BilRはビリルビンをウロビリノーゲンに還元する腸内細菌酵素である
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公開日：2024年01月03日
BilRはビリルビンをウロビリノーゲンに還元する腸内細菌酵素である
https://www.nature.com/articles/s41564-023-01549-x
ブラントリー・ホール、ソフィア・レヴィ、...姜暁芳 著者表示
Nature Microbiology (2024)この記事を引用する
メトリクス詳細
要旨
過剰な血清ビリルビンは黄疸や神経障害を引き起こす可能性があるため、ヒトとその腸内細菌叢によるビリルビンなどのヘム副産物の代謝は、ヒトの健康に不可欠である。この経路の重要なステップであるビリルビンをウロビリノーゲンに還元する細菌酵素は、これまで未同定のままであった。今回我々は、生化学的解析と比較ゲノム解析を用いて、ビリルビンをウロビリノーゲンに還元する腸内細菌由来のビリルビン還元酵素としてBilRを同定した。ビリルビンの還元に重要な残基を同定することで、類似の還元酵素とBilRの配列を区別し、BilRは主にファーミキューテス属にコードされていることを明らかにした。ヒトの腸内メタゲノム解析から、BilRは健康な成人ではほぼどこにでも存在するが、新生児や炎症性腸疾患の患者では有病率が低下することが明らかになった。この発見は、ビリルビン代謝における腸内細菌叢の役割に光を当てるものであり、ビリルビンの恒常性維持における腸肝軸の重要性を浮き彫りにするものである。
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メイン
ヘム分解経路の中間体であるビリルビンは、腸-肝臓軸を通じてヒトの生理学において重要な役割を果たしている1。コレステロールや胆汁酸などの胆汁中の他の有機分子とともに、ビリルビンジグルクロニド（抱合ビリルビン）は腸に分泌され、そこで排泄または再吸収される。ビリルビンジグルクロニドがヒトまたは細菌のβ-グルクロニダーゼによって脱共役されて非共役ビリルビンになると、腸肝循環に容易に再吸収されるか、腸内微生物による還元反応によってさらに代謝され、より排泄性の高い代謝産物であるウロビリノーゲンやステルコビリノーゲンになる2。ビリルビンの再吸収は血清ビリルビン濃度を上昇させるが、ウロビリノーゲンやステルコビリノーゲンとして便や尿中に排泄されることでクリアランスが促進され、ヘム分解経路が完成する3,4,5（図1a）。
図1：ビリルビン還元菌株の同定。
図1
a, ヘム分解経路の図解。b、ビリルビンとウロビリノーゲンの構造図。c、細菌株の蛍光アッセイスクリーニングの結果。n=3の独立した生物学的複製からの測定値を黒点で示す。棒グラフは、ビリルビンを添加した対応する無生物培地サンプルに対するサンプルの蛍光の比率を示す。エラーバーは平均値の上下1 s.e.を示す。灰色の線は比率5を示し、これを超えるとビリルビン減少が陽性とみなされる。Clostridium sp. M62/1とClostridium citroniae WAL-17108は単一データ点で表される。
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腸内細菌によるビリルビン減少の調節異常は血清ビリルビン濃度に影響を及ぼし、これは健康に重大な影響を及ぼす可能性がある。中程度の濃度であれば、ビリルビンは健康に役立つ可能性のある重要な抗酸化物質として機能する6,7。しかし、血清ビリルビン濃度が上昇すると毒性を示し、黄疸や、極端な場合にはビリルビン誘発性神経障害の一種であるケルニクテルスを引き起こす可能性がある8。同様に、ウロビリノーゲンは再吸収される可能性があり、複数の疾患と関連していることから、複数の代謝産物のホメオスタシスにおけるビリルビン減少の重要な役割が浮き彫りになっている3,4,5,9,10。血清ビリルビン濃度に対するビリルビン腸肝循環の重要性は1960年代から1970年代にかけて示唆されていたが、2000年代初頭の研究で、微生物によるビリルビン代謝が血清ビリルビン濃度に直接影響することがラットで示されるまで、ほとんど過小評価されていた11,12,13,14。
腸内微生物は、ビリルビンをウロビリノーゲンに還元し、この分子を嫌気性呼吸の終末電子受容体として利用する可能性がある。ビリルビン還元における腸内微生物の役割は認識されているにもかかわらず、ビリルビンをウロビリノーゲンに還元する腸内微生物酵素（以下、ビリルビン還元酵素と呼ぶ）は発見されていない15。Clostridioides difficile12株、Clostridium ramosum16株、Clostridium perfringens12株、Bacteroides fragilis17株など、複数のビリルビン還元菌が同定されているが、これらの研究の多くは、ゲノム配列決定が広く普及する前に行われたものであり、どの菌株を研究対象としたかを知ることは困難である。ビリルビン還元酵素をコードする遺伝子についての知識がなければ、腸内微生物の代謝が血清ビリルビンの恒常性にどのような影響を及ぼすかについて結論を出すことは難しく、ヘム分解経路についての理解に重要なギャップを残している。
本研究では、ビリルビンのウロビリノーゲンへの還元を担う酵素を同定し、微生物によるビリルビン還元とヒトの健康との関係を理解するために、この知識を応用することを目的とした。一般的な腸内細菌の実験的スクリーニング、比較ゲノム学、生化学的推論を組み合わせることで、我々はbilRと名付けたビリルビン還元酵素遺伝子の候補を同定し、蛍光アッセイとメタボロミクスによってそのビリルビン還元酵素活性を確認することができた。ヒトの腸内メタゲノムを解析したところ、ビリルビン還元酵素は健康な成人にはほぼ普遍的に存在する一方、炎症性腸疾患（IBD）患者や乳幼児、特に乳幼児が黄疸を発症しやすい生後数カ月には、この遺伝子の有病率がかなり低いことがわかった。本研究は、ヘム分解経路における長年の知見のギャップを埋めるものであり、黄疸のような血清ビリルビンの恒常性障害を理解するための基礎となるものである。
研究結果
推定ビリルビン還元酵素の同定
我々の目標は、実験的スクリーニングと比較ゲノム学によって、ビリルビン還元酵素をコードする遺伝子を特定することであった。ビリルビン還元酵素はおそらく、炭素-炭素二重結合に作用する酸化還元酵素であろう（Enzyme Commission (EC): 1.3.-.-;図1bおよびExtended Data Fig.1）。さらに、この遺伝子はビリルビンを還元できる種のゲノムには存在し、還元できない種のゲノムには存在しないはずである。ビリルビンを還元する能力が異なる近縁種を調べることで、この活性を担う特定の遺伝子を同定することを目指した。
ビリルビン還元能を持つと推定される腸内細菌種を同定するために、ビリルビンを含む培地で培養した細菌からの抽出物を用いた蛍光アッセイを行った。このアッセイの前提は、ビリルビン還元の不安定な潜在的産物であるウロビリノーゲンとステルコビリノーゲンは、ヨウ素を加えることでより安定なウロビリンとステルコビリンに容易に酸化され（Extended Data Fig. 陽性対照として、既知のビリルビン還元物質であるClostridioides difficile CD3が蛍光アッセイで陽性結果を示し、培養にビリルビンを添加しない場合は蛍光が生じないことを示した（図1cおよびExtended Data Fig.
