膣内マイクロバイオームの微細多様性は早産と関連する

膣内マイクロバイオームの微細多様性は早産と関連する
View ORCID ProfileJingqiu Liao, View ORCID ProfileLiat Shenhav, Myrna Serrano, Bin Zhu, Gregory A. Buck, View ORCID ProfileTal Korem
doi: https://doi.org/10.1101/2023.01.13.523991
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要旨
早産（PTB）は、新生児の罹患率および死亡率の主要な原因である。膣内マイクロバイオームはPTBと関連しているが、この関連の根底にあるメカニズムは十分に理解されていない。選択圧に対する微生物の遺伝的適応、特に宿主に関連する適応を理解することで、これらの関連性についての新たな知見が得られる可能性があります。このため、Multi-Omic Microbiome Study-Pregnancy Initiative（MOMS-PI1）から自然分娩で早産した女性40人と有期対照者135人から妊娠中に縦断的に収集した705個の膣サンプルのメタゲノムデータを解析しました。早産で終わった妊娠の膣内マイクロバイオームは、ユニークな遺伝子プロファイルを示すことがわかった。種レベルでより遺伝的に多様であり、抗菌薬耐性遺伝子の豊富さと多様性が高く、おそらくトランスダクションによって促進されていると考えられる。興味深いことに、膣病原体の中心的存在であるGardnerella属菌が、特に妊娠前半において、この高い遺伝的多様性を牽引していることを見出した。さらに、Gardnerella属は、脂質代謝に関わる遺伝子において、より頻繁な組換えとより強い浄化選択を受けるという証拠を提示した。全体として、我々の結果は、集団遺伝学的解析を用いて膣マイクロバイオームとPTBとの新しい関連性を明らかにし、膣マイクロバイオームに作用する進化的プロセスが早産などの有害な妊娠転帰に重要な役割を果たす可能性を示唆している。

はじめに
妊娠37週未満での出産である早産（PTB）は、新生児の罹患率および死亡率の主要な原因である2。早産児は呼吸器系、消化器系、神経発達系の合併症を引き起こすリスクが高い4。母体、胎児、環境要因の多くがPTBと関連していますが2,5,6、その病因はほとんど解明されておらず、早期診断や効果的な治療法はまだ不足しているのが現状です。

過去数十年にわたり、PTBに膣内細菌が関与している可能性を指摘する証拠が増えてきました1,7-10。この関与は、これまでのところ、微生物の存在量や膣内コミュニティの状態の変化を意味する、生態学的プロセスとして特徴付けられることがほとんどです。例えば、微生物群集の豊かさと多様性の増加、および特定の群集状態タイプ（CST）の存在は、PTB1,9,11-15と繰り返し関連しています。さらに、早産した女性の膣マイクロバイオームは、妊娠中に安定性が低下するようで、いくつかの研究では、妊娠中にこれらの微生物群集の豊かさと多様性が著しく減少することが報告されています1,12。

ホルモンの変化、栄養の利用可能性、微生物の相互作用などの複数の内因性因子と、性器感染症、抗生物質治療、異物への曝露などの外因性因子が、生態学的プロセスを引き起こし、膣内微生物の組成を変化させる可能性があります16,17。また、これらの要因は、膣マイクロバイオームを構成する微生物集団の遺伝的変異に影響を与える選択圧として作用する可能性があります。妊娠中であっても、微生物の高い突然変異率、短い世代時間、大きな集団サイズを考えると、膣環境におけるこのような適応的進化は非常に妥当なものである18。さらに、他のヒトに関連する微生物生態系における環境変化への迅速な適応の観察からも支持されている19-21。膣内微生物が様々な選択的圧力に対応する方法は、ひいては妊娠の結果を含む宿主に影響を与える可能性があります。したがって、私たちが「マイクロダイバーシティ」と呼ぶ膣マイクロバイオームの集団レベルでの遺伝的多様性と、それを形成する根本的な進化の力を包括的に調査することは、PTB の病因論に対する理解を深める上で有望である。

ここでは、綿密な集団遺伝学的解析を行い、妊娠中および早産との関連で膣マイクロバイオームの集団構造を特徴づけました。Multi-Omic Microbiome Study-Pregnancy Initiative（MOMS-PI1）の一環として、妊娠中に縦断的に収集した705個の膣サンプルのメタゲノム配列データを使用しました。この解析には、その後自然早産（sPTB）を経験した40人の女性と、期産（TB）を経験した135人の女性のサンプルを含んでいます。早産で終わった妊娠の膣マイクロバイオームは、種レベルで高いヌクレオチド多様性と高い抗菌薬耐性ポテンシャルを示すことを明らかにした。この高いヌクレオチド多様性は、特に妊娠前半に膣病原体の中心的存在であるGardnerella属細菌によってもたらされることを見出し、この分類群における増殖速度の最適化に関連している可能性を示唆するものであった。さらに、Gardnerella属では、相同組換えの頻度が高く、浄化作用の強い選択など、進化的な特徴とsPTBとの間に強い関連性があることを明らかにした。全体として、我々の結果は、集団遺伝学レベルでの膣マイクロバイオームとsPTBとの新しい関連を示し、膣マイクロバイオームに作用する進化的プロセスがsPTBに、そして他の有害妊娠転帰にも重要な役割を果たす可能性を示唆するものであった。

研究成果
膣内細菌群の系統的構成とsPTBの関連性
705個の膣サンプルから得られた既報1メタゲノムリードから、少なくとも中程度の品質22（完全性50%以上、汚染度10%未満、補足表1；方法）を有する合計1,078個のメタゲノム集合ゲノム（MAG）を構築した。これらのサンプルは、バージニア州とワシントン州の産科クリニックを訪れた175人の女性から、妊娠中の様々な時期に採取されたものである1。これらのMAGを、種レベルにほぼ相当する95%の平均塩基同一性（ANI）レベルで157の種レベルの系統群に分類し23、各系統群の代表として、汚染が最も少ない完全なMAGを選択しました。これらの代表的なMAGは、86±14%（平均±SD）完全、1.1±1.8%汚染であり、そのうち93（157の59%）は高品質22（完全性90%以上、汚染5%未満：補表1）と推定された。これらの代表的なMAGを分類学的に分類した結果（Methods）、少なくとも8つの系統群を表し、ゲノムサイズ（完全性で調整）は0.6〜7.4Mbps、GC含有率は25.3〜69.7%であった（図1a、Supplement Table 1）。試料から検出された系統群は、放線菌が最も多く、次いでファーミキューテス、バクテロイデテスの順であった（図1a）。

図1.
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図1.
sPTBに関連する膣内マイクロバイオームの構成。
a. 120のマーカー遺伝子の連結アミノ酸（AA）配列に基づき、少なくとも95％の平均塩基同一性（ANI）で異なる132の種レベルの系統群を代表する非冗長なMAGの系統樹。25の系統群の代表的なMAGは、マーカー遺伝子のAA配列が60%未満しか確認されておらず、ツリーには含まれていない。灰色のノードはブートストラップ値が80以上であることを示す。b. Compositional tensor factorization（CTF）解析により、妊娠転帰別に妊娠期間中のマイクロバイオーム組成の推移を上位2軸（Component 1とComponent 2）で表したもの。c. CTF分析における成分1は、SPTBとTBを比較したものである。箱は IQR、線は中央値、ひげは 1.5*IQR、p は両側マン・ホイットニー。 d. CTF 分析の Component 1 に基づき、早産（sPTB）と期産（TB）で色分けした系統群の特徴順位。

注目すべきは、これらの種レベルの系統群（PG042〜PG053）のうち12個が、CheckM24に従ってGardnerella vaginalisに割り当てられ、「種」G. vaginalis内に種レベルで複数の遺伝子型が存在することを裏付けていることである25,26。これらのG. vaginalis系統群の分類をより明確にするために、これらの系統群の代表的なMAGについて、G. vaginalis, G. piotti, G. leopoldii, G. swidsinskii、および特性解析が残っている9種（gs2-3とgs7-13）25など最新の参照ゲノムと平均塩基一致度（ANI）を比較しました；gs2-3とgs7-13は25で図1に示したグループ2-3と7-13に対応しています。ANI解析の結果、PG043はG. vaginalis、PG044はG. swidsinskii、PG042はG. piotti、PG046, PG049, PG051, PG053はそれぞれgs7、gs8、gs13、gs12を表すことがわかった（補図1）。残りの系統群（PG045, PG047, PG048, PG050, PG052）は、いずれの基準種ともクラスター形成せず、Gardnerellaの新種を表している可能性がある。ここでは、系統群PG042-PG053をGardnerella属と呼ぶことにする。

