アスピリンはロタウイルスの複製を阻害し、ラットの腸内微生物組成を変化させる
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公開日：2023年10月17日
アスピリンはロタウイルスの複製を阻害し、ラットの腸内微生物組成を変化させる
https://virologyj.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12985-023-02199-5
Wei Zhao, ZhouPing Li, ...Yong Gang Li 著者一覧を見る
Virology Journal 20巻 記事番号：237 (2023) この記事を引用する
メトリクス詳細
要旨
背景
アスピリンはさまざまな臨床症状の治療に広く使用されている。アスピリンには抗ウイルス作用があることが示唆されているが、ロタウイルスに対する特異的作用についてはほとんど知られていない。
方法
MA104、Caco-2およびCV-1細胞にロタウイルスを感染させ、12時間後にアスピリンを添加した。in vivoでの検証のため、40匹の特異的病原体を持たないSDラットを無作為にアスピリン経口投与群（ASP）と対照群（NC）に分けた。腸内細菌叢を同定するために16 S rRNA遺伝子配列決定を行った。6ヵ月間のASP/NC連続投与後、ラットをロタウイルスに感染させた。30日間にわたって糞便サンプルを採取し、ウイルスレベルを定量した。炎症性サイトカイン/ケモカインレベルをELISAで測定した。
結果
アスピリンは細胞株およびラットにおいてロタウイルス感染を阻害した。ウイルス複製に対するアスピリンの効果は、アスピリンによる腸内細菌叢組成の変化と関連しており、アスピリン投与後は、ファーミキューテス属の存在量が増加し、バクテロイデーテス属の存在量が減少した。メカニズム的には、アスピリンはIL-2とIL-10レベルを減少させ、IRF-1とCOX-2レベルを増加させた。アスピリンはin vitroおよびin vivoでロタウイルスの複製を阻害したが、これはIRF-1、COX-2、ケモカイン、および腸内細菌組成への影響と関連している可能性がある。
結論
これらの結果は、アスピリンの長期経口投与がロタウイルス感染を減少させることを示している。アスピリンを長期間内服している高齢者では、腸管ウイルス感染が抑制される可能性がある。腸内細菌叢の変化は腸管の機能障害につながる可能性があり、プロバイオティクスによる臨床的補助療法の参考となる可能性がある。
背景
ロタウイルスは、レオウイルス科の非エンベロープ型二本鎖RNAウイルスで、重症ウイルス性胃腸炎の最も重要な原因であり、生命を脅かすこともある [1, 2]。世界中のほぼすべての5歳未満の小児、高齢者、慢性疾患患者がロタウイルス感染の主なグループである [3]。ロタウイルスは通常、成熟した小腸の腸管細胞で複製され、血流に入り、抗原血症とウイルス血症を引き起こす。ロタウイルスの疫学に関する広範な実験的研究 [6, 7]があるにもかかわらず、臨床の現場では、長期間薬を服用している高齢者や慢性疾患患者におけるロタウイルス感染に関する詳細な研究が不足している。
アセチルサリチル酸とも呼ばれるアスピリンは、軽度の痛みを和らげ [8]、発熱を抑え [9]、炎症を抑え [10]、トロンボキサンA2の生成を阻害して血小板凝集を防ぐ [11] ために一般的に使用されている。血栓を抑制するアスピリンの能力は、心臓発作や脳卒中の予防薬としての有用性の根底にある [12,13,14] 。低用量アスピリン投与（75～100mg/日）は、重要な内皮細胞機能に影響を与えることなく、血小板凝集を効果的に抑制することができる [13] 。また、可溶性アスピリンを分割経口投与することで、急性胃腸炎の乳児や幼児における腸液減少や下痢を有意に減少させるという報告もある [15] 。胃腸炎を引き起こすウイルス病原体のような腸管感染因子に対するアスピリンの潜在的な効果に関する情報は限られているが、インフルエンザAウイルスを含むヒト病原性ウイルスのパネルに対して抗ウイルス薬として機能することが示されている [16, 17]、 ヒトライノウイルス（HRV）[18]、水痘帯状疱疹ウイルス（VZV）[19]、サイトメガロウイルス（CMV）[20]、C型肝炎ウイルス（HCV）[21、22]、エプスタインバーウイルス（EBV）[23]、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（RSV）[24]、日本脳炎ウイルス（JEV）[25]、デングウイルス（DENV）[26]、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）[27、28]などである。
