ミツバチにおける植物毒の宿主マイクロバイオームによる代謝

2023年6月21日 17:16

生態学微生物学・感染症学
ミツバチにおける植物毒の宿主マイクロバイオームによる代謝

https://elifesciences.org/articles/82595

Erick VS Motta Is a corresponding author et al.
2022年12月6日
https://doi.org/10.7554/eLife.82595

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2023年2月3日(本編)
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概要
ミツバチは花蜜や花粉を採る際に、植物代謝物を含む無数のゼノバイオティクスにさらされ、その健康状態に様々な影響を及ぼす可能性がある。ハチのゲノムには、ゼノバイオティクスの代謝に役立つ酵素がコードされていますが、他の昆虫のゲノムに比べ、解毒遺伝子の多様性は低くなっています。そのため、ハチは潜在的な毒性分子を分解するために、微生物叢など、ハチの生理を形成する他の構成要素に依存している可能性があります。本研究では、ミツバチが受粉したアーモンドの木に含まれる青酸配糖体であるアミグダリンが、ミツバチと腸内細菌叢の双方によって代謝されることを明らかにした。微生物叢を失ったミツバチでは、アミグダリンはプルナシンに分解され、中腸と後腸にプルナシンが蓄積されるようになる。一方、微生物叢を持つハチでは、アミグダリンはさらに分解され、プルナシンは腸内に蓄積しないことから、微生物叢がアミグダリンのシアン化水素への完全分解に寄与していると考えられる。In vitroの実験では、ハチ腸内細菌によるアミグダリン分解は菌株特異的であり、特定の属や種に特徴的ではないことが示された。アミグダリンを分解できるビフィドバクテリウム、ボンビラクトバチルス、ギリアメラの菌株を発見した。中間体としてプルナシンを生成する株もあることから、分解機構は様々であると思われる。最後に、アミグダリンを完全に分解する菌株であるBifidobacterium wkB204において、分解の基礎を調査した。その結果、グリコシドヒドロラーゼファミリー3（GH3）を含むいくつかの糖質分解酵素の過剰発現と分泌が確認された。このGH3を大腸菌で発現させ、アミグダリンと一緒に細胞溶解液を培養したところ、副産物としてプルナシンが検出され、アミグダリン分解への寄与が示唆されました。これらの結果は、宿主と微生物相の両方が、食餌性植物代謝物の代謝に協力できることを示すものである。

編集部による評価
本論文は、食餌性二次代謝物であるアミグダリンの分解におけるハチ宿主とマイクロバイオームの役割の理解に重要な貢献をするものである。アミグダリンの脱グリコシル化に関与するいくつかの細菌株とその酵素が同定されている。遺伝子発現解析、プロテオミクス、HPLC-MS、組換え大腸菌を用いた酵素機能試験など、in vitroとin vivoの実験を総合的に組み合わせることで、説得力のある結論に達した。微生物由来のアミグダリン代謝が宿主の健康に及ぼす影響は、実施した実験ではまだ不明であるが、この研究は、マイクロバイオームによる二次代謝物の処理が昆虫宿主の健康に及ぼす重要性について、今後の研究を刺激するものである。

https://doi.org/10.7554/eLife.82595.sa0
決定書
Scietyに関するレビュー
eLifeのレビュープロセス
eLifeのダイジェスト
ほとんどの植物は、少なくとも一部の動物に対して有毒な化学物質を生成します。毒素が特定の動物に有害かどうかは、その動物が摂取する量と消化の際に起こる特定の生化学に依存する。動物や微生物が腸内で生成する酵素は、有害物質を有害でない分子に分解するのに役立つことが多い。しかし、この分解から生まれるものの中には、それ自体が有毒なものもあります。動物に害を与える一方で、腸内に寄生する寄生虫に害を与えることもあり、結果的に良い影響を与えることになります。

アーモンドとその花粉は、人間やミツバチが食べても、明らかに有害な影響はありません。しかし、アーモンドにはアミグダリンという分子が含まれており、消化されると猛毒のシアン化水素を発生させる可能性がある。アミグダリンは大量に摂取するとハチに毒性を示すが、アーモンドの蜜に含まれる程度の量であれば害はなく、むしろハチを寄生虫から守ってくれる可能性がある。Mottaらは、アミグダリンがミツバチの腸内でどのように消化されるのか、また腸内細菌がこの消化に関与しているのかどうかを知りたいと考えた。

これらの疑問に答えるため、Mottaらは、アミグダリンを摂取した場合の影響を、正常なミツバチと腸内細菌を持たないミツバチで比較しました。腸内細菌を持たないハチは、アミグダリンを分解してプルナシンという無害な物質にした。しかし、腸内細菌を持つハチだけが、プルナシンをさらに分解してシアン化水素にすることができました。興味深いことに、アミグダリンの完全な代謝は、ハチがより長く生存するかどうか、あるいは腸内にどの微生物が存在するかに、検出可能な影響を与えなかった。Mottaらは、アミグダリンを分解してシアン化水素を放出できるハチの腸内細菌も発見し、このプロセスを担う酵素を特定した。この酵素をコードする遺伝子を別の種の細菌に挿入すると、2番目の種がアミグダリンを分解する能力を獲得した。

Mottaらの発見は、ミツバチのアミグダリンの処理における腸内細菌の役割を説明するものである。将来的には、人間や他の生物が植物毒をどのように処理するかを理解する鍵になるかもしれません。今後、動物とその腸内に生息する微生物との関係を解明することで、毒素や栄養素、薬剤の消化・処理を操作して人間の健康に役立てる方法を科学者が理解できるようになるかもしれません。

はじめに
多くの動物が食物とともに潜在的な毒素を摂取しており、これらの毒素は複雑な結果をもたらすことがある。食餌性毒素は多くの場合、劇薬であるが、病原菌や寄生虫などの天敵から身を守るなど、有益な場合もある（Gowler et al.、2015）。摂取されると、食餌性化合物の酵素代謝により、毒性が強くなったり弱くなったりする（Masonら、2019；Dearing and Weinstein、2022）。宿主自身は、毒素を分解する酵素を産生することができる。さらに、腸内細菌叢のメンバーは、毒素を含む食物化合物の酵素分解に寄与することが示されている。

一般的な採食者であるミツバチとマルハナバチは、広範囲の植物二次代謝物（Irwin et al., 2014）にさらされる可能性があり、これらは通常、病原体や草食動物に対する防御として植物によって生産されます（Zaynab et al., 2018）。低濃度であっても、これらの代謝物はハチの行動や健康にネガティブからニュートラル、ポジティブまで様々な影響を与え、誘引や抑止に関与する可能性があります（Detzel and Wink, 1993; Hagler and Buchmann, 1993; Stephenson, 1982）。興味深いことに、一部のハチ種は、キニーネ、ニコチン、カフェイン、アミグダリンなど、自然に存在する濃度の特定の花蜜代謝物を検出できない（Tiedeken et al.、2014）。この鋭敏性の低さは、代謝物の毒性によっては、長期的な副作用につながる可能性があります。

