大気中水素からのバクテリアによるエネルギー抽出の構造的基盤

2023年3月9日 13:16

オープンアクセス
発行：2023年3月8日
大気中水素からのバクテリアによるエネルギー抽出の構造的基盤

リース・グリンター
アシュリー・クロップ
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クリス・グリーニング
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337 Altmetric（アルトメトリック
メートル法詳細
アブストラクト
多様な好気性細菌は、大気中のH2をエネルギー源として増殖・生存する1。この世界的に重要なプロセスは、大気の組成を制御し、土壌の生物多様性を高め、極限環境における一次生産を促進する2,3。大気中のH2酸化は、[NiFe]ヒドロゲナーゼスーパーファミリーの未同定メンバーによるものと考えられています4,5。しかし、これらの酵素が、触媒毒である酸素が周囲に存在する中で、ピコモルレベルのH2を酸化するという並外れた触媒的課題をどのように克服し、得られた電子がどのように呼吸鎖に伝達されるかは、依然として未解明である1。今回、我々はMycobacterium smegmatisヒドロゲナーゼHucの低温電子顕微鏡構造を決定し、その機構を検討した。Hucは、大気中の水素を酸化して呼吸電子伝達物質メナキノンを水素化する、非常に効率の良い酸素非感受性酵素である。Hucは、疎水性の狭いガスチャネルを使って、酸素を犠牲にして大気中のH2を選択的に結合し、3つの[3Fe-4S]クラスターが、大気中のH2の酸化がエネルギー的に実行可能なように酵素の特性を調節している。Hucの触媒サブユニットは、833 kDaの8量体からなる複合体を形成し、膜に結合したストークを中心に、メナキノンを膜から94 Å輸送し還元する。これらの結果は、生物地球化学的、生態学的に重要な大気中のH2酸化過程のメカニズム的基礎を提供し、長距離キノン輸送に依存するエネルギー結合様式を明らかにし、大気中のH2を酸化する触媒の開発への道を開くものである。
主な内容
土壌による大気中の水素（H2）の酸化は、大気の酸化還元状態を形成する重要な生物地球化学プロセスである1。最近まで、これは生物学的プロセスであると考えられていたが、現在では、少なくとも9つの系統の多様な好気性細菌が大気中のH2を酸化し、合わせて年間大気から除去されるH2全体の75%（約60 Tg）を占めることが認識されている1、4、6。大気中のH2酸化は、栄養が限られた土壌環境において細菌に補助的なエネルギー源を提供し、混合栄養的に成長するか7,8,9,10,11、あるいは大気だけで長期間休眠しながら生存することを可能にします2,4,6, 12,13,14,15. 例えば、マイコバクテリウムの細胞やストレプトマイセスの胞子は、好気性呼吸鎖を通じて電子を大気中のH2からO2へと移動させることで飢餓状態を生き延びる（文献7,14,16,17）。大気中のH2を酸化する能力は、様々な環境の細菌に広く見られ2、超乾燥地の極地土壌のように、主に大気中のエネルギー源によって駆動されている生態系もあるようだ1, 2, 3, 15.
大気中のH2を酸化する化学触媒は知られておらず、触媒毒であるO2を高濃度（21%）に含む大気中で低濃度の基質（530ppbv）を選択的に酸化する必要がある（参考文献18,19）。グループ1 [NiFe] ヒドロゲナーゼは、膜結合型のH2酸化金属酵素で、H2が豊富な環境での細菌の好気的・嫌気的成長を支える。しかし、これらの酵素は、H2に対する親和性が低く（ミカエリス定数（Km）>500 nM）、O2によって可逆的または不可逆的に阻害されるため、一般に大気中のH2酸化ができない（文献20、21、22、23、24）。近年、大気中のH2由来の電子を好気性呼吸鎖に入力する、グループ1および2の[NiFe]ヒドロゲナーゼの高親和性系統がいくつか同定された3, 4, 5, 6。全細胞の研究から、これらの酵素はH2に対する見かけの親和性が著しく高く（Km値30〜200 nM）、O2による阻害に鈍感であることが示唆されている（文献4,6,10,25,26）。しかし、これらのヒドロゲナーゼはまだ単離されていないため、どのようにしてH2を選択的に酸化し、O2への曝露に耐え、電子伝達鎖と相互作用するように進化してきたかは不明である。特に、大気中のH2を酸化するヒドロゲナーゼは、もともと高い親和性を持っているのか、それとも呼吸鎖との相互作用によって親和性が調節されているのかについては議論がある1,23.
このような知識のギャップを解決するために、我々は好気性細菌M. smegmatisにおける大気中のH2酸化の構造的および機構的基盤を調査した。この細菌は、系統的に異なる2つのヒドロゲナーゼ-Huc (group 2a)とHhy (group 1h)-を持っており、どちらもH2を大気圧以下のレベルまで酸化する4, 17, 26. 我々は、M. smegmatisからHucを直接単離し、大気中のH2を酸化する構造および生化学的根拠を明らかにした。
Hucは大気中のメナキノン類縁体を還元する
我々は、染色体上にコードされたStrep-tag IIをHucSサブユニットに用いて、M. smegmatisからHucを分離した。SDS-PAGEによる解析の結果、HucはHucL（約58 kDa）、HucS-2×Strep（約39 kDa）、および未知の第3のサブユニット（約18 kDa）に相当する3つのタンパク質サブユニットで構成されていました（拡張データ図1a）。質量分析により、この第3のサブユニットは、hucS17の直上流のhucオペロンのオープンリーディングフレームにコードされる未知のタンパク質MSMEG_2261であることが判明した（Extended Data Fig.1b）。MSMEG_2261は、大小のヒドロゲナーゼサブユニットと共精製されたことから、Huc複合体の追加構成要素であると考えられ、これをHucMと命名した。M. smegmatis細胞溶解液中のHucについて以前に観察されたように、精製されたHuc複合体はネイティブゲル上で約800-900 kDaの分子量で移動した（Extended Data Fig. 1c）26。Hucは、複数の金属クラスターが存在することから赤褐色をしており、室温で非常に安定で、融点は78.3℃である（Extended Data Fig.1d）。Huc複合体におけるHucMの役割を調べるため、M. smegmatisからhucM遺伝子を欠失させた。細胞溶解液の活性染色から、この変異体ではHucは活性を示すが、高分子量種は存在しないことがわかり、HucMがHucオリゴマーの形成に重要であることが示唆された（Extended Data Fig.1e）。
Hucは全細胞で大気中のH2を酸化できるが、もともと高い基質親和性を持っているのか、それともこの性質が呼吸電子輸送鎖との結合に起因しているのかは不明であった4。この疑問を解決するため、我々は精製Hucが大気中のヘッドスペースで3〜100ppmのH2を酸化する能力をテストした。Hucは、ニトロブルーテトラゾリウム（NBT）またはキノン類縁体のメナジオンを電子受容体として、ガスクロマトグラフの検出限界以下（約40ppbv）までH2を急速に消費した（図1a、bおよび拡張データ図1f）。一方、Escherichia coli27,28のモデル的なO2耐性第1d族[NiFe]ヒドロゲナーゼHyd1は、この条件下でよりゆっくりと作動し、H2を4ppmv以下に酸化することができなかった（図1bと拡張データ図1f）。精製Hucの速度論的解析から、Hucは大気中のH2を酸化するのに適応しており、高い親和性（Km = 129 nM）と低いH2閾値（<31 pM）を持つが回転は遅い（触媒定数（kcat） = 7.05 s-1）ことがわかった（図1a、d、補足表1）。Hucのkcat/Kmは5.4 × 107 M-1 s-1であり、この酵素が低H2濃度で高効率であることを示している。精製Hucの動態は、Hucを唯一のヒドロゲナーゼとして保有するM. smegmatis変異体の動態（Km = 184 nM, threshold = 133 pM）と似ており、ヒドロゲナーゼ自体が全細胞のH2親和性を決定する主要因であることを示唆している4. また、Hucが大気中の低濃度でH2を酸化する能力は、O2による阻害に対して高い耐性を持つことを示す。そこで、HucのO2耐性を評価するため、0%、10%（約0.12 mM）、100%（約1.2 mM）の飽和O2を含むバッファー中でH2酸化速度をアンペロメトリックに測定した。その結果、酸素濃度を変化させてもHucが介在するH2酸化の速度や親和性に大きな違いは見られなかったことから、Hucは酸素に鈍感な酵素であることがわかった（図1c）。代替電子受容体がない場合、O2はHucによるH2酸化を刺激する（図1d）。これは、この酵素がO2に直接電子を移動できることを示している。
図1: Hucは高親和性O2非感受性ヒドロゲナーゼである。
a, 200μMのメナジオンを電子受容体とし、Hucまたは酵素を含まない密閉バイアル瓶のヘッドスペースのH2濃度をガスクロマトグラフィーで分析した値。Hucは、大気中濃度（紫線）以下のH2を検出限界（緑線）まで酸化する。c,200μMメナジオン（0%O2は微量のO2を含む脱気したバッファーを指す）を添加した、O2飽和率の異なるバッファーの中でのHucによるH2酸化のミカエリス-メンテンキネティクス。d,脱気したが微量のO2を含む、電子受容体の異なるバッファーの中でのHuc H2 消費のミカエリス-メンテンキネティクス。Vmaxは最大速度。 e, 100%H2雰囲気下でのHucタンパク質固定化膜のサイクリックボルタモグラム。Eonsetは4回の実験の平均から求めたHucのオンセット電位である（わかりやすくするために代表的な1本の曲線を示す）。 ηは2H+/H2レドックスカップル電位と比較した推定Hucオーバーポテンシャル（ ({E}{2{rm{H}}^{+}/{{rm{H}}{2}}^{0}^{{prime} }} ）。ベンジルビオローゲン({E}{{rm{BV}}^{2+}/{{rm{BV}}{cdot }^{+}^{0}^{{prime} }})及びメナキノン({E}{rm{MQ}}/{{}rm{MQH}}{2}}^{0}^{prime} }})の中点電位は示している。SHE、標準水素電極。 f、アルゴン、N2、および指示されたレベルのH2からなる混合ガスをヘッドスペースに流して固定化したHucタンパク質フィルムのサイクリックボルタモグラム。破線の縦線は、2H+/H2カップルの電位とHucのオンセット電位を示し、常圧で5%のH2について計算した。スキャンは低H2から高H2の順で記録された。挿入図は、低H2分圧でのHucの電圧応答の拡大図である。
出典データ
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M. smegmatis細胞では、HucによるH2酸化の電子は、マイコバクテリアの主要な呼吸キノンであるメナキノンの還元を経て呼吸電子伝達系に入るが26、この還元が直接起こるか未知の膜タンパク質中間体を経由するかは不明である。メナキノンがHucの直接的な電子受容体であるかどうかを調べるため、メナキノンの酸化還元頭部を表すメナジオン、あるいは酸化還元活性を持つ色素NBTやベンジルビオロゲンを電子受容体として、その酵素の動態を測定した。メナキノンが生理的な電子受容体として働くことと一致し、Hucは、中点電位が同程度にもかかわらず、メナジオン（E 0′ = -74 mV）を電子受容体とした場合、NBT（E 0′ = -80 mV）よりもはるかに高い最大速度を示した29,30（図1dと補足表1）。低電位電子受容体であるベンジルビオロゲン（E 0′ = -374mV）は、緩衝液コントロールと比較してH2の酸化を誘導しなかったことから、Huc31から電子を受容しないことがわかった（Fig. 1d）。これは、低濃度でH2を酸化するHucの役割と一致する。周囲条件下では2H+/H2酸化還元カップルの酸化還元電位が高いため（E 0′ = -136 mV）、低電位の基質の還元はできないからである。このことは、Hucがより高い酸化還元電位に同調していることを示唆している。
Huc活性の電位依存性を調べるために、Huc膜のH2分圧を広範囲に変化させてサイクリックボルタンメトリーを行った（図1e、f）。低濃度のH2分圧では、10ppm H2までバックグラウンドの容量電流を上回る電極触媒電流が観測された（図1f）。Hucは、試験したH2分圧の範囲において、255±10mVのオーバーポテンシャルを維持した（Extended Data Fig.2a）。例えば、メナジオン還元がH2による基質飽和に近い1μM H2では、Hucの測定したオンセット電位（Eonset）は-80 mV ± 10 mVで、メナジオン電位（E 0′ = -74 mV）のちょうど負に位置し、これ自体が酸化種と還元種の比に敏感であると考えられる。これは、低濃度でH2を酸化するHucの役割と一致し、より低い電位の電子受容体よりもメナキノンの還元に選択性をもたらすと思われる。Hucは、これまでに記録された[NiFe]ヒドロゲナーゼの中で最大のオーバーポテンシャルを示した27,32,33,34（Extended Data図2b,cで大腸菌Hyd1およびHyd2との比較を参照）。HucによるH+還元に起因する有意な電流は観測されず、この触媒的不可逆性は、H2酸化に対する酵素の高いオーバーポテンシャルと一致している（図1e）。H2濃度が高い場合、Hucは他の[NiFe]ヒドロゲナーゼに特徴的な酸化的不活性化や還元的再活性化の証拠を示さないが（Extended Data Fig. 2b、c）、H2 0.5% でわずかに再活性化のピークが見られた（図1eの挿入図の星印で示した）。
Hucは中央の茎を中心にオリゴマー化する