最近では、抗炎症作用、抗血小板凝集作用、抗凝固作用、免疫系の調節作用、ウイルスの複製や侵入を阻害する可能性があることから、COVID-19の治療におけるアスピリンの潜在的な役割が提唱されている［29,30,31］。しかし、アスピリンがin vitroおよびin vivoでロタウイルスの複製と感染を阻害できるかどうかは報告されていない。
in vitroでのアスピリンの抗ウイルス効果および慢性ロタウイルス感染に対する長期効果を調べるため、in-cellモデルを用いてin vitroでのアスピリンの抗ウイルス効果を評価した。ラットを用いた長期アスピリン投与薬物モデルを確立し、さらにロタウイルスに感染させた。in vitroとin vivoの両モデルでロタウイルス感染に対する効果を評価した。その結果、アスピリン投与により細胞内でのロタウイルスの複製が抑制され、ラットモデルにおいてもロタウイルス感染が抑制された。アスピリンを長期間経口摂取したラットの腸内細菌叢は特異的に変化しており、これがアスピリン経口摂取の有無によるロタウイルス感染の差につながったと考えられた。さらに、アスピリンはIRF-1とCOX-2の発現を増加させる一方で、IL-2とIL-10の発現を抑制した。これらの結果は、ロタウイルス感染時にアスピリンを長期服用している高齢者の臨床投薬やプロバイオティクスの使用に参考になる。
材料と方法
ウイルス、細胞株、ウイルス感染
ロタウイルスSA11株（シミリアンRV SA11株、G3P）は、大阪大学の小林博士から提供された。アフリカミドリザル胎児腎臓CV-1細胞、アカゲザル腎臓MA104細胞、およびヒト結腸腺癌Caco-2細胞（Cell Resource Center, IBMS, and CAMS/PUMC、北京、中国）は、10％ウシ胎児血清（GIBCO, Paisley, UK）および抗生物質（Sigma-Aldrich, St. ロタウイルスSA11の増殖にはMA104細胞を用いた。Caco-2細胞およびCV-1細胞は既述のように感染させた[32]。簡単に述べると、細胞単層をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で3回洗浄し、1μg/μlのトリプシン（Sigma-Aldrich, St. 1時間の吸着後、細胞を0.5μg/mlのトリプシンを含むMinimal-Essential Mediumにプレーティングした。ウイルス力価は蛍光フォーカスアッセイでカウントし、RNAウイルス量はqRT-PCRで定量した。
アスピリン細胞毒性の測定
抗ウイルス活性の評価に用いる無毒性量のアスピリンを同定するため、アスピリンの連続希釈液で細胞を連続培養した。アスピリンを処理しない細胞をコントロールとして用いた。12、24、36、48時間後にCCK8アッセイを行い、細胞毒性の閾値を決定した。細胞は96ウェルプレートに、1ウェルあたり100μLの培地に5000個の密度で、実験の1日前にプレーティングした。毒性濃度の限界を決定するため、細胞はアスピリンとコントロールの希釈度（10～0.005 mol/ml ）を変えながら、37℃、5% CO2で培養した。細胞の生存率は、CCK-8キット（Benefiting Lives, Serving Life Science, Beijing, China）を用いて、製造元の指示に従って調べた。
ロタウイルス感染モデルラットへのアスピリン経口投与の実験デザイン
錦州医科大学実験動物センター（中国、遼寧省）より、40匹の1ヶ月齢の特定病原体非感染SDラット（平均体重200g、雄/雌）を提供された。すべての実験用ラットは、同じ病原体非存在室内で、個別に換気されたオートクレーブケージに収容された。動物の生活環境、摂食条件、微生物条件は、12時間の明暗サイクルで、22±2℃、湿度40～70％に一貫して維持された。ラットを無作為にアスピリン経口投与群（ASP）と対照群（NC）に分けた。ASP群には0.5％カルボキシメチルセルロース溶液に溶解したアスピリン（アスピリン腸溶錠100mg/錠、Bayer AG、ドイツ）を以下の計算に従い経口投与した： ラット投与量＝（ヒト投与量、mg/kg）×70kg×0.018/200g＝ラット1匹あたり630mg（ラット体重1gあたり3.15mg）。NC群には対照として0.5％カルボキシメチルセルロース溶液1mlを経口投与した。アスピリンまたは対照液を6ヶ月間継続投与した（フロー図を補足図1に示す）。