ジェネラリストのハチが慢性的にさらされる可能性のある植物二次代謝物は、アーモンド、リンゴ、チェリー、ネクタリンに含まれるシアノゲン配糖体のアミグダリンです (London-Shafir et al., 2003; Barceloux, 2009; Bolarinwa et al., 2015; Lee et al., 2017). アーモンドに関する研究では、アミグダリンが花蜜と花粉に存在することが示されています（London-Shafirら、2003）。西洋ミツバチであるApis melliferaはアーモンドの主要な受粉者であり、おそらく他の作物でもアミグダリンに遭遇している。アミグダリンの毒性は、その分解生成物に由来する（Jaszczak-Wilkeら、2021年）。アミグダリンは細胞液胞に貯蔵され、分解に関与するグリコシドヒドロラーゼ（GH）は細胞質に存在するため、草食動物による咀嚼など、植物組織の損傷時に分解が起こる。アミグダリンは通常、分解されるとまずプルナシンとグルコース分子に分解される。そして、プルナシンはさらにグルコース分子とマンデロニトリルに分解され、後者の化合物はベンズアルデヒドとシアン化水素に変換される。シアン化水素は、酸化的リン酸化の際に電子輸送鎖を妨害するため、動物の急性中毒につながる有毒分子です（Khandekar and Edelman, 1979; Carter et al., 1980; Newton et al., 1981; Kolesarova et al., 2021; Kovacikova et al., 2019; Salama et al., 2019）。

興味深いことに、一部のハチは、アーモンドの蜜で遭遇するアミグダリン濃度（最大15μM）では抑止されず（London-Shafirら、2003；Stevensonら、2017）、最大219μMの濃度でも生存率に影響がなく耐えられる（Irwinら、2014；Lecocqら、2018）。特定の植物を餌とするハチは、さらに高用量のアミグダリンにさらされる可能性があり、例えば、アーモンド花粉中の濃度は最大4mMに達することがあります（London-Shafirら、2003年）。このような高用量のアミグダリンに曝露すると、逆さまになっている時間の急増や腹部を引きずるなどの急性倦怠感症状が現れ（Hurst et al., 2014）、数日間曝露するとハチの生存率が下がる（Kevan and Ebert, 2005）。また、実験室での試験では、低用量でも生存率が低下する可能性がある (Ayestaran et al., 2010)。ハチに対する毒性の可能性があるにもかかわらず、コロニーレベルでアミグダリンに曝露すると、トリパノソーマティッドである Lotmaria passim などの寄生虫からハチを守り (Tauber et al., 2020) 、一部の病原ウイルスの力価を下げることができる (Tauber et al., 2020; Palmer-Young et al., 2017) かもしれない。したがって、アミグダリンへの曝露は、用量と感染状態に応じて、ハチの健康にプラスとマイナスの両方の影響を及ぼす可能性がある。

ハチの健康に影響を与える可能性があるにもかかわらず、ハチ内のアミグダリン代謝経路は解明されていない。ミツバチとマルハナバチのゲノムは、他の昆虫と比較して解毒遺伝子が少ないが (Berenbaum and Johnson, 2015; Sadd et al., 2015) 、シトクロム P450 モノオキシゲナーゼ、グルタチオン転移酵素、GH など、植物代謝物を分解できる酵素をいくつかコードしている (Berenbaum and Johnson, 2015; Pontoh and Low, 2002; Rand et al., 2015) 。例えば、ミツバチは下咽頭腺から口内にGHを分泌し、それが中腸に移動して、アミグダリンのプルナシンへの変換など、グリコシドの初期分解を触媒する可能性がある（Pontoh and Low, 2002; Ricigliano et al.、2017）。

アミグダリンの毒性は摂取後に生じるが、血液リンパへの注入後には生じないことから（Hurst et al., 2014）、腸内の酵素がアミグダリンのシアン化水素への変換を実現していると考えられる。これらの酵素の供給源は不明である。可能性としては、ハチのGH（Pontoh and Low, 2002）、ハチが摂取する花粉由来のGH（Ricigliano et al., 2017）、またはハチの腸内細菌叢が産生するGH（Kwong and Moran, 2016; Zheng et al., 2018; Motta et al., 2022a）などが考えられる。後者の可能性は、優勢なハチ腸内細菌種が産生するGHの膨大なアーセナルによって示唆されている（Zheng et al., 2019; Ellegaard et al.、2019）。興味深いことに、アミグダリン自体はin vitroで抗菌作用を示さず、ミツバチの腸内細菌叢はアミグダリン曝露によって大きな影響を受けないようです（Tauber et al.、2020）。

本研究では、アミグダリン分解におけるミツバチとその微生物叢の寄与を調査した。その結果、微生物叢を持たない宿主でもプルナシンへの分解が達成され、さらに優勢な微生物叢種の特定の菌株によって分解が行われることがわかりました。生化学的アッセイを用いて、アミグダリンとプルナシンを分解できるハチ関連ビフィドバクテリウム菌株が分泌するGHの特徴を明らかにした。これらの結果は、宿主とマイクロバイオームの複合的な貢献により、食餌性植物代謝物の分解が可能になることを明らかにするものである。

研究成果
ハチ腸内細菌によるアミグダリン代謝を調べるため、ハチ腸内で食物代謝に関与する4つの細菌群の代表的な菌株を選択した： Bifidobacterium、Bombilactobacillus（旧名Lactobacillus Firm-4）、Lactobacillus nr. melliventris（旧名Lactobacillus Firm-5）、Gilliamella（図1）です。これらの菌株を半定形培地（SDM、図1A）または栄養豊富な培地（MRSまたはInsectagro、図1B）で培養し、アミグダリンに対する感受性と、アミグダリンを代謝して副産物であるプルナシンなどに変換する能力をLC-MSによって分析しました（図1C）。

図1 付録1

ミツバチ腸内細菌のアミグダリンへのin vitro曝露。
96ウェルプレートでの（A）半定義培地または（B）栄養豊富な培地での実験デザイン。(C) LC-MS分析用のサンプル処理。(D)ビフィズス菌と(E)ボンビラクトバチルス菌の増殖の様子。

ミツバチの腸内細菌共生体はアミグダリンに対する感受性が異なる
種内（または近縁種クラスター）において、in vitroで異なる濃度のアミグダリンに対処する能力が異なる菌株が存在することがわかった。

ビフィドバクテリウム
A.melliferaの腸から分離した3株（wkB204、wkB344、wkB338）を、アミグダリンおよび／またはグルコースを唯一の炭素源として、SDMの存在下で培養した（図1A）。wkB204株はアミグダリンを単独炭素源とする存在下で増殖したことから、この株はアミグダリンを分解し、潜在的な副産物の影響を受けにくいことが示唆された（図1D）。一方、wkB344株とwkB338株はグルコースを添加した場合のみ増殖し、アミグダリンを添加した場合は増殖が阻害されたことから、これらの株には毒性があることが示された（図1D）。

ボンビラクトバシラス
Bombus impatiens (BI-1.1 and BI-2.5), Bombus appositus (LV-8.1) and A. mellifera (Bin4N) の腸から分離した菌株をSDMで試験した (Figure 1A). BI-1.1およびBI-2.5株は、唯一の炭素源としてアミグダリン存在下で増殖し、BI-2.5はBI-1.1よりも良好に増殖した。実際、BI-2.5の成長は、グルコースを唯一の炭素源とした場合よりも、アミグダリン存在下でより高かった（図1E）。LV-8.1株とBin4N株はグルコースを含む培地でのみ生育したが、アミグダリンを添加してもその生育に影響はなかった（図1E）。