Hucの構造を決定するために、精製した833 kDaの複合体の低温電子顕微鏡（cryo-electron microscopy）イメージングと単粒子再構成を行った。クライオ電子顕微鏡写真とその結果のクラス平均から、四つ葉のクローバーのような形をした分子が見つかり、茎のような突起を介して膜小胞に結合していることがわかった（拡張データ図3a、b）。精製に用いたHuc過剰発現株（詳細は方法参照）では、Huc活性は主に可溶性画分に会合しているが、これまでの報告では、Hucは主に細胞膜に会合することが示されており4,26、今回のサンプルに膜会合型Hucが存在したことと一致する。Huc複合体の3次元再構築により、2.19Åの解像度でマップが得られ（拡張データ図3c-eおよび拡張データ表1）、Hucの4つのローブはそれぞれ、HucSとHucLサブユニットからなる2つのHucプロモーターからなることが示された（図2a）。4つのHucローブは、細長いα-ヘリカルタンパク質であるHucMの4分子で形成される足場に結合し、それらが絡み合ってかご状の構造を形成している（図2bおよび拡張データ図4a、b）。この複合体は柔軟性があるため（拡張データ図3f、補足動画1）、2つのデータセットから個々のHucローブの3D再構成を行い、1.52 Åと1.67 Åの分解能を得た（図2c、拡張データ図4c、d、拡張データ表1、補足図2、3）。HucSLヘテロ二量体は、他の[NiFe]ヒドロゲナーゼと類似しており、Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F (Protein Data Bank (PDB) ID = 4U9H) と Cupriavidus necator H16 (PDB ID 5AA5) のヒドロゲナーゼとの平均平方根偏差 (rmsd) がそれぞれ 3.7Å と 2.8Å である 23,24. 一貫して、[NiFe]活性部位の構造は、既報35と同じである（図3a）。HucSの3つの鉄硫黄クラスターの密度マップと第4配位残基は、それらがすべて[3Fe-4S]配置であることを示している（図3b、拡張データ図5a、補足動画2-4）。このことは、Hucの電子常磁性共鳴（EPR）分析によって裏付けられ、複数のスピン結合した[3Fe-4S]クラスターの存在に一致するシグナルが得られ、その酸化還元活性が示された（図3c、拡張データ図5b、補足注1）。これは、酸素耐性変異体を含む他の特徴的なヒドロゲナーゼが1つ以上の[4Fe-4S]クラスターを持つのと対照的である21,35。[3Fe-4S]クラスターは、一般に[4Fe-4S]2+/+クラスターよりも約+250 mV高い電位で+/0酸化還元転移を起こす36。他のヒドロゲナーゼでは、電子伝達鎖の電位が触媒のバイアスを決定することが以前に示されているので、Hucの[3Fe-4S]クラスターだけの存在は、おそらく酵素のオーバーポテンシャルを調整する上で大きな役割を担っている37。
図2：Hucは、HucS、HucL、HucMからなる833kDaのオリゴマーを形成している。
a, Hucオリゴマーの低温電子顕微鏡密度マップ。4つのローブにそれぞれ2つのHucSL二量体があり、中央に位置する4つのHucMサブユニットがオリゴマーの足場として機能している。Hucの1つのローブは1.52Åの高解像度マップを示し、HucLとHucSのサブユニットは示されたように個別に色付けされている。b, 4つのHucMサブユニット（残基20から79）によって形成される中央の4量体を漫画で表現したもの。e, HucMのC末端領域（残基80から189）のAlphaFold2モデルを漫画で表したもので、4量体のコイルドコイル管を形成していることがわかる。 f, HucM C末端の低温電子顕微鏡構造とAlphaFoldモデルから再構成されたHuc複合体を、茎領域の低温電子顕微鏡密度マップにフィッティングした漫画の表現である。
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図3: Hucは大気環境下で非阻害性Ni-B状態をとり、触媒クラスターへのO2拡散を抑制する。
a, 大気下でのHuc [NiFe]クラスターの立体図。 b, 3つのHucS [3Fe-4S]クラスターの構造。 c, Hucの高温（30K）EPRスペクトル。酸化状態（Huc-Air）およびH2還元状態（Huc-H2）で分離されている。g = 2.03 (gはランデ係数) の等方性シグナルは、酸化した [3Fe-4S]+ クラスターに関連するもので、Huc-H2 ではクラスターが還元され消失することがわかった。d,大気中で分離した酸化HucのFTIRスペクトル。酵素の[NiFe]活性部位がNi-B状態と一致する酸化状態をとっていることがわかる。 e,Huc[NiFe]活性部位。Ni-B状態の水酸化配位子とクラスターのNiおよびFeイオンとの相対距離を示している。f, HucSL二量体。[NiFe]活性部位への基質アクセスを提供する疎水性ガスチャネルの位置と幅を示す。 g, 左は距離対時間のプロット。H2存在下のHucSLの分子力学シミュレーションでH2とHuc [NiFe]活性部位間の距離が最も近いことを示す。右は、H2分子が活性部位に最も接近したときのシミュレーションフレームの代表的なサブセットにおけるH2分子の位置。 hはgと似ているが、O2存在下で行われたHucSLのシミュレーションにおけるHuc [NiFe] サイトに対するO2の位置を示す。 iは、HucL D-His166と近位および中位 [3Fe-4S] クラスター、未知のリガンドの位置の近さを示す。a,b,iのクライオ電子顕微鏡密度ポテンシャルマップは、5σで透明な青面として示されている。
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HucMの188個のアミノ酸のうち、低温電子顕微鏡の密度マップにモデル化できたのは20-79残基だけで、密度の拡散はHucMの残りのC末端領域が茎状の突起を形成していることに対応していた。この領域の構造をよりよく理解するために、この領域をマスクし、残りのHuc構造に対してシグナルサブトラクションを行い、その後、焦点を絞った精密化と3次元分類を行いました（拡張データ表1および補足図4）。この処理により、HucMのC末端領域は、Hucオリゴマーの本体と膜をつなぐチューブを形成していることがわかった（図2dおよび拡張データ図4e、g）。AlphaFoldモデリングによると、このチューブは、4つのHucM分子からなるα-helicの対称的なコイルドコイルからなり、Hucの中心で部屋を囲んでいる（図2eと拡張データ図4f、g）。これらのα-ヘリックスは、疎水面を内側に向けた両親媒性であり、チューブ全体を疎水性残基で覆っている（Extended Data Fig.4h）。チューブと膜のリン脂質ヘッドグループとの相互作用は、アルギニン、リジン、トリプトファン残基を含むチューブ末端の外向きのヘリックスによって促進される（Extended Data Fig.4i）。HucM四量体のモデルをHucストークのマップにドッキングさせることで、完全なHuc複合体の構造を解明した（図2fおよび補足動画5）。
ユニークな特徴により、環境下でのH2触媒反応が可能になる
Hucは本来、大気圧以下の濃度でH2を酸化することができ、O2による阻害にほとんど影響を受けない（図1c）。これはヒドロゲナーゼとしては驚くべきことであり、好気的条件下でH2を酸化する生体触媒の開発にとって非常に望ましいことである38,39。Hucは逆電子流を利用して活性部位に結合したO2をH2Oに還元することができるが、4個の電子を迅速に移動させるための近位[4Fe-3S]クラスターを持たないため、これまでに報告されているO2耐性ヒドロゲナーゼ（例えば、大腸菌 Hyd-1 ）のように振舞うことはできない（補足注2）。他のいくつかのヒドロゲナーゼ23,41と同様に、HucS2L2二量体の遠位Fe-Sクラスターは電子伝達距離内にあり（図2cと3b）、隣接する二量体サブユニットによるH2酸化から結合O2を減らすための電子源を提供できる（参考文献23、41）。しかし、Hucは、O2がH2の400万倍も存在する大気圧下で活動するため（文献18,19）、H2酸化だけでHuc二量体を十分に還元し、結合したO2を持続的に置換できるとは考えにくく、酵素はさらなるメカニズムでO2阻害に対抗しなければならない。また、Hucの疎水性ガスチャネルを解析したところ、活性部位へのH2アクセスは、構造的に特徴付けられたO2感受性およびO2耐性[NiFe]ヒドロゲナーゼのそれよりも明らかに狭いことがわかった（図3f、拡張データ図6a、補足表2）。その代わり、C. necator23のO2非感受性だが低親和性のグループ1h [NiFe]ヒドロゲナーゼと同様の幅を持っている（補足表2）。これらのチャネルがHucの活性部位からO2を立体的に排除する役割を持つかどうかを調べるため、HucSL二量体の全原子分子動力学シミュレーションを水に溶かした過剰なH2とO2の存在下で実施した。このシミュレーションでは、H2がHucの活性部位に入るのに対し、O2は活性部位と酵素表面の間にある一連のボトルネックによって立体的に排除され、触媒クラスターに5Å以上近づくことはなかった（図3g、hおよび拡張データ図6）。このシミュレーションから、O2に対する選択の臨界点は、活性部位入口の直前にある3つのガストンネルが収束した後のボトルネックであることが示唆された。この観察結果を裏付けるように、このボトルネックを解消する変異を持つHuc変異体のシミュレーションでは、O2が活性部位に到達した（拡張データ図7および補足注3）。このことは、以前[NiFe]ヒドロゲナーゼで提案されたように42、Hucのガスチャネルが[NiFe]-クラスターをO2による不活性化から守る役割を担っていることを示唆する。
疎水性の狭いガスチャネルは、速度論的には酸素よりも水素の拡散に大きく有利であるが、フーリエ変換赤外分光（FTIR）分析および低温電子顕微鏡構造から、大気中で分離したHucの活性部位は、水酸化物配位子を架橋して酸化状態にあることがわかった（図3a、dおよび補足説明2）。FTIRの振動数は、電子不足のNi-B種と一致している（拡張データ図8a,b）。このことは、空気に触れたHucのEPRスペクトルでさらに裏付けられ、正規のNi-B種32によく似たひし形のシグナルを示した（拡張データ図5c,dおよび補足注1）。このNi-B状態をもたらすO2による酵素の酸化は、おそらく間接的な経路で起こり、O2非依存的なNi-B状態の形成を示す先行研究43,44と一致している。FTIRスペクトルはこの仮説を支持する。還元型Hucを20%O2を含む雰囲気に曝すと、Ni-RとNi-Cを犠牲にしてNi-SI状態が急速に出現し、その後水酸化物結合型のNi-Bがゆっくりと現れる（Extended Data Fig.8e、fおよび補足注2）。
Hucの高親和性動態は、より高速な低親和性酵素である傾向がある、より古典的な酸素感受性ヒドロゲナーゼとは根本的に異なる4,45 (Fig. 1d)。HucとO2感受性ヒドロゲナーゼの[NiFe]活性部位を取り巻く環境を比較すると、これらの酵素の分岐した特性を容易に説明できるような違いはなかった（Extended Data Fig.）このことは、[NiFe]活性部位の全体的な活性は、代わりに小サブユニットの鉄-硫黄クラスターや酵素の他の領域の特性の変化から生じることを示している。Hucで同定された修飾されたガスチャネルは、その明確な構造から、H2分子を選択的に捕捉して活性部位に送り込み、速度を低下させるが酵素の親和性を高める役割を担っているのかもしれない42。さらに、Hucの酸化還元電位（Eonset ≈ -80 to -160 mV）（図1e,f）は、pH7での酸化還元電位（Eatm）が -0.134 mVであり、最小オーバーポテンシャル46（Eonset ≈ -360 mV）で働く低親和性変異体と比較して、大気中のH2酸化は熱力学的に有利であることを意味します。Hucの近位クラスターと内側クラスターの酸化還元特性は、HucLの166位にある低温電子顕微鏡マップに示されたヒスチジンの珍しいD-異性体によってさらに変化する可能性がある（拡張データ図9d、補足動画6と7）。他のヒドロゲナーゼでは、この位置にL-異性体のヒスチジンが保存されており、そのイミダゾール頭部は近位の[Fe-S]クラスターと相互作用する（Extended Data Fig.9e）。Hucでは、His166も近位クラスターと相互作用するが（図3i）、D-異性体配置では、His166の骨格カルボニルの位置が移動し、内側クラスターの近くにある高配位リガンドと相互作用する（図3iおよび拡張データ図9f）。この配位子を特定することはできなかったが、その細長い密度は水ではないことを示唆しており、内側の[3Fe-4S]クラスターの酸化還元電位を調整する役割を担っている可能性がある。
Hucは内部でメナキノンを還元する
HucのEMマップを解析すると、各Hucプロトマーの遠位[3Fe-4S]クラスター付近にさらなる密度があり、これはメナキノンとして明確にモデル化できた（図4a、b、補足動画8）。これと一致して、β-ジヒドロメナキノン-9は精製Hucと96.2%の占有率で結合していることが質量分析で確認された（図4eおよび補足的図5）。メナキノンの頭部は、その酸素基とTyr301の末端水酸基およびLys212の骨格カルボニルとの間の水素結合、およびHucSのTyr229とのπ-π相互作用によって安定化されている（図4c）。1.67Åの再構成では、Tyr229はメナキノンに対応する密度と衝突する第二のコンフォメーションをとり、近接する[3Fe-4S]クラスターを溶媒から遮蔽し、メナキノンがない場合に活性酸素種の形成につながる酸素還元を緩和すると考えられる（図4dおよび補足ビデオ9）。これらのデータは、Hucが直接メナキノンと結合して還元することを示し、メナジオンがHucにとって好ましい電子受容体として働くことと一致する（図1c）。これは、グループ1 [NiFe] ヒドロゲナーゼの観察結果と対照的で、小さなサブユニットは触媒的な役割を果たすことなく電子の中継役となっている20, 21, 22, 23, 24.