図1
図1
ロタウイルスに対するアスピリンの用量依存的抗ウイルス活性のqRT-PCRアッセイ
細胞にロタウイルスSA11株を感染させ、異なる濃度のアスピリン（0.6、0.3、0.15、0.08 mol/ml）を12時間培養液に添加した。MA104（A）、Caco-2（B）およびCV-1（C）細胞について、細胞培養における阻害率（感染させたが非処理細胞に対する相対値）を示した。リバビリン（0.2 mol/ml）を内部陽性対照として用いた。データは3反復から得られたもので、3回の独立した実験の代表値である。すべてのウイルスは107 FFU/mlで使用した。RV、ロタウイルス；ASP、アスピリン。* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001
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6ヵ月後、2群に同量のロタウイルスSA11（1日106PFU/ml）を30日間持続感染させた。介入期間中、体重を記録した。感染後6日目、12日目、18日目、24日目、30日目に糞便サンプルを検出した。ウイルス力価およびウイルス遺伝子複製は、それぞれ蛍光フォーカスアッセイおよびqRT-PCRにより定量した。ラットの結腸および直腸粘膜は、オートクレーブ滅菌した手術用ナイフの刃を用いて採取し、滅菌チューブに入れて-80℃で保存した。
すべての動物実験は、錦州医科大学のガイドラインに従って行われ、錦州医科大学動物福祉倫理審査委員会の承認を得た（承認ID：202,014）。すべての動物感染および感染作業は、バイオセーフティレベル2の施設で行った。
ラット便サンプル中の腸内細菌叢の16 S rDNA配列決定
微生物叢組成を評価するため、16匹のラット（ASP群8匹、NC群8匹）の便サンプルを16 S rRNA遺伝子配列決定により評価した。DNAは、QIAamp DNA Stool Mini kit（Qiagen Inc. 細菌性16 SリボソームRNA遺伝子のV3-V4領域（342 Fおよび806R）は、既述のようにqRT-PCRで増幅した[34]。サンプルはIlluminaMiSeqプラットフォーム（Illumina, Inc.
α多様性は、各サンプルのクリーンリード数を正規化するソフトウェアを用いて計算した[35]。2つのグループ間で共有されるβ多様性は、UniFrac距離行列[36]を用いて計算した。UniFrac距離に基づいて、グループの類似性を主座標分析プロットした。線形判別効果量（LefSe）分析を用いて、ASP群とNC群の違いを説明する可能性が最も高い特徴を決定した。LDAスコアを持つ異なる特徴が同定された [37]。分類学的および機能的プロファイルの統計解析は、Reconstruction of Unobserved States (PICRUSt) [38, 39]を用いた第2レベルのKEGG解析により、さらなる探索に用いられた。
COX-2およびIRF-1 mRNAのqRT-PCR
TRIzol試薬（Invitrogen社）を用いて、Caco-2細胞から全RNAを抽出した。次に、PrimeScript Reverse Transcriptase（TaKaRa Bio, Dalian, China）を用いて1μgの全RNAからcDNAを逆転写した。qRT-PCRは、SYBR PrimeScript RT-kit（TaKaRa Bio, Dalian, China）と以下のプライマーを用いて行った： COX-2：フォワード5′-CGGTGAAACTCTGGCTAGACAG-3′、リバース5′-GCAAACCGTAGATGCTCAGGGA-3′、IRF-1：フォワード5'-ACCCTGGCTAGAGATGCAGA-3'、
Reverse 5'-GCTTTGTATCGGCCTGTG-3'; GAPDH: Forward 5-GTCT CCTGA CTT CAACAGCG-3, Reverse 5'-ACC ACCC TGTT GCT GTA GCC AA-3'.