ギリアメーラ
Apis dorsata（wkB112、wkB178、wkB108）、Apis cerana（wkB308）、A. mellifera（M6-3G, M1-2G, wkB7, wkB1）の腸から分離した株は、これらの株に対するSDMがないためInsectagroで培養した（Figure 1B）。10mMのアミグダリンの存在下または非存在下で、ほとんどの菌株が同様の速度で増殖したが、wkB108とwkB1は増殖の遅延を示し、試験濃度でのアミグダリンへの感受性を示唆した（図1F）。

ラクトバチルス nr.melliventris
A. mellifera（HB-1、HB-2、HB-C2、HB-D10、wkB8、wkB10）、B. impatiens（BI-4G）、Bombus occidentalis（OCC3）の腸から分離した菌株は、SDMではうまく増殖しないので、リッチ培地（MRS）で培養した（図1B）。すべての菌株はアミグダリンの存在下で増殖したが、HB-2の増殖はアミグダリンをMRSに添加することで減少した（図1G）。

試験したほとんどの細菌株について、アミグダリンの濃度を10mMから100mMに上げると増殖が阻害された（図1-図1A-C）。この毒性は、ほとんどの菌株がアミグダリンを分解できなかったことから、おそらくアミグダリン自体の存在に関連しており、潜在的な副産物には関連していない。アミグダリン濃度は、細菌による炭素源の利用を調べるために通常増殖培地に添加されるグルコース濃度に対応するように選択され、アーモンド花粉（~4 mM）および花蜜（~0.01 mM）（London-Shafirら、2003）で検出される濃度よりも高くなる。

特定のハチ腸内細菌株はアミグダリンを分解する
LC-MS分析を用いて、ビフィドバクテリウム株wkB204（図1H）、ボンビラクトバチルス株BI-1.1およびBI-2.5（図1I）など、アミグダリンを唯一の炭素源とする存在下で増殖できる株についてアミグダリンの分解を確認した。アミグダリンを生育させた培養物の使用済み培地には、初期濃度と比較して、アミグダリンは検出されなかったか（図1H）、または低濃度で検出された（図1Iおよび図1-図1D-E）。これらの場合、グルコースが存在するかどうかにかかわらず、アミグダリンの分解が観察された。興味深いことに、ボンビラクトバチルス株BI-2.5は、培地中にグルコースも存在する場合、アミグダリンの分解が少ない（図1I）。一方、Bifidobacterium strain wkB204とBombilactobacillus strain BI-1.1については、グルコースがある場合とない場合の培養で同程度のアミグダリン分解が検出された（図1H-I）。

Gilliamella株とLactobacillus nr.melliventris株は栄養豊富な培地で培養したため、アミグダリンの分解は主に使用済み培地のLC-MSによって調査した。その結果、ギリアメラー株wkB112のみアミグダリンの分解が確認された（図1Jおよび図1-図1F）。これらの菌株は、代替炭素源としてグルコースを有していたため、栄養価の高い培地を使用したことにより、一部の菌株のアミグダリン分解能力が覆い隠された可能性がある（図1J-K）。

ハチ腸内細菌によるアミグダリン分解の異なるメカニズム
ビフィドバクテリウム株wkB204およびボンボラクトバチルス株BI-1.1によるアミグダリンの代謝は、副産物としてプルナシンを生成するが（図1L-Mおよび図1-図1G-H）、プルナシンは過剰量のアミグダリンを与えた後のwkB204培養物でのみ検出した（図1-図1G）。このことから、wkB204とBI-1.1は、アミグダリン構造中のグルコース残基間のグリコシド結合を分解する酵素をコードし、プルナシンとグルコース1分子を放出し、これらの細菌が炭素源として使用できることが示唆された。一方、ボンビラクトバチルス菌BI-2.5株やギリアメラ菌wkB112株では、アミグダリンを過剰に添加してもプルナシンは生成されなかった（図1-図1H-I）（図1M-N）。したがって、BI-2.5とwkB112は、wkB204とBI-1.1とは異なる方法でアミグダリンを代謝しているようで、おそらくアグリコンに2つのグルコース残基をつなぐグリコシド結合を分解して、二糖とマンデロニトリルを培地に放出すると考えられる。これらのメカニズムは、これらの培養から毎日センサスで採取した使用済み培地のLC-MS分析によって裏付けられました（図2）。これらの結果から、プルナシン中間体を介したアミグダリンの分解は、wkB204とBI-1.1に限られることが示唆された。

図2

ハチ腸内細菌によるアミグダリン分解のメカニズム。
(A)ビフィドバクテリウム株wkB204、(B)ボンボラクトバチルス株BI-1.1およびBI-2.5、(C)ギル... 詳細表示

アミグダリン代謝に関与する酵素の特性解明
異なるミツバチ腸内細菌種の特定株がアミグダリンを分解することを発見した後、ミツバチ関連ビフィドバクテリウム株に着目し、この代謝に関与する酵素を検討しました。まず、酵素が分泌されるか否かを確認した。wkB204、wkB344、wkB338の大培養液を5日間培養し（図3A）、その後、グルコースおよびアミグダリンで培養した培養液の使用済み培地と細胞溶解液の両方を用いて生化学アッセイを実施した。

図3 with 1 supplement

ビフィドバクテリウム株の使用済み培地および細胞溶解液におけるアミグダリン分解。
(A）炭素源なしの半定義培地（SDM）、10mMグルコース（10G）、10mMアミグダリン（10A）、または10mMグルコースとアミグダリンの両方で培養したビフィドバクテリウム株の細菌増殖曲線 ... 詳細表示

前の実験で観察されたように、wkB204はアミグダリンを完全に分解した。使用済み培地（10A sm、図3B）またはアミグダリンで育った培養物の細胞溶解液（10A cl、図3C）でアミグダリンを検出しなかった。アミグダリンの分解に関与する酵素が分泌されているかどうかを調べるために、滅菌した使用済み培地（10A sm + 10A）またはアミグダリンを生育した培養物に由来する滅菌細胞溶解液（10A cl + 10A）に新鮮なアミグダリンを添加した。3日間のインキュベーション後、使用済み培地（10A sm + 10A）ではアミグダリンの完全な分解が見られたが（図3B）、細胞溶解液（10A cl + 10A）ではわずかな分解しか見られなかった（図3C）；これは培地とアミグダリンだけを含む対照試料（新鮮な10A）と比較した。アミグダリンを培養した細胞溶解液ではアミグダリンは検出されず、アミグダリンが細菌細胞に侵入しないことが示された（10A cl、図3C）。さらに、アミグダリンを添加したアミグダリン生育培養物（それぞれ10A sm + 10Aおよび10A cl + 10A）の使用済み培地および細胞溶解液の両方でプルナシンを検出した（図3-図解1）。