図4：Hucは膜からメナキノンを抽出し、直接還元する。
a, Hucオリゴマーの低解像度クライオ電子顕微鏡再構成図から、Hucに結合したメナキノンに対応する密度。 b, Huc二量体の高解像度クライオ電子顕微鏡マップから、結合したメナキノンに対応する密度を示す。メナキノン尾部の密度は、マスキングと対称性の平均化により、これらのマップにはない。 c. [3Fe-4S]遠位クラスターの電子伝達距離内にあるHucSサブユニットによるメナキノン頭部基の配位。 d. 高解像度Huc低温電子顕微鏡密度マップにおいてHucSのTyr229で観察された2つのコンフォーメーション。Tyr229は、メナキノン存在下で開いた状態（上）と、メナキノン結合と排他的な閉じた状態（下）をとる。 e. 精製Hucからのフォルチ抽出物の高速液体クロマトグラフィー-質量分析（LC-MS）分析。ベースピーククロマトグラム（左）は、m/z = 804.66455のイオン（右）に対応する24.6分の実質的なピークを示し、これはβ-ジヒドロメナキノン-9のアンモニウム付加体、m/z = 804.66531 （下）と一致する。 f, 中央空洞Hucのハイブリッドスティックと静電表面表現で、チャンバの表面が疎水性残留物で並んでいることがわかる。h, HucM C末端チューブの上から見た図。チューブの内部は疎水性残基で覆われており（左）、メナキノン分子を収容できる（右）。 i, Hucによるメナキノンの還元モデル。大気中のH2の酸化から得られる電子を使用。
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しかし、HucがH2酸化から呼吸器キノンに直接電子を供与するという強い証拠にもかかわらず、Hucは一体型膜タンパク質ではないため、疎水性の高い膜結合型メナキノンは、膜表面から94Å離れた基質結合部位に輸送される必要があります。Hucオリゴマーの構造を解析したところ、このようなメカニズムが考えられることがわかった。Hucの内部空洞の内面は、HucSとHucMの疎水性側鎖で覆われており、メナキノンや他の疎水性分子の結合を促進し、メナキノンを収容できる寸法を持っている（図4f-h、拡張データ図4hおよび補足ビデオ10）。疎水性チャンバーへのメナキノンの出入りのための導管は、おそらく膜に結合しているHucストークによって提供されている。全体として、メナキノン分子はおそらくこの管を通ってHuc疎水性室に拡散し、そこで基質受容部位に結合してメナキノールに還元された後、再び膜に拡散し、そこでシトクロムbcc-aa3酸化酵素末端酸化酵素によって酸化されてプロトン運動力を発生する26 (図4i). ヒドロゲナーゼの中でも、このキノン還元機構はHucに特有のもので、構造的に特徴づけられる他の呼吸性ヒドロゲナーゼは、膜に内在するシトクロムbサブユニットへの直接電子伝達を介して膜内でキノンを還元する28。しかし、呼吸鎖複合体Iの還元機構には、キノンを膜から約30Å取り出し、可溶性アーム内の[4Fe-4S]クラスターによる還元を行うという類似点がある。しかし、複合体I47、48では、この取り出しは、Huc47で観察される広い疎水性の管や部屋ではなく、閉鎖的なチャンネルを介して行われる。
結論
大気中に存在する微量のH2を利用するために、微量ガス捕捉細菌の[NiFe]ヒドロゲナーゼは、H2が豊富な低酸素または無酸素条件下で機能する対応するものと比べて、異なる特性を必要とします4、35。我々は、好気性細菌M. smegmatis由来のHucの生化学的および電気化学的特性解析を行い、酸素不感受性とH2への高い親和性という必要な特性が、細菌細胞内の他のプロセスとの結合によって生じるのではなく、このヒドロゲナーゼに固有であることを明らかにした。さらに、Hucの低温電子顕微鏡構造、分子動力学シミュレーション、FTIRおよびEPR分光法を用いて、活性部位から少なくとも部分的に酸素を排除することが、この酵素の酸素不感受性に寄与することを強く立証した。また、Hucの電気化学的なオーバーポテンシャルが大きく、微量のH2を酸化し、生じた電子を呼吸補酵素であるメナキノンに直接供与するために、Hucがユニークに調整されていることが示された。さらに、Hucが非常に珍しいユニークなメカニズムでメナキノンにアクセスすることも明らかにした。足場となるタンパク質HucMを通して、Huc複合体は膜からメナキノンを取り出し、酵素の電子受容体部位まで94Åの距離を輸送することができます。この発見は、呼吸性キノン還元の可能性を大きく広げるものである。これまで、全細胞系や精製酵素系で応用されてきたヒドロゲナーゼは、酸素によって阻害される低親和性酵素であったため、今回の発見は、より広範に生体触媒開発の道を開くものである。Hucは酸素非依存性の高親和性酵素であり、2族[NiFe]ヒドロゲナーゼであることから、環境下で作動する生体触媒の開発の基礎となるものである。
研究方法
統計と再現性
Huc精製とPAGE解析
Hucは、研究期間中、8回にわたってM. smegmatis細胞から精製されました。精製されたHucの収量（培養液1リットルあたりmg）は、精製ごとに5倍程度のばらつきがあった。Hucオリゴマーと低分子量種（Extended Data Fig.1a）の相対量は、精製間でおよそ2倍変化した。各精製で得られたHuc（n = 8）について、SDS-PAGEと活性染色を実施した。Hucオリゴマー中のHucS、HucL、HucMサブユニットの存在量（拡張データ図1b）とその活性（拡張データ図1c）は精製間で一致していたので、単一の精製からのゲルを表示した。異なる精製から得られたHucオリゴマーは、下流の酵素的、電気化学的、および分光学的分析に利用された。本研究では、サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。盲検化と無作為化は、この種の研究には適切でないため、使用しなかった。
HucM変異体の解析
野生型およびΔhucMの細胞溶解液におけるHuc活性のNative PAGE解析は、独立して培養した細胞溶解液を用いて3回行った（n = 3 biological replicates）。すべての複製は、同等の相対活性とバンドサイズを示した。代表的なゲル1枚を示す（Extended Data Fig.1e）。
Huc示差走査蛍光測定法
Hucの融解温度を決定するための示差走査蛍光測定実験は、精製Hucの1バッチ（n = 3テクニカルレプリケート）に対して3回行われ、サンプル間で一貫した結果が得られた。Hucオリゴマーの純度と活性が一定であることから、酵素の融解温度を決定するためには、1つのサンプルの分析で十分である。1回の実験から得られた代表的な曲線を示す（Extended Data Fig.1d）。
ガスクロマトグラフィー
Huc H2消費実験は、各電子受容体（NBTまたはメナジオン）を用いた4種類のHuc調製物（n = 4、生物学的複製）で、それぞれのケースで3つの複製バイアルが使用されました（n = 3技術的複製物）。得られたデータは、生物学的複製と技術的複製の両方で一貫していた。大腸菌Hyd1 H2消費実験は、単一の酵素調製物（n = 1生物学的複製）で実施し、3つの複製バイアルを使用した（n = 3テクニカルレプリケート）。図1a,bおよび拡張データ図1fは、提示されたすべてのサンプルについて同時に収集されたデータを持つ単一の酵素調製物からのデータを示す。データは、3つの技術的複製物（n = 3）の平均として示され、エラーバーはs.d.を示す。酵素を含まないコントロールバイアルは、H2消費または損失を示さず、2または3の技術的複製物（n = 2または3）の各実験に含まれた。
水素電極実験
Hucの酸素耐性および電子受容体依存性実験は、別々のHuc精製（n = 3、生物学的複製）で3回行い、各HucサンプルのO2濃度または電子受容体について3つの別々の電極トレースを収集した（n = 3、技術的複製）。メナジオン活性実験では、この化合物を使用すると装置のノイズが増加するため、5つの技術的複製を実施した（n = 5, technical replicates）。得られたデータは、生物学的複製と技術的複製の両方で一貫していた。1つのHucサンプルから得られた各条件の3反復（メナジオンでは5反復）の平均を示し、エラーバーはs.d.を示す（図1c、d）。
タンパク質膜の電気化学的特性
100%H2中のHucのサイクリックボルタンモグラム（図1e）は、単一の酵素調製物（n = 1 biological replicates）を用いて記録された。固定化された2枚のHucフィルムが記録され（n = 2技術的複製）、各フィルムは少なくとも2回スキャンされました。得られたデータは、技術的複製物間で一貫していた。酵素を固定化していない2枚のコントロールフィルムも各実験に含まれ（n = 2 technical replicates）、それぞれ2回スキャンされた。Huc、Hyd1およびHyd2について、10ppmから5%H2でのサイクリックボルタンメトリーを、それぞれの酵素の単一調製物（n = 1、生物学的複製物）に対して、それぞれの3種類のタンパク質フィルム（n = 3技術的複製物）で行った（図1fおよび拡張データFig.2）。これらの実験で使用したHucは、100%H2実験とは異なる精製によるものであった。タンパク質膜の電気化学実験では、膜の準備のわずかな違いに起因する、異なる膜間の絶対的な酵素被覆率のばらつきが見られるのが普通であるため、異なるタンパク質膜間の電気化学実験による絶対電流を比較するのは妥当ではなかった。しかし、H2分圧の変化に対する電流の傾向は、技術的複製物間で一貫していた。Hucのオンセット電位の決定には、2つのHucタンパク質フィルムのオンセット電位の3つの客観的な読み取りの平均を決定し、エラーバーはs.d.を示した（Extended Data Fig. 2a）。
クライオ電子顕微鏡イメージング
2つの別々の精製（n = 2生物学的複製）から得られたHucについて、低温電子顕微鏡によるイメージングを実施した。合計で2,226枚と3,113枚の画像がそれぞれの精製から収集され、Extended Data Fig.3aに遊離および膜結合したHucの単一の代表画像が示されている。2次元および3次元の再構成は、各データセットで独立して行われた。
EPR実験
EPR実験は、単一の酵素調製物（n = 1生物学的複製）に対して行われ、瞬間冷凍前にH2またはAr下でインキュベートした。個々のパワーと温度設定は1回ずつ記録し（n = 1技術的複製）、表示された各スペクトルは4回のスキャンの平均を表す（図3c、拡張データ図5b-d）。相互相関させたときのパワーと温度依存性の一貫性を考えると、これは原稿で導かれた結論には十分であった。
FTIR実験
FTIR実験は、単一の酵素調製物（n = 1生物学的複製物）を用いて行った。H2曝露による還元状態の集団と空気曝露によるNi-Bの形成は、少なくとも3つの個別の減衰全反射（ATR）-FTIR分光法サンプル調製物（n = 3、技術的複製）で行われ、同様の結果が得られた（図3dおよび拡張データ図8a-d、h）。これらの酸化還元状態集団の間を移動するキネティクスは、1つの試料調製（n = 1技術的複製）で記録された（Extended Data Fig. 8e）。
マススペクトロメトリー
LC-MSによる精製Hucタンパク質中のジヒドロメナキノン-9の同定（図4e）は、分析の質的性質とサンプル量の制約から、1回（n = 1 technical replicate）実施しました。これらのデータを用いた占有率の推定（補足図5）は定量的であるが、その分析の目的は主に、シグナルがリガンドについて予想されるものと一致していることを示すことであり、1回の複製で済んだ。
分子動力学実験
分子動力学シミュレーションは、シミュレーションした各条件について3回実施した（n = 3）。累積ガス占有率プロットは、これらのシミュレーションの平均値として示され、点線はs.d.を示す（拡張データ図6bおよび7b）。
公開されているデータ
本研究で使用した構造座標は、以下のPDBアクセッションコード（5AA5, 2FRV, 4U9H, 6EHQ, 4C3O, 3AYX, 5MDK）により公開されているものを利用することができます。
細菌株と増殖条件