ビリルビンを還元する可能性のある他の菌種を探索するため、ヒト腸内細菌叢の主要な門から、ビリルビンを還元することが以前に報告された菌種とその分類学的近縁種を優先的に選び、ビリルビンを添加した培地で様々な細菌を増殖させ、ウロビリンについて蛍光アッセイを行った。この蛍光アッセイ法を用いて、これまでビリルビンを還元することが知られていなかった3種を含む9株の推定ビリルビン還元活性を同定した： その中には、Clostridium symbiosum（WAL-14163株およびWAL-14673株）、Clostridium sp. M62/1株、Ruminococcus gnavus CC55_001C株の3種が含まれていた（図1cおよびExtended Data Fig.2）。また、13の腸内細菌種は蛍光陽性の結果を示さなかった（図1c）。検査した種のうち、すべてのビリルビン還元菌が固形化門Clostridiaクラスに属することが判明した。しかしながら、クロストリジウム・クロストリジオフォルメ2_1_49FAAやクロストリジウム・ボルテアエCC43_001Bのような、これらの還元因子の近縁種は還元因子であることが判明しなかった。
我々は、近縁菌株間のビリルビン還元のばらつきを利用して、比較ゲノム解析によりビリルビン還元酵素遺伝子の候補を同定した。解析の対象は、ビリルビン還元活性を示すと推定される5株と、蛍光アッセイでビリルビン還元活性を示さなかった近縁5株のゲノムであった。解析した10種のゲノムのうち、合計6,256のオルソグループが同定され、そのうち389が推定酸化還元酵素であると予測された。これらのオルソグループのうち2つだけが、ビリルビン減少の表現型と同じように、菌株における存在と不在のパターンに当てはまった。そのうちの1つは4-ヒドロキシ-3-メチルブト-2-エニル二リン酸レダクターゼ（EC: 1.17.1.2）と予測され、CHまたはCH2基に作用し、イソプレノイド生合成に関与する酵素であるが、ビリルビン還元酵素として提案されている要件を満たしていなかった20。もう1つの還元酵素オルソグループは、2,4-ジエノイル-CoA還元酵素（EC: 1.3.1.34）と相同であることが判明した注釈のない酵素で、予想されるビリルビン還元反応と同様に、炭素-炭素二重結合を還元する酸化還元酵素であった。
次に、推定ビリルビン還元酵素を含むオペロンを解析した。bilRは推定ビリルビン還元酵素、bilSはフラボドキシン様タンパク質、bilQはMarRファミリーの転写制御因子である。Clostridioides difficile CD3とClostridium symbiosumの両菌株は、3つの遺伝子すべてを含むバージョンのオペロンを含んでいた。Clostridium sp. M62/1はbilRとbilSのみ、Ruminococcus gnavus CC55_001CはbilRのみであった。Ruminococcus gnavus CC55_001CのbilRは、他の4つのbilR遺伝子と比較して、2つの余分なC末端ドメインをコードしている点で異なっている（Extended Data Fig.3）。Ruminococcus gnavus CC55_001C BilRタンパク質のN末端ドメインは、トリオースリン酸イソメラーゼ（TIM）バレルフォールドであると予測され、他のbilR遺伝子の全タンパク質配列と相同である。Ruminococcus gnavus CC55_001C BilRの2つの余分なドメインは、フラボドキシン様ドメインとNADP(H)結合ドメインである。Ruminococcus gnavus CC55_001C bilRがコードするフラボドキシン様ドメインとbilSがコードするフラボドキシン様タンパク質との間には、同じフォールドを持ち、おそらく電子伝達に関与していると予測されるが、配列相同性は検出されなかった。Ruminococcus gnavus CC55_001CのBilRはOld Yellow Enzymeファミリー（COG1902）に属すると予測され、大腸菌2,4-ジエノイル-CoA還元酵素（Protein Data Bank (PDB): 1PS9、タンパク質同一性＝29. 82%、予測BilRと2,4-ジエノイル-CoAレダクターゼの二乗平均平方根偏差=2.79、正規化テンプレートモデリングスコア0.90; Extended Data Fig.4）、2-trans,4-cisと2-trans,4-trans-ジエノイル-CoAチオエステル21の両方の還元を触媒する酵素である。この相同性は、ビリルビン還元酵素がビリルビンの複数のCH-CH基に作用できる酸化還元酵素であると仮定されていることから、BilRが推定ビリルビン還元酵素であることを裏付けている。
図2：推定ビリルビン還元酵素オペロン。
図2
系統樹は、5つのビリルビン還元酵素と5つの非還元酵素の関係を示している。遺伝子は矢印で表されている。遺伝子は予測されるドメインを示すように色分けされている。
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BilRはビリルビン還元酵素活性を与える
BilRがビリルビン還元酵素の候補として同定されると、大腸菌での異種発現を通して、ビリルビン還元酵素活性を付与するのに十分であることを実験的に検証しようとした。Clostridium symbiosumとClostridioides difficile由来のbilRS遺伝子（short bilRS）とRuminococcus gnavus由来のbilR（long bilR）を別々にpCW-licベクターにクローニングし、大腸菌10-βに形質転換するか、pET-28a(+)ベクターに形質転換し、大腸菌T7でlysY/Iqを発現させた（図3a,b）。蛍光アッセイがビリルビンのウロビリノーゲンへの還元の代理として使用できることを検証するため、蛍光アッセイでビリルビンのウロビリノーゲンへの還元を測定し、液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析（LC-MS/MS；図3c,d）で結果を検証した。クロストリジ オイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）およびクロストリジウム・シンビオサム（Clostridium symbiosum）BilRSで形質転換された株は、ビリルビンとインキュベートした後、いずれも顕著な蛍光を示し、対応するLC-MSサンプル中にウロビリンの存在が観察された（蛍光アッセイ： 蛍光測定：Clostridioides difficile BilRS P = 9.99 × 10-6、Clostridium symbiosum BilRS P = 2.29 × 10-5、対数変換データに対する2標本t検定；メタボロミクス： メタボロミクス：Clostridioides difficile P = 7.59 × 10-5, Clostridium symbiosum P = 2.78 × 10-4, 対数2変換データの2標本t検定（urobilin m/z 591.4→m/z 343.2））。サンプルは、ステルコビリンが存在することを示すピークを示さなかった（Extended Data Fig.5）ことから、このアッセイは、ウロビリノーゲンへのビリルビン還元の信頼できる指標として使用できることが示唆された。長いBilR構築物もビリルビンをウロビリノーゲンに還元することができた（蛍光アッセイ： Ruminococcus gnavus BilR P = 3.48 × 10-7、log2変換データに対する2標本のt検定；図3e）、空のベクターバックボーンpCW-licを持つ大腸菌はビリルビンを還元しなかった（P = 0.167、abiotic培地対照に対するlog2変換データに対する片側t検定）。メソビリルビン（m/z 589.3→z 301.2）もステルコビリン（m/z 595.4→z 345.2）も一貫して検出されなかった（Extended Data Fig.5）。ネイティブなビリルビン還元酵素とbilRSを発現する大腸菌は、メソビリルビンをウロビリノーゲンに還元することもできたことから、この酵素はビリルビン中の4つの二重結合すべてに作用できることが示唆された（Extended Data Fig.） これらの結果は、BilRがビリルビンまたはメソビリルビンをウロビリノーゲンに還元するのに十分であることを示している（Extended Data Fig.）
図3: bilR(S)ビリルビン還元酵素活性の確認。
図3