膣マイクロバイオームの時間的動態がsPTBと関連しているかどうかを理解するために、我々は、組成テンソル因子法（CTF）27の改訂版を用いて、妊娠中のマイクロバイオームの組成の時間的変化を評価した。この分析により、女性のマイクロバイオーム組成の経時的動態に基づき、妊娠転帰ごとに女性が有意に分離することが示された（PERMANOVA F = 8.0492; P = 0.002; 図1b）。このことは、CTF分析の成分1について特に観察された（Mann-Whitney P = 0.015; 図1c）。さらに、この差に寄与する上位の特徴は、結核に関連するLactobacillus helveticus (PG081), Lactobacillus crispatus (PG080), Lactobacillus gasseri (PG079), Lactobacillus jensenii (PG076 と PG077) と Megasphaera genomsp.に属することが判明した。(PG061), Gardnerella spp. (PG047, PG050, PG052), Atopobium vaginae (PG041) はPTBと関連し（図1d）、これらの種は以前に妊娠経過と関連することが分かっている1,9,28). これらの結果は、膣マイクロバイオームが早産で終わる妊娠中に異なる時間的軌跡を持つことを示唆しており、これまでの知見1,7と一致し、ガードネレラが重要な要因であることを示唆している。全体として、我々の結果は、デノボメタゲノム解析が、膣マイクロバイオームの構成とsPTBとの関連性に関して、これまでの知見を再現し、さらに拡張することを実証している。

次に、種内で検出される微生物株の多様性とsPTBとの関連について検討した。その結果、M. genomosp.の菌株は、無作為に抽出した2人の女性のANIに基づいて算出したヌル分布と比較して、早産女性間で有意に高いANIを示し（Permutation P = 0.002, adjusted P < 0.05; Methods）、その関係は早産女性間では認められなかった（P = 0.208; Supplementary Fig.2）。この結果は、M. genomosp.が早産した女性間で偶然に予想されるよりも密接に関連していたことを示している。このことは、結核に関連した膣の状態と比較して、sPTBに関連した膣の状態は、有意に近縁なM. genomosp.株群を保有し、より保存されている可能性を示唆している。

早産で終わった妊娠の前半では、Gardnerella種のマイクロダイバーシティが高い
ヒトの微生物は、宿主による環境変化（食事、抗生物質など）に対して、遺伝子の変異を通じて適応することができる29。そのため、異なる宿主に存在する同一種の微生物集団は、異なる遺伝子構造を持ち、それが競争上の優位性をもたらすことがある。これらの遺伝子の違いは、ひいては宿主の表現型に関係している可能性があります。腟内環境における微生物集団の遺伝的構造と妊娠転帰との関連を理解するために、同定された系統群ごとにヌクレオチド多様性を算出した。全体として、膣内微生物集団は結核よりもsPTBにおいてゲノム全体のヌクレオチド多様性が有意に高かった（妊娠に沿った中央値；Mann-Whitney P = 0.0073； 図2a）。系統群で層別したところ、この差は主にGardnerella属に起因することがわかった（P = 0.017；図2b）。G. piotti (PG042), G. swidsinskii (PG044), G. gs13 (PG051) と新規Gardnerella属 (PG045), および膣病原体30と疑われるAtopobium vaginaeの系統群はsPTBでゲノム全体の塩基多様性が著しく高かった（P < 0.05, 全てについて補正P < 0.1; 補遺図3）。これらの結果は、sPTBに関連する膣内環境では、同種の菌株、特にGardnerella属のより多様な菌株からなる微生物集団が増殖していることを示唆している。

図2.
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図2.
膣内マイクロバイオームのマイクロダイバーシティパターンは、sPTBと関連している。
a-b、妊娠期間中のゲノム全体のヌクレオチド多様性中央値をsPTBと結核菌で比較。S1-妊娠前半、S2-妊娠後半。f. G. swidsinskii (PG044)の各遺伝子について、sPTBとTBのヌクレオチド多様性の差（変化倍率；x軸）の有意性（Mann-Whitney；y軸）を示すボルケーノプロット。赤の破線より上の遺伝子はP < 0.05、調整後P < 0.1である。塩基多様性の有意な違いを示す遺伝子に有意に濃縮されていたKEGGパスウェイに属する遺伝子は色分けされている（調整済みP < 0.1）。

Gardnerella属菌のヌクレオチド多様性が妊娠中にどのように経時的に変化するかを理解するために、我々は、定期妊娠と早産妊娠の時間的軌跡を解析した。この目的のために、各群の全女性のデータをプールし、妊娠週数をビン分けし、スプラインを用いて時間的曲線を平滑化した（Methods）。その結果、正期産で終了した妊娠と早産で終了した妊娠におけるGardnerella属菌の塩基多様性の時間的軌跡に有意差が認められた（Permutation test < 0.001(ref. 31), Wilcoxon signed-rank P < 0.003; Methods; Figure 2c）。

具体的には、Gardnerella属菌の塩基配列の多様性は、早産で終わった妊娠の初期に増加し、妊娠13週頃にピークを迎え、その後妊娠20週頃に初期値まで減少することが分かった（図2c）。一方、結核菌のGardnerella属の塩基配列の多様性は比較的安定していた（Fig.2c）。妊娠20週は満期妊娠の真ん中であることから、妊娠前半（妊娠0-19週）と後半（妊娠20-37週、sPTBとTBで同様の時間帯を確保するために37を選択）の二つの期間に関してサンプルを解析した。予想通り、sPTBにおけるGardnerella属菌の塩基配列の多様性は、妊娠前半ではTBよりも有意に高かったが（前半に沿った中央値；Mann-Whitney U P = 0.0091； 図2d）、後半ではそうではなかった（P = 0.71；図2e）。さらに、ヌクレオチドの多様性は、非同義語の変異よりも同義語の変異と有意に強い相関があることがわかった（paired t-test P =0.0011; 補足図4）。これは、ゲノム多様性の形成において純化選択の役割がより重要であることを示唆するものである。これらの結果から、妊娠前半のGardnerella属菌の遺伝的多様性は、出生時の予後に重要であり、おそらくsPTBの早期診断のためのバイオマーカーとして利用できる可能性が示唆された。

妊娠前半のGardnerella属菌の微細多様性とsPTBとの関連を、特定の遺伝子が牽引しているかどうかを理解するために、これらの種についてさらに遺伝子レベルでの塩基多様性を解析した。その結果、G. swidsinskii (PG044) と G. vaginalis (PG043) において、sPTB と TB の間でヌクレオチドの多様性が有意に異なる遺伝子 (825 と 531 のうちそれぞれ 21 と 47) を同定した（妊娠前半の中央値； Mann-Whitney P < 0.05, 調整 P < 0.1 for all）。これらの遺伝子には、バクテリオファージHK97-gp10の推定tail-componentをコードする1遺伝子（P = 0.0012）および推定AbiEii toxin, Type IV toxin-antitoxin system（P=5×10-4）が含まれており、これらは母親の健康状態と相互に関与している可能性があった32,33。さらに、これらの関連性にどのような機能が関係しているかを明らかにするため、次に、eggNOGの機能アノテーション遺伝子を用いて機能エンリッチメント解析（Methods）を行った（補足表2）。その結果、微小多様性が有意に高いG. swidsinskii（PG044）由来の遺伝子において、KEGGパスウェイ「薬物代謝-その他の酵素」（ko00983）が有意に濃縮されていた（P < 0.05, adjusted P < 0.1; Fig. 2f）。この結果は、sPTBで検出されたG. swidsinskii（PG044）のより多様な遺伝子プールは、環境に存在する薬物への適応と関連している可能性を示唆している。このことは、膣内環境から検出されるゼノバイオティクスがsPTBと強く関連しているという我々の最近の知見と一致するかもしれない34。

妊娠した結核菌で観察された高いヌクレオチドの多様性が、サンプリングやシーケンスの偏りによるものではないことを確認するために、結核菌と結核菌サンプルから得られたMAGの読み取り回数と品質を比較した。もし、この高い多様性が、SPTBサンプルのリード数が多いか、より完全なMAGの結果であるならば、リード数とMAGの完全性はSPTBサンプルの方が高いと予想される。その代わりに、sPTBサンプルから組み立てられたMAGの完全性と汚染度は結核と有意な差がないことがわかった（それぞれMann-Whitney P = 0.71と0.73；補足図5a,b）。次に、各系統群にマッピングされたリードの数とゲノム全体の多様性の相関を評価した。もし、多様性が高いほど、その系統群を代表するMAGにマッピングされたリードが多くなるのであれば、この2つの測定値の間には正の相関があると予想される。しかし、3つの系統群（PG064, Dialister spp.; PG102, Peptoniphilus spp.; PG122, Bradyrhizobium spp.）のみがリード数と塩基多様性の間に有意な正の相関を示した（それぞれ Spearman ρ = 0.70, 0.54, 0.42; 無調整 P = 0.035, 0.024, 0.00015） 。98%の系統群で、統計的に有意な正の相関は観察されなかった（Spearman相関の中央値[IQR]は-0.067 [-0.19, -0.13]）。また、補足図3においてsPTB妊娠で有意に高い塩基多様性を示した4つのGardnerella属Phylogroupsはいずれも有意な正の相関は認められなかった（Spearman ρ = -0.00, -0.12, -0.02, -0.35 and P = 0.96, 0.091, 0.77, and 0.00045 for PG042, PG044, PG045, and PG051、補足図5c）。