M. smegmatis mc2155およびその誘導体は、0.05% (w/v) Tween 80 (LBT)を添加したリソジェニーブロス（LB）寒天プレートで培養した。ブロス培養では、M. smegmatisをLBT、または0.2％（w/v）グリセロール、0.05％（w/v）タイロキサポール、10 mm NiSO4（HdB）を添加したHartmans de Bont最小培地で培養しました。大腸菌はLB寒天培地上で維持し、LBブロスで増殖させた。クローニング実験に使用した選択的LBまたはLBT培地は、M. smegmatisに対しては5μg ml-1で、大腸菌に対しては20μg ml-1のゲンタマイシンを含んでいた。培養は、特に指定がない限り、液体培養の場合、150rpmで回転振盪しながら37℃でインキュベートした。M. smegmatisおよびその誘導体、大腸菌の菌株は、補足表4に示すとおりである。
M. smegmatis の遺伝子操作
Hucの生産には、グリセロール応答制御因子gylR（gylR Leu154→フレームシフト）とHhyヒドロゲナーゼ（hhyS不活性化）を欠くM. smegmatis mc2155株PRC1を用いてタンパク質発現を行った49、50。Hucの精製を容易にするため、2×StrepIIタグを小サブユニット（MSMEG_2262、HucS）のN末端に、前述のように対立遺伝子交換変異誘発によって挿入した51。対立遺伝子交換構築物であるhucS-2×StrepII（2656bp）をGenewizで合成し、マイコバクテリアシャトルプラスミドpX33のSpeI部位にクローニングして構築物pHuc-2×StrepIIを得た（補足表4）。 pHuc-2×StrepIIは大腸菌DH5αで増殖させ、野生型マイコバマティスmc2155 PRC1細胞にエレクトロポレーションによりトランスフォームした。pX33を増殖させるために、選択的な固体および液体培地においてゲンタマイシンを使用した。寛容な温度感受性ベクターの複製を可能にするために、形質転換体を28℃のLBTゲンタマイシンプレート上でコロニーが見えるまでインキュベートした（5〜7日）。得られたカテコール陽性コロニーを40℃のLBTゲンタマイシンブロスで3〜5日間サブカルチャーし、次にブロスから新鮮なLBTゲンタマイシンプレートに希釈して37℃で3〜5日間インキュベートし、フランキング領域を介して組換えプラスミドが染色体に組み込まれることを促進させた。2回目の組換え事象は、カテコール反応性コロニーとゲンタマイシン耐性コロニーを10％スクロース（w/v）を添加したLBTで3-5日間サブカルチャーし、その後10％スクロース（w/v）を添加したLBT寒天プレートに希釈して37℃で3-5日間インキュベーションして促進した。その後、ゲンタマイシン感受性およびカテコール非反応のコロニーをPCRでスクリーニングし、野生型復帰体とHucS-2×StrII変異体とを区別した。HucS-2×StrII挿入に対してPCR陽性であったコロニーをM. smegmatis mc2155 PRC1 HucS-2×StrIIとし、その後の実験に使用した。スクリーニングに使用したプライマーを補足表4に示す。HucMは、HucSの2×StrepIIタグ付けのために同じPRC1親株と手順を用いて、対立遺伝子交換変異誘発を使用して欠失させた。HucMの両側のゲノム配列からなる1,000bp程度の対立遺伝子交換コンストラクトを使用した。
Hucの精製
M. smegmatis mc2155 PRC1 HucS-2×StrII細胞を、大量のHdB（10-20 l）で定常期に入る24時間まで増殖させた。細胞を遠心分離によって収穫し、0.1 mg ml-1 リゾチーム、0.1 mg ml-1 DNase、1 mM MgCl2およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠を補充した溶解緩衝液（50 mM Tris、150 mM NaCl pH 8.0）中に再懸濁しました。細胞を細胞崩壊剤（Emulsiflex C-5）で溶解し、30,000g、15分間の遠心分離により細胞残渣を除去した。ビオチンブロッキングバッファー（IBA）を清澄化した細胞溶解液に加え（溶解液25mlあたり1ml）、1mlのStrepTrapカラム（Cytiva）にロードし、カラムを溶解液で広範囲に洗浄してから、結合Hucを溶解液+2.5mMデスチオビオチンで溶出した。StrepTrapからのHuc含有画分をSDS-PAGEで測定し、プールし、100 kDa MWCO遠心濃縮器（Amicon, Millipore）を用いて濃縮した。濃縮したHucをSuperose 6 10/300カラム（Cytiva）にロードし、オリゴマーHucを含むフラクションをSDS-およびネイティブPAGEで確認してプールし、液体N2中で瞬間冷凍して-80℃で保存する前に〜6mg ml-1に濃縮した。通常、精製により10-20μg l-1のHuc複合体を得ることができた。
PAGE解析、活性染色、ウェスタンブロッティング
SDS-PAGEおよびネイティブPAGEについては、製造者の指示に従って、サンプルをそれぞれBolt 4-12% SDS-PAGEおよびネイティブPAGE 4-16%ゲル（Invitrogen）上で実行した。ゲルは、AcquaStain Protein Gel Stain（Bulldog）により総タンパク質を染色し、比色電子受容体NBTヒドロゲナーゼを使用してヒドロゲナーゼ活性を染色した。NBT活性の染色には、ゲルを50mM Tris、150mM NaCl pH8.0に500μM NBTを添加し、7％H2嫌気性ミックスを添加した嫌気性ジャーでインキュベートした。インキュベーションは、活性のレベルに応じて、30分～12時間実施した。ヒドロゲナーゼ活性を示すバンドは、還元されたNBTの紫色に基づいて同定された。ウェスタンブロッティングでは、Transblot Turbo semidry transfer apparatus (BioRad) を用いて、SDS-PAGEまたはNative PAGEゲルからニトロセルロース膜にタンパク質を25V、30分間で転写した。転写後、タンパク質を含むニトロセルロース膜を、0.1％（v/v）Tween 20（PBST）を含むPBS（pH7.4）中の3％（w/v）BSAでブロッキングした。ニトロセルロース膜を20mlのPBSTで3回洗浄し、最後に10mlの同じバッファーに再懸濁した。次に、Strep-Tactin HRPコンジュゲートを1：100,000希釈で添加した。結合したStrep-Tactin HRPは、製造者の仕様に従ってECL Prime検出キット（Cytiva）を用いて化学発光で検出し、ブロットはChemiDoc（BioRad）を用いて可視化した。
Huc活性のアンペロメトリック測定
精製HucによるH2消費量は、+100 mVに分極したユニセンスH2マイクロセンサーで1時間アンペロメトリーに測定した。最初に、電極はガス飽和バッファ（50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8.0）中の0%、1%、10%のH2（v/v）の既知のH2スタンダードで校正した。このバッファーは、まずすべてのバッファーを100%窒素ガスで1時間バブリングして微量の酸素を除去し、次に脱酸素したバッファーを100%H2 (v/v)で10分間バブリングして調製しました。脱気および再気化の前に、すべてのバッファーは最終濃度200μMの電子受容体（メナジオン、NBT、またはベンジルビオロゲン）を含んでいた。各読み取りのために、電子受容体を含む1％（8μM）H2入りバッファーを1ml、最終濃度が1％H2になるようにマイクロレスピレーションアッセイチャンバーに添加した。その後、電極をチャンバーに入れ、平衡化させた。平衡化した後（約10分）、BSA（0.3 mg ml-1）とHuc（0.3 mg ml-1 BSA中1-3 nM）を、溶液中のガスバランスを崩さないように、針でチャンバーに添加した。H2濃度の変化はSensorTrace Suite v3.4.00を用いて測定し、Hucの添加から完全にH2が消費されるまでのH2消費量の直線速度を測定した。HucによるH2消費の直線速度は、8つの時間ポイントにわたって、約2.5μM H2から0.0125μM H2までの濃度間で計算されました。これらのH2消費速度を用いてミカエリス-メントン曲線を描き、異なる電子受容体存在下でのHuc特異的活性と、Hucの最大速度を算出した。
質量分析によるメナキノンの検出
サンプルは、修正Folch抽出を使用してLC-MS分析用に準備された。簡単に説明すると、精製タンパク質（〜57μg）の100μl溶液を2000μlの2：1クロロホルム：メタノール（v/v）で処理した後、混合物を10分間振とうし、さらに50分間静置した。400μlの水を加え、混合物を10分間振った後、2つの相が完全に分離するまで試料を静置した。クロロホルムに富む下層相を2mlのサンプルバイアルに移し、窒素ガス気流下で溶媒を除去した。得られた残渣を100μlの2：1クロロホルム：メタノール v/vで再構成し、200μlのサンプル挿入口に移し、溶媒を再び除去し、サンプルをLC溶媒A：LC溶媒B（v/v）の7：3混合物で再構成した。サンプルは、Dionex RSLC3000 UHPLC (Thermo) と Q-Exactive Plus Orbitrap MS (Thermo) を組み合わせ、C18 カラム (Zorbax Eclipse Plus C18 Rapid Resolution HD 2.1 × 100 mm × 1.8 μm, Agilent) と二元溶媒システム (solvent A = 40% isopropanol と solvent B = 98% isopropanol、いずれも 2 mM ギ酸および 8 mMギ酸アンモニウム含有 ) で分析されました。直線勾配時間、%Bは以下の通り。0 min, 0%; 8 min, 35%; 16 min, 50%; 19 min, 80%; 23 min, 100%; 28 min, 100%; 30 min, 0%; 32 min, 0%. 流速は250μl min-1、カラム温度は50℃、サンプル注入量は10μlであった。質量分析計は、極性切替モードで70,000の分解能で動作し、エレクトロスプレーイオン化源の条件は、スプレー電圧3.5 kV、キャピラリー温度300 ℃、シースガス34、Auxガス13、スイープガス1、プローブ温度120 °Cである。
Hucに関連するMQ9(II-H2)の占有率は、標準物質であるMQ9を含む単一試料との比較により算出した。MQ9は、市販されているMQ9(II-H2)に最も近い構造類似体（第2のイソプレニル単位に追加の二重結合が存在することのみ異なる）で、トロント・リサーチ・ケミカルズから購入した。452.64ngのMQ9を含む標準試料のMQ9のアンモニウム付加物のピーク面積は7.40×109、タンパク質試料のMQ9（II-H2）のアンモニウム付加物のピーク面積は6.77×109だった（補足図5）。MQ9(II-H2)とMQ9標準品の応答が同等であると仮定すると、タンパク質試料中のMQ9(II-H2)の量は414 ngと推定されます。タンパク質サンプルには57μgのHucが含まれており、68.4pmolesに相当する（HucのMWは833kDa）。Huc複合体1個あたり8個のMQ9(II-H2)がフル稼働しているので、これは547.2 pmolesまたは430.4 ng (MQ9(II-H2) = 786.63 g mol-1) of MQ9(II-H2) に対応します。その結果、MQ9(II-H2)におけるHucの占有率は96.2%（414 ng / 430.4 ng）と見積もられる。もしMQ9(II-H2)がHuc構造で観察された結合部位の外で結合していれば、これらの部位における実際の占有率はより低くなるであろう。しかし、Hucの頭部基の存在密度の高さから、これらの部位に存在するMQ9(II-H2)がサンプル中の大部分を占めていると予想されます。
HucMの質量分析による同定