a, Clostridium symbiosumおよびClostridioides difficile bilRSコンストラクトの概略図。Ptacはtacプロモーター、PT7はT7プロモーター、LacOはlacオペレーターである。 c, 空のベクター、Clostridium symbiosumコンストラクト、およびClostridioides difficileコンストラクトで形質転換した大腸菌10-βのビリルビン還元活性を比較した蛍光アッセイ（2標本片側t検定）。e, Ruminococcus gnavus bilRコンストラクトで形質転換した大腸菌10-βのビリルビン還元活性を蛍光で確認（2標本片側t検定）。棒の高さは、cとdのプロットと統計量を作成するために使用したn = 4の独立した生物学的複製の平均を示す。サンプルの平均がベクター対照の平均より大きいかどうかを判定するための2標本片側t検定のP値は、括弧の上に記載されている。個々のデータ点は、各プロット上の黒い点で示されている。
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BilRクレードの定義
BilR配列をOld Yellow Enzymeファミリーの他のメンバーから区別するために、構造予測と配列保存の組み合わせを使用して、推定BilR配列中の主要残基を同定し、BilRを他の配列から区別した（図4aおよびExtended Data Fig.） 我々の解析により、クレード1と呼ばれるある特定のクレードがビリルビン還元酵素クレードである可能性が高いことが明らかになった（図4aおよび拡張データ図8）。BilRの予測構造を、構造的に相同な大腸菌の2,4-ジエノイル-CoA還元酵素と比較したところ、BilR酵素の推定活性部位が示された（Extended Data Fig.4）。大腸菌2,4-ジエノイル-CoA還元酵素のY166残基は、酵素の基質中の炭素二重結合を形成する炭素原子の1つをプロトン化して、その結合の還元を完了すると考えられている21,22。予測されたBilR構造における正電荷を帯びたアルギニン残基の位置が類似していることから、このR167残基または隣接するD166残基もプロトン供与体として働き、NAD(P)Hのフラビン補因子から炭素-炭素二重結合にヒドリド基が移動した後に還元反応を完了すると考えられる。D166残基とR167残基は、隣接するH164残基とG165残基とともに、確認された5種のビリルビン還元種のBilR遺伝子間で保存されていることがわかった。このヒスチジン、グリシン、アスパラギン酸、アルギニン（HGDR）モチーフをオールドイエローエンザイムファミリー内で検索したところ、5つのビリルビン還元酵素をすべて含むタンパク質の大きなクレード内でほぼ普遍的に保存されていることがわかった（図4b,c）。これらの残基がクレード1の配列（図4a）内で保存されていることと、これらの残基が大腸菌の2,4-ジエノイル-CoA還元酵素の活性部位残基と同様の位置にあることから、クレード1にはビリルビン還元酵素が含まれていることが示唆された。
図4：bilRクレードの同定。
図4
a,推定bilR配列とOld Yellow Enzymeファミリーの関連還元酵素から構築した遺伝子ツリー。実験的に確認されたビリルビン還元酵素はツリー中にラベルされている。クレード1は全体的なbilRクレードを示し、クレード2は短いbilRクレードを示す。すべてのブートストラップ値と種のラベルを付けた同じツリーは、Extended Data Fig.8に含まれている。b, ConSurf保存解析に基づくクレード1内での保存の程度を示すように配列に色を付けた、Ruminococcus gnavus BilRのAlphaFold予測構造。ドッキングされたビリルビン（緑）とFMN（オレンジ）分子が構造上に示されており、挿入図はR167残基と推定される酵素基質との相互作用の可能性のある部位を示している。HGDR残基は挿入図で紫色に着色されている。 c, clade 1 BilR配列内の保存位置を示す図。d, ベクターコントロール、Ruminococcus gnavus bilR、および166-167位のアスパラギン酸、アルギニン（DR）残基をアラニン、アラニン（AA）に変異させたRuminococcus gnavus bilRで形質転換した大腸菌10-βにおけるビリルビン還元酵素活性を比較した蛍光アッセイの結果。バーの高さは、プロットおよびdの統計を作成するために使用したn = 6の独立した生物学的複製の平均に基づいている。ネイティブのRuminococcus gnavus bilRの平均値がベクターコントロールまたは変異体の平均値より高いかどうかを決定するための2標本片側t検定のP値を示す。個々のデータ点は、各プロット上の黒い点で示されている。
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クレード1がビリルビン還元酵素で構成されていることを確認するために、酵素活性に対するD166残基とR167残基の機能的影響を調べる実験を行った。これには、問題の残基をD166AとR167Aに変異させ、変異タンパク質を異種発現させて酵素活性への影響を測定することも含まれた。変異タンパク質は野生型タンパク質と同様の構造特性を示し、この変異が酵素の全体的なフォールディングに大きな破壊をもたらさないことが確認された（Extended Data Fig.9）。大腸菌で発現させると、変異タンパク質は野生型タンパク質よりも有意に低いビリルビン還元酵素活性を示した（P = 3.27 × 10-6、2標本t検定；図4d）。この実験的アプローチは、活性部位のD166残基とR167残基がビリルビン還元に重要であることを示す直接的な証拠であり、ビリルビン還元酵素に特異的で、オールド・イエロー・エンザイム・ファミリーの他のメンバーとは異なる特徴であり、クレード1がビリルビン還元酵素であることを支持するものである（図4a）。
次に、ビリルビン還元酵素の分類学的分布と多様性を調べ、Genome Taxonomy Database（GTDB；図5および補足表1）の代表的ゲノム658個から推定ビリルビン還元酵素を同定した。bilR遺伝子の分布は、これまでに報告されているビリルビン還元菌の分布とほぼ一致しており、Clostridium ramosumやClostridioides difficileなどの種が予測されるbilR遺伝子を有していた。クロストリジウム・ペルフリンゲンスの代表ゲノムはビリルビン還元酵素を持たないが、クロストリジウム・ペルフリンゲンス属に割り当てられた315ゲノムのうち137ゲノムはビリルビン還元酵素を持っており、ビリルビン還元は株特異的な特徴であることが示唆された。特筆すべきは、バクテロイデス科のどの種もビリルビン還元酵素を持たないことで、1972年に発表された過去の報告と矛盾しているが、これは菌株特異的な特徴であるか、分類学的な割り当てが間違っている可能性がある17。
図5：ビリルビン還元酵素の分類学的分布。
図5
クラドグラムは、ビリルビン還元酵素遺伝子が検出された異なる分類群間の関係を示している。外側のリングは、短いbilR遺伝子（赤）と長いbilR遺伝子（オレンジ）の存在を示す。
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bilR遺伝子の長い変異型は、複数の系統に広く分布しているが、短い変異型は、ファーミキューテス門の外ではパロルセネラ属にのみ見られ、ファーミキューテス門に限定されるようである。bilR遺伝子の大部分は、Roseburia intestinalis、Roseburia inulinivorans、Faecalibacterium prausnitziiのような一般的なヒト腸内細菌種を含む、ファーミキューテス属で同定された。bilR遺伝子の短い変異体は単系統であり（図4aのクレード2）、特にファーミキューテスにおいて、bilRの進化の過程で広範な水平遺伝子転移があったことを示唆している。いくつかのbilR遺伝子は、一般的に水生や土壌環境に生息するFlavobacterialesの細菌で見つかっており、他の環境においてビリルビンまたは類似の代謝産物を分解するビリルビン還元酵素の役割の可能性を示唆している。ビフィドバクテリウム属の9種がビリルビン還元酵素であると予測され、ニワトリ、キツネザル、サルなどヒト以外の動物の糞便から分離された。このことは、ヒトの腸内細菌叢のビリルビン還元能力は、ファーミキューテス属に属するビリルビン還元酵素の存在量に大きく影響されていることを示唆している。
新生児の腸にはビリルビン還元酵素が存在しないことが多い