比較のため、これらのアッセイをwkB344およびwkB338培養物についても実施した。wkB344アミグダリン生育培養物の使用済み培地について、若干のアミグダリン分解が観察されたが、この分解はwkB204で観察されたものよりはるかに少なかった（図3B-C）。また、アミグダリン非存在下において、グルコース生育培養物（10G sm + 10Aおよび10G cl + 10A、図3B-C）の使用済み培地および細胞溶解液にアミグダリンを添加し、酵素生産および活性について調べた。これらの条件下では、いずれの菌株もアミグダリンを有意に分解することはできなかった。

wkB204アミグダリン生育培養物の使用済み培地はアミグダリンの完全分解を達成したので、分解に関与する分泌酵素の特徴を明らかにすることにした。アミグダリンまたはグルコースで培養したwkB204培養物の使用済み培地を処理し、濃縮タンパク質抽出物を得た（図4A）。タンパク質プロファイルは、まずSDS-PAGEゲルによって得られ、グルコースで育てた培養物と比較して、アミグダリンで育てた培養物が明確なセクレトームを持つことが示された（図4B、図4-source data 1）。次に、サンプルをプロテオミクス解析に供したところ、アミグダリン生育培養物ではより高濃度に分泌される107種類のタンパク質が、グルコース生育培養物ではより高濃度に分泌される131種類のタンパク質が見つかり、発現の違いが確認された（p<0.05、t検定後、偽発見をコントロールするためにBenjamini-Hochberg手順を実施、図4C）。アミグダリン培養液で有意に発現量が増加したいくつかのタンパク質は、糖質代謝に関連している（図4-source data 2）。興味深いことに、グリコシドヒドロラーゼファミリー 3 (GH3) (WP_254476944) に属する高発現酵素をアミグダリン生育培養物でのみ検出し（図4C）、観察された分解への関与が示唆された。他の研究では、特定の細菌または真菌のGH3酵素がアミグダリンを分解できることが示されている（Gao and Wakarchuk, 2014; Guo et al., 2015; Chang and Zhang, 2012; Li et al., 2018）。

図4

ビフィドバクテリウム由来のアミグダリン分解酵素の同定。
(A）ビフィドバクテリウム株wkB204を炭素源なしの半定義培地（SDM）、10 mMグルコース、または10 mMアミグダリンで35℃、5％CO2で大規模培養。実験は、... もっと見る

図4-ソースデータ1
ビフィズス菌wkB204株の培養物に対するSDS-PAGEゲルラン。

左から右へ、列は以下を表す：(1) PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; (2-10) 炭素源の不在下で培養した(1-4)、唯一の炭素源として10 mMグルコースの存在下で培養した(5-7)、または唯一の炭素源として10 mM amygdalinの存在下で培養した (8-10) の上澄み汁。各サンプル（30μL）を5μLの6×SDSゲルローディングバッファー（0.35M Tris-Cl pH 6.8, 10% w/v SDS, 0.012% w/v bromophenol blue, 30% v/v glycerol, 0.6 mM dithiothreitol）と混合して100℃で5分間変性し、Bolt 4-12% Bis-Tris Plus, 1.0mm, protein gel上で200V、22分実行しました。

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図4-ソースデータ2
ビフィズス菌wkB204株のアミグダリン培養とグルコース培養のタンパク質発現差解析。

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ビフィドバクテリウム株のGH3遺伝子発現量
このwkB204株のGH3（WP_254476944）をクエリーとして、ハチ関連ビフィドバクテリウム22株を含むハチ腸内細菌由来のタンパク質のカスタマイズデータベースを検索しました。他の10株のビフィドバクテリウムは、wkB204 GH3と高い配列類似性を持つGH3をゲノムにコードしていた（図5-図1）。興味深いことに、これらの中には、in vitroでアミグダリン存在下で増殖しないwkB344由来のGH3（WP_121913979）が含まれていた。

このGH3がなぜwkB344がアミグダリンを炭素源として利用できないのかを調べるため、この酵素が培養物中で発現しているかどうかを調べ、wkB204とwkB338の培養物をそれぞれGH3活性の有無のコントロールとして使用した（図5A）。唯一の炭素源としてグルコースが存在する場合、wkB204株とwkB344株はGH3遺伝子を発現するが、wkB338株は発現しない（図5B）。アミグダリンを唯一の炭素源として培養した場合、wkB204のみがGH3転写物の発現上昇を示し（図5B）、これはこの株がin vitroでアミグダリンを分解する能力と相関している。wkB344では発現の上昇は見られず（図5B）、グルコース生育培養でwkB344が産生したGH3のレベルは、10mMアミグダリン中でインキュベートしても観察できるアミグダリン分解をもたらさなかった（図3C）。

図5 1つの補足

ビフィズス菌培養物におけるグリコシドヒドロラーゼファミリー3（GH3）遺伝子の発現。
(A) ビフィズス菌wkB204株、wkB344株、wkB338株の培養物からのRNA抽出と相補的DNA（cDNA）合成。(B) ビフィズス菌の細胞におけるGH3の転写レベルのqPCRデータ... 詳細表示

図5-ソースデータ1
Bifidobacterium wkB204株、wkB344株、wkB338株のdbCANメタサーバー結果。

https://cdn.elifesciences.org/articles/82595/elife-82595-fig5-data1-v2.xlsx
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アミグダリン生育培養で過剰発現するwkB204のGH3（WP_254476944）は、他の4つの遺伝子（major facilitator superfamily transporter（WP_254476943）、グリコシドヒドロラーゼファミリー30（WP_254477160）、βガラクトシダーゼ（WP_254477161））を含むオペロンでコードされている（図5C）。これらは、プロテオミクスデータに基づき、アミグダリン存在下でも過剰発現していた（図5C）。wkB344 GH3（WP_121913979）もオペロンにコードされているが、オペロン内の他の遺伝子はβ-ガラクトシダーゼ（WP_121914045）だけであり（図5C）、オペロンマッパーWebサーバーで予測された（Taboada et al.、2018）。

自動CAZymeアノテーションのためのdbCANメタサーバーによると、これら3つのビフィドバクテリウム株のゲノムは複数のGH3をコードする：wkB204は10の異なるGH3をコードし、wkB344とwkB338はそれぞれ5の異なるGH3をコードする（図5のソースデータ1；Yinら、2012；Changら、2018年）。NCBI推論データベースと他のアノテーションされたGH3とのアミノ酸類似性に基づいて、これらの3つの株は、wkB204-GH3（WP_254476944）とwkB344-GH3（WP_121913979）（図5E）で指摘したようにアミノ酸配列において非常に類似し、おそらく機能においても類似したいくつかのGH3があります（図5Dと表1）。

表1
ビフィズス菌wkB204株、wkB344株、wkB338株のゲノムから検出されたグリコシド水解酵素ファミリー3（GH3）。
Protein IDは、NCBI Reference Sequence Databaseにおける各GH3のユニークな識別を意味します。Inferenceは、NCBI Reference Sequence Databaseに存在する最も近縁のGH3を意味する。同じ ... もっと見る

株GH3遺伝子座番号タンパク質ID（NCBI RefSeq）推測（NCBI RefSeq)
wkB204 10 WP_254476932a WP_007147852
WP_254476944b WP_015021504
WP_254477003 WP_003842825
WP_254477019 -
WP_254477308c WP_015022086
WP_254477316 - WP_254477624
WP_254477624d WP_016461981
WP_254477626e WP_004221005
WP_254478126 ・・・。
WP_254478363
wkB344 5 WP_121913968a WP_007147852
WP_121913979b WP_015021504
WP_121914233c WP_015022086
WP_121914846d WP_016461981
WP_121914847 WP_004221005
wkB338 5 WP_121912678c WP_015022086c
WP_121912768 WP_003838412
WP_121912769e WP_004221005e
WP_121913257 WP_003839235
WP_121913288 WP_015450023
ビフィドバクテリウム株もプルナシンを分解する
ビフィドバクテリウム株もプルナシンを分解できるかどうかを調べるために、ビフィドバクテリウム株wkB204、wkB344、wkB338をSDM中10mMグルコース中、0.1mMプルナシンの存在下で培養するという追加のin vitro実験を行った（図6A）。この条件下では、すべての株がプルナシンの存在下で増殖し（図6B）、プルナシンを分解した（図6C）。比較のため、0.1 mMのアミグダリン存在下での生育も確認したところ（図6D）、wkB204だけでなくwkB344もアミグダリンを分解していることがわかった（図6E）。この株で以前観察された増殖の欠如、ひいては分解の欠如は、おそらく以前の培養で提供されたアミグダリンの濃度がはるかに高かった（10または100 mM）ことに起因している。