Huc複合体に由来するSDS-PAGE上の18kDaのバンドを切り出し、ゲルマトリックスから抽出した。脱染後、タンパク質をトリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン（Pierce）で還元し、ヨードアセトアミド（Sigma）でアルキル化し、質量分析グレードのトリプシン（Promega）で消化させた。抽出されたペプチドは、ナノスプレー源を備えたOrbitrap Fusion Tribrid（ThermoFisher Scientific）質量分析計と結合したUltimate 3000 RSLCnano System（Dionex）上でLC-MS/MSにより分析された。ペプチドは、まずAcclaim PepMapトラップカラム（0.1 mm id × 20 mm、5 µm）にロードして脱塩し、次にAcclaim PepMap分析カラム（75 µm id × 50 cm、2 µm）で、4-36%アセトニトリル/ 0.1% ギ酸の30分直線グラジェントで分離しました。Orbitrap Fusion Tribridは、データ依存の取得モードで、固定サイクルタイム2秒で動作させた。Orbitrapフルms1スキャンは、質量範囲375～1,800 m/z、m/z 400での分解能120,000、AGCターゲット1 × 106、最大注入時間110 msに設定した。個々のプリカーサーイオンはHCDフラグメンテーション（コリジョンエネルギー32%）に選択され、その後のフラグメントms2スキャンはOrbitrapでm/z 400で60,000の解像度、5×105のAGCターゲット、118 msの最大注入時間を使用して取得されました。動的排除は、1回発生後10秒間、±10ppmに設定された。生データは、M. smegmatis mc2155をカバーするタンパク質データベースに対してByonic (ProteinMetrics v4.3)を使用して処理した。プリカーサーマスの許容範囲は20ppmに設定され、フラグメントイオンは0.6Daで検出された。酸化(M)は動的修飾、カルバミドメチル(C)は固定修飾として設定した。誤検出率0.01を下回るペプチドとタンパク質のみが報告された。
ガスクロマトグラフィー分析
ガスクロマトグラフィー実験により、純粋なHucタンパク質とHucを発現するM. smegmatis培養物の両方によるH2ガスの消費量を測定した。純粋なタンパク質実験では、メナジオンを電子受容体とするHucのH2酸化速度を評価するために、200μMメナジオンを含む5mlの緩衝液（50mM Tris, 150mM NaCl, pH 8.0, 0.3mg ml-1 BSA）を120mlの密閉血清バイアルに3連で収容した。バイアルのヘッドスペースに大気圧ガスミックスで3ppmのH2を10分間流し、その後100nMのHucをシリンジで加えて反応を開始させた。HucとHyd1のH2酸化速度を比較する実験では、同じ反応バッファにメナジオン代わりに200 μM NBTを入れ、ヘッドスペースにN2中の10または100 ppm H2を使用し、50 nM HucまたはHyd1を加えて反応を開始させました。実験前に、Hyd1をN2中の7%H2の雰囲気で18時間インキュベートすることで活性化し、その後、血清バイアルに嫌気的に添加した。バイアルを室温で攪拌しながらインキュベートし、パルス放電式ヘリウムイオン化検出器（モデルTGA-6791-W-4U-2、Valco Instruments Company）を用いて水素ガス濃度を特定の時間間隔で、著しいH2酸化が見られなくなるか、検出限界に達するまでモニターした。
示差走査型蛍光測定法
Huc複合体の安定性を調べるため、高感度キャピラリーを用いたPrometheusNT.48 DSF（Nanotemper社）を用いて、20～90℃の熱融解を実施した。330nmと350nmの蛍光の変化比率をモニターし、タンパク質のアンフォールディングを判定した。融解は、50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 8.0を含むバッファー中、0.2 mg ml-1のHuc濃度で実施しました。
クライオ電子顕微鏡イメージング
試料（3 µl）をグロー放電させたUltrAuFoilグリッド（Quantifoil GmbH）上に塗布し、湿度100%、プレップチャンバーを4℃に設定したVitrobot mark IV（ThermoFisher Scientific）を用いて液体エタン中で瞬間凍結させた。データは、Titan Krios顕微鏡（ThermoFisher Scientific）を用いて、加速電圧300kV、50μm C2アパーチャー、表示倍率105kxで、ナノプローブEFTEMモードで収集しました。ガタンK3直接電子検出器をガタンQuantumエネルギーフィルターの後に設置し、ゼロエネルギーロスモードでスリット幅10eVで動作させ、対物アパーチャーなしでHuc複合体の線量分画画像を取得しました。2,226本の動画からなる低濃度データセット（0.4 mg ml-1）と、3,113本の動画からなる中濃度データセット（1 mg ml-1）の2つの初期Hucデータセットが収集された。動画はハードウェアビンドモード（以前はK3カメラのカウントモードと呼ばれていた）で記録され、物理ピクセルサイズ0.82Å pixel-1、露出時間6秒、総線量66.0 e-Å-2（7.5 e- pixel-1 s-1 の線量率）となり、60サブフレームに分画されました。さらに高濃度データセット（4 mg ml-1）9,868枚を同じ顕微鏡で記録したが、K3検出器の倍率は165 kx、ピクセルサイズは0.5 Åである。動画は露光時間4秒、総線量60.4e-Å-2、さらに60個のサブフレームに分割して収集した。デフォーカス範囲は-1.3～-0.3μmに設定した。
クライオ電子顕微鏡データの処理と解析
すべてのデータセットの顕微鏡写真はUCSF Motioncor 1.0.4で動き補正され、線量加重平均はRelion 3.1.2（ref. 52）を用いて実装したCTFFIND 4.1.8でコントラスト伝達関数（CTF）パラメータを推定しました。
データセット1からのHucオリゴマー再構成
粒子座標は、20枚の顕微鏡写真から選んだ手動粒子で学習させたモデルを用いて、crYOLO 1.7.6で決定した53。アンビン粒子はRelion 3.1.2を用いて顕微鏡写真から抽出し、cryoSPARC 3.3.1にインポートして不良粒子を取り除く初期2次元分類を行い、その後第一原理モデル生成と3次元精製54を行いました。精製された粒子はRelion 3.1.2に再インポートされ、CTF精製が行われ、その後ベイズ研磨が行われた52。粒子をcryoSPARC 3.3.1に再インポートし、最終的に2D分類を行い、残存する不良粒子を除去した後、非均一3Dコンセンサス精密化を行い、2.19Åの最終マップ（Fourier shell correlation (FSC) = 0.143, gold standard）を作成しました。
HucS2L2サブユニットデータセット1
HucS2L2粒子は、gautomatch V 0.53 (developed by K. Zhang)を用いて、直径80Å、粒子間の最小距離を20Åに設定し、抽出された粒子は4回ビニングされ、56ピクセルのボックスサイズになりました。224ピクセルのボックスサイズを持つビン詰めされていない粒子の小さなサブセットは、ノイズの多い粒子を除外するために2D分類にかけられ、残りは選択され、cryoSPARC v3.0.1 (ref. 54) を用いて4クラスで3D第一原理モデル生成にかけられました。HucS2L2サブユニットの集団に対応するクラスは、明確なC2対称性を示し、この粒子セットは、C2対称性を適用した均質な精密化を行い、3.25Åの解像度で再構成された。得られたボリュームは、ワークフロー補足図3に示すように、全データセットのさらなる分類と精密化のための初期モデルとして使用された。サブユニットに対応する粒子は、2次元分類と異種精密化後にビニングされたデータセットから選択されました。異種精密化で得られたcryoSPARCの3Dアラインメントは、pyem v0.5パッケージのcsparc2star.pyスクリプトを用いてRelionにエクスポートされた。Relionでは、インポートされた粒子から精製された座標を使用して、ビニングなしで粒子が再抽出されました。これをcryoSPARCに再インポートし、異種精製を行った後、C2対称を適用した同種の精製を行った。再構成結果のFSCでは、gautomatchを用いたオーバーピッキングの結果、粒子の重複が見られた。精製された粒子座標は、上記のようにRelionにインポートされ、重複した粒子を除去するためにクリーニングされました。洗浄された再抽出粒子は、CTF精密化、自動精密化、ベイズ研磨のラウンドにかけられました。得られた研磨粒子をcryoSPARCにインポートしてCTF精密化を行い、CTFパラメータ最適化による非均一精密化を行い、最終的なグローバル分解能は1.67 Å（FSC=0.143、ゴールドスタンダード）となり、このデータセットのナイキスト限界（1.64 Å）に近い値となりました。
HucS2L2サブユニットデータセット2
データセット1のマップ解像度に課せられたナイキスト制限を克服するために、より高倍率の2番目のデータセットが収集された。粒子は、上記および補足図2で説明したように、摘出、抽出、ビン詰めされた。2次元分類、第一原理分類、異種精製を複数回行い、完全なHucオリゴマーを含む粒子のみを保持した。HucS2L2サブユニットの中心に粒子を置くために、HucS2L2サブユニットマップを初期モデルとして、ビニングされた粒子に対して均質精密化を実行した。その後、これらの粒子をRelionで、精製された座標に基づいて、ボックスサイズ380ピクセルに再抽出した。C2対称の均質な精密化により、2.15Åのサブユニット再構成マップが得られた。Hucオリゴマーに対応する対称性のあるHucS2L2粒子をすべて確実に保持するために、上記の選択された粒子を512ピクセルという大きなボックスサイズで再抽出し、128ピクセル（4×ビニング）に再スケーリングしました。得られた粒子セットを第一原理モデル生成し、C4対称性を用いた均質な精密化を行い、Hucオリゴマーの4.10 Åマップを得た。粒子は、576ピクセルのボックスサイズで前のステップで精製された座標に基づいて再抽出され、288ピクセル（2×ビン化）に再スケーリングされました。これらの粒子をcryoSPARCで均質精製、CTF精製、Non-Uniform精製を行い、2.05Åの分解能のマップを得た54。精製された粒子セットはRelionに再インポートされ、ベイズ研磨が行われた。得られた "shiny "粒子は、ビニングなしで576ピクセルの最終ボックスサイズに抽出され、cryoSPARCに再インポートされて対称性の拡張と最終精製が実行されました。重複する粒子を除外し、153,359個のHucオリゴマーを保持しました。得られた粒子は、C4対称を課す精製を1回行い、2.19 Åのマップを得た。得られた精製粒子を対称に拡大し、cryoSPARC 3.3.2内で対称性のない局所精製を行い、HucS2L2の2.16 Åのマップを得た。得られたvolと粒子は、HucS2L2内のC2対称性を利用するために、C2対称軸に整列されました。対称に揃えた粒子をC2対称で精製し、グローバルCTF精製、粒子ごとのデフォーカス精製、Ewald Sphere補正、粒子ごとのデフォーカス精製を繰り返し、最終的にグローバル分解能1.52 Å（FSC = 0.143, ゴールドスタンダード）に達しました。
HucMストークの再構成
データセット2のHucS2L2サブユニット再構築時に2.15Åのマップを得た粒子セットを512ピクセルのボックスサイズで再抽出し、128ピクセル（4×ビン化）に再スケーリングしました。得られた粒子セットを2次元分類し、第一原理モデル生成とC4対称性を用いた均質な精密化を行い、Hucオリゴマーの4.10Åマップを得ました。粒子は、576ピクセルのボックスサイズで前のステップで精製された座標に基づいて再抽出され、その後288ピクセルに再スケーリングされました（2×ビン化）。これらの粒子を、cryoSPARCで均質精密化、CTF精密化、不均一精密化を行い、2.05Å分解能のマップを得た54。精製された粒子セットはRelionに再インポートされ、ベイズ研磨が行われ、その結果、「輝く」粒子がビニングなしで最終ボックスサイズ576ピクセルに抽出された。これらの粒子を3つのクラスで第一原理モデル生成し、HucM尾部領域に対して明確な密度を示す粒子を保持しました。選択された粒子は、ctf精製とNon-Uniform精製を行い、2.09Åのマップを得ました。ChimeraX 1.3のボリュームツールを使って茎の密度を分離し、20Åにローパスフィルターをかけ、cryosparc55で局所的に精製するための初期モデルを導き出しました。初期モデルを用いて、拡張コサインパディングソフトマスクを生成した。ChimeraのVolume Tracerツールを用いて、サブユニット本体へのストークの取り付け部分の座標を決定し、局所精密化のための新しい支点を定義するために使用した（補足図4）。マスクありの局所精密化を2回行った結果、図に示すように、膜に関連するストーク領域の密度が向上し、5.7Åの分解能（マスクなし）となりました。その結果、FSCは5.21Å（FSC = 0.143、ゴールドスタンダード）のマップ解像度を算出したが、マップの特徴は目視で6-8Åの解像度により一致している。