ビリルビン還元酵素と年齢や健康との関係を調べるために、我々はヒト腸内メタゲノムの大規模解析を行った。生後1年目の乳児4,296人の腸内メタゲノムについて、ビリルビン還元酵素の有無について調べた（補足表2）。その結果、ビリルビン還元酵素は、新生児黄疸のリスクが最も高い生後数カ月の間は乳児に存在しないことが多かったが（Extended Data図10）、生後1年の終わりまでにはほとんど存在するようになる23（図6a）という顕著な傾向が見られた。乳児の血清ビリルビン濃度には様々な要因が影響すると考えられるが、ビリルビン還元酵素が欠損しているサンプルが最も多く観察される時期と新生児黄疸のリスクとの対応関係は、マイクロバイオームの構成と乳児の黄疸発症との間に強い関連があることを示唆している。
図6：発育期および疾患時のヒト腸内におけるbilRの存在。
図6
a, 生後1年間にbilRが欠損した乳児の腸内メタゲノムの割合。b、生後1ヶ月の健康な成人と乳児のサンプルにおけるbilRの欠如の比較。c、健康な成人とIBD（クローン病（CD）または潰瘍性大腸炎（UC））の成人のbilRが検出されなかったサンプルの割合の比較。各データセットに含まれるメタゲノミックサンプル数は、各バーの上に示されている。各比較のP値は、多重検定で調整することなく、bilRが検出されなかったサンプルの割合がグループ間で異なるかどうかを判定するための等比割合検定の結果を示しています。
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ビリルビン低減はヒト腸の中核機能である
IBD患者では血清ビリルビン濃度が有意に変化しており、この疾患ではビリルビン代謝マイクロバイオームが破壊されていることが示唆されている24。健康な成人のメタゲノムを調べたところ、ビリルビン還元酵素は分析した1,801サンプルのわずか0.1%にしか存在せず、これは幼児に見られたものより有意に低い割合であった（P < 2.2 × 10-16、等比検定）（図6b）。健常成人と比較して、IBD患者はウロビリン濃度が低く、高濃度のビリルビンを含む色素沈着胆石を形成することが観察されている25,26。ビリルビン還元酵素は、クローン病患者（P < 2.2 × 10-16、等比検定）または潰瘍性大腸炎患者（P < 2.2 × 10-16、等比検定）の検体では、健常検体と比較して有意に高い割合で欠失した（図6c）。このことは、IBDやその他の炎症性疾患に伴う微生物分類学的変化が、腸内細菌叢のビリルビン減少活性に直接的な影響を及ぼしている可能性を示す証拠となる。
考察
125年以上前に尿中の黄色色素としてウロビリンが同定されたにもかかわらず、その生成に関与する酵素は謎のままであった27。以前は、ビリルビンの還元には複数の酵素が関与していると考えられていたが、今回の結果は、ビリルビンをウロビリノーゲンに還元するのは単一の酵素であるという知見を支持するものである19。ビリルビン還元酵素の同定により、7,960のメタゲノムにおけるその存在量をプロファイリングすることができ、ビリルビン還元酵素は健康な成人ヒト微生物叢の中心的な特徴であり、新生児黄疸の発症率が最も高い時期には、新生児がビリルビン還元酵素を欠損していることが多いことが示された28,29。さらに、IBD患者ではビリルビン還元酵素の有病率が低下していることもわかった。
我々の実験から、ビリルビン還元酵素はビリルビンをウロビリノーゲンに完全に還元することができ、複数の基質に作用する可能性があることが示された。このプロセスの重要性は、ヘム分解の律速段階である血清ビリルビンを抱合する肝臓のUGT1A1酵素の能力が限られていることによって、さらに強調されている30。加えて、共役ビリルビンは腸内微生物によって容易に脱共役されると考えられており、共役ビリルビンに対する微生物の活性は限られていることが示されていることから、ビリルビンの還元がヘム分解の副産物が再吸収または排泄される程度を決定する重要なステップであることが示唆される5,11,19,31。
ビリルビン還元酵素の発見は、ヘム排泄の健康に関連する段階についての理解における重要なギャップを明らかにするものであるが、この経路にはさらに解明が必要な側面がある。第一に、ビリルビンはBilRによって還元される前にβ-グルクロニダーゼによって脱共役されると考えられるが、経路の順序を確認するためには、ビリルビン・ジグルクロニドを用いた追加実験が必要である19。第二に、腸内細菌叢によって行われるビリルビン還元の下流経路には、酵素が未知であるウロビリノーゲンのステルコビリノーゲンへの還元という、さらなる段階がある。ビリルビンと同様に、ウロビリノーゲンは、これらの還元酵素をコードする微生物にとって終末電子受容体として機能し、腸内の嫌気性環境において競争上の優位性をもたらすのかもしれない。
ビリルビンの還元に関与する微生物種、遺伝子、酵素の知識が得られたことで、今後の研究は、腸内微生物のビリルビン代謝が血清ビリルビンの恒常性にどの程度影響を及ぼすか、また、健康と疾患におけるビリルビン還元の役割に焦点を当てることができるようになった。ビリルビン還元酵素が幼い乳児には存在しないことが多いというわれわれの発見は、新生児黄疸は腸内にビリルビン還元微生物が存在しないか、存在量が少ないために悪化するという仮説を支持するものである11,12。宿主とマイクロバイオームの両方に関連する複数の要因が黄疸の発症に寄与していることは間違いない。これらの要因に対処するためには、血清ビリルビン、便中ウロビリノイド、ビリルビン還元菌の絶対量を同時に測定する新たなコホート研究が、この疾患におけるこれらの役割を明らかにするために必要であろう32,33。血清ビリルビン濃度は、脂肪率や心血管疾患と逆相関することが観察されている10,34。ウロビリン濃度もヒトの健康に影響を及ぼし、インスリン抵抗性や心不全と正の相関がある9,10。このことから、ヘム分解経路の複雑さと重要性がさらに浮き彫りになり、健康に関連する複数の代謝産物のバランスを決定する上で、ビリルビン還元酵素が重要な役割を果たしていることが確認された。
健常人のメタゲノムとIBD患者のメタゲノムとの間に観察された違いは、IBDにおけるビリルビン代謝の潜在的な破綻を浮き彫りにしている。IBD患者ではビリルビン還元菌の有病率が低いことから、IBD患者におけるビリルビン代謝の破綻と、すでに確立されている非抱合型一次胆汁酸の増加が組み合わさって、これらの患者で観察されているビリルビン酸カルシウム胆石の発生率の上昇に寄与している可能性があるとの仮説を立てた25,35。これらの結果は、これらの疾患におけるビリルビン代謝微生物の役割を示唆しているが、結論を出すにはさらなる研究が必要である。我々の研究は、長年にわたる知識のギャップを埋めるものであり、ヒトの健康におけるビリルビン代謝の重要性に関する今後の研究の基礎となる知識を提供するものである。
方法
培養方法
嫌気性細菌
細菌株はNIH Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository（BEI）から入手した。菌株はグリセロールストックから植菌し、嫌気チャンバー（Coy Laboratory Products社製）内で37℃、嫌気条件下（90％N2、5％CO2、5％H2）で培養した。菌株は、ジメチルスルホキシド（DMSO、Sigma-Aldrich）に溶解した滅菌ろ過ビリルビンを100mlあたり4.4mg添加した200mlの液体脳心筋注入（BHI）ブロス（Research Products International、B11000）または酵母カシトン脂肪酸ブロス中で増殖させた。菌はクロロホルム抽出を行う前に、37℃で24時間嫌気的に増殖させた。
形質転換大腸菌
形質転換大腸菌株を寒天コロニープレートから、100μg ml-1 カルベニシリン（GoldBio, 00901C103）または50μg ml-1 カナマイシンおよび100μM イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG, GoldBio, 221105I2481）を添加した300 ml BHI培地に接種し、37℃で16時間好気的に振盪した。その後、細菌を3,260×gで6分間遠心分離してペレット化し、嫌気チャンバーに移した。このペレットを200 mlのBHIに再懸濁し、100 ml当たり4.4 mgの滅菌濾過したビリルビンをDMSOに溶解し、100 μg ml-1のカルベニシリンまたは50 μg ml-1のカナマイシンを加え、100 μMのIPTGでクローニングしたbilR遺伝子の発現を誘導した。クロロホルム抽出を行う前に、菌株を37℃で24時間嫌気培養した。
ビリルビン減少の測定
蛍光アッセイ
嫌気チャンバーから細菌培養液を取り出し、3,260×g、6分間の遠心分離によりペレット化した。上清を非滅菌0.22μmフィルターでろ過した。クロロホルム（5ml；Sigma-Aldrich）を濾過した上清に加え、分液漏斗で有機抽出し分離した。得られたクロロホルム-ウロビリノーゲン溶液は、クロロホルムが完全に蒸発するまで風乾され、その後の蛍光アッセイおよびLC-MS/MSで使用される抽出液が得られた。