COX-2、IRF-1、およびGAPDH転写物の発現は、3連の閾値サイクル（CT）平均値法を用いて分析した。ウイルスRNAとGAPDHの相対発現は、2-ΔΔCT法を用いて計算した。結果はBio-Rad IQTM5光学系ソフトウェアを用いて解析した。群間の差はStudent's t-testを用いて調べ、P < 0.05を統計的有意性の閾値とした。データは平均値±SDで示した。
酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）
ラットの結腸組織を摘出し、主軸に沿って縦に切り開いた後、通常の生理食塩水（0.9％NaCl）で洗浄した。大腸の内部粘膜をオートクレーブ滅菌した手術用ナイフの刃で静かに削り取り、リン酸緩衝生理食塩水に入れてボルテックス混合した。上清は遠心分離後、ELISA検出用とした。血清中のプロスタグランジンE2(PGE2)(No.875)、アデノシン三リン酸(ATP)(No.20,973)、トロンボキサンA2(TXA2)(No.7477)、cAMP(No.14,171)、大腸粘膜中のTNF-α(No.1113)の検出にはELISAキット(江蘇美麵工業有限公司)を用いた。また、大腸粘膜中のIL-10(ZK-4375)およびIL-2(ZK-5859)はELISAキット(Shanghai Zhen Ke Biological Techology Co., Ltd.)を用いて検出した。
統計解析
統計解析は、GraphPad Prism Version 5.01（La Jolla, CA, USA）を用いて行った。治療群と対照群間の実験データの統計的比較は、両側スチューデントのt検定または一元配置分散分析（ANOVA）を用いて行った。実験結果は平均値±標準偏差（SD）で表した。P値＜0.05を統計的に有意とみなした。
結果
アスピリンはin vitroでロタウイルスの複製を阻害する
アスピリンの抗ウイルス活性を決定するアッセイの前に、抗ウイルスアッセイに使用した細胞に対する細胞毒性効果を決定する必要があった。10mol/mlのアスピリン濃度では、細胞単層の溶解の程度が異なり、3つの細胞株すべてで20％以上の細胞毒性を示した。しかし、MA014細胞（補足図1A）では2.5 mol/mlから0.3 mol/mlの範囲で、Caco-2細胞（補足図1B）およびCV-1細胞（補足図1C）では1.3 mol/mlから0.08 mol/mlの範囲で、20%未満の細胞毒性が達成された。MA104およびCV-1細胞では0.6 mol/ml未満、Caco-2細胞では0.08 mol/ml未満の濃度では、アスピリンの毒性作用は検出されなかった。したがって、その後の抗ウイルス活性のアッセイでは、上限0.6 mol/mlのアスピリンを用いた。
アスピリンがロタウイルスの複製を阻害できるかどうかを調べるため、MA104、Caco-2、CV-1細胞にロタウイルスSA11株を感染させ、異なる濃度のアスピリンを培養液に添加した。12時間後、ロタウイルス負荷量をVP6遺伝子のqRT-PCRで測定した。アスピリンの抗ウイルス効果は、3つの細胞株すべてで観察された（図2）。MA104（図2A）およびCV-1（図2B）では、0.6mol/mlのアスピリンはウイルス複製を4.5％阻害し、0.3mol/mlおよび0.15mol/ml希釈液もウイルス複製を阻害した。さらに、Caco-2細胞（図2C）では、0.6 mol/mlのアスピリンはウイルス複製を6.5%阻害し、0.3 mol/mlでも効果があったが、0.15 mol/mlではウイルス複製に検出可能な効果はなかった。これらの結果から、アスピリンの効果は用量依存的かつ細胞依存的であるが、0.6 mol/mlのアスピリンは3つの細胞株すべてにおいてロタウイルスの複製を阻害するのに有効であることが示唆された。
図2
図2
ロタウイルスに対するアスピリンの抗ウイルス活性の免疫蛍光アッセイ