最後に、sPTBサンプルで有意に高いリード数が観察されたため（Mann-Whitney P = 0.0004, 0.061, それぞれサンプルと被験者；補足図5dと5e）、それぞれのサンプルから同じ数のリード（105）をサブサンプリングして75%のサンプルを保持し、塩基多様性の分析を繰り返した。最初の解析（図2）と同様に、sPTB妊娠ではすべての系統群で、特にGardnerella属で塩基多様性が有意に高かった（それぞれMann-Whitney P = 0.015, P = 0.0043; 補足図5fおよび5g)。同様に，妊娠前半ではGardnerella属の塩基多様性はsPTBで有意に高かったが（P = 0.026; 付図5h），後半では有意差はなかった（P = 0.22; 付図5i）．これらの結果から、私たちが観察したsPTBに関連する塩基配列の多様性は、技術的なアーチファクトによる偏りではないことが確認された。

ガードネレラ属細菌に働く進化的な力は、妊娠の結果と関連している
適応は、生物の適応度、すなわち与えられた環境下で生き残り、繁殖する能力を高めるはずである。そこで、遺伝的多様性の高いGardnerella属細菌集団がsPTBに関連する膣内環境においてよりよく成長するかどうかを理解するために、相対的存在量と成長率という2つの指標を用いて適応度を推定した。実際、これらの種のヌクレオチド多様性は、相対的な存在量と正の相関があることがわかった（Spearman ρ = 0.35, P = 0.0013; Fig.3a）。この相関は、他の系統群では観察されなかった（補足図6a）。L. crispatus (PG080) と L. iners (PG086) では、有意な負の相関さえ見られた（それぞれρ = -0.39, -0.32, P = 0.026, 0.0014; 補足図6b,c）。さらにgRodon35を用いて、リボソームタンパク質をコードする高発現遺伝子におけるコドン使用量の偏りから、微生物の最大増殖速度を予測した。その結果、妊娠前半では、Gardnerella属はsPTB妊娠において、統計的に有意ではないものの、最大増殖速度がやや高く（Mann-Whitney P = 0.057; Fig. 3b）、妊娠後半では、その差が小さくなる（P = 0.15; Fig. 3c）ことがわかった。これらの結果から、Gardnerella属菌で観察されるsPTB関連の遺伝的多様性は、sPTB関連の膣内環境においてより速く増殖するための最適化と関連している可能性が示唆された。

図3.
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図3.
ガードネレラ属菌の進化的な力
a. ゲノム全体の塩基多様性の中央値と妊娠に伴うGardnerella属菌の相対的存在量の間のスピアマン相関。b, c, Gardnerella属菌の予測最大倍加時間（gRodon35）を妊娠前期（b, S1）と後期（c, S2）で表示し、SPTBとTBを比較した。d,e, Gardnerella属菌のD'の中央値を妊娠前期（S1, d）と後期（S2, e）に分けて、sPTBと結核で比較。f, Gardnerella属遺伝子のdN/dSをCOG機能カテゴリー別にsPTBとTBで比較し、妊娠後期（S2）に表示。dN/dSが0に近いほど純化選択が強いことを示す。

微生物の集団構造は、選択、相同組換えなど様々な進化過程の影響を受けている36。Gardnerella属では、相同組換えを伴う遺伝子水平伝播のメカニズムであるコンピテンス（Competence）が同定されている37。Gardnerella属菌の微細多様性パターンがsPTBとTBで大きく異なることを解釈するために、2つの遺伝子座の対立遺伝子間の連鎖不平衡の正規化係数D'を用いて相同組換えの度合いを定量化した。D'の値が0に近いほど、組み換えの程度が高いことを示している38。興味深いことに、Gardnerella属のD'の中央値は、妊娠前半（Mann-Whitney P = 0.041; Fig. 3d）および後半（P = 0.013; Fig. 3e）ともにsPTB妊娠では有意に小さく、同じことが3つの特定のGardnerella属のD'でも観察された。piotti (PG042), G. gs7 (PG046), PG047 の3種のD'についても妊娠前半に同様の結果が得られた（P < 0.05, 調整後P < 0.1; 補足図7a）。この結果から，Gardnerella属菌は，妊娠両期の早産を経験した女性では，組換えの頻度が高い傾向にあることが示唆された．

次に、本種のdN/dSを用いて、選択の度合いを定量化した（Methods）。この指標は、同義語変異と非同義語変異の比率を定量化するもので、それゆえ選択の種類を知ることができ、ゼロに近い値は浄化的選択を、1より大きい値は正の選択を示す39。dN/dSは基準との関係で計算されるので、集団内ですでに固定された変異に対する選択も検出できる40。腸や海のマイクロバイオーム41-43と同様に、膣マイクロバイオームのすべての遺伝子で浄化選択が優勢である（dN/dS << 1；中央値［IQR］ dN/dS 0.17 [0.10, 0.29]; 補足図7b）。Gardnerella属遺伝子のdN/dSの中央値は、sPTB妊娠と結核妊娠で有意差はなかったが（Mann-Whitney U P = 0.48）、高次機能（COG category44）を妊娠の各半期で検討すると、いくつかの違いが検出された。妊娠前半では、無機イオン輸送・代謝、脂質輸送・代謝、二次構造、細胞壁・膜・包膜生合成において、Gardnerella属遺伝子のdN/dS中央値はsPTB妊娠でやや低かったが、これは多重検定を調整しても統計的に有意ではなかった（それぞれCOG category "P", "I", "Q", "M"; Mann-Whitney P < 0.05, 全て調整P > 0.1; 補足図7c)。妊娠後期には，脂質輸送・代謝および細胞運動性（COG分類「I」「N」；Mann-Whitney P = 0.0040 および P = 0.04，調整後 P = 0.07 および 0.40； 図3f）でsPTB妊娠のdN/dS中央値は有意に低下していた．この結果は、脂質の輸送と代謝に関わるGardnerella属の遺伝子は、sPTBにおいてより強い純化選択を受ける可能性を示唆している。浄化選択は、常に有害な変異を一掃し、機能を保存することで生物の体力を維持するため、妊娠中のsPTB関連膣環境で増殖するGardnerella属は、この脂質機能を標的としたより強い浄化選択の恩恵を受けている可能性がある。

sPTB関連膣内細菌群は、より高い抗生物質耐性の可能性を持つ
妊娠中は抗生物質が広く使用され、時には膣内にも局所的に使用されます45。このような曝露は、抗菌薬耐性（AMR）を促進する可能性がある。膣マイクロバイオームにおける抗生物質耐性の可能性がsPTBと関連しているかどうかを評価するために、各サンプルから同じ数のリード（105）をサブサンプリングし、それらをComprehensive Antibiotic Resistance Database46にマッピングした。AMR参照遺伝子にマッピングされたリードの総数は、sPTB妊娠の前半で有意に多かったが（Mann-Whitney U P = 0.015; 図4a）、後半ではそうでもなかった（P = 0.76; 図4b）。さらに、sPTBとTBの膣マイクロバイオーム間の特定のAMR遺伝子の違いを評価するために、ゲノムアセンブリーでAMR遺伝子を同定した。早産で終わった妊娠の前半に採取した膣内細菌では、AMR遺伝子の中央値とシャノン-ワイナーの多様性が有意に高く（平均3倍；Mann-Whitney U P = 0.011, P = 0.0078, それぞれ図4cと4e）、しかし後半ではこの違いは検出できなかった（両方P = 0.16, 図4dと4f, それぞれ)。これらの遺伝子の由来を調べたところ、早産した女性のマイクロバイオームではファージベースのAMR遺伝子の割合が中央値で有意に高く（P = 0.031; 図4g）、sPTB妊娠の前半に観察されるAMR遺伝子の数の中央値と多様性がトランスダクションによって促進されている可能性が示唆された（図4c、図4e）。少なくとも10%の女性に存在する遺伝子を持つ9つのAMR遺伝子カテゴリーのうち、フェニコールとアミノグリコシド耐性遺伝子は、sPTBマイクロバイオームにおいて有意に高い中央値を示した（それぞれP = 0.041, P = 0.032、図4h）。これらの結果は、sPTB妊娠の前半に特有の抗生物質耐性プロファイルを示唆しており、特定の抗生物質の使用を示している可能性がある。実際、妊娠前の過去6ヶ月間に抗生物質を使用した女性では、そうでない女性に比べて妊娠前半のAMR遺伝子の豊富さがやや高いことがわかった（Mann-Whitney U P = 0.079; Fig.4i）。これは、G. swidsinskii (PG044)において、sPTBに関連する塩基多様性を持つ遺伝子が薬物代謝に濃縮されているという我々の観察とも一致する（図2d）。