ビリルビン還元のウロビリノーゲン生成物は酸素中で不安定であるため、ウロビリノーゲン自体の測定は不可能であった。そこで、ビリルビン還元を測定するために、ウロビリノーゲンをヨウ素添加によりウロビリンに酸化した。ウロビリンは、酢酸亜鉛溶液を加えて蛍光性の亜鉛-ウロビリン錯体を形成させることにより定量した36,37,38。しかし、このアッセイは、ウロビリンと同じ波長で蛍光を発するステルコビリンも検出する39,40。この2つの潜在的生成物を区別するために、蛍光アッセイを質量分析で検証した。
ウロビリノーゲンは不安定であるため、このアッセイはクロロホルム抽出のクロロホルムが蒸発した直後に行う必要がある。600μlの脱イオン水で抽出物を再水和した。400μlの再水和溶液のアリコートを別のチューブに移し、アッセイを続けた。ウロビリノーゲンをウロビリンに酸化するために、10μlの10％ポビドンヨード溶液（CVS、A47194）を添加し、続いて10μlの100mMシステイン溶液を添加して、残りのヨウ素を還元し、シュレジンジャー試薬（メタノール中545mM酢酸亜鉛）添加後のビリルビンの酸化を防止した。シュレジンジャー試薬（400 µl）を加えて、ウロビリンの蛍光を増加させた。得られた溶液を96ウェルアクリルプレートに100μlの3連または4連に分注した。各ウェルの蛍光は、SpectraMax M5プレートリーダーを用い、波長495 nmの励起と波長525 nmの発光を中程度のゲインで測定した。対照試料の蛍光の5倍を超える蛍光シグナルを発した試料を還元剤と同定した。閾値の5倍以下のサンプルは非還元体であるとみなされた。
LC-MS/MS
クロロホルム抽出液から1mlのクロロホルム溶液を採取し、完全に乾燥させた。サンプルはドライアイスで夜間輸送し、Dukeメタボロミクスコアに送った。乾燥したサンプルに10%ポビドンヨード溶液60μlを加えた。サンプルをボルテックスし、15,000 × g、4 °C で 5 分間遠心した。上清をLC-MS/MS注入用の1.7 ml Macherey-Nagelガラスバイアルに移した。
サンプルは6500+ QTRAP LC-MS/MSシステム（Sciex）で分析した。Sciex ExionLC超高性能液体クロマトグラフィーシステムには、脱気装置、ADオートサンプラー、ADカラムオーブン、コントローラー、ADポンプが含まれる。液体クロマトグラフィー分離は、Agilent Eclipse Plus C18 RRHDカラム（2.1×50 mm、1.8 μm）を用い、移動相A（水中0.2%ギ酸）および移動相B（アセトニトリル中0.2%ギ酸）で行った。流速は0.35 ml min-1であった。リニアグラジエントは以下の通りであった： オートサンプラーは10℃に設定し、カラムは35℃に保った。注入量は5μlであった。質量スペクトルは、イオンスプレー電圧5,500 Vのポジティブエレクトロスプレーイオン化で取得した。カーテンガス、イオンソースガス1およびイオンソースガス2は、それぞれ33、55および60 psiであった。メソビルビン(m/z 589.3→z 301.2)、ウロビリン(m/z 591.4→z 343.2)、ステルコビリン(m/z 595.4→z 345.2)の検出には多重反応モニタリングが用いられた。ビリルビンおよびウロビリノーゲン標準物質とインキュベートしたClostridium symbiosumの共注入を行い、サンプルと標準物質の保持時間が一致していることを確認した（Extended Data Figure 7m,n）。すべてのデータはAnalyst 1.7.1ソフトウェアで解析した。
構築物の開発
pCW-sym-bilRS
Clostridium symbiosum由来のbilRS遺伝子を大腸菌で発現させるため、遺伝子を増幅し、発現ベクターバックボーンpCW-lic (Addgene, 26908)に挿入した。OneTaq Master Mix（New England Biolabs（NEB）、M0482）を用いたポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅を、クロストリジウム・シンビオサムゲノムDNAに対して、フォワードプライマーTAAGCACATATGCTGGAAAGACGAAGGAGGCTCとリバースプライマーTAAGCAGGTACCGCAGCGTCCCTGAGTを用いて行い、クロストリジウム・シンビオサムbilRSを増幅した。産物をMonarch PCR and DNA cleanup kit (NEB, T1030)で精製し、NEBclonerプロトコルを用いて酵素Nde1 (NEB, R0111)とKpn1-HF (NEB, R3142)で制限し、pCW-licバックボーンへのライゲーションに備えた。pCW-licベクターバックボーンを同じ酵素で制限した。pCW-licは自己ライゲーションを防ぐため、antarctic phosphatase (NEB, M0289)で脱リン酸化した。制限したインサートと脱リン酸化したバックボーンをT4 DNAリガーゼ（NEB, M0202）でライゲーションし、コンストラクトを形成した。
pCW-dif-bilRS
2つの例外を除いて、pCW-sym-bilRSと同じプロトコルを用いた。PCR増幅は、クロストリジオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）ゲノムDNAに対して、フォワードプライマーTAAGCAGGATCCCAGCTGTGGAGGAAGAATAGGATGおよびリバースプライマーTGCTTAAAGCTTACTACAATACTAGCTTTAATCATCATAを用いて行い、クロストリジオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）bilRSを増幅した。生成物はライゲーション前に酵素BamH1-HF (NEB, R3136)とHindIII-HF (NEB, R3104)で制限した。
pCW-gna-bilR
2つの例外を除いて、pCW-sym-bilRSと同じプロトコルを用いた。PCR増幅は、フォワードプライマーTAAGCAGGATCCGCAGAAAGAAATGTTAAGGAGGCTGおよびリバースプライマーTAAGCAGGTACCGAAGGATGTTTCATCCACCTGTACGを用いて、Ruminococcus gnavusゲノムDNA上で行い、Ruminococcus gnavus bilRを増幅した。この産物を酵素BamH1-HFとKpn1-HFで制限してからライゲーションした。
pCW構築物による形質転換
コンストラクトを、製造業者のプロトコール（NEB, C3019）を用いて、NEB 10βコンピテント大腸菌細胞に個別に形質転換した。形質転換に成功したコロニーを選択するために、細胞を100μg ml-1 カルベニシリンを添加したLuria-Bertani（LB）プレートにプレーティングした。形質転換されたコロニーは、Azentaによるサンガー配列決定によって確認した。
pET28-bilR
bilRの発現を最適化するために、pET28a(+)ベクターバックボーンを用いて第2のコンストラクトを開発した。Ruminococcus gnavus CC55_001CのbilR遺伝子をpET28a(+)にクローニングしてタンパク発現を行うために、報告されているプロトコール41を用いてRuminococcus gnavusのグリセロールストックからインサートを増幅した。使用したフォワードプライマーはCGGCAGCCATGAGATTATTAGAACCAATTAAAGで、リバースプライマーはGGCCGCAAGCTTATAAAACGTTTGCTGCCであった。ベクターバックボーンはpET28a(+)からフォワードプライマーCGTTTTATAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGとリバースプライマーATAATCTCATGGCTGGCCGCGCGCACで増幅した。得られたインサートとベクターバックボーンPCR産物をNEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix (NEB, E2621S)を用いてアセンブルし、pET28-BilRを得た。PCRにはQ5 High-Fidelity 2× Master Mix (NEB, M0492L)を用い、クローニングにはコンピテントセルとしてNEB Turbo Competent E. coli (NEB, C2984H)を用いた。
pET28-bilR-166AA
