り外すたびに集められ、メスメイトまたはマナガムと同定され、乾燥され、重量を測定されました。落とした葉の乾燥重量を、各樹種の総DMIから差し引き、実際のDMIとした。
メスメイト導入前、コアラがマンナガムのみを食べていた時の各コアラの一日平均摂取量（ADI）を計算した。これにより、体格の違いや消化・代謝効率の違いによるコアラ間の維持エネルギー要求量の個体差を把握することができました。また、糞便接種前の各コアラのメスメイトの夜間 DMI を算出しました。これにより、実験操作前の各コアラのメスメイトに対する食欲を測定した。次に、糞便接種中と接種後の各コアラのメスメイトの夜間 DMI を測定した。これらの計算では、対照枝の重量が10%以上増加した、あるいは5%以上減少した摂食期間（12時間窓）は除外した。この限界を超えて変化すると、DMIの推定に大きな誤差が生じるからである。雨で葉に水が溜まると枝の重量が増加し、これは枝全体で一貫した変化であることが確認された。日差しや風にさらされ、葉の水分が失われた枝は、通常、重量が減少した。このような変化は枝によって多少異なることが確認されたため、重量増加よりも重量減少に厳しい制限が課された。これらの制限により、日中の摂取量測定の大部分が除外され、総摂取量とマナガム摂取量（実験のほとんどで日中のみ給餌）は、一部の日（52%）でのみ信頼性の高い評価を行うことができた。しかし、メスメイトが主に消費される夜間の摂取量の推定は、大半の日で信頼できるものであった。
総乾物摂取量
実験期間中の1日の総乾物摂取量に影響を与える因子を評価するため、線形混合モデルを使用した。モデルはRでlme4パッケージ[76]を用いて構築し、固定効果の有意性はlmerTestパッケージ[77]を用いて計算した。コアラ ID は、反復測定研究デザインを考慮し、すべての分析にランダム効果として含まれた。また、日付もランダムな要因として含まれた。実験のフェーズ、治療グループ、および実験期間中のコアラのGIマイクロバイオームの変化は、別のモデルで説明変数として考慮した。また、治療グループおよびGIマイクロバイオームの変化を示したコアラにおいて、摂取量が経時的に変化した可能性を考慮し、最初の糞便接種後の日数を実験グループ（治療/対照）およびGIマイクロバイオームの変化説明変数との交互作用項として含めた。有意でない変数は後方消去法で削除し、報告されたp値はすべて最終モデルから取り出した。
接種前のメスメイトの摂取量
また、導入後3日間と接種前の夜間のメスメイト摂取量に影響を与える要因を線形混合モデルで評価しました。メスメイトの摂取量がコアラ間で異なるか、経時的に異なるか、コアラのGIマイクロバイオームの構成で説明できるかどうかを判断した。捕獲時およびメスメイト導入直前のコアラのGIマイクロバイオームを予測因子として、別々のモデルに当てはめた。コアラのGIマイクロバイオーム組成の指標として、Bacteroidetes to Firmicutes（B：F）比と、重み付けUniFrac距離行列に基づくPCoAの第1軸におけるコアラのGIマイクロバイオームの位置が用いられた。マナガムADIとコホート（1または2）は、固定共変量として解析に含めた。また、摂食に影響を与える可能性のある天候などの環境条件の変動を考慮し、ランダム因子として日付を含めた。有意でない変数は、後方消去法で取り除いた。
接種中および接種後のメシマズの摂取量
また、線形混合効果モデルを用いて、メスメイト摂取量が糞便接種によってどのような影響を受けるか、コアラのGIマイクロバイオームと関連するかどうかを評価した。夜間のメスメイトDMIは、信頼性の高い推定値であるため、最適な応答変数と考えられたが（上記参照）、我々の知見を確認するために、説明変数として1日の総摂取量のうちメスメイトの割合を用いたサブセットの解析も行った。マナガムADI、メスメイトの接種前摂取量、コホートは、夜間のメスメイトDMI分析において固定共変量として含まれた。コアラIDは、反復測定研究デザインを考慮し、すべての分析においてランダム効果として含まれた。また、日付もランダムな要因として含めた。
一連の潜在的な説明変数は、別のモデルで評価された： 1.コアラが治療群と対照群のどちらに属するか、2.捕獲時のコアラのGIマイクロバイオーム（B：F比とPC1スコア）、3.フェーズ直前のコアラのGIマイクロバイオーム、4.フェーズ直後のコアラのGIマイクロバイオーム、5.実験期間中のコアラのGIマイクロバイオームにおける全体変化。赤池情報量規準（AIC）を用いて、両変数が有意である場合に、フェーズ前のGIマイクロバイオームとフェーズ後のGIマイクロバイオームのどちらがメスメイト摂取量の予測因子として優れているかを評価しました。また、治療群やGIマイクロバイオームの変化を示したコアラにおいて、メスメイト摂取量が経時的に変化した可能性を考慮し、最初の糞便接種後の日数を実験群（治療/対照）およびGIマイクロバイオームの変化説明変数との交互作用項として含めた。接種中と接種後を合わせた全期間と、異なるフェーズ（すなわち、接種中、ウォッシュアウト、定着後）を別々にモデル化した。有意でない変数は後方消去法で除去し、報告されたすべてのp値は最終モデルから引用した。
データおよび資料の入手方法
シーケンスデータはNCBI SRAデータベース（Bioproject: PRJNA554505）で、処理されたデータセットはDryad (https://doi.org/10.5061/dryad.45ct519)で利用可能です。
略号
ADI：
1日平均摂取量：コアラが24時間に摂取するユーカリの葉の乾物重量の平均値を指す。
DMIのこと：
Dry Matter Intake（乾燥物質摂取量）： 乾燥重量で測定したユーカリの葉の消費量
GIです：
胃腸のマイクロバイオーム： 動物の消化管に関連する微生物群
TDMI：
24時間における総乾物摂取量
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リファレンスのダウンロード
謝辞