図4.
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図4.
膣内細菌群の抗菌薬耐性（AMR）遺伝子プロファイルは、sPTBと関連している。
a,b, 妊娠前期（S1, a）および後期（S2, b）において、sPTBと結核の間で比較したAMR遺伝子にマッピングされたサブサンプルリードの合計（105）。 c,d, 妊娠前期（S1, c）と後期（S2, d）のsPTBと結核の間で比較したAMR遺伝子の中央値（期間に沿って）。e,f, 妊娠前半（S1, e）および後半（S2, f）における、sPTBと結核の間で比較したAMR遺伝子のシャノン-ワイナーの多様性の中央値（期間）。 g, 妊娠前半の中央値で示した、異なる場所に由来するAMR遺伝子の割合。h. 異なる耐性カテゴリーに属するAMR遺伝子の割合、各妊娠前半に沿った中央値で示す。MLS：マクロライド、リンコサミド、ストレプトグラミンB i. 妊娠前半（S1）におけるAMR遺伝子の豊富さを、妊娠前の過去6ヶ月間に薬剤を使用した女性と使用しなかった女性で比較した。箱はIQR、線は中央値、ひげは1.5*IQR、pは両側Mann-Whitney U.

sPTBと膣内細菌群のAMRポテンシャルとの強い関連性が、特定の系統群によって寄与されているかどうかを確認するために、各系統群について同様の解析を行った。しかし、sPTBとTBの間で、AMR遺伝子の数の中央値と多様性に有意な差を示すものはなかった（すべてMann-Whitney U P > 0.05）。この結果は、sPTBに関連する高いAMRの可能性が、生態系としての膣内マイクロバイオームの特性である可能性を示唆している。しかし、この関連性の欠如は、移動性遺伝要素の回収におけるMAGビニング法の限界に起因するAMR遺伝子の過小評価によるものである可能性もある47。

考察
微生物ゲノムは、様々な環境に適応した結果、同一種内でも大きな変異を示すことがある48。膣内マイクロバイオームと早産との関連は広く報告されている7,8,12,49。しかし、このような状況における宿主とマイクロバイオームの相互作用の根底にある潜在的なメカニズムについては、まだ多くの探求が残されている。ここでは、一般に公開されているメタゲノム解析データ1 を活用し、妊娠中の膣内マイクロバイオームについて集団遺伝学的な見解を示しています。その結果、sPTBに関連する集団ヌクレオチド多様性、選択指標、抗生物質耐性の可能性など、多くの新規な微生物の特徴を明らかにしました。興味深いことに、妊娠前半に高い集団ヌクレオチド多様性がGardnerella属によって引き起こされることがわかりました。この種は、早産で終わった妊娠において、組換えと純化選択によって、より激しい集団構造の変化を受けたようである。また，Gardnerella属菌のこのようなsPTBに関連した遺伝的パターンは，sPTBに関連した膣の状態での増殖速度の最適化に関連している可能性を示す．この結果は、膣内細菌叢の宿主への適応を示唆するものであり、ひいては妊娠経過に影響を及ぼす可能性がある。

妊娠中の膣内マイクロバイオームの生態的プロセスとその後の早産との関係に関する我々の知見は、先行研究1,7,11,12,14,50,51と整合的である。我々は、sPTBに関連する微生物の変動性の追加的な層、すなわち微生物の遺伝的多様性を探求することによって、これらの先行研究に追加します。種内のゲノム変異は、表現型の多様性と異なる環境への適応をもたらすことが知られている48。これらの適応は、ひいては疾患の転帰など宿主の表現型に影響を与える可能性があります52。このような微生物のゲノム変異と宿主の表現型との関連は、腸内細菌叢で報告されている42,53,54。我々の研究は、この現象が膣の生態系でも起こることを示唆し、それが妊娠の転帰と関連している可能性を示唆するものである。とはいえ、我々が検出した微生物遺伝的多様性と妊娠転帰の関連は、両変数に作用する別のプロセスの結果である可能性もあり、我々はその可能性は低いと考えているが、これは今後の研究によって明らかにされるべきであろう。

興味深いことに、遺伝的多様性とsPTBとの関連は、BV50,55,56とよく関連する種群であるGardnerella属に大きく左右されることが分かった。多くの研究が、sPTB妊娠においてこれらの種がより多く存在することを報告している9,50,57,58,1,9。我々は、より遺伝的に多様な株を持つGardnerella属の集団もsPTBと関連している可能性があることを示す。さらに、この分類群は早産で終わった妊娠では1.5倍速く増殖することがわかり、以前に報告されたG. vaginalisの相対転写速度が全体的に高いことと一致している1。これらの遺伝的多様性の高い株は、sPTBに関連する膣内の環境に適応し、高い適応力を示しているように思われる。注目すべきは、Gardnerella属のsPTBに関連する高い遺伝的多様性が、妊娠後半よりも妊娠前半（妊娠20週未満）に検出されたことである。sPTBの潜在的なバイオマーカー（例えば、血清α-フェトプロテイン59）のほとんどは、これまでのところ、妊娠第2期（妊娠週数14-27）のサンプルを用いて同定されている。今回の結果は、妊娠のさらに初期段階（20週未満）のマイクロバイオームサンプルを高解像度で解析することで、妊娠の転帰に関する有益なバイオマーカーが得られる可能性を示唆している。

ヒトの腸内細菌叢19-21と同様に、我々は膣内細菌叢でも適応進化が起きている証拠を示している。pH、好中球レベル、有害物質など、膣の生態系に影響を与えるいくつかの環境因子が、sPTBと関連していることが報告されている34,60。

これらの環境因子は、膣内細菌群の異なる進化パターンをもたらす選択的なストレス要因として作用する可能性がある。実際、早産で終わった妊娠では、Gardnerella属の相同組換えがより頻繁に起こり、より強い浄化作用のある選択が検出された。相同組換えは、細菌において有益な変異の固定確率を高め61、クローン干渉（すなわち有益な変異同士の競合）を減らすことで、適応を早める重要なメカニズムである62。また、精製選択も、貧栄養条件下などで、有害な変異を一掃し、機能を保存することにより、適応に寄与している41,63。特に、sPTBに関連する精製選択は、脂質の輸送と代謝に関わる遺伝子に強く作用することがわかった。このことは、過去にsPTBのシグネチャーとして脂質代謝物（例えば、モノアシルグリセロールやスフィンゴ脂質）が同定されたことと一致する34,64,65。しかし、早産で終わった妊娠中の脂質の輸送と代謝をターゲットにしたこの強い精製選択によって、脂質代謝物の濃度が変化するかどうかは、さらなる実験的検証が必要である。組換えと純化選択の両方が遺伝的多様性を減少させるので、sPTBに関連した妊娠中の組換えと純化選択は、妊娠前半と後半のsPTBにおけるGardnerella属のヌクレオチドの多様性が高いことを説明するかもしれない。

抗生物質は、ヒトのマイクロバイオームに作用する一般的な選択的ストレスであり29、早産との関連も指摘されている66。我々は、早産と関連するAMR遺伝子の数と多様性が高いことを検出したが、これは早産の膣マイクロバイオームにおけるプロファージによって促進されることを示唆するものであった。妊婦の膣内では複数のファージ（Siphoviridae、Myoviridae、Microviridaeなど）が検出されているが、sPTBとの関連はほとんど研究されていない67。この結果は、細菌-ファージ間の相互作用が、AMR遺伝子の伝達を介して妊娠の予後に重要な役割を果たす可能性を示唆している。また、フェニコールおよびアミノグリコシド耐性に関連する遺伝子が、早産で終わった妊娠中の膣マイクロバイオームにおいてより多く存在することも明らかにした。両抗生物質は数十年にわたり婦人科感染症の治療に頻繁に使用されており68、一部のフェニコール（クロラムフェニコールなど）は妊娠中の使用も安全と考えられているが69、アミノグリコシドには催奇形性がある。以前の研究では、抗生物質への曝露が膣内微生物の組成を変化させる可能性があると報告されており45,70、生態学的な影響を示している。これと比較して、我々の結果は、早産を経験した女性において、より頻繁に抗生物質を使用することに膣マイクロバイオームが適応し、AMR遺伝子が濃縮されるとともに、薬剤代謝酵素をコードするGardnerella属遺伝子において高い塩基多様性がもたらされることを示唆しているのかもしれない。この仮説はさらなる研究を要するが、早産した女性（31％）が妊娠前の過去6カ月間に抗生物質を使用した割合が、正期産の女性（23％）よりも高いという事実がさらに裏付けている。