部位特異的突然変異誘発は、KOD Hot Start DNA polymerase (Sigma-Aldrich, 71086-3)とNEB Turbo Competent E. coliを用いた以外は、Agilent QuikChange II Site-Directed Mutagenesis kitのプロトコルを用いて行った。簡単に説明すると、PCR産物をpET28-BilRを鋳型として、フォワードプライマーGAAGTACGGAGCCGCTCTGATCGGATCATTCとリバースプライマーGAATGATCCGATCAGCGCTCCGTGTACTTCを用いて増幅した。残りの工程は、部位特異的突然変異誘発プロトコールに記載されたように行い、pET28-BilR-D166A + R167Aを得た。変異はサンガー配列決定により確認した。
pET構築物による形質転換
このコンストラクトを大腸菌T7 express lysY/Iqコンピテントセルにメーカーのプロトコール（NEB, C3019）を用いて形質転換した。形質転換に成功したコロニーを選択するため、細胞を50μg ml-1カナマイシンを添加したLBプレートにプレーティングした。形質転換コロニーはAzentaによるサンガー配列決定で確認し、プラスミドはPlasmidsaurusで確認した。
精製と円偏光二色性
タンパク質の精製のために、pET28-bilR(DR166AA)またはpET28-bilRで形質転換した大腸菌T7発現lysY/Iqを、50μg ml-1カナマイシンを添加したLBブロス中で一晩培養した。一晩培養した菌体（5 ml）を50 μg ml-1カナマイシンを添加した新鮮なLBブロスに移し、光学密度約0.5まで増殖させた。タンパク質の発現を0.4 mMイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシドで誘導し、培養を25℃で18時間行った。細胞を3,000 × gで遠心し、2時間凍結した後、溶解バッファー（20 mM Tris、0.2 M NaCl、1 mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、16 μg ml-1 RNase、0.5 mg ml-1 リゾチーム）に再懸濁した。ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動で、タンパク質が溶解液の上清に存在することを確認した。上清を滅菌した0.2μmフィルターで濾過し、ニッケルカラム（G Biosciences社製ニッケルキレート樹脂）と5ml重力濾過カラム（G Biosciences社製カラム、5ml）を用いて精製した。精製したタンパク質は、フィルター滅菌した溶出バッファー（20 mM Tris, 0.2 M NaCl, 200 mM imidazole, pH 6.5）を用いて溶出した。精製した野生型BilRタンパク質と変異型BilR(DR166AA)について、pH 7、50 mM塩化ナトリウムを含む20 mM Tris緩衝液中で円偏光二色性測定を行った。円偏光二色性測定は、Jasco J-810分光光度計を用い、光路長1 mmで行い、測定値を正規化し、Rを用いて可視化した。
バイオインフォマティクス解析
bilR候補遺伝子の同定
実験的に確認されたビリルビン還元菌の5つのゲノムと、近縁の確認された非還元菌の5つのゲノムをNCBIからダウンロードした。Clostridium bolteae CC43_001BとClostridium innocuum 6_1_30のアセンブル済みゲノムは入手できなかったので、対応するバイオプロジェクトから生のシーケンスデータをダウンロードした。SRA-Tools（バージョン2.11.0; https://github.com/ncbi/sra-tools）を用いて2種のFastqファイルをSRAからダウンロードし、Trim-Galore（バージョン0.6.7; https://github.com/ncbi/sra-tools）を用いてFastqファイルのトリミングとクオリティフィルターを行い、Spades（バージョン3.15.5）を用いてゲノムをアセンブルした42。ゲノムはProkka (version 1.14.6)43でアノテーションした。Orthologer（バージョン2.7.1）を用いて、各ゲノムから予測されるタンパク質配列をデフォルト設定でオルソグループにグループ分けした44。次に、ECPred (version 1.1)を用いて、デフォルト設定45で各タンパク質配列に推定EC番号を割り当てた。次に、オキシドレダクターゼEC番号（EC: 1.-.-.-）に割り当てられた2つ以上のタンパク質のみを含むグループを残すために、オルソグループをサブセットし、合計389のオルソグループを残した。これらのオキシドレダクターゼオルソグループ内のタンパク質の分類学的分布をプロファイリングし、ビリルビン還元菌には存在し、非還元菌には存在しないオルソグループを同定した。分類学的分布に適合したオルソグループは2つだけであった。このうち、1つはEC: 1.17.7.4 (4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase)に分類され、ビリルビン還元酵素である可能性は低かった。もう1つはEC: 1.-.-.-に分類され、ビリルビン還元酵素と推定された。
構造予測と分子ドッキング
Ruminococcus gnavus CC55_001C 由来の推定 BilR タンパク質、Clostridium symbiosum WAL-14163 由来の BilR と BilS タンパク質の構造は AlphaFold (version 2.2.0)46 を用いて予測した。基質結合ポケットは、Fpocket (version 4.0.2)をデフォルト設定で使用して予測した47。予測されたポケットはPyMOL (version 2.5.0)を用いて可視化され、相同性のある大腸菌2,4-ジエノイル-CoA還元酵素の基質結合領域(PDB: 1PS9)と比較され、BilR構造上の3つの基質結合領域が同定された(http://www.pymol.org/)。ビリルビン（PubChem 化合物識別子 5280352）とフラビンモノヌクレオチド（FMN）（PubChem 化合物識別子 643976）の構造を、AutoDock Vina（バージョン 1.2.0）48,49を用いて Ruminococcus gnavus の BilR 構造にドッキングした。ドッキングシミュレー ションは、選択した 3 つの Fpocket 基質結合ポケット予測の中心点 を中心とする 20 Å × 20 Å × 20 Å の立方体内で、網羅性を 32 に設定 して行った。ドッキング結果はPyMOLを用いて可視化し、図中で使用した結果は、ビリルビン上でどのような結合が減少するかについて知られていること、および大腸菌1PS9タンパク質の既知の結合コンフォメーションとの比較に基づいて選択した。Ruminococcus gnavus CC55_001Cの予測構造とClostridium symbiosum WAL-14163 BilR, Clostridium symbiosum WAL-14163 BilSおよび大腸菌1PS9の各構造との間で、TM-Align50を用いてタンパク質構造アラインメントを行った。タンパク質の配列保存は、アラインメントされたクレード1のBilR配列に基づき、ConSurfを使用して予測されたRuminococcus gnavus BilR構造を可視化した（https://consurf.tau.ac.il/consurf_index.php）。
GTDBにおけるBilRの検索
クレード1の生物種からのアミノ酸配列のアラインメント（図4a）と、Ruminococcus gnavus CC55_001C BilRタンパク質の最初の373残基に対応するアラインメント内の位置を抽出し、hmmbuildツールを使用して隠れマルコフモデル（HMM）プロファイルを生成した。このプロファイルはBilRタンパク質のTIMバレルドメインを表している。このHMMプロファイルを用いて、GTDB51のゲノム内検索を行い、BilRの分類学的分布をプロファイリングした。検索はhmmsearchを用いて行い、e-valueが1×10-100以下のヒットのみを考慮した。次に、InterProScan (version 5.57-90.0)52を用いて、ヒットしたBilRと思われるタンパク質ドメイン予測を行った。推定BilR配列は、Clostridium symbiosum WAL-14163由来のBilR配列の少なくとも50%の長さであること、高度に保存されたHGDRモチーフが配列中に存在すること、そして予想されるドメインのみが存在すること（短いBilRの場合はPF00724、長いBilRの場合はPF07992とPF00724）を条件としてフィルタリングされた。次に、BilRの有無を異なる細菌分類群にわたって要約し、その結果をiTOL53を用いて可視化した。