図6

ハチ腸関連ビフィズス菌によるプルナシンの分解。
(A) 実験デザイン。(B) 0.1 mMのプルナシン存在下で3日間培養した後の菌の増殖、および(C)プルナシンの分解。(D)菌の増殖、(E)3日間培養後のアミグダリン分解 ... 詳しく見る

GH3酵素を発現する大腸菌がプルナシンを産生する
ビフィドバクテリウムのGH3酵素がアミグダリンおよび／またはプルナシンを分解する能力を確認するために、ビフィドバクテリウム株wkB204（WP_254476944）またはwkB344（WP_121913979）のGH3遺伝子を大腸菌でクローニングして発現した（図7A-B）。GH3を発現する形質転換大腸菌の細胞溶解液を、0.1 mM アミグダリンまたは0.1 mM プルナシンの存在下でインキュベートした（図7C）。5日間インキュベートした後、wkB204-GH3またはwkB344-GH3を発現する大腸菌細胞溶解物ではアミグダリンの分解（図7D）に続いてプルナシンの生成（図7E）が観察されたが、空のプラスミドで形質転換した大腸菌では見られなかったことから、両方の酵素がアミグダリンを分解してプルナシンを生成できることがわかった。また、細胞溶解液をプルナシンの存在下でインキュベートしたところ、プルナシンは少量しか分解されなかった（図7F）ことから、本酵素は、試験した条件下で、やはりプルナシンを分解できるが、その程度は低いことが示唆された。これらのことから、このビフィズス菌関連GH3酵素は、アミグダリンをプルナシンに、プルナシンをマンデロニトリルに分解できる可能性があり、ビフィズス菌wkB204株をアミグダリン存在下で培養した際に観察される分解パターンに関与していると考えられる。

図7

大腸菌におけるBifidobacterium glycoside hydrolase family 3（GH3）酵素の異種発現。
(A）大腸菌Rosetta BL21コンピテントセルを、wkB204-GH3またはwkB344-GH3をコードする遺伝子を有するベクターpET-25b、またはコントロールとして空ベクターのみで形質転換した。(B) 細菌... もっと見る

アミグダリン分解に寄与する宿主と共生生物
また、生体内でのアミグダリン分解についても検討した。そのため、微生物叢を欠くハチ（微生物叢欠乏型、MD）、従来の微生物叢でコロニー形成したハチ（CV）、またはビフィドバクテリウム株wkB204またはwkB344でモノコロニー形成したハチで実験を実施した（図8A）。ハチには、スクロースシロップ中の1mMアミグダリン5μL、またはスクロースシロップのみを手渡しで与えた。アミグダリンは、MD、CV、およびモノコロン化したハチの腸を含まない中腸、後腸、および体幹部など、ハチの体の異なる区画で検出された（図 8B）。後腸サンプルにおいて、アミグダリンは MD と wkB344 モノクロナイズドビーで検出されたが、CV と wkB204 モノクロナイズドビーでは検出されなかった（図 8B）。総アミグダリン濃度は、アミグダリンで処理しないが抽出プロトコル中に5μLの1mMアミグダリンをスパイクした対照蜂と比較すると、CV蜂とwkB204-monocolon化蜂で著しく低かった（図8C）。興味深いことに、プルナシンは MD ハチの中腸と後腸でのみ検出された (図 8D-E) 。

図8

ミツバチにおけるアミグダリン代謝。
(A) 5日齢のミツバチは、微生物相を欠いた状態（微生物相欠乏型、MD、n=4）、通常の微生物相を持つ状態（従来型、CV、n=3）、ビフィドバクテリウム株wkB204（n=3）または...続きをみるでモノクロナイズした。

これらの知見は、アミグダリン濃度がCV蜂で減少し、プルナシンがCV蜂やモノコロナイズド蜂の腸内に蓄積しないことから、アミグダリン分解における微生物叢の役割を示している。また、これらの結果は、ミツバチ自身がアミグダリンを分解することができるが、プルナシンが MD ハチの腸内に蓄積されるため、この分解は部分的であることを示す。したがって、微生物叢の存在は、ミツバチの腸内でアミグダリンとプルナシンの分解を継続させることに寄与していると言える。

ミツバチは環境中の一般的な濃度のアミグダリンに耐えられる
0.01～1mMのアミグダリン濃度に曝露したミツバチは、死亡率の上昇や生物異常は見られなかった（図9A-B）。アミグダリン処理したミツバチの腸内細菌組成 (図 9C-D) や存在量 (図 9E) に、未処理のミツバチと比較して有意な変化は見られず、これは他の研究 (Tauber et al., 2020) と一致する。さらに、アミグダリンは MD ハチの死亡率に影響を与えなかった（図 9-図 1）。in vivo実験で使用した濃度は、アーモンド花粉で検出された濃度（〜4 mM）以下であり、低濃度はアーモンド蜜で検出されたもの（〜0.01 mM）に似ている（London-Shafir et al., 2003）。

図9 補足資料1

ミツバチの腸内細菌叢に対するアミグダリン効果。
(A) 実験デザインおよび (B) 異なる濃度のアミグダリンに曝露したミツバチの生存率。(C）ミツバチ腸内細菌種の相対的存在量を示す積み重ねられた列グラフ ... 詳しく見る

ディスカッション
食事性化合物は、宿主酵素だけでなく腸内細菌叢によっても代謝され、毒性の増減をもたらす可能性がある（Koppel et al.、2017）。ミツバチが消費すると、アミグダリンはミツバチの腸内で分解されるが、この分解が宿主または花粉由来のGH（Pontoh and Low, 2002; Ricigliano et al., 2017）経由なのか、微生物叢の活動経由なのかは、これまで不明であった。我々は、ハチの腸内細菌叢のメンバーが、アミグダリンとその中間体であるプルナシンをin vitroで分解できることを発見した。A. mellifera、B. impatiens、A. ceranaからそれぞれ分離したBifidobacterium、Bombilactobacillus、Gilliamellaの特定の菌株は、in vitroでアミグダリンを分解することができました。この経路は、無毒の中間体であるプルナシンの生成につながるケースもあれば、そうでないケースもあった。アミグダリンをプルナシンに分解するのは宿主だけであるが、プルナシンをさらに分解し、毒性のあるシアン化水素を放出するには、腸内細菌から分泌される酵素が必要である。ミツバチに関するこの発見は、ラットにおけるアミグダリンの代謝に関するものと類似しており、アミグダリンは腸内細菌叢が存在する場合にのみ分解され、有毒なシアン化水素を生成するが、細菌叢がない場合や注射した場合は生成しない（Carter et al., 1980）。