このような知見が得られたものの、本研究は、シーケンスの深度が低いこと（細菌の読み取り数の中央値が5×105未満）、妊娠中のサンプリング頻度が一定でないこと（妊娠1回につき1〜8サンプル、平均4サンプル）により制限されています。これらの制限により、解析された特徴のばらつきが大きく、膣マイクロバイオームの集団遺伝学とsPTBとの関連について、より詳細な時間的および予測的解析が妨げられることになる。この結果は、頻繁なサンプリングと高い配列決定深度による膣メタゲノムの高解像度調査を保証するものである。

要約すると、綿密な集団ゲノム解析を通じて、本研究は、膣マイクロバイオームと早産との間の新規の遺伝的および機能的関連を明らかにした。早産に関連する宿主環境への微生物の遺伝的適応の証拠を明らかにし、特にGardnerella属における、有害な妊娠転帰に対する微生物の進化過程の重要性を強調した。今後、早産の分子メカニズムを理解するために、SPTBに関連する微生物適応を促進する圧力について調査することが必要である。

研究方法
サンプルの選択とメタゲノムデータ
メタゲノムシークエンスデータ1 は、妊娠中に縦断的に収集した、最終的に早産で自然分娩した黒人女性（sPTB）40 人の膣サンプル 135 個と、正期産（TB）135 人の膣サンプル 570 個を dbGaP （研究番号 20280、アクセッション ID phs001523.v1.p1 ）から取得したものである。早産の定義はFettweisら20191と同じものを用いた：自然早産は医学的適応のない妊娠23週から37週の間の生児と定義し、期産は妊娠39週以降の生児と定義している。膣内細菌とPTBとの関連について、いくつかの潜在的交絡因子の存在を確認するため、ロジスティック回帰モデルを用いて、所得、年齢、人種に基づいて各被験者の傾向スコア71を算出した。その結果、sPTBとTBの両被験者の傾向スコアは同様の分布を示し（Kolmogorov-Smirnov検定 P = 0.21）、我々が検出した関連は、これらの変数と交絡していない可能性があることを示唆した（補足図8）。これらの結果は、本研究における所得、年齢、人種がマイクロバイオームとPTBとの関連に及ぼす交絡の影響が無視できる程度であることを示唆している。

メタゲノム解析、ゲノムビニング、ゲノムアノテーション、相対現存量
ATLASパイプライン76を使用し、refs72-75で使用されている標準に従って解析した。品質スコア<25、リード長<50 bpの塩基、配列アダプターはTrimomatic v.0.3977で除去した。ヒトおよびPhiXゲノム配列にマッピングされたリードは、Bowtie2 v.2.3.5.178でマッピングして除去しました。MetaSPAdes v.3.15.279でアセンブルし、MetaBAT2 v.2.14.080で最小コンティグ長1500でメタゲノム集合ゲノムにビンニングした。MAGの品質、GC含有量、ゲノムサイズ、分類はCheckM v.1.0.924を使用して推定した。平均塩基同一性（ANI）0.95、最小完全性50％、最大ゲノム汚染10％の条件で、dRep v.3.2.081を用いてMAGをデリプリケート化した。各95%ANIクラスター内でdRepスコアが最も高いMAG（ここでは系統群と呼ぶ）を、その系統群の代表MAGとして選択した。Prodigal v.2.6.382 を用いて遺伝子を予測し、EggNOG v.5.083 を用いてアノテーションを行った。Bowtie2 v.2.3.5.184を用いて、フィルタリングしたリードを代表的なMAGにマップした。ゲノムサイズと完全性に補正した上で、そのMAGにマップされたリード数を各サンプルのリード総数で割ることにより、各代表的MAGの相対的存在比を算出した。

テンソル因子分解
定期妊娠と早産妊娠における膣内マイクロバイオームの動態を特徴づけ、比較するために、組成テンソル因子法27の改訂版を用いた。

系統樹
GTDB-Tk v.1.5.185を用いて、120のマーカー遺伝子のアミノ酸（AA）配列をコールし、代表的なMAGについてアラインメントを行った。アラインメント中のAAが60%未満のMAGは系統樹構築の際に除外した。最良の進化モデルLG+G+I（Le Gascuelモデル+ガンマ分布+不変部位）をprottest3 v.3.4.286を用いて同定し、500ブートストラップを用いてRAxML v.8.2.1287 で樹形図を作成した。木は中点でルートされ、iTol v.6.388で可視化された。

マイクロダイバーシティプロファイリング、成長率推定、抗菌性遺伝子
代表的な157のMAGを参照データベースとして、InStrain v1.0.040を用いて、ゲノム全体の塩基多様性、遺伝子全体の塩基多様性、連鎖不平衡尺度（D'）、dN/dSなどの集団の微細多様性指標を算出した。最大増殖速度は、gRodon35を用いて各MAGについて推定した。抗菌性（AMR）遺伝子は、PathoFact v.1.089 を用いて、デフォルトのパラメータでアセンブリとMAGから検出された。

機能的エンリッチメント解析
sPTBと結核の間で塩基多様性に有意差を示す遺伝子に濃縮されたCOG/KEGGパスウェイを特定するために、まず有意な遺伝子からCOG/KEGGカテゴリーごとの頻度を算出した（観察頻度）。次に、全遺伝子からランダムに選んだ同数の遺伝子から、各COG/KEGGカテゴリーの頻度を算出した（期待頻度）。この作業を10,000回繰り返した。帰無仮説は、観測された COG カテゴリーの頻度が期待値より小さいというものであった。各COGについて、帰無仮説の確率Pは、P=|[xi ϵ X: xi > = k]| / 10000の式で計算した。ここで[...]は多集合を、x = (x1, x2, ..., xn) は期待値のリスト、kは観測値であることを表している。

統計解析
データベース内の各女性について、異なるサンプル数が利用可能であった。したがって、我々の分析では、妊娠（またはその前半または後半）に沿った中央値を使用した。Benjamini and Hochberg (BH)90 の偽発見率法 (FDR) を用いて多重検定を補正した。調整後P < 0.1が有意差のカットオフとして使用された。

時間軸解析
成熟期分娩と早産におけるヌクレオチド多様性の経時変化を表す軌跡を作成するために、各グループ（成熟期と早産）のすべての女性からのGardnerella spp.の経時データをプールした。妊娠週数ごとの観測値が1つ以上ある場合は、サンプル間の中央値をとった。次に、時間的データを3週ごとにビン分けし、1週目から7週目までのビンを除いて、各ビンの中央値を要約として取りました。このビン分けされたデータを平滑化するために、多項式で区分けされた特殊な関数であるスプラインを適用した。早産と満期の時間的軌跡を比較するために、これらの軌跡を104回シャッフルしてユークリッド距離のヌル分布を生成し、元データのユークリッド距離と比較する順列検定を実施した31。

データの入手方法
使用したデータセットは、dbGaP (phs001523)から入手可能である。

著者による貢献
J.L.とT.K.は研究の設計を行った。J.L.とL.S.はT.K.、M.S.、G.A.B.の助言を受けてデータを解析した。J.L.はL.S.、T.K.、 M.S. 、 B.Z. および G.A.B の助言を得て論文を執筆した。

競合する利益
G.A.B.は、Juno, LTD.の科学諮問委員会のメンバーであり、Junoは、膣マイクロバイオームを使って女性の婦人科および生殖に関する健康問題に取り組む新興のバイオテクノロジー企業である。Juno社は本試験に関与していない。他の著者は、競合する利害関係を宣言していない。

補足図
補足図1.
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補足図1.
G. vaginalis (PG42-53)と注釈された代表的なMAGと、文献25で定義された13種のGardnerellaの参照ゲノムをANIに基づきデンドログラム化した。
青線は原核生物種のカットオフ値であるANI値0.95を示す。

補足図2.
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補足図2.
M. genomospに分類されるMAGの平均ホスト間塩基同一性（ANI）の分布。
灰色のヒストグラムは、ヌル分布を示す。赤と青の線と斜線部分は、それぞれsPTBと結核で観測されたANIの平均値と標準偏差を10,000回の繰り返しから算出したもので、pは有意。

補足図3.
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補足図3.
膣内細菌集団のヌクレオチド多様性。
4つのGardnerella属の系統群とA. vaginaeに分類される系統群の妊娠期間中のゲノムワイドなヌクレオチド多様性の中央値を、sPTBと結核の間で比較したもの。箱はIQR、線は中央値、ひげは1.5*IQR、pは両側Mann-Whitney U。

補足図4.
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補足図4.
ガードネレラ属12系統の遺伝子の塩基多様性と同義性変異および非同義性変異の数のスピアマン相関係数。
妊娠に伴う遺伝子のヌクレオチド多様性の中央値に基づく各系統群の遺伝子のスペアマン相関係数の中央値を、同義語変異と非同義語変異の間で比較した。箱はIQR、線は中央値、ひげは1.5*IQR、pは両側Student T test。