ヒト腸内におけるBilR存在のプロファイリング
基本的な品質管理に合格したメタゲノムデータセットを収集し、生後1年目の乳児（n = 4,296）、IBD患者（n = 1,863）、および健康な成人（n = 1,801）の腸内メタゲノムの断面を提供した（補足表2）。BilR参照遺伝子データセットは、以前に作成したBilR TIMバレルドメインのHMMプロファイルを用いて、Unified Human Gastrointestinal Genomeコレクションを検索することにより作成した。得られたヒットは1×10-100 e-valueの閾値に基づいてフィルタリングされ、GTDBに対する検索で使用されたのと同じ品質管理が行われ、合計11,158個のbilR参照配列が得られた。メタゲノムはすべて、以下のステップからなる標準的なワークフローで処理された： (1) SRAからリードをダウンロードし、(2) Trim-Galoreを用いてアダプターをデフォルト設定でトリミングし、(3) ヒトゲノムリファレンス（アセンブリT2T-CHM13v2.0）にリードをマッピングすることで潜在的なヒトのコンタミリードを同定し、Samtools（バージョン1.16.1）54を用いて除去し、(4) 100万リード未満のサンプルは保存せず、(5) Bowtie2（参考文献55）を用いてリードをbilR参照遺伝子セットにアラインメントした。そして、bilR参照データベースにマップされたリード数を、サンプル中の総リード数で正規化し、100万倍することで、各サンプルのbilR counts per million値(CPM)としてまとめた。
乳児関連のメタゲノムは、生後0日から1歳までの30日間の年齢グループにビニングされ、年齢メタデータのないサンプルはこの解析では考慮されなかった。IBD患者のサンプルは、潰瘍性大腸炎かクローン病かに基づいて分類した。健常腸メタゲノムについては、3歳未満の患者からのサンプルは除外した。bilR CPM値が5 CPMより大きい場合、そのサンプルにbilRが存在するとみなした。グループ間のbilRの有病率は、R 'stats'ライブラリの'prop.test'関数を用いて、bilRが存在するサンプルの与えられた割合が2つのグループ間で異なるかどうかを検定する等比割合検定を使用して比較した。
報告の要約
研究デザインに関する詳細は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
Clostridioides difficile、Clostridium symbiosum、Ruminococcus gnavusのbilR遺伝子の塩基配列は、それぞれRefSeqのアクセッションWP_021359617.1、WP_003504328.1、WP_009244284.1で公開されている。本研究で解析した全てのゲノムデータは、GTDB (https://gtdb.ecogenomic.org/) またはUnified Human Gastrointestinal Genome collection (https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB33885) から入手可能である。本研究で解析したメタゲノミックデータセットはすべて公開されており、プロジェクトおよびラン情報は補足表2に詳述されている。メタゲノム解析に使用したヒトリファレンスゲノム（アセンブリーT2T-CHM13v2.0）は、NCBI RefSeqデータベースで入手可能である（アクセッションGCF_009914755.1）。メタボローム解析と蛍光解析に関連する図を作成するために使用したデータは、GitHubリポジトリで提供されています: https://github.com/nlm-irp-jianglab/bilirubin-bioinfo.git (https://doi.org/10.5281/zenodo.10058858)56.
コードの利用可能性
メタゲノムデータの処理と解析に関するスクリプト、およびメタボロミクスと蛍光データの解析に関するスクリプトとデータは、以下のGitHubリポジトリで提供されている: https://github.com/nlm-irp-jianglab/bilirubin-bioinfo.git (https://doi.org/10.5281/zenodo.10058858)56.
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謝辞
A.Burnimの円偏光二色性測定の処理とBilR構造の可視化の支援に感謝する。本研究はNIH HPC Biowulf cluster (http://hpc.nih.gov)の計算資源を利用した。図1aはBioRender.comで作成した。K.D.-T.、Y.Y.およびX.J.は、NIH国立医学図書館の学内研究プログラムの支援を受けている。B.H.はメリーランド大学からのスタートアップ資金による支援を受けている。ビリンの超高速液体クロマトグラフィー分析は、NIH National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseasesの助成金（助成金番号U54DK110858）の一部支援を受けて、ユタ大学のIron and Heme Core Facilityで行った。pCW-licはC. Arrowsmithから贈られた（Addgeneプラスミド番号26098; http://n2t.net/addgene:26098; RRID: Addgene_26098）。以下の試薬はNIAID, NIHのBEI Resourcesから入手した： Clostridium symbiosum、WAL-14163株、HM-309；Ruminococcus gnavus、CC55_001C株、HM-1056；Clostridium clostridioforme、2_1_49FAA株、HM-306；Clostridium bolteae、CC43_001B株、HM-1038；E. coli, DC10B株, HM-49804; Lactobacillus reuteri, CF48-3A株, HM-102; Bacteroides finegoldii, CL09T03C10株, HM-727; Bifidobacterium adolescentis, L2-32株, HM-633; Clostridium innocuum, 6_1_30株, HM-173; Clostridium sp、 M62/1株、HM-635；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）3_1_12株、HM-20；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）CL05T00C42株、HM-711；バクテロイデス・フラギリス（Bacteroides fragilis）CL07T00C01株、HM-709；バクテロイデス・ドレイ（Bacteroides dorei）CL02T00C15株、HM-717； Bacteroides dorei, 5_1_36/D4, HM-29; Bacteroides cellulosilyticus, CL02T12C19, HM-726; Bacteroides finegoldii, CL09T03C10, HM-727; Clostridium symbiosum, WAL-14673, HM-319； クロストリジウム・シトロニアエ（Clostridium citroniae）、WAL-17108株、HM-315；ペプトクロストリジウム・ディフィシル（Peptoclostridium difficile）、CD3株、NR-43546；ペプトクロストリジウム・ディフィシル（Peptoclostridium difficile）、CD178株、NR-43504；ペプトクロストリジウム・ディフィシル（Peptoclostridium difficile）、CD160株、NR-43516； クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）P7株、NR-32887；クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）P8株、NR-32888；クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）P11株、NR-32890；クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）P29株、NR-32903；およびクロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）分離株-7株、NR-13433。