ハチの腸内細菌叢の特定のメンバーは、ペクチンリアーゼ（PL）やGHを含む多様な炭水化物消化酵素を産生し、食品加工（Zheng et al., 2019; Zheng et al., 2016; Engel et al., 2012）や解毒（Berenbaum and Johnson, 2015; Koch et al., 2022）に役立っています。例えば、Gilliamella株は、花粉細胞壁からのペクチンやヘミセルロース、花蜜からの有毒糖の代謝に関与したり、ペクチンの消化時に生成されるPLやGHを生成する（Zheng et al., 2016; Engel et al., 2012）。マンノース、アラビノース、キシロース、ガラクトースなど、これらの糖の一部はハチにとって難消化性であり、腸内に蓄積されると毒性を引き起こす可能性があります（Barker, 1977）。ボンビラクトバチルス株とラクトバチルス株は、マンノース代謝に関わる酵素も産生し、この解毒機構に寄与する可能性があります（Zheng et al., 2019; Ellegaard et al, 2019）。興味深いことに、ビフィドバクテリウム株のゲノムは、ハチ腸内細菌叢の他のコアメンバーよりも幅広いGHのレパートリーを保有しているようだが、PL関連遺伝子を欠いている（Zheng et al.、2019）。これらの酵素は基質特異的である傾向があり、機能を確認するためには通常、生化学的アッセイが必要である。本研究では、ビフィドバクテリウム株において、in vitroでアミグダリンとプルナシンの代謝に寄与する特異的なGH3を同定しました。他の研究では、細菌または真菌由来のGH3がアミグダリンを分解することが示されている。例えば、グラム陽性菌のCellulomonas fimiは、アミグダリンの構造に見られる結合と同様のβ-1,6-結合型グリコシド（Gao and Wakarchuk, 2014）に対する活性を有するGH3をコードする（図2D）。Rhizomucor miehei (Guo et al., 2015) およびTalaromyce leycettanus (Li et al., 2018) から分離したGH3、またはAspergillus nigerからの関連細胞外酵素によるアミグダリンの分解も観察されている (Chang and Zhang, 2012) 。さらに、哺乳類腸管関連ビフィドバクテリウム株の異なる種は、GH1またはGH3酵素の産生に起因する可能性があり、アミグダリンの存在下で増殖できる（Modrackova et al.、2020）。

我々の場合、大腸菌を用いたwkB204-GH3（WP_254476944）またはwkB344-GH3（WP_121913979）の異種発現もアミグダリン分解につながったが、その程度は元の宿主で観察されたものよりも小さかった。形質転換大腸菌における分解率の低さを正確に定量化するために、0.1 mMのアミグダリン溶液を使用した（図7）。可能性としては、アミグダリンまたはプルナシンの代謝に寄与するビフィドバクテリウムがコードする他の炭水化物消化酵素が存在するか（図4C）、またはビフィドバクテリウム宿主が大腸菌での異種発現時には達成できないこの酵素に対する特定の翻訳後修飾を行っている（Adav et al., 2014）。さらに、このGH3はビフィズス菌wkB204株から分泌されるようですが、クローニングのために、分泌のためのシグナル配列を持たずに大腸菌で発現させたため、酵素活性の特性評価に最適とはいえない細胞溶解液でアッセイを行ったことがあります。これらの特徴により、もしこのGH3がビフィドバクテリウム株によるアミグダリン分解に関わる主要な酵素であれば、その潜在的な活性を覆い隠してしまった可能性がある。さらに、プロテオミクスデータから他のヒドロラーゼも同定された（図4C）。文献には報告されていないが、これらのいくつかはアミグダリン分解に関与する可能性がある。

他の研究で示されているように、花蜜と花粉の代謝物は、腸を通過する際に化学的に変換される可能性があり、これは宿主および/または微生物叢への影響に影響する可能性があります（Koch et al., 2019; Vidkjær et al., 2021）。アミグダリンの分解に宿主と微生物叢の両方が寄与する可能性を明らかにするため、MDハチと微生物叢を持つハチをアミグダリンに短時間曝露するin vivo実験を実施しました。その結果、MDハチはアミグダリンを分解できるが、部分的にしか分解できず、腸内区画にプルナシンが蓄積されることがわかった。一方、微生物叢を形成したハチや特定のビフィドバクテリウム菌株でモノクロナイズしたハチでは、プルナシンの蓄積は観察されず、アミグダリンの分解は MD ハチと比較してこれらのグループでより高かった。このことは、微生物叢のメンバーがアミグダリンの分解に寄与するだけでなく、プルナシンを効率的に分解し、アミグダリン代謝の最終生成物であるシアン化水素などを放出する可能性があることを示唆しています。シアン化水素は好気性生物に毒性があるため (Khandekar and Edelman, 1979; Hurst et al., 2014) 、アミグダリン副産物のハチや微生物叢への副作用を高める可能性があります。しかし、他の研究と同様に、アミグダリンに曝露したハチについて、死亡率の増加や微生物群集の存在量と組成の変化は検出されず（Lecocq et al., 2018; Tauber et al., 2020）、アミグダリンの現場関連濃度はハチにとって有害ではないことを強く示唆しました。興味深いことに、腸を取り除いたハチの死骸からもアミグダリンが検出され、アミグダリンがハチの細胞によって全身的に吸収されていることが示唆されました。このことは、経口摂取後にハチの血液リンパにアミグダリンが検出された他の研究でも確認されています (Hurst et al., 2014; Vidkjær et al., 2021).

他の動物を用いた研究でも、アミグダリンの分解における微生物叢の役割が検討されています。例えば、ラットを用いた研究では、アミグダリンを経口摂取した後、微生物叢を持つラットの血液中のシアン化水素濃度が、MDラット（Carterら、1980）または抗生物質処理ラット（Newtonら、1981）よりも高いことが分かっています。しかし、アミグダリンの静脈内投与はシアン化水素の生成につながらないようであり（Jaswal and Palanivelu, 2018）、これはアミグダリンを血液リンパに注入した後にミツバチで観察された毒性がないことと相関していると考えられる（Hurst et al., 2014）。これらの研究は、腸内細菌叢が動物の腸内でアミグダリンの分解とシアン化水素の放出を促進する主要な要因であることを示唆しています。

正常な微生物叢によるコロニー形成は、ハチの腸内でpHを約5まで低下させ（Zheng et al., 2017）、低いpHはアミグダリンのプルナシンへの分解、次にプルナシンのマンデロニトリルへの分解を促進し、酸性pHで自然分解を受けてベンズアルデヒドと青酸水素が得られる（Jaswal and Palanivelu, 2018）ことが重要です。したがって、GHの作用を伴わない微生物叢の存在自体が、アミグダリンのプルナシンへの分解を促進し、シアン化水素の生成につながる可能性があると考えられる。

ハチとその固有の微生物相は比較的高用量のアミグダリンに耐えるようだが、ハチの腸に普通に生息する寄生虫はそれほどうまくいかないかもしれない。花蜜や花粉に含まれる代謝物は、場合によっては有毒とされるものであっても、特定の濃度になると寄生虫の負荷を制御または軽減することで花粉媒介者の健康を改善できるという証拠が増えている (Stevenson et al., 2017; Tauber et al., 2020; Costa et al., 2010; Simone-Finstrom and Spivak, 2012; Stevenson, 2020)。実際、ミツバチはコロニーの病原体負荷を軽減する手段として、特定の植物を採食する傾向がある（Simone-Finstrom and Spivak, 2012）。例えば、アミグダリンで処理した巣箱のミツバチは、寄生虫 L. passim といくつかのウイルスによる感染レベルが低下していた (Tauber et al., 2020)。一方、マルハナバチのCrithidia感染については、この寄生虫はアミグダリンに感受性がないため、アミグダリン曝露後もその負荷は減少しない（Richardson et al., 2015）ようです（Palmer-Young et al., 2016）。精油チモールなどの他の植物代謝物は、ミツバチのノセマ胞子負荷を減少させることができる（Costa et al., 2010; Stevenson, 2020）。したがって、保護の程度は、曝露レベルや曝露される寄生虫に依存する可能性がある。