補足図5.
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補足図5.
マイクロダイバーシティとsPTBの関連は、シーケンシングの深さによって偏りがない。
a,b, MAGの完全性（a）と汚染度（b）をsPTBとTBで比較。 c,d, 各妊娠に沿ったサンプルの総リード数（c）と中央値（d）をsPTBとTBで比較。 e, 図S2aのsPTBとTBで塩基多様性に差があるGardnerella属4系統の各リードとゲノム全体の核酸多様性のスピアマン相関を示したもの。線と網掛け部分は、線形回帰の最適なトレンドラインと95%信頼区間（平均±1.96 s.e.m.）を示す。 f,g, 全動物系統群（f）およびGardnerella属（g）の妊娠に沿ったゲノム全体の塩基多様性の中央値（f）。(h,i, Gardnerella spp.の妊娠前半（S1, h）と後半（S2, i）のゲノムワイド塩基多様性の中央値。各サンプルから採取した105のリードに基づき、sPTBとTBで比較した。箱はIQR、線は中央値、ひげは1.5*IQR、pは両側Mann-Whitney。

補足図6.
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補足図6.
ゲノム全体の塩基多様性と非ガードネレラ菌の系統群の相対的存在度のスピアマン相関。
a. ゲノムワイド塩基多様性の中央値と相対的存在量の間のスピアマン相関（有意、y軸、係数、x軸）を示すボルケーノプロット。b, c, L. crispatus (b) と L. iners (c) のゲノムワイド塩基多様性中央値と妊娠期間中の相対現存量との間のスピアマン相関。線と網掛け部分は、線形回帰の最良適合傾向線と95%信頼区間（平均±1.96 s.e.m.）を示す。

補足図7.
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補足図7.
膣マイクロバイオームに対する進化的な力。
a. sPTBとTBの間で比較したGardnerella属菌の系統群の妊娠前半（S1）に沿ったD'の中央値。D'が低いほど組み換えの頻度が高いことを示す。b. sPTB（赤）とTB（青）の遺伝子のdN/dSの中央値（妊娠期間中）の密度。c. Gardnerella spp.遺伝子の dN/dS を妊娠前半（S1, c）の COG 機能分類別に sPTB と TB で比較したもの。C、エネルギー生産・変換、D、細胞周期制御・細胞分裂・染色体分配、E、アミノ酸輸送・代謝、F、ヌクレオチド輸送・代謝、G、糖質輸送・代謝、H、補酵素輸送・代謝、I、脂質輸送・代謝、J、翻訳・リボソーム構造・生着、K、転写、L、複製・組み換え・修復、M、細胞壁・膜・包膜生合成、N、細胞運動、O、。翻訳後修飾、タンパク質回転、シャペロン、P、無機イオン輸送と代謝、Q、二次代謝産物の生合成、輸送と異化、T、シグナル伝達機構、U、細胞内輸送、分泌と小胞輸送、V、防御機構。

補足図8.
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補足図8.
ロジスティック回帰モデルによる所得、年齢、人種に基づく女性グループの傾向スコアの分布。
ヒストグラムはカーネルで平滑化されている。sPTB：赤、TB：青、P：Kolmogorov-Smirnov (KS) 検定。

補足表
補足表1 代表的なMAGの系統分類と分類のゲノムアセンブリの特徴。

付表2 eggNOGによる遺伝子の機能アノテーション。

謝辞
有益な議論を提供してくれたKorem研究室のメンバーに感謝する。本研究は、Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) of the National Institutes of Health, award number R01HD106017, the Program for Mathematical Genomics at Columbia University, and the CIFAR Azrieli Global Scholarship in the Humans & the Microbiome Program (T.K.) から支援を受けている。使用したデータセットは、Gregory A. Buck, Ph.D. らから提供され、NICHD (U54 HD080784) の支援を受けて、dbGaP (phs001523) から取得したものです (G.A.B).