著者情報
著者および所属
米国メリーランド大学カレッジパーク校細胞生物学・分子遺伝学教室
ブラントリー・ホール、ソフィア・レヴィ、ガブリエラ・アープ、グローリー・ミナボウ・ンジテ、アシュリー・ワイス、マギー・R・グラント、ステファニー・アベイシンゲ、マディソン・D・ジャーメイン
メリーランド大学バイオインフォマティクス・計算生物学センター（米国メリーランド州カレッジパーク
ブラントリー・ホール & ドメニック・ブラッチャ
米国国立衛生研究所国立医学図書館（メリーランド州ベセスダ
キース・デュフォー・トンプソン、ヤン・イーヤン、ジャン・シャオファン
米国メリーランド州ベセスダ、ユニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健・人間発達研究所分子細胞生物学部門
Aoshu Zhong
メリーランド大学化学・生化学部（米国メリーランド州カレッジパーク
コナー・ジェンキンス
メリーランド大学計算生物学・バイオインフォマティクス・ゲノミクスプログラム（米国メリーランド州カレッジパーク
Chih Hao Wu
ゲノム科学研究所、メリーランド大学医学部微生物学・免疫学教室、米国メリーランド州ボルチモア
ビン・マー
貢献
B.H.とX.J.がプロジェクトのコンセプト立案と監督を行った。B.H.、X.J.、S.L.、K.D.-T.、G.M.N.、A.Z.、G.A.、A.W.、D.B.、C.J.、S.A.、Y.Y.、M.D.J.、C.H.W.、M.R.G.およびB.M.が実験および/または解析を行った。B.H.、X.J.、S.L.およびK.D.-T.が論文を執筆した。
著者
Brantley HallまたはXiaofang Jiangまで。
倫理申告
競合利益
B.H.は、ビリルビン還元酵素の使用に関してメリーランド大学が出願した仮特許の発明者である。他の著者は、競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Microbiology誌は、Terry Hinds, Jrおよびその他の匿名の査読者に感謝する。
その他の情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 ヒトにおけるヘム分解経路の図。
各中間代謝物の化学構造、関与する酵素の名称、およびそれらが宿主または細菌にコードされているかどうかを示す。
Extended Data 図2 還元スクリーニングのネガティブコントロール。
プロットは、図1Cに示した実験に対応する蛍光アッセイを示し、培養にビリルビンを添加していない。n=3の独立した生物学的複製からの個々のデータ点を黒点で示し、バーの高さは複製の平均値を示す。エラーバーは平均値の上下の1標準誤差を示す。灰色の線は、蛍光の対 生培地試料比を5として示した。C. citroniae WAL-17109ではデータが得られなかった。
Extended Data 図3 AlphaFoldで予測されたBilRとBilSの構造。
C. symbiosumのBilRとBilSは、R. gnavusのBilR構造とアラインメントされ、同様の折りたたみ構造を示すために同じ向きで示されている。構造は予測されるタンパク質ドメインに基づいて色分けされている。
Extended Data 図4 予測されたBilRと1PS9構造の構造アラインメント。
a) 2,4-ジエノイルCoA還元酵素(1PS9)の完全構造(青)とR. gnavus BilRタンパク質のAlphaFold予測構造(赤)のアラインメント。BilRのアルギニン167残基は薄い赤で、1PS9タンパク質のチロシン166残基は薄い青でハイライトされている。目的の代謝物および残基にはラベルが付けられている。
Extended Data 図5 メタボロミクスによるビリルビン還元の確認。
メソビルビン（m/z 589.3→m/z 301.2）、ウロビリン（m/z 591.4→m/z 343.2）、ステルコビリン（m/z 595.4→m/z 345.2）を検出するための抽出イオンクロマトグラム。b) ウロビリン標準物質 c) ステルコビリン標準物質 d-g) pCW-dif-bilRS生物学的複製物 h-k) pCW-sym-bilRS生物学的複製物 l-o) ベクターコントロールサンプル p-s) BHI培地コントロールサンプル。パネルaとaは、対応するピークを示すために、他のプロットと比較してY軸とX軸のスケールが異なっている。
Extended Data 図6 ビリルビン、メソビルビンからウロビリンへの還元の確認。
a) C. difficile CD3、C. symbiosum WAL-14163、およびR. gnavusのメソビルビン還元活性を、メソビルビンを添加したアビオティック培地対照と比較した蛍光アッセイ。 b) 大腸菌で異種発現させたC. symbiosum bilRSのメソビルビン還元活性を、ベクター対照と比較した蛍光アッセイ（2標本片側t検定）。プロット中の棒の高さは、n = 3個の独立した生物学的複製の平均値を示す。グレーの線は、コントロールの平均蛍光に相当する比率1を示す。個々のデータ点は、各プロット上の黒い点で示されている。エラーバーは平均値の上下の1標準誤差を示す。サンプルの平均値がコントロールの平均値より大きいかどうかを検定する2標本片側t検定のP値をパネルaとbに示す。
Extended Data Fig. 7 メタボロミクスによるメソビルビン還元の確認。
メソビルビン（m/z 589.3→m/z 301.2）、ウロビリン（m/z 591.4→m/z 343.2）、ステルコビリン（m/z 595.4→m/z 345.2）を検出するための抽出イオンクロマトグラム。a) メソビルビン標準物質 b) ウロビリン標準物質 c) ステルコビリン標準物質 d-f) pCW_gna_bilRSで形質転換した大腸菌を、ビリルビン（d）、メソビリルビン（e）または何もない状態（f）でインキュベートしたもの。difficileをメソビルビン（g）または無添加（h）でインキュベートしたもの。pCW_sym_bilRS で形質転換した大腸菌をメソビルビンとインキュベートしたもの（k）、または何もインキュベートしないもの（l）。 m-n) ビリルビンとインキュベートしたC. symbiosum（m）、およびビリルビンとインキュベートし、ウロビリン標準物質を共注入したもの（n）。空のpCWベクターで形質転換した大腸菌株をビリルビン（o）とメソビリルビン（p）でインキュベートしたもの。
Extended Data 図8 bilRクレードの遺伝子ツリー。
この木は図4aに示した木と同じである。ブートストラップ値は1000回のブートストラップ反復に基づく。実験的にBilR遺伝子が確認された種は白背景で示した。bilR遺伝子のクレード1は青で、クレード2はオレンジでハイライトされている。bilR遺伝子を含まないクレードは折りたたんである。
Extended Data 図9 変異型bilRの構造類似性の円偏光二色性による確認。
野生型BilRタンパク質（青）とDR166AA変異型BilRタンパク質（赤）の円偏光二色性スペクトル。
Extended Data Fig. 10 生後3ヵ月の間、bilRが存在しない頻度。
ビリルビン還元酵素が検出されなかった各5日齢ビン内のサンプルの割合を示すプロット。点の大きさは各ビンに含まれるサンプル数に基づいている。
補足情報
報告概要
補足表
補足表1：ビリルビン還元酵素遺伝子が検出されたGTDBのゲノム。補足表2：解析したメタゲノムサンプルに関連するメタデータ。
権利と許可
オープンアクセス 本論文は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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BilRはビリルビンをウロビリノーゲンに還元する腸内細菌酵素である。Nat Microbiol (2024). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01549-x
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受領
2023年3月15日
受理
2023年11月07日
発行
2024年01月03日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41564-023-01549-x
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