異なる宿主細胞におけるロタウイルスに対する抗ウイルス活性を定量化するために、蛍光フォーカスアッセイを行った。(A)、Caco-2 (B)、CV-1 (C) MA104。ウイルス感染（107 FFU/ml）後、培養液中に異なる濃度のアスピリンを添加した。12時間後、上清を回収し、免疫蛍光法によりウイルス力価を測定した。陰性対照として非処理ウイルス感染細胞を用い、内部陽性対照としてリバビリン（0.2mol/ml）を用いた。ウイルス力価＝（蛍光量×希釈率）/ウェルあたりの添加ウイルス量×1000。RV、ロタウイルス；ASP、アスピリン。*p = 0.0003, **p = 0.0002, ***p = 0.0001
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アスピリンがロタウイルスの複製を阻害することを確認するために、免疫蛍光アッセイを行った（図3）。その結果、アスピリンは用量依存的にウイルス力価を阻害することが確認され、3つの宿主細胞株すべてにおいて0.6 mol/mlと0.3 mol/mlで最も顕著な阻害効果が観察された。これらの結果から、0.6 mol/mlのアスピリンが宿主細胞におけるロタウイルスの感染と複製を最も効果的に阻害することが確認され、抗ウイルス剤としての有用性が確認された。
図3
図3
ロタウイルス感染ラットモデルにおけるアスピリン長期投与の抗ウイルス活性の測定
40匹のラットを無作為にコントロール（NC）群（0.5％カルボキシルメチルセルロース溶液1ml経口）とASP群（アスピリン経口）に分けた。6ヵ月後、2群に同量のSA11（106 PFU/ml/日）を30日間感染させた（NC-RVおよびASP-RV）。6、12、18、24、30日後のラット糞便中のウイルス力価およびウイルスRNAを蛍光測定法（A）およびqRT-PCR法（B）で評価した。RV、ロタウイルス；ASP、アスピリン
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アスピリンの長期投与はラットロタウイルス感染モデルにおいて抗ウイルス活性を促進した
アスピリンがin vitroでロタウイルスの複製を阻害する能力があることを示す上記の証拠を踏まえて、アスピリンの長期投与がin vivoでロタウイルスの持続感染を阻害するかどうかを評価しようとした。明らかな下痢症状は観察されず、アスピリンもウイルス感染もラットの体重や成長に影響を与えなかった（データは示さず）。免疫蛍光病巣（FFU/mL）の結果によると、蛍光細胞数はNC-RV群で24日目に最も多く、30日目に減少した（図3A）。対照的に、ASP-RV群では30日間の時間経過のどの段階でも蛍光細胞は検出されなかった（補足図2）。qRT-PCRの結果と一致して、ASP-RV群のラットはRV感染ラットのみよりも時間経過を通じてウイルスコピー数が少なかった（図3B）。これらの結果から、ラットにアスピリンを長期経口投与すると、ロタウイルス感染が抑制されることが示唆された。
長期アスピリン投与によるラットの腸内細菌叢の変化
アスピリン経口投与中の腸内微生物の変化を調べるため、NC群とASP群から各8匹のラットを無作為に選び、16 S rRNA遺伝子の塩基配列を決定した。ベン図（図4A）に見られるように、589の操作分類単位（OTU）がASP群とNC群で共有されていた。図4Bに示すように、腸内細菌叢の豊かさと群集の多様性はASP群よりもNC群で著しく低く、アスピリン投与後のラットではより多くの細菌種がコロニー形成されていたことを示している（図4B）。β多様性解析と一致して、NC群の腸内細菌叢はASP群と異なっていた。この結果から、ASP群とNC群では細菌組成が明確に分離し、明確な違いがあることが示唆された（図4C）。次に、両群間の細菌分類群の違いを門、属、科レベルで検討した。門レベルでは、NC群ではASP群に比べ、ファーミキューテス類の相対量が少なかった。一方、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）はASP群と比較してNC群で多かった。