参考文献
1.↵Fettweis, J. M. et al. The vaginal microbiome and preterm birth（膣内マイクロバイオームと早産）. Nat. Med. 25, 1012-1021 (2019).CrossRefPubMedGoogle Scholar
2.↵Tiensuu, H. et al. 自然早産と胎児成長のリスクは胎児SLIT2と関連する. PLoS Genet. 15, e1008107 (2019).CrossRefGoogle Scholar
3.↵早産. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/preterm-birth.Google Scholar
4.↵Goldenberg, R. L., Culhane, J. F., Iams, J. D. & Romero, R. Epidemiology and causes of preterm birth（早産に関する疫学と原因）. Lancet 371, 75-84 (2008).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
5.↵Hong, X. et al. Genome-wide approach identifies a novel gene-maternal pre-pregnancy BMI interaction on preterm birth.（ゲノムワイドなアプローチにより、早産に関する新しい遺伝子と母体のBMIの相互作用を特定した。Nat. Commun. 8, 15608 (2017).Google Scholar
6.↵Hong, X. et al. Genome-wide association study identifies a novel maternal gene× stress interaction associated with spontaneous preterm birth（ゲノムワイド関連研究により、自然早産に関連する新規の母体遺伝子×ストレス相互作用が明らかになった。Pediatr. Res. 1-8 (2020).Google Scholar
7.↵DiGiulio, D. B. et al. 妊娠中のヒトマイクロバイオータの時間的・空間的変動. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 11060-11065 (2015).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
8.↵ラベル、J.ら、生殖年齢女性の膣内細菌叢。Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 Suppl 1, 4680-4687 (2011).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
9.↵Tabatabaei, N. et al. 妊娠初期の膣内マイクロバイオームとその後の自然早産リスク：ケースコントロール研究. BJOG 126, 349-358 (2019).PubMedGoogle Scholar
10.↵Chu, D. M., Seferovic, M., Pace, R. M. & Aagaard, K. M. The microbiome in preterm birth.（早産におけるマイクロバイオーム）. Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 52, 103-113 (2018).PubMedGoogle Scholar
11.↵Freitas, A. C., Bocking, A., Hill, J. E., Money, D. M. & VOGUE Research Group.（以下、VOGUE研究グループ）。膣内細菌叢の豊かさと多様性の増加と自然早産。マイクロバイオーム 6, 117 (2018).CrossRefPubMedGoogle Scholar
12.↵Stout, M. J. et al. 妊娠初期の膣内マイクロバイオームの動向と早産。Am. J. Obstet. Gynecol. 217, 356.e1-356.e18 (2017).Google Scholar
13.Hyman, R. W. et al.膣内マイクロバイオームの多様性と早産との相関. Reprod. Sci. 21, 32-40 (2014).CrossRefPubMedGoogleスカラー
14.↵Feehily, C. et al. Shotgun sequencing of the vaginal microbiome reveals both a species and functional potential signature of preterm birth.膣マイクロバイオームのショットガンシーケンスにより、早産に関連する種と機能的可能性のシグネチャーが明らかになった。NPJ Biofilms Microbiomes 6, 50 (2020).Google Scholar
15.⅛Kosti, I., Lyalina, S., Pollard, K. S., Butte, A. J. & Sirota, M. Vaginal Microbiome Data Meta-Analysis Provides New Insights Inter Preterm Birth.（早産に対する新たな洞察をもたらす膣マイクロバイオームのメタ分析）. Front. Microbiol. 11, 476 (2020).Google Scholar
16.↵Gupta, P., Singh, M. P. & Goyal, K. Diversity of Vaginal Microbiome in Pregnancy（妊娠中の膣マイクロバイオームの多様性）: Deciphering the Obscurity. Front Public Health 8, 326 (2020).Google Scholar
17.↵Ceccarani, C. et al. 性器感染症における膣マイクロバイオームとメタボロームの多様性. Sci. Rep. 9, 14095 (2019).CrossRefPubMedGoogle Scholar
18.↵Chase, A. B., Weihe, C. & Martiny, J. B. H. Adaptive differentiation and rapid evolution of a soil bacterium along a climate gradient.（気候勾配に沿った土壌細菌の適応的分化と急速な進化）. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 118, (2021).Google Scholar
19.↵Zhao, S. et al. 健康な人の腸内細菌叢における適応進化. Cell Host Microbe 25, 656-667.e8 (2019).CrossRefGoogle Scholar
20.Garud, N. R., Good, B. H., Hallatschek, O. & Pollard, K. S. Evolutionary dynamics of bacteria in the gut microbiome within and across hosts.（宿主内および宿主を超えた腸内細菌群の進化動態）。PloS Biol 17(1), e3000102 (2019).CrossRefGoogle Scholar
21.↵Garud, N. R. & Pollard, K. S. Population Genetics in the Human Microbiome. Trends Genet. 36, 53-67 (2020).CrossRefGoogle Scholar
22.↵Murovec, B., Deutsch, L. & Stres, B. Computational Framework for High-Quality Production and Large-Scale Evolutionary Analysis of Metagenome Assembled Genomes.（メタゲノム集合ゲノムの高品位生産と大規模進化解析のための計算フレームワーク）. Mol. Biol. Evol. 37, 593-598 (2020).Google Scholar
23.↵Olm, M. R. et al. Consistent Metagenome-Derived Metrics Verify and Delineate Bacterial Species Boundaries. mSystems 5(1), e00731-19 (2020).CrossRefGoogle Scholar.
24.⅛Parks, D. H., Imelfort, M., Skennerton, C. T., Hugenholtz, P. & Tyson, G. W. CheckM: assess the quality of microbial genomes recovered from isolates, single cells, and metagenomes. Genome Res. 25, 1043-1055 (2015).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
25.ȕVaneechoutte, M. et al. Gardnerella vaginalisの記述を修正し、Gardnerella leopoldii sp.nov., Gardnerella piotii sp.nov., Gardnerella swidsinskii sp.nov. を記述し、Gardnerella属内の13ゲノム種の区切りを示した。Int. J. Syst. Evol.Microbiol. 69, 679-687 (2019).CrossRefGoogle Scholar
26.⅛Hill, J. E., Albert, A. Y. K. & the VOGUE Research Group. 膣マイクロバイオーム内のGardnerella leopoldii, G. swidsinskii, G. piotii, and G. vaginalisの解像度と共起パターン. Infect Immun. 87(12), e00532-19 (2019).Google Scholar
27.↵Martino, C. et al. Context-aware dimensionality reduction deconvolutes gut microbial community dynamics.（コンテキストを考慮した次元削減による腸内微生物コミュニティダイナミクス）。Nat. Biotechnol. 39, 165-168 (2021).Google Scholar
28.↵Mendz, G. L., Petersen, R., Quinlivan, J. A. & Kaakoush, N. O. Potential involvement of Campylobacter curvus and Haemophilus parainfluenzae in preterm birth（早産におけるカンピロバクター・キュルブスおよびヘモフィルス・パラインフルエンザ）の可能性。BMJ Case Rep. 2014, (2014).Google Scholar
29.↵Suzuki, T. A. & Ley, R. E. The role of the microbiota in human genetic adaptation（ヒトの遺伝的適応における微生物群の役割）. Science 370, eaaz6827 (2020).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
30.ȕFerris, M. J. et al. 最近記載されたメトロニダゾール耐性嫌気性菌Atopobium vaginaeと細菌性膣炎との関連性. BMC Infect. Dis. 4, 5 (2004).CrossRefPubMedGoogle Scholar
31.↵Danielsson, P.-E. ユークリッド距離マッピング。コンピュータグラフィックスと画像処理 vol.14 (3), 227-248 (1980).Google Scholar
32.↵Manrique, P., Dills, M. & Young, M. J. The Human Gut Phage Community and Its Implications for Health and Disease（ヒト腸内ファージコミュニティとその健康と病気への影響）. Viruses 9(6), 141 (2017).CrossRefGoogle Scholar
33.↵Schwebke, J. R., Muzny, C. A. & Josey, W. E. Role of Gardnerella vaginalis in the pathogenesis of bacterial vaginosis: a conceptual model.（細菌性膣炎の発症におけるガードネラ膣炎の役割：概念モデル）. J. Infect. Dis. 210, 338-343 (2014).CrossRefPubMedGoogle Scholar
34.⅛Kindschuh, W. F. et al. 早産はゼノバイオティクスと関連し、膣のメタボロームによって予測される。Nat Microbiol 2023 (2023). doi: 10.1038/s41564-022-01293-8.CrossRefGoogle Scholar
35.↵Weissman, J. L., Hou, S. & Fuhrman, J. A. Estimating maximal microbial growth rates from cultures, metagenomes, and single cells via codon usage patterns.「培養物、メタゲノム、単一細胞から、コドン使用パターンを介して微生物の最大増殖速度を推定する」。Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 118(12), e2016810118 (2021).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
36.⅛Achtman, M. & Wagner, M. Microbial diversity and the genetic nature of microbial species(微生物種の多様性と遺伝的性質)。Nat. Rev. Microbiol. 6, 431-440 (2008).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
37.↵Bohr, L. L., Mortimer, T. D. & Pepperell, C. S. Lateral Gene Transfer Shapes Diversity of spp. Front. Cell. Infect. Microbiol. 10, 293 (2020).Google Scholar
38.↵Hudson, R. R. Linkage disequilibrium and recombination（連鎖不平衡と組換え）. 統計的遺伝学のハンドブック (2004).Google Scholar
39.↵ Kryazhimskiy, S. & Plotkin, J. B. The population genetics of dN/dS. PLoS Genet. 4, e1000304 (2008).CrossRefPubMedGoogle Scholar
40.↵Olm, M. R. et al. inStrain profiles population microdiversity from metagenomic data and sensitively detects shared microbial strains.メタゲノム解析データから集団の多様性をプロファイルし、共有された微生物株を感度よく検出する。Nat. Biotechnol. 39, 727-736 (2021).Google Scholar
41.⅛Shenhav, L. & Zeevi, D. Resource Conservation manifests in the genetic code.（資源保存は遺伝暗号に現れる）。Science 370, 683-687 (2020).要旨/Free Full TextGoogle Scholar
42.↵Schloissnig, S. et al. ヒト腸内細菌群のゲノム変異ランドスケープ。Nature 493, 45-50 (2013).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
43.↵ M. et al. クロストリジウム・ディフィシルの短時間および長時間スケールでの進化動態. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7527-7532 (2010).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
44.↵Tatusov, R. L., Galperin, M. Y., Natale, D. A. & Koonin, E. V. The COG database: a tool for genome-scale analysis of protein functions and evolution.「COGデータベース：タンパク質の機能と進化をゲノムスケールで解析するツール」. Nucleic Acids Res. 28, 33-36 (2000).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
45.↵Stokholm, J. et al. 妊娠中の抗生物質使用は、膣常在菌の微生物叢を変化させる。Clin. Microbiol. Infect. 20, 629-635 (2014).CrossRefPubMedGoogle Scholar
46.↵Alcock, B. P. et al. CARD 2020: antibiotic resistome surveillance with the comprehensive antibiotic resistance database（包括的抗生物質耐性データベースを用いた抗生物質レジストーム監視）。Nucleic Acids Res. 48, D517-D525 (2020).CrossRefPubMedGoogle Scholar