Hucモデルの構築と可視化
AlphaFoldを使ってHucSとHucLサブユニットの二量体のモデルを作り、ChimeraX 1.3を使って高解像度Huc Dimerマップの2分の1にドッキングした（参考文献56,57）。このモデルをCoot 0.92（文献58）を用いて精製し、マップ密度に再構築した。Hucに関連する[NiFe]、[3Fe-4S]、メナキノン補酵素はPDBからダウンロードし、PHENIXパッケージのElbowを使ってカスタマイズした拘束を生成してからCootを使ってマップにフィットさせ精製した59、60。その後、PHENIXの実空間精密化を使ってモデルを精密化した61。モデル構築が完了したら、Map symmetry ツールを使ってモデルを対称に展開し、PHENIX パッケージの DOUSE を使って水を追加した60。精製された二量体モデルは、ChimeraX56を使ってHucオリゴマーマップにドッキングされ、HucMはCoot58を使って1つのサブユニットに対して利用可能な密度に手動で組み込まれ、その後PHENIXで実空間の精製を繰り返し、さらにモデル構築を行った。モデル構築が完了したら、PHENIXパッケージのMap symmetryツールを使ってモデルを対称に展開した60。モデルの品質はMolProbity62を使用して検証された。画像と動画は、Coot、ChimeraX、Pymol56,58で作成した。Hucと他の[NiFe]ヒドロゲナーゼのガスチャネルの位置と直径は、CAVERコード63を使用して決定した。
AlphaFold構造モデリング
AlphaFoldモデリングは、MASSIVE M3コンピューティングクラスター57,64に実装されたAlphaFoldバージョン2.1.1を使って行われた。HucMのC末端領域（アミノ酸80-189）の配列が提供され、4分子のHucMを要求して、多量体モードでモデリングを実行した。AlphaFoldによって生成された5つのランク付けされたモデルは、さらなる解析と図の生成に使用されたトップランクのモデルとの一貫性を比較した。
分子動力学のパラメータ設定とシミュレーション
Hucヒドロゲナーゼの1.52 Å低温電子顕微鏡構造を用いて、Charmm36m力場65,66とTIP3P67水モデルを用いてシミュレーションシステムを構築した。システムの電荷を中和するために、溶液にナトリウムの対イオンを添加した。気体分子を含まない場合と、水素250個または酸素250個を濃縮した溶液を含む場合の3組のシミュレーションを設定した。気体分子はランダムに水相に挿入された。各シミュレーションは、異なる開始速度とガス位置で開始され、各システムについて3つの独立したシミュレーションが実行されました。シミュレーションは50 ns（野生型）または100 ns（変異体）で実行された。分子の可視化と解析は、VMDソフトウェア68を使用して行った。金属補酵素のトポロジーは、低温電子顕微鏡構造からの座標をもとに構築した。ヒドロゲナーゼの補酵素に関するこれまでの研究69により、構造的に同一の金属補酵素がヒドロゲナーゼ間で移行可能であることが示された。そこで、金属補酵素の結合長に関する原子部分電荷と力定数は、構造的に類似したDesulfovibrio fructosovorans [NiFe] hydrogenaseの先行研究69から引用した。金属補酵素の結合長と角度の平衡値は、低温電子顕微鏡構造から直接取得した。分子動力学シミュレーションは、単一の酸化還元状態において行われた。活性部位のNi-SI型と鉄-硫黄クラスターの酸化型は、過去の類似解析に基づいて選択された70。NiFe]補酵素は、CNとCOの配位子間、および鉄原子と2つの結合した硫黄原子間の結合制約を受けた。Lennard-Jones パラメータは、必要に応じて Charmm36m65,66 力場から取得した。ただし、シアヌル炭素71 は例外で、鉄パラメータは物理データから取得し、ゼロではないイプシロン値72 を持つようにした。Javanainen ら 73 が開発した QL 分子酸素モデルは、分子内の四重極をより明確に定義するために選択されました。酸素原子は質量と非ゼロのLennard-Jonesパラメータ、および部分電荷を与えられている。質量がない仮想サイトOD1が2つの酸素原子の中間点に存在し、中和電荷を運ぶことで、酸素四重極内の電荷分布をシミュレートしています。同様に、水素モデルには、Hunterら70の研究結果と一致する質量と電荷分布が与えられた。分子動力学シミュレーションは、GROMACS v 2021.3 シミュレーションスイートで行った。エネルギー最小化は、最急降下アルゴリズムを使用し、次に共役勾配アプローチを使用した2回目の最小化ステップを行い、どちらも最大力250 kJ mol-1 nm-1に設定した。位置拘束は、タンパク質、補酵素、マグネシウムイオンに適用し、103 kJ mol-1 nm-2の力定数で100 psの間、NVTアンサンブルの中で平衡化シミュレーションを行いました。さらに、Parrinello-Rahman barostat74を使用して圧力を1barに維持し、NPTアンサンブル内で100ps間、平衡化を実施した。長距離静電気はParticle Mesh Ewald法75で処理し、これらの力とファンデルワールス力の実空間長距離カットオフの値は10Åに設定した。水素原子を含む共有結合はLINCSアルゴリズム76,77で拘束し、2fsの統合ステップを可能にした。
EPR分光法
Hucの鉄-硫黄クラスターの組成をEPR分光法で分析した。XバンドEPR測定は、SuperX EPR049マイクロ波ブリッジと円筒形TE011 ER 4122SHQEキャビティを備えたBruker ELEXYS E500スペクトロメーターと、Oxford Instruments連続流クライオスタットに接続して行った。測定温度は、ITC 503温度コントローラー（オックスフォード・インストゥルメンツ）を通した液体ヘリウム流で達成した。空気中で孤立したHucの試料は、アルゴン雰囲気下で調製するか、1気圧のH2下でインキュベートした後に瞬間冷凍し、マイクロ波の出力を変えながら、温度範囲40-7 KでXバンドEPRスペクトルを収集した。EPRスペクトルのNiシグナルの予備シミュレーションは、EasySpin v.6.0.0-dev47 (ref. 78)を用いて実施された。
FTIR 分光法
50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 8を含む緩衝液中の5 mg ml-1 Huc酵素溶液を4 μl量、ATR結晶表面に付着させた。試料は実験室雰囲気（空気）下で塗布し、100%窒素ガス下で乾燥させ、既述のように加湿エアゾール（100 mM Tris-HCl (pH 8)）で再水和した79, 80. ガス交換が可能な特注のPEEK製セル（Strippら81にヒントを得た）で、FTIR分光計（Vertex V70v、Bruker）に取り付けられたATRユニット（HarrickのBioRadII）を密閉した。スペクトルは、2cm-1分解能、80Hzのスキャナ速度で記録され、様々な数のスキャン（少なくとも100スキャン）で平均化された。すべての実験は、周囲条件（室温と圧力、水和された酵素フィルム）で行われました。データは、OPUS 8とOrigin 2021ソフトウェアを使用して分析されました。Huc [NiFe]クラスターの周囲空気、N2、H2に対する応答を評価するために、PEEKセルを以下の順序で各ガスで順次フラッシングした。N2（周囲空気から分離した酵素）、2H2、N2、H2、周囲空気。Hucスペクトルの変化が安定してから、各ガスでのスペクトルを収集した。
タンパク質膜の電気化学
100%H2実験におけるHuc
タンパク質膜電気化学実験は、嫌気的条件下で実施した。3電極システムは、(1)参照電極としてAg/AgCl (4 M KCl)、(2)回転円板作用電極としてエポキシに包まれた直径5mmのパイロライティックグラファイトエッジ (PGE)、(3) 対極としてグラファイトロッドを使用しました。ガラスセルには、温度調節用のウォータージャケットと、H2フロー用のガス出入り口が設けられている。バッファーは、5mM 2-[N′-モルフォリノ]-エタンスルホン酸（MES）、5mM 2-[N′-シクロヘキシルアミノ]エタンスルホン酸（CHES）からなるものを使用。5 mM N′-[2-hydroxyethyl]piperazine-N′-2-ethane sulfonic acid (HEPES), 5 mM N′-tris[hydroxymethyl]methyl-3-amino propane sulfonic acid (TAPS), 5 mM sodium acetate, with 0. 1MのNa2SO4を電解液として用い、20℃でH2SO4でpH7.0まで滴定し、N2で3〜4時間パージした。PGE電極に残留するO2を除去するために、0から-800mV（対SHE、標準水素電極）まで100mV s-1でサイクリックボルタモグラムを10スキャン実行した。脱気したPGE電極にHucを付着させるため、表面をP1200サンドペーパーで削り、精製水で洗浄した。50 mM Tris, 150 mM NaCl pH 8を含む緩衝液中の5 mg ml-1 Huc酵素溶液のアリコートをポリミキシンB硫酸と混合し、電極表面に移した。その後、セル溶液をH2で飽和させ（1 bar、10分）、固定化酵素を含む系のサイクリックボルタンモグラムを10 mV s-1で記録した。ブランク電極のサイクリックボルタモグラムは、酵素を固定化しない状態で記録した。電気化学データは、PGSTAT10とGPES 4.9ソフトウェア(Metrohm/Autolab)を用いて取得しました。データはOrigin 8ソフトウェアを使って分析した。すべての電位値は、対SHEで参照される。実験は、独立した2枚のHucフィルムで実施し、各フィルムを少なくとも2回スキャンした。
Huc、Hyd1、Hyd2の0～5% H2実験結果
タンパク質膜の電気化学実験は、N2充填の嫌気性グローブボックス（Glove Box Technology Limited、O2＜2ppm）内で行われた。実験は、ガス入口および出口バルブ82を備えたガラス製電気化学セルを用いて実施された。メインセルコンパートメントは、温度制御のためにウォータージャケットで囲まれていた。すべての実験は、25℃で行われた。飽和カロメル電極（SCE）を基準として使用し、0.10M NaClを含む絶縁ガラスアームに保持し、ルギン毛細管によってメインセルコンパートメントに接続した。SCEはフェロセンメタノールを用いて25℃で+244mV対SHEとして校正され、すべての図において電位はV対SHEに戻して補正されています。作用電極は直径2 mmのPGE回転ディスク電極で、炭化ケイ素ペーパー（最初はP1200、次にP4000）で研磨した。電極の回転はMetrohm Autolab IME663ローテーターで制御し、ここに示すすべての実験では、固定化酵素膜との間で効果的な質量輸送を達成するために、電極を2,000rpmで回転させた。対極には白金線を使用した。サイクリックボルタンメトリーは、NOVAソフトウェアバージョン1.10を使用したAutolab PGSTAT 10ポテンショスタットで制御しました。すべての実験は、電気化学セルのヘッドスペースにガスを流しながら行った。ガス混合物は、不活性キャリアガス（ArまたはN2）内でH2の所望の分圧を得るために、ガスマスフローコントローラ（Smart-Trak2、Sierra Instruments）を使用して、純Ar、純H2、N2中5%H2、N2中1,000 ppm H2（すべてBOC製）のシリンダーから準備されました。すべての実験で混合バッファシステムを使用しました。これは、MES、HEPES、TAPS、CHES（すべてMelford製）、酢酸ナトリウム（Sigma製）の各15mMと、支持電解質として0.1M NaCl（Fisher製）から構成されています。すべての溶液は精製水（ミリポア：抵抗率18.2MΩcm）を用いて調製し、25℃でHClでpH7.0に滴定した。バッファーはグローブボックスに入れる前に、一晩N2でフラッシュしてO2を除去した。Hucの膜を作るために、2μlの酵素溶液（共吸着物として20mg ml-1 ポリミキシンB硫酸塩を含む）を研磨したばかりのPGE電極表面にスポットして3分間放置し、電極を精製水ですすいで未吸着の酵素を除去した。電極は、8mlの原液混合バッファーを含む電気化学セルに置かれた。測定中のタンパク質膜の損失を最小限に抑えるため、0.025 mg ml-1 ポリミキシンB硫酸塩を混合バッファーに添加した。電位をかける前に、セルヘッドスペースを少なくとも15分間ガスでフラッシュし、セル溶液と完全に平衡化させた。サイクリックボルタンモグラムは、セルのヘッドスペースを通るガス流を1 barで一定にして記録した。大腸菌Hyd1およびHyd2は、以前に説明したように調製した83,84。これらのヒドロゲナーゼは、まず100% H2、室温で少なくとも5時間活性化した。Hyd1およびHyd2のフィルムは、Hucと同様に調製したが、硫酸ポリミキシンBを使用しなかった。