その結果、NC群ではASP群に比べてファーミキューテス/バクテロイデーテス比が低く、アスピリン経口投与後に腸内微生物の組成と構造が有意に変化したことが示された（図4D）。属レベルでは、NC群ではPrevotella属とLactobacillus属が豊富であったが、ASP群では減少し、ASP群ではAnaerostipes属、ClostridiumXlVa属、Alloprevotella属が豊富であった（図4E）。ファミリーレベルでは、PrevotellaceaeとLactobacillaceaeはNCグループで濃縮されたがASPグループで減少し、Lachnospiraceae、Ruminococcaceae、PorphyromonadaceaeはASPグループで濃縮された（図4F）。
図4
図4
アスピリン経口投与ラットモデルにおける腸内微生物の変化の特徴
(A）アスピリン（ASP）群と対照（NC）群のOTUのベン図。(B）ASP群とNC群の細菌多様性は、観察種多様性、Chao-1、Shannon index、Simpson indexによって推定した。(C）NC群とASP群におけるβ多様性は、Weighted Unifrac ANOSIM分析によって評価した。UniFrac距離に基づいてグループ間の類似性を主座標分析プロットした。主成分PCOA1とPCOA2はそれぞれ分散の76.87%と8.55%を説明した。(D-F) 門、属、科レベルで割り当てられたOTUの相対存在量。(G) NCグループとASPグループ間の分類学的差異のLEfSe分析。ASP群（赤）とコントロール群（青）で見つかった分類学的バイオマーカーを線形判別分析効果量（LEfSE）で同定した。ASP群とNC群で有意差のある微生物群から得られたLDAスコアは、回帰分析によって確認された（LDA閾値2）。(H）レベル2のKEGGパスウェイに関連する16SrRNA遺伝子シーケンスにおける予測遺伝子の機能的差異
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2群間の顕著な特徴を同定するために、線形判別分析効果量（LefSe; LDA Effect Size）分析を行った。NC群ではプレボテラ属、乳酸桿菌属、ブドウ球菌属が濃厚であったが、ASP群ではアネロフスチス属、ジェメラ属、連鎖球菌属が優勢であった（図4G）。これらの違いの機能的帰結を評価するために、第2レベルのKEGGパスウェイ解析を行った。NC群では「消化器系」、「細胞増殖と死」、「シグナル伝達分子と相互作用」、「免疫系疾患」、「ヌクレオチド代謝」に関連する機能が濃縮され、アスピリン経口投与ラットモデルでは「細胞運動」、「シグナル伝達」、「排泄系」、「環境適応」、「脂質代謝」に関連する機能が濃縮された（図4H）。これらの結果は、腸内細菌叢の違いがアスピリン投与ラットにおけるロタウイルスに対する反応の違いに寄与している可能性を示唆した。
アスピリンの長期投与は、ラットの炎症性サイトカイン/ケモカインの発現レベルを低下させた
ロタウイルス感染ラットでは、インターロイキン-2（IL-2）（図5A）、インターロイキン-10（IL-10）（図5B）が高値を示し、感染と同時にアスピリンを投与すると、その上昇が一部回復した。一方、腫瘍壊死因子α（TNF-α）のレベルは変化せず（図5C）、ATPとcAMPの血清レベルはロタウイルスによって低下した。しかし、アスピリンによって影響を受けたのはcAMPだけであった（図5D、E）。逆に、TXA2とPGE2のレベルはロタウイルスによって増加し、TXA2ではなくPGE2のレベルはアスピリン処理によってさらに増加した（図5F、G）。
図5
図5
アスピリン経口投与ラットロタウイルス感染モデルにおける炎症性サイトカイン・ケモカインレベル