実際、ミツバチ、アリ、ハエ、チョウなどの一部の昆虫は、治療的または予防的な方法で自分自身を薬漬けにするために、広範囲の有毒二次代謝産物を使用できます（de Roode and Hunter, 2019）。ミツバチは通常、寄生虫からコロニーを守るための予防的な投薬行動として、植物樹脂、花蜜、花粉に含まれる二次代謝物を収集します（Simone-Finstrom and Spivak, 2012; Erler and Moritz, 2016; Simone-Finstrom et al., 2017）。同様に、オオカバマダラは寄生虫に対する治療薬として、毒性のあるカルデノライドを高濃度に含む乳草を食べます（Gowler et al.、2015）。オオカバマダラはまた、孵化した子実体における寄生虫の増殖を抑えるために、カルデノライドを高濃度に含む産卵場所を選択したり（Lefèvre et al., 2012）、カルデノライドを卵に移行させたり（Sternberg et al., 2015）して、予防薬としてカルデノライドを使うことがあります。ミバエのいくつかの種は、寄生蜂からの攻撃に抵抗するために、世代を超えた薬物療法を利用している（Poyet et al.、2017）。雌のハエはアルカロイドのアトロピンを含む培地で優先的に排卵し、寄生虫の感染成功率を下げるが、繁殖力も低下させる。

より最近では、いくつかの研究により、植物由来化合物の宿主腸内での活性に注目が集まり、宿主および/または微生物叢によって調節され、最終的な代謝物活性につながる可能性があります（Koch et al., 2019）。最近記載されたヘザー蜜由来の植物代謝物calluneneは、特に作物に寄生虫細胞が存在する場合、マルハナバチのクリチジア感染症を予防する役割を果たすことができる。しかし、calluneneは通常Crithidiaが定着する後腸に到達する前に宿主の代謝によって不活性化されるため、感染宿主では治療の役割を果たすことができません（Koch et al., 2019）。

宿主だけでなくマイクロバイオームも、寄生虫に対する活性に影響を及ぼすいくつかの花蜜代謝物の代謝に大きな役割を果たすことができます。花蜜代謝物のグリコシル化状態はその活性に直接影響し、アグリコンが対応するグリコシル化代謝物よりも高い活性を示す。このことは、シナノキの代謝物であるティリアシドとイチゴの代謝物であるウネドンで観察されている（Koch et al.、2022）。Tiliasideは配糖体であり、Crithidia bombiに対してin vivoでは活性を示すが、in vitroでは活性を示さない。抗寄生虫活性を示すには、腸管通過中に宿主および/または微生物群の酵素による脱グリコシル化が必要だからである（Koch et al., 2022）。一方、ウネドンはグリコシドではなく、C. bombiに対してin vitroとin vivoの両方で活性を有する。興味深いことに、ウネドンはまず中腸で蜂の酵素によってグリコシル化され不活性化され、その後後腸で微生物群によって脱グリコシル化され再活性化されます（Koch et al., 2022）。

他のいくつかの研究では、他の植物代謝物の代謝における微生物叢の役割も調査されている。Kešnerováら、2017は、ビフィドバクテリウム、ボンビラクトバチルス、またはラクトバチルスの菌株でモノクロナイズしたミツバチがフラボノイド配糖体を代謝できることを証明しました。実際、ゲノム解析により、これらの細菌群の菌株のゲノムには、糖残基の切断に関与しうるGHを含む多様な糖質処理遺伝子が含まれていることが示されています（Zheng et al., 2019; Ellegaard et al.、2019）。アミグダリン代謝の菌株変異を発見したが、このような変異は他の食物二次代謝産物の処理に影響を及ぼす可能性が高い。マイクロバイオームにおける菌株レベルの変動は、結果として、寄生虫の持続または定着に影響を与える可能性がある。農薬や重金属によるミツバチの腸内微生物攪乱（Motta and Moran, 2020b; Rothman et al., 2020; Motta et al., 2022b）は、微生物叢による二次代謝物の代謝の変化を通じて、ミツバチ腸内での寄生成功に間接的に影響すると考えられる。

腸内細菌叢と病原体の相互作用は広く存在し、ハチの腸内細菌叢については繰り返し示されている（Raymann and Moran, 2018）。ミツバチでは、コアマイクロバイオータは、RNAウイルス（Dosch et al., 2021）、病原性細菌感染（Steele et al., 2021; Lang et al., 2022）、および微胞子虫寄生虫ノゼマ（Wu et al., 2020）からの保護に寄与する。さらに、例えばノセマによる感染は、マイクロバイオーム異常につながる可能性があります（Paris et al., 2020; Rubanov et al., 2019; Huang et al., 2018）。微生物叢がもたらす保護はミツバチでは一般的であるようだが、その基礎となるメカニズムは一般に不明である。それらは、宿主免疫系（Horakら、2020；Kwongら、2017a）および／または腸内の直接的な微生物相互作用（Steeleら、2017）に関与する可能性があります。アミグダリンに関する我々の研究は、食事成分の微生物代謝が、微生物叢のメンバーが宿主または同居微生物に影響を与えるメカニズムの1つである可能性を示している。

我々の結果は、宿主と微生物叢によって共同代謝される毒素の例としてアミグダリンを用いて、植物毒素の代謝における微生物叢の関連性を示している。アミグダリンの完全代謝がミツバチにもたらす影響はまだ明確ではないが、宿主と微生物の相互作用が有益から中立の範囲にあることを示唆している。現場に関連する濃度のアミグダリンの代謝は、ハチの生存率や微生物叢の構成に影響を与えず、ハチを遠ざけることはない (Tiedeken et al., 2014) 。場合によっては、食餌性アミグダリンは寄生虫やウイルスの負荷を減らすことができる (Tauber et al., 2020; Palmer-Young et al., 2017)。今後の研究では、アミグダリン分解細菌を用いたin vitro実験中、または微生物叢を持つハチと微生物叢を奪われたハチを用いたin vivo実験中に放出されるシアン化水素の量を調査できる。アミグダリンがハチの健康に与える影響については、腸内に放出されたシアン化水素が特定の寄生虫に感染したハチを保護するかどうかを調べる実験によって評価することができる。このような実験的研究により、腸内微生物コミュニティが植物代謝物をどのように代謝し、この代謝が宿主の体力にどのように影響するかがより明らかになる可能性があります。

方法論

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データ提供

参考文献
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決定書
ハウケ・コッホ
英国王立植物園（キュー）、査読編集者
ウェンディ・S・ギャレット
シニアエディター、ハーバード大学T.H.チャン公衆衛生大学院、アメリカ
ハウケ・コッホ
レビュアー：英国王立植物園、キュー、イギリス
(i)読者のためにプレプリントと一緒に掲載されるパブリックレビュー、(ii)著者へのフィードバック（修正依頼を含む）です（下記）。また、編集者がこの論文のどこを面白いと思ったか、あるいは重要だと思ったかを説明するアクセプトサマリーも含まれています。