47.⅛Maguire, F. et al. Metagenome-assembled genome binning methods with short reads disproportionately fail for plasmids and genomic Islands.メタゲノム集合ゲノムビニング法（ショートリードを用いたビニング法）は、プラスミドとゲノムアイランドに対して不均衡に失敗する。Microb Genom 6(10), mgen000436 (2020).Google Scholar
48.↵Liao, J. et al. Nationwide genomic atlas of soil-dwelling Listeria reveals effects of selection and population ecology on pangenome evolution.土壌に生息するリステリア菌の全国規模のゲノムアトラスから、パンゲノム進化における選択と集団生態の影響を明らかにした。Nat Microbiol 6(8), 1021-1030 (2021).Google Scholar
49.↵Elovitz, M. A. et al. Cervicovaginal microbiota and local immune response modulate the risk of spontaneous preterm delivery.頚膣微生物叢と局所免疫反応は自然早産のリスクを調節する. Nat Commun 10, 1305 (2019).CrossRefPubMedGoogle Scholar
50.⅛Callahan, B. J. et al. Replication and refinement of a vaginal microbial signature of preterm birth in two racially distinct cohorts of US women.米国女性の2つの人種的コホートにおける早産に関する膣内微生物のシグネチャの再現と精緻化。Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 9966-9971 (2017).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
51.↵Haque, M., Merchant, M., Kumar, P. N., Dutta, A. & Mande, S. S. First-trimester vaginal microbiome diversity（初回妊娠中の膣内マイクロバイオームの多様性）。早産リスクの潜在的指標。Sci. Rep. 7, 16145 (2017).Google Scholar
52.↵Leung, J. M., Graham, A. L. & Knowles, S. C. L. Parasite-Microbiota Interactions With the Vertebrate Gut（脊椎動物の腸内細菌と寄生虫の相互作用）: 生態学的レンズによる合成。Front Microbiol 9, 843 (2018).PubMedGoogle Scholar
53.↵Morowitz, M. J. et al. Strain-resolved community genomic analysis of gut microbial colonization in a premature infant.（未熟児における腸内細菌コロニー形成の菌株分解コミュニティゲノム解析）。Proc Natl Acad Sci U S A 108(3),1128-33 (2011).要旨/FREE Full TextGoogle Scholar
54.↵Zeevi, D. et al. 腸内細菌群の構造的変動は宿主の健康と関連する。ネイチャー 568, 43-48 (2019).CrossRefPubMedGoogle Scholar
55.↵Pace, R. M. et al. 妊娠から産後までの膣マイクロバイオームの複雑な種と株の生態、および早産との関連性。Med (2021) doi:10.1016/j.medj.2021.06.001.CrossRefGoogle Scholar
56.ȕBrown, R. G.ら、膣内ディスバイオーシスは早産胎膜破裂、新生児敗血症のリスクを高め、エリスロマイシンで増悪させる。BMC Med. 16, 9 (2018).CrossRefGoogle Scholar
57.↵Menard, J. P. et al. 早産中の女性におけるAtopobium vaginaeおよびGardnerella vaginalisの高い膣内濃度. Obstet. Gynecol. 115, 134-140 (2010).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
58.↵S.ら、インド人女性における早産分娩の膣内細菌シグネチャーズ。Front. Cell. Infect. Microbiol. 11, 622474 (2021).Google Scholar
59.↵Yuan, W., Chen, L. & Bernal, A. L. 妊娠第2期における母親の血清αフェトプロテインの上昇は早産リスクの上昇と関連するか？Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 45(1), 57-64 (2009).Google Scholar
60.⅛Simhan, H. N., Caritis, S. N., Krohn, M. A. & Hillier, S. L. Elevated vaginal pH and neutrophils are associated strongly with early spontaneous preterm birth.膣内pHと好中球の上昇は早期の自然早産と強く関連している。Am. J. Obstet. Gynecol. 189, 1150-1154 (2003).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
61.↵Otto, S. P. & Barton, N. H. The evolution of recombination: removing the limits to natural selection. Genetics 147, 879-906 (1997).要旨/Free Full TextGoogle Scholar
大腸菌の集団において、組換えは有益な突然変異の間の競争を減少させ、適応を早める。このような場合、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」。
63.⅛Martinez-Gutierrez, C. A. & Aylward, F. O. Strong Purifying Selection Is Associated with Genome Streamlining in Epipelagic Marinimicrobia（表層性海洋生物における強力な浄化選択とゲノム合理化）. ゲノム生物学(Genome Biol. Evol. 11, 2887-2894 (2019).CrossRefGoogle Scholar
64.ȕGerson, K. D. et al. 妊娠中の非最適な子宮頸管マイクロバイオータは、非ヒスパニック系黒人における明確なメタボロームシグネチャーと関連している。Sci. Rep. 11, 22794 (2021).Google Scholar
65.↵Ghartey, J., Bastek, J. A., Brown, A. G., Anglim, L. & Elovitz, M. A. 早産女性は頚膣メタボロームが特異的であること。Am. J. Obstet. Gynecol. 212, 776.e1-776.e12 (2015).Google Scholar
66.↵Terzic, M. et al. 歯周病菌と早産.Periodontal Pathogens and Preterm Birth: 現在の知見とさらなる介入。Pathogens 10, 730 (2021).Google Scholar
67.↵da Costa, A. C. et al. 妊婦の膣内におけるバクテリオファージの同定：記述的研究. BJOG 128, 976-982 (2021).Google Scholar
68.↵Bargaza, R. A. & Cunha, B. A. Aminoglycosides in gynecology. Int. Urogynecol. J. 3, 197-207 (1992).Google Scholar
69.↵Amstey, M. S. 妊娠中のクロラムフェニコール療法。69.↵Amstey, M.S. Chloramphenicol therapy in pregnancy.Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America vol. 30 237 (2000).CrossRefPubMedGoogle Scholar
70.↵Rick, A.-M.ら：グアテマラ人妊婦におけるB群レンサ球菌のコロニー形成。有病率、リスクファクター、および膣内マイクロバイオーム。オープンフォーラム インフェクト ディズ 4, ofx020 (2017).Google Scholar
71.↵Rosenbaum, P. R. & Rubin, D. B. The central role of the propensity score in observational studies for causal effects（因果関係の観察研究における傾向スコアの中心的役割）.
72.↵Gálvez, E. J. C. et al. Distinct Polysaccharide Utilization Determines Interspecies Competition between Intestinal Prevotella spp. Cell Host Microbe 28, 838-852.e6 (2020).CrossRefPubMedGoogle Scholar.
73.Yang, S., Liebner, S., Svenning, M. M. & Tveit, A. T. Decoupling of microbial community dynamics and functions in Arctic peat soil exposed to short term warming.（短期温暖化にさらされた北極圏泥炭土壌における微生物群集の動態と機能の分離）. Mol. Ecol. 30, 5094-5104 (2021).Google Scholar
74.Kieser, S., Zdobnov, E. M. & Trajkovski, M. Comprehensive mouse microbiota genome catalog reveals major difference to its human counterpart.「マウス微生物群の包括的なゲノムカタログは、ヒトの微生物群との大きな違いを明らかにした」。PLoS Comput. Biol. 18, e1009947 (2022).Google Scholar
75.↵Chevalier, C. et al. 温熱は腸内細菌叢を通して骨量減少を防ぐ. Cell Metab. 32, 575-590.e7 (2020).Google Scholar
76.↵ Kieser, S., Brown, J., Zdobnov, E. M., Trajkovski, M. & McCue, L. A. ATLAS: a Snakemake workflow for assembly, annotation, and genomic binning of metagenome sequence data.（ATLAS：メタゲノム配列データのアセンブリ、アノテーション、ゲノムビニングのためのSnakemakeワークフロー）. BMC Bioinformatics 21, 257 (2020).CrossRefGoogle Scholar
77.⅛Bolger, A. M., Lohse, M. & Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. バイオインフォマティクス 30, 2114-2120 (2014).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
78.⅛Langmead, B. & Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.（ボウタイ2によるギャップリードの高速アライメント）。Nat. このような場合、「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」「痒いところに手が届く」。
79.↵Nurk, S., Meleshko, D., Korobeynikov, A. & Pevzner, P. A. metaSPAdes: a new versatile metagenomic assembler. Genome Res. 27, 824-834 (2017).Abstract/FREE Full TextGoogle Scholar
80.⅛Kang, D. et al. MetaBAT 2: an adaptive binning algorithm for robust and efficient genome reconstruction from metagenome assemblies.（メタゲノム・アセンブリからの頑健で効率的なゲノム再構成のための適応的ビニング・アルゴリズム）。PeerJ 7, e7359 (2019).CrossRefPubMedGoogle Scholar
81.↵Olm, M. R., Brown, C. T., Brooks, B. & Banfield, J. F. dRep: a tool for fast and accurate genomic comparisons that enables improved genome recovery from metagenomes through de-replication.D. F.メタゲノムからのゲノム再構築のための高速かつ正確な比較ツール。ISME J. 11, 2864-2868 (2017).CrossRefGoogle Scholar
82.⅛Hyatt, D. et al. Prodigal: Prokaryotic gene recognition and translation initiation site identification.原核生物の遺伝子認識と翻訳開始部位の同定。BMC Bioinformatics 11, 119 (2010).CrossRefPubMedGoogle Scholar
83.Huerta-Cepas, J. et al. eggNOG 5.0: a hierarchical, functionally and phylogenetically annotated orthology resource based on 5090 organisms and 2502 viruses.（5090の生物と2502のウイルスに基づく、階層的、機能的、系統学的アノテーションを施したオーソロジーリソース）。Nucleic Acids Res. 47, D309-D314 (2019).CrossRefPubMedGoogle Scholar
84.↵Danecek, P. et al. SAMtoolsとBCFtoolsの12年間. ギガサイエンス10(2), giab008 (2021).CrossRefPubMedGoogle Scholar
85.↵Chaumeil, P.-A., Mussig, A. J., Hugenholtz, P. & Parks, D. H. GTDB-Tk: a toolkit to classify genomes with the Genome Taxonomy Database.ゲノム分類データベースでゲノムを分類するツールキット. バイオインフォマティクス (2019) doi:10.1093/bioinformatics/btz848.CrossRefPubMedGoogle Scholar
86.↵Darriba, D., Taboada, G. L., Doallo, R. & Posada, D. ProtTest 3: Fast selection of best-fit models of protein evolution.タンパク質進化の最良適合モデルの高速選択. このような場合、「このような場合、どのようにすればよいのか？
87.↵Stamatakis, A. RAxML version 8: a tool for phylogenetic analysis and post-analysis of large phylogenies. バイオインフォマティクス 30, 1312-1313 (2014).CrossRefPubMedWeb of ScienceGoogle Scholar
88.↹Letunic, I. & Bork, P. Interactive Tree Of Life (iTOL) v5: an online tool for phylogenetic tree display and annotation(系統樹の表示とアノテーションのためのオンラインツール). このような場合、「萌芽的研究」を行う必要があります。
89.↵Nies, L. de al. PathoFact: A pipeline for the prediction of virulence factors and antimicrobial resistance genes in metagenomic data.メタゲノムデータにおける病原性因子と抗菌剤耐性遺伝子の予測のためのパイプライン.PathoFact. Microbiome 9(1), 49 (2021).Google Scholar
90.↵Benjamini, Y. & Hochberg, Y.偽発見率を制御する。を制御する：多重検定への実用的で強力なアプローチ。を用いた。Soc. 57, 289-300 (1995).CrossRefPubMedGoogle Scholar