報告書の要約
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryでご確認いただけます。
データの入手方法
本論文で作成した低温電子顕微鏡マップと原子モデルは、Protein Data Bank (accession code 7UTD, 7UUR, 7UUS, 8DQV) と Electron Microscopy Data Bank (accession code EMD-26767, EMD-26801, EMD-26802, EMD-27661) に寄託されています。Huc分子動力学シミュレーションの生データは、Zenodo (https://zenodo.org/record/7378976)を通じて入手できます。ソースデータは本論文に添付されています。
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リファレンスのダウンロード
謝辞
Bio21研究所には、クライオ電子顕微鏡による試料作製およびスクリーニングの際に、施設内に設置されたThermo Glaciosを使用していただき、感謝いたします。精製したHyd1およびHyd2を提供してくれたS. Carr、原稿のレビューと建設的なフィードバックをくれたS. Frielingsdorf, J. Rossjohn, F. Armstrong, B. Murphy, G. Knottに感謝する。Microscopy AustraliaのNodeであるMonash Ramaciotti Centre for Cryo-Electron Microscopyの機器の使用と支援に感謝する。この研究は、オーストラリア研究会議（ARC）のDECRAフェローシップ（DE170100310）（C.G.へ）、ARC発見プロジェクトグラント（DP200103074）（R.G.とC.G.へ）、National Health and Medical Research Council Emerging Leader Grant (NHMRC) (APP1178715) (C.G.へ）、NHMRC Emerging Leader Grant (APP1197376) (R.G.へ) によって支援されました。 )、Titan Krios Gatan K3カメラおよびTitan KriosのためのARC LIEFグラント(LE200100045, LE120100090)、優先プログラム1927 (1554/5-1) によるドイツ連邦政府、スウェーデンエネルギー庁のグラント番号48574-1 (G.B. へ) )、欧州研究評議会助成金(714102)(G.B.)、欧州連合の研究・イノベーションプログラムHorizon 2020 (Marie Skłodowska Curie Grant no. 897555)(M.S.) および米国国立科学財団助成金 (CHE-2108684) (H.S.S.) によります。
著者情報
著者ノート
これらの著者は均等に貢献した。リース・グリンター、アシュリー・クロップ
著者と所属
モナシュ大学バイオメディシン・ディスカバリー研究所微生物学教室（オーストラリア、ビクトリア州クレイトン
リース・グリンター、アシュレイ・クロップ、クリス・グリーニング
モナシュ大学ラマチオッティ低温電子顕微鏡センター（オーストラリア、ビクトリア州、クレイトン
ハリ・ヴェヌゴパール
ウプサラ大学化学部、Ångström研究所、ウプサラ、スウェーデン
Moritz Senger、Princess R. Cabotaje、Ping Huang、Gustav Berggren
オックスフォード大学生化学科、英国、オックスフォード
ジャック・バドリー、ルユ・ジア＆シマ・カリド
オックスフォード大学化学部・無機化学研究所（英国・オックスフォード
ゼフイ・ドゥアン＆カイリー・A・ヴィンセント
ベルリン自由大学物理学科、実験分子生物物理学、ベルリン、ドイツ
スヴェン・T・ストリップ
モナシュ大学モナシュ・バイオメディシン・ディスカバリー研究所生化学部（オーストラリア、ビクトリア州クレイトン
クリストファー・K・バーロウ＆ラルフ・B・シッテンヘルム
モナシュバイオメディシン・ディスカバリー研究所モナシュプロテオミクス＆メタボロミクスファシリティモナシュ大学クレイトンオーストラリアビクトリア州
クリストファー・K・バーロウ＆ラルフ・B・シッテンヘルム
モナシュ製薬研究所膜タンパク質電子顕微鏡センター（オーストラリア、ビクトリア州、パークビル
マシュー・ベルーソフ
オハイオ州立大学化学・生化学部（米国オハイオ州コロンバス市
ハンナ・S・シャファート
オタゴ大学微生物学・免疫学教室、ニュージーランド、ダニーデン
グレゴリー・M・クック
南極の環境の未来を確保するために、モナシュ大学（オーストラリア、ビクトリア州、クレイトン
クリス・グリーニング
モナシュ大学AMR影響センター（オーストラリア、ビクトリア州、クレイトン
クリス・グリーニング
オーストラリア、ビクトリア州クレイトン、モナシュ大学、炭素利用とリサイクルのためのARC研究ハブ
クリス・グリーニング
貢献度
C.G.、R.G.、A.K.、G.M.C.は、プロジェクトの構想・設計を行った。C.G.とR.G.はプロジェクトの運営にあたった。A.K.とR.G.は、M. smegmatis変異体の作製、タンパク質の精製、速度論的解析とH2消費アッセイを実施した。H.V.、R.G.、A.K.、M.B.はクライオ電子顕微鏡グリッドの準備、クライオ電子顕微鏡データの収集と処理を行った。R.G.は、Huc構造のモデリングと解析を行った。G.B.、K.A.V.、P.R.C.、Z.D.はPFE実験の考案、実施、分析を行った。G.B.、P.H.、H.S.S.がEPR実験を考案、実施、分析した。G.B.、M.S.、S.T.S.はFTIR実験を考案、実施、分析した。S.K.、J.B.、R.J.およびR.G.は、分子動力学シミュレーションを考案し、実行し、分析した。R.B.S.とC.K.B.は、質量分析実験の設計と実行を行った。R.G.、C.G.、A.K.は、全著者の意見を取り入れながら原稿を執筆し編集した。
対応する著者
通信先はRhys GrinterまたはChris Greeningです。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
査読
ピアレビュー情報
Natureは、Martin Högbom、Janet Vonck、およびその他の匿名の査読者の方々に感謝します。査読者のレポートがあります。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権主張に関して中立を保っています。
拡張データ図と表
Extended Data 図1 Hucの分離と精製。
(a) 左側のパネル。Superose 6 10/300カラムでサイズ排除クロマトグラフィーにより分離したストレプトアクチン精製Hucを示すクロマトグラム。緑色の領域はHucオリゴマー、ピンク色の領域は低分子量Huc種である。右のパネル。クロマトグラムのカラーピーク領域からのフラクションを示すクマシー染色SDS-PAGEゲル。(b) hucM (MSMEG_2261)の位置をhucSおよびhucLと比較したHuc遺伝子群の模式図である。(c) 精製したHucオリゴマー（緑）と低分子種（ピンク）をクマシー（左パネル）およびNBT（右パネル）で染色したネイティブPAGEゲル。(d) Hucオリゴマーの示差走査蛍光分析。78.3℃でトリプトファン由来の蛍光が遷移し、オリゴマーの融点が示される。(e) M. smegmatis細胞溶解液のNBT染色ネイティブPAGEゲル。ΔhucM株ではHucがオリゴマーを形成しないことがわかる。(f) Huc、大腸菌Hyd1、または酵素を含まない密閉バイアル瓶のヘッドスペースのH2濃度のガスクロマトグラフ分析。HucはH2を100 ppmからガスクロマトグラフの検出限界（40 ppbv）まで酸化できる（緑線）ことがわかる。一方、Hyd1はH2 < 8 ppmvを酸化しない。データは平均値+/- SDで表示されています。
出典データ
Extended Data 図2 Hucと大腸菌由来のHyd1およびHyd2のH2濃度を変えた場合のタンパク質膜電気化学反応の比較。
(a) 図1fに示したデータから算出したHucのオンセット電位と、H2濃度の関数として算出された◆({{rm{E}}^{rm{0}},}}{{{rm{2}}{rh}}^{+}/{{rh{2}}}{{rm{2}}}の電位を示し、これらの電位の差（過電位η）はH2濃度に応じて一定であることが分かる。データは平均値+/-SDで示した（b）低H2での大腸菌Hyd2およびHyd1の挙動。アルゴン、N2、および指示されたレベルのH2からなる混合ガスをヘッドスペースに流し、固定化したヒドロゲナーゼでサイクリックボルタモグラムを記録した。上：E. coli Hyd2、下：E. coli Hyd1。E. coli Hyd1。破線の縦線はH+/H2カップルの電位を示し、pH7、5%H2、常圧で計算した。(c) ヒドロゲナーゼを固定化したサイクリックボルタモグラム。酵素を含まない混合バッファ（pH7.0、25℃）で、ヘッドスペースにアルゴン、N2、H2を含む混合ガスを流し込む。破線の縦線はH+/H2カップルの電位を示し、pH7、常圧の5%H2について計算した。各酵素について、一連のスキャンは、低H2から高H2の順に同じ酵素フィルムで記録された。上段。Huc；中パネル。大腸菌Hyd1、下パネル。E. coli Hyd2。H2が5%のとき、Hyd1はH2酸化のオンセット電位-340 mVを示し、Hucで観察されたオンセット電位-120 mVよりも負側にあることがわかった。一方、Hyd2は5%H2において可逆的な触媒作用を示し、H+還元とH2酸化の電流がゼロ電流電位を切り、熱力学的㊙電位である-375 mVに非常に近い電位を示した（{{rm{E}}{{rm{2}}{rm}H}}^{+}/{{rm{H}}_{{rm}2}}}）．Hyd2に対するH+還元電流は、H2濃度が低下し、生成物阻害が緩和されると大きさが増加する。
出典データ
Extended Data 図3 Hucオリゴマーの低温電子顕微鏡による可視化と3D再構成。
(a) ガラス固化した精製Hucオリゴマーの運動補正顕微鏡写真。膜小胞に結合したHuc（左パネル）と遊離Huc（右パネル）。(b) Hucオリゴマーの2次元クラスアベレージ。C4対称性と柔軟な膜結合ストークを示す。(c) Hucオリゴマー再構成のためのデータ処理ワークフロー。(d) Hucオリゴマー再構成に使用した粒子のオイラー角分布。(e) 2つの独立したハーフマップから計算された金標準フーリエ殻相関 (FSC) 曲線は、FSC = 0.143 で全体の解像度が 2.19 Å、Guinier プロットは 57.2 のシャープニング B ファクターを示す。 (f) Huc オリゴマーの局所解像度マップ。Huc コアから周辺まで ~1.8 から 4.8Å の解像度範囲を示し、領域間の大きな動きを示すことが分かる。
Extended Data 図4 Hucオリゴマーとダイマーの低温電子顕微鏡再構成のマップ品質、およびHucストーク領域の低温電子顕微鏡密度マップとAlphaFoldモデル。