査読後の決定通知書

論文「Cooperative host-microbe metabolism of a plant toxin in bees」を eLife に投稿していただき、ありがとうございました。あなたの論文は、Hauke Koch氏を査読編集者、査読者#1として含む3名の査読者によって査読され、シニアエディターであるWendy Garrett氏によって評価が監督されました。

査読者は互いのレビューについて議論し、査読編集者はあなたが修正投稿を準備するのを助けるためにこれを起草しました。

本質的な修正

3人の査読者全員が、この原稿は結論を裏付ける説得力のある証拠があり、重要であると考えました。修正要望は以下の通り：

アミグダリンの微生物由来分解の影響について、原稿の一部をより慎重に表現し、宿主の健康への影響を判断するために今後どのような実験を行う必要があるのかを強調した。タイトルや考察の一部で「協力」という言葉やそれに類する表現が使われているのは、修正すべきです。
Results セクションとの冗長性を排除し、文脈やハチ以外の研究との類似性を含むように、考察を修正する。

査読者2（著者への提言）：

宿主の体力に及ぼす可能性のある結果は実に興味深いものであるが、著者らは現在の知見を基にした将来の方向性をうまく指摘している。最も興味深いのは、シアン化水素のような潜在的に毒性のある分解生成物が、病原体の感染から保護することが提案されていることである。この点については、より多くの文脈が必要であり、ミツバチ以外の研究との類似性が強調される可能性があると思う（de Roode and Hunter, 2019を参照）。最後に、考察のいくつかの段落は、結果セクションと重複しており（387～396行目など）、明瞭さに影響を与えることなく合理化することができます。この原稿は、植物毒素の共生生物媒介分解に関する我々の理解に素敵な事例を追加する、読んでいて楽しいものでした。

査読者#3（著者への推薦文）：

この原稿は、アミグダリンの菌株特異的な代謝を実証し、解剖することに成功しており、楽しく読ませていただきました。

特に、さまざまな分解産物がミツバチに与える健康への悪影響や有益性を明確に示すものはなく、アミグダリンとその代謝産物を代謝する能力を持つ株は限られているため、寄生虫耐性に関する適応的価値の議論は、過度に推測の域を出ないと思われる。これは偶然や別のプロセスの産物ではないのでしょうか？

例えば、生存率に関する用量反応曲線のアプローチを使用するなどして、微生物叢の完全なハチと自由なハチにおけるさまざまな分解生成物の影響を明確に示すことができれば、この結果の解釈に大きなプラスになると思います。

https://doi.org/10.7554/eLife.82595.sa1
著者からの回答
本質的な修正：

著者からの回答：3 名のレフェリー全員が、この原稿は結論を支持する説得力のある証拠があり、重要であると考えた。修正依頼は以下の通り：

アミグダリンの微生物由来分解の影響について、原稿の一部をより慎重に表現し、宿主の健康への影響を判断するために今後どのような実験を行う必要があるかを強調した。タイトルや考察の一部で「協力」という言葉や同様の表現が使われているのは、修正すべきです。

微生物による分解がハチの健康に及ぼす影響について、ハチにとっての利益に関する不当な結論を避け、その意味を明確にした (326-333、399-402 行、追加の図 9 - 図補 1)。

さらに、ハチと微生物群の相互作用に関する他の研究との関連でこの研究を位置づけ、アミグダリンの分解がハチの健康に及ぼす影響を調査するための今後の実験の可能性について議論するため、2 つの段落を追加した (474-497 行目)。

ここでは「協力的」がなじまないことに同意し、タイトルから「協力的」という言葉を削除し、議論中の一例（485行目）で「共同して」に置き換えた。

Resultsセクションとの冗長性を排除し、文脈と非ビー作品との類似性を含むように議論を修正した。

Results」セクションとの重複をなくし、査読者から提案されたように、他の宿主-微生物系に関連する文脈を追加するために、議論を再編成した（336-349行、432-443行、451-4561行）。

査読者#2（著者への提言）：

宿主の体力に及ぼす可能性のある結果は実に興味深いものであるが、著者らは現在の知見を基にした将来の方向性をうまく指摘している。最も興味深いのは、シアン化水素のような潜在的に毒性のある分解産物が、病原体の感染から保護することを提案していることである。これは、より多くの文脈が必要であり、ミツバチ以外の仕事との類似性が強調される可能性があるところだと思う（de Roode and Hunter, 2019を参照）。

このコメントに同意し、二次代謝産物が他の昆虫に与える保護に関する議論を追加しました（432～443行目）。

最後に、考察のいくつかの段落は、Resultsセクションと重複しており（387～396行目など）、明瞭さに影響を与えることなく合理化することができます。

我々はこれに同意し、結果の繰り返しを避けるため、考察を再編成した。

この原稿は、植物毒素の共生生物による分解に関する我々の理解に、素晴らしい事例を追加するものであり、読んでいて楽しいものでした。

ありがとうございました！

査読者#3（著者への推薦文）：

この原稿は、アミグダリンの株特異的な代謝を実証し、解剖するのに良い仕事をしており、楽しく読ませていただきました。

ありがとうございます！

特に、さまざまな分解産物がミツバチに与える健康への悪影響や有益性を明確に示すものはなく、アミグダリンとその代謝産物を代謝する能力を持つ株は限られているため、寄生虫耐性に関する適応的価値の議論は、過度に憶測に基づくものだと感じます。これは偶然や別のプロセスの産物ではないのでしょうか？

アミグダリンの分解がハチの腸内で偶然に起こるとは考えていませんが、例えば、追加の炭素基質として使用するなど、単に微生物自身の利益のために起こる可能性があることには同意します。ハチへの適応的価値が示唆されないよう、多くの箇所で表現を変更した。

試験管内実験でアミグダリンを分解できる菌株は限られた数しか検出されませんでしたが、これは主に、実験室で入手できる限られた数の菌株しかテストしなかったためです。さらに、半定形培地で培養できたのは一部の株だけで、GilliamellaとLactobacillus nr. melliventrisの株は豊富な培地で培養する必要があったため、アミグダリンを分解する可能性が隠されていた可能性があります。今回の in vivo 実験では、本来の腸内細菌叢がアミグダリンとプルナシンの両方を分解できることが示されましたが、これは微生物叢を失ったハチでは分解されなかったものです。このことは、多くのハチ、あるいはすべてのハチの在来株の多様性にアミグダリンを分解する能力が含まれていることを示唆している（図 8 の CV 型ハチ対 MD 型ハチ）。

微生物相が完全なハチとそうでないハチにおいて、さまざまな分解産物の影響を明確に示すことができれば、例えば生存率に関する用量反応曲線アプローチなどを用いて、この結果の解釈に大きな影響を与えることになると思います。

アミグダリンの分解がハチに及ぼす影響を完全に理解するためにさらなる研究を行うべきであることに同意し、484-497 行でその背景を説明した。また、アミグダリンの現場関連用量は、微生物叢のないハチや微生物叢のあるハチの生存率に影響しないことを示す追加結果を掲載した (図 9 -図解サプリメント 1).

https://doi.org/10.7554/eLife.82595.sa2
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