フィールドワークとコアラの飼育を手伝ってくれた以下の方々に感謝します：Huiying Wu、Georgina Pitson、Jessica Pulvirenti、Denise Dearing、Sam Fischer、Sarah Leeson、 Lauren Halstead、Giselle Owens. また、イソフルランによるコアラ鎮静のトレーニングをしてくれたポートマッカリーコアラ病院のCheyne Flanaganと、オーストラリア生態系研究センターの配列決定チームにも感謝します。
資金提供
この研究は、Evolva Biotech A/S、NSW Office of Environment and Heritage、The Conservation Ecology Trustとの共同研究として、オーストラリア研究会議（LP140100751）から資金提供を受けました。
著者情報
著者と所属
西シドニー大学ホークスベリー環境研究所（オーストラリア、ニューサウスウェールズ州、シドニー、2753年
ミカエラ・D・J・ブライトン＆ベン・D・ムーア
オーストラリア生態学センター、クイーンズランド大学、ブリスベン、クイーンズランド州、4067、オーストラリア
ロシェル・M・スー＆フィリップ・フーゲンホルツ
ディーキン大学生命環境科学部（オーストラリア、ビクトリア州、メルボルン、2134年
デズリー・ウィッソン
オーストラリア国立大学生態学・進化学研究室（オーストラリア、ACT、2601、Canberra
カレン・J・マーシュ＆ウィリアム・フォーリー
オーストラリア、ビクトリア州、3233、オトウェイ岬、コンサベーション・エコロジー・センター
ジャック・パスコ＆マーク・ル・プラ
貢献度
糞便移植実験は、PH、JP、WF、BMが発案した。研究の設計は、MB、WF、BMが行った。MB、DW、KM、JP、ML、WF、BMは、研究のためのデータを取得するために、フィールドワークと飼育実験の運営に携わった。RSは、糞便サンプルの微生物組成の分子解析とバイオインフォマティクス解析を行った。MBは統計解析を行った。MB、WF、PH、BMは、データの解釈に貢献した。MBは原稿を執筆した。すべての著者が原稿を読み、編集し、最終版を承認した。
執筆者
ミカエラ・D・J・ブライトンに対応します。
倫理に関する宣言
倫理的承認と参加への同意
フィールドワークは、Western Sydney University Animal Care and Ethics Committee (A12282) の承認と、Victorian Department of Environment, Land, Water and Planning (10008442) の科学許可を受けて実施された。
出版に関する同意
該当事項はありません。
競合する利益
著者は、競合する利害関係がないことを宣言する。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図や所属機関に関する管轄権の主張に関して中立を保っています。
追加ファイル
追加ファイル1：
糞便接種実験用カプセルのin vitroでの開発。(PDF 89 kb)
追加ファイル2：
図S1. 糞便サンプルを1/4リンゲル液と混合してスラリーを形成し、15分間遠心分離したときに形成される層の画像。図S2. コアラの捕獲場所、eucalupt forect の種類、捕獲実験の場所を示す研究サイトの地図。MG1＝捕獲コアラコホート1、MG2＝捕獲コアラコホート2、MM＝治療ドナーコアラ。図S3. 糞便接種実験のタイムライン。青丸は、GIマイクロバイオーム評価のために糞便サンプルを採取した時期を示す。緑色の給餌スケジュールバーにおいて、MG＝マナガム；およびMM＝メスメイトである。D＝Day、N＝Night。飼育下のコアラの体重の経時変化。実験日0は糞便接種の初日である。接種期間は灰色の枠で示す。各コアラは異なる記号で表されている。コントロールコアラは青色、トリートメントコアラは赤色で表示されている。開いている四角で示した対照コアラは、糞便接種終了後9日目に許容できない体重減少のため、リリースされた。(PDF 393 kb)
追加ファイル3：
表S1. 研究コアラ。表S2. 各日の接種液に使用されたドナーコアラの糞： コホートMG1。表S3. 各日、接種液に使用したコアラの糞： MG2コーホート (PDF 428 kb)
権利と権限
オープンアクセス この記事は、クリエイティブ・コモンズ 表示 4.0 国際ライセンス (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/) の条件の下で配布されています。これは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズのライセンスへのリンクを提供し、変更を加えた場合に示すことを条件に、あらゆる媒体での無制限の使用、配布、複製を許可します。本記事で公開されているデータは、特に断りのない限り、クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの放棄(http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/)が適用されます。
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Blyton, M.D.J., Soo, R.M., Whisson, D. et al. faecal inoculations alter gastrointestinal microbiome and allow dietary expansion in a wild specialist herbivore, the koala. anim microbiome 1, 6 (2019). https://doi.org/10.1186/s42523-019-0008-0.
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2019年2月21日受領
2019年7月09日受理済み
2019年8月21日発行
DOIhttps://doi.org/10.1186/s42523-019-0008-0
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