(a) 1つのHucローブ（HucS2L2）と2つのHucM分子に対する2.19ÅのHucオリゴマー再構成からのマップ。(b) HucSとHucMのヘリックスと、オリゴマー再構築による関連密度。(c) 1.52ÅのHuc二量体再構成からのマップ。(d) Huc二量体再構成から得られたアミノ酸に対応する密度の例（5または15σで輪郭を描く） (e) 補足図4の低温電子顕微鏡密度マップからの茎領域 (f) 2.19 ÅデータセットからのHuc茎および体マップ領域の合成図。(g) パネルfの複合マップの切断面。密閉された部屋とHuc複合体の中心を示す。(h) HucM C末端ストーク領域のAlphaFoldモデルの表面図。静電表面（左）と疎水性残基で囲まれた内部表面（右）を切り取ったもの。(i) パネルdのHucM C末端領域。ストークの基部にある正電荷領域（左）と、この領域にアルギニンとリジン残基が多く存在すること（右）を示している。
Extended Data 図5 HucS鉄硫黄クラスターの3×[3Fe-4S]への帰属と酸化型HucのNi-B状態。
(a) 3つのHucS [FeS]クラスター（黄色）および追加の非システィン [FeS]クラスター相互作用残基（赤色）に対応する彫刻密度マップのクロスアイステレオ画像。密度マップは、1.52ÅのHuc二量体の再構成を5σにコンターしたものである。 (b) 低温（7K）でHuc溶液の酸化状態（Huc-Air）とH2還元状態（Huc-H2）から集めたEPRスペクトル；変調周波数100kHz、振幅10G；マイクロ波周波数9.4GHz、パワー2mW。H2フラッシュした試料の低Tでのスペクトルは、還元型[4Fe-4S]+クラスターによく見られる菱形成分の寄与は確認できなかった。(c) 10K（黒）と40K（緑）で測定した分離したままのHucのEPRスペクトルを拡大した図。低温で複数のピークが見られるのは、EPR活性を持つNi中心と[3Fe-4S]+クラスターの間に強いスピン-スピン相互作用があり、「スプリット」ニッケルシグナルが観測されているためと考えられる。高温では、このスプリットシグナルは崩壊し、より正規のNi-Bシグナルに特徴的なスペクトルが回復する。g=2.36、2.22、2.00の単一種のシミュレーションを重ね合わせ、3番目のg値はクラスター信号と重なるため未解決であることに注意。3番目のg値はクラスターのシグナルと重なるため未解決である。(d) Hucの単離した状態（黒）とH2還元した状態（赤）のEPRスペクトルを7Kで比較した拡大図。ニッケルシグナルはH2インキュベーションにより大きくシフトすることがわかる。スペクトルの異方性の減少は、Ni-BからNi-Cへの変換で予想される変化と一致するが、信号の分裂はまだ観察されている。
出典データ
Extended Data 図6 HucSLのH2またはO2存在下での分子動力学シミュレーション。
(a) Desulfovibrio vulgaris 由来の [NiFe] 水素化酵素の大小サブユニット（PDB ID = 4U9H）24の拡大図。[NiFe] 活性部位への基質アクセスを提供する疎水性ガスチャンネルの位置と幅が示されている。トンネル幅の統計については、補足表2を参照。(b) Hucの[NiFe]クラスターにH2分子とO2分子が接近していることを、分子動力学シミュレーションを通して示す累積占有率プロットである。(c) 分子動力学シミュレーションでHuc [NiFe] クラスターに最も接近したO2分子の代表的なサブセットの位置の拡大図。疎水性ガスチャネルの経路は青、緑、シアンの球で示されている。(d) パネルcで説明したO2の拡大立体図。 (e) と (f) パネルcとdで説明した、Huc [NiFe] クラスターに最も近接したH2分子の代表的サブセットの位置を表示。 (g) H2存在下のHuc MDシミュレーションにおける、セリン104とアルギニン443の近接度を示す距離-時間プロットである。(h)O2存在下でのHucシミュレーションにおける、セリン104とアルギニン443の相対的な近接を示す距離-時間プロットである。(i) Huc MDシミュレーションで得られた状態1（上段）と状態2（下段）におけるアルギニン443の相対位置。
Extended Data Fig. 7 Hucガスチャネル変異体の触媒部位への酸素の接近性を示す分子動力学シミュレーション。
(a) Huc MDシミュレーションにおける、WTおよびガスチャネル変異体Hucの[NiFe]クラスターへのH2およびO2の相対的接近を示す距離-時間プロット。(b)分子動力学シミュレーションを通して、WTおよびガスチャンネル変異型Huc変異体の[NiFe]クラスターへのH2およびO2分子の近接を示す累積占有率プロットである。(c) MDシミュレーションのRun 1で得られたWTおよびガスチャネル変異型Huc変異体の触媒クラスターを包含するHucの領域の構造表現で、シミュレーションの各フレームでこの領域におけるO2分子の位置を示している。また、E15A + I64A変異体およびE15A + I64A + L112A変異体においてO2アクセスが促進された領域が示されている。
Extended Data Fig. 8 大気、N2、H2存在下でのHucのFTIR分析。
(a) 空気中で平衡化したHucの絶対FTIRスペクトル。その後、標識ガスの100%雰囲気中で平衡化し、さらに空気中で平衡化する。[NiFe]クラスター状態は、文献由来の値（補足表3参照）に基づいて割り当てられている。(b) パネルaに示したスペクトルから得られた差分スペクトル。 (c) Hucを大気から100%H2雰囲気に移した直後のFTIR割り当て状態の相対分率を示す時間経過プロット。数分の時間スケールで、水酸化物結合Ni-Bを犠牲にして触媒Ni-R状態が発現する。 (d) Ni-SI, Ni-R 混合状態でのHucを100%窒素から100%H2雰囲気に移した直後のFTIR割り当て状態の相対分率を示す時間経過プロット。触媒的なNi-R状態は、数秒の時間スケールで、非水素結合の還元型Ni-SI状態を犠牲にして、人口に膾炙するようになる。(e) 100%N2から80%:20%N2→O2へのNi-SI状態でのHucの移動に伴う[NiFe]クラスタの状態の時間経過プロット。最初は、Ni-SI状態が水素結合のNi-CとNi-R状態を犠牲にして人口され、その後、数分の時間スケールでNi-SIを犠牲にしてNi-B状態が人口される。 (f) 大腸菌由来のHyd2が100％N2から99％：1％N2→O2に移行した後の[NiFe]クラスター状態のタイムコース・プロットです。Ni-B状態は、数秒のタイムスケールで、他のすべての状態を犠牲にして急速に人口が増加している。データはSengerら201885から。(g) [NiFe]-ヒドロゲナーゼの提案された触媒サイクルのスキームで、FTIR分析中にHucによって占有される状態を示す。(h) 提案されたHucの各状態のFTIRスペクトルから特定されたCOバンドとCNバンドの振動周波数。ピークの位置とFWHMの単位はcm-1。
出典データ
Extended Data 図9 Hucと酸素に敏感な[NiFe]水素化酵素の比較。
(a) Huc [NiFe]クラスターとその周辺のアミノ酸の立体構造図。O2感受性ヒドロゲナーゼで保存されているアミノ酸を青で、分岐している残基を赤で示す。分岐したアミノ酸にはアミノ酸の種類と位置が記されている。(b) パネルaのHuc触媒部位残基とD. vulgarisのO2感受性ヒドロゲナーゼ（PDB ID = 4U9H）の残基をステレオビューで重ね合わせたものです。Hucの残基はパネルaと同様に色付けし、D. vulgarisのヒドロゲナーゼの残基はシアン（保存）、ピンク（分岐）に色付けしてある。(c) HucとD. vulgarisヒドロゲナーゼの触媒部位残基の配列アラインメント。 (d) HucLのD-ヒスチジン166を棒状にした十字架立体視で、アミノ酸のキラリティを示す。対応するCryo-EM密度マップを5σで示し、密度がD-異性体と一致することを示す（上図）。参考のため、L-ヒスチジン194フォームHucLを示す（下パネル）。(e) D. vulgarisヒドロゲナーゼのL-ヒスチジン235の位置。これはHucのD-ヒスチジン166に対応し、近位の4Fe-4Sクラスターとの相互作用を示している。(f) HucのD-ヒスチジン166とD. vulgaris hydrogenaseのL-ヒスチジン235の相対位置を重ね合わせ、D-異性体がHucの主鎖の位置をどのように移動させるかを示している。
Extended Data 表1 低温電子顕微鏡データの収集、精密化、検証の統計情報
フルサイズテーブル
補足情報
補足情報
本ファイルには、補足図1～5、補足表1～4、補足注1～4、参考文献が含まれています。
報告書の概要
ピアレビューファイル
補足データ（補足図4）
このファイルには、補足図4のソースデータが含まれています。
補足動画1
Hucの3D変動解析では、葉間の移動が顕著に見られる。
補足動画2
Huc proximal [3Fe-4] クラスターの配位と密度マップ。
補足動画3
Huc medial [3Fe-4] クラスターの座標と密度マップ。
補足動画4
Huc遠位[3Fe-4]クラスターの配位と密度マップ。
補足動画5
全長Huc複合体の構造再構築。
補足動画6
HucLポリペプチドのD-His166を含む領域の密度分布図
補足映像7
HucLポリペプチドのL-His193を含む領域の密度マップ。
補足動画8
Hucの電子輸送リレー
補足映像9
Hucのメナキノン結合部位は、HucSのTyr229によってゲートされている。
補足動画10
Hucは、メナキノンを還元するための疎水性チャンバーを内部に有している。
出典データ
ソースデータ Fig.1
ソースデータ Fig.3
ソースデータ Fig.4
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
ソースデータ拡張データ Fig.
権利と権限
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際ライセンスの下でライセンスされています。このライセンスは、原著者と出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更があった場合にそれを示す限り、あらゆる媒体や形式での使用、共有、適応、配布および複製を許可します。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、素材へのクレジット表示で別段の指示がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれておらず、あなたの意図する使用が法的規制によって許可されていない場合、または許可された使用を超える場合、あなたは著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。
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Grinter, R., Kropp, A., Venugopal, H. et al. 大気中の水素から細菌がエネルギーを取り出すための構造的基礎(Structural basis for bacterial energy extraction from atmospheric hydrogen). Nature (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05781-7
引用元：ダウンロード
2022年5月17日受理
2023年2月2日受理
2023年3月8日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41586-023-05781-7
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対象者
細菌学
クライオエレクトロンマイクロスコピー
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ネイチャー（Nature） ISSN 1476-4687（オンライン） ISSN 0028-0836（印刷物）
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