対照ラット（NC）およびアスピリン（ASP）を6ヵ月間連続投与および/またはSA11ロタウイルス（RV）に30日間感染させたラットの炎症性サイトカイン/ケモカインレベルをELISAで検出した。(A) IL-2、(B) IL-10、(C) TNF、(D) ATP、(E) cAMP、(F) TXA2、(G) PGE2.* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001
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ロタウイルスを阻害するアスピリンのメカニズムを評価するために、抗ウイルス宿主タンパク質であるインターフェロンの転写活性化因子であるIRF-1に対する潜在的効果を検出した[40]。その結果、0.6 mol/mlのアスピリンは3つの宿主細胞すべてにおいてIRF-1 mRNAを誘導した（図6A）。このことは、アスピリンの抗ウイルス活性の一部をインターフェロンが担っている可能性を示唆している。
図6
図6
アスピリンはIRF-1、COX2、PGE2の発現を促進する
Caco-2、CV-1、MA104細胞にロタウイルス（107 FFU/ml）を感染させ、0.6、0.3、0.15、0.08 mol/mlのアスピリンを12時間添加した。データは平均値±SDで示した。**P < 0.0001. (B) COX-2 mRNAの発現レベルは、12時間後の非感染細胞に対する感染細胞のCOX-2特異的プライマーを用いたqRT-PCRによって決定した。エラーバーは平均値の標準誤差を示す（n = 3）。(C）培地中に分泌されたPGE2をELISA法で定量した。サンプル間の有意差（, P 0.01;）を示す。エラーバーは平均値の標準誤差（n = 3）を示す。
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ロタウイルスがCaco-2細胞に感染すると、COX-2 mRNAの発現が増加し、PGE2プロスタグランジンの分泌が増加することが、これまでの研究で示されている[41]。アスピリンは、そのメカニズムの重要な特徴として、シクロオキシゲナーゼ1および2（COX-1およびCOX-2）を不可逆的に不活性化することにより、プロスタグランジンの合成を阻害する[42]。感染後24時間で、COX-2 mRNA発現レベルはロタウイルス感染により増加した（RV群）；しかし、ロタウイルス感染細胞（RV + ASP）にアスピリンを添加すると、COX-2 mRNA発現は有意に変化しなかった（図6B）。PGE2のmRNA発現量は、アスピリン添加後に宿主細胞で減少したが、ロタウイルス感染群とRV＋ASP群との間に統計学的有意差は認められなかった。これらの結果は、COXとPGE2がロタウイルス感染の重要な初期メディエーターを構成しているが、アスピリン投与ではCOX mRNA 2とPGE2活性は阻害されず、初期メディエーターでロタウイルス感染を阻害できない可能性を示した。
考察
アスピリンは、軽度の痛み、疼痛、発熱、および炎症を緩和するために、少なくとも115年間使用されてきた [18, 43]。さらに、アスピリンは血小板におけるトロンボキサンA2の形成を阻害することにより血小板凝集を阻害し、心臓発作や脳卒中の予防薬として特に有用である [12, 44, 45]。さらに最近では、アスピリンと細菌、ウイルス、真菌、寄生虫、およびそれらに関連する感染症によって引き起こされる感染症との関係が、蓄積されたデータによって実証されている［46］。しかし、アスピリンがウイルスの複製を減少させる能力について検討した研究はわずかである。
本研究では、ロタウイルスの細胞内感染を阻害するアスピリンの可能性を評価した。その結果、0.6mol/mlのアスピリンが3つの細胞株（MA101、CV-1、Caco2）においてロタウイルスの複製を阻害することが示された。COX-2およびプロスタグランジンカスケードの異常誘導が、ウイルスが介在する細胞障害に重要な役割を果たしているという仮説が、いくつかの科学的研究によって支持された [49, 50]。ロタウイルス感染は、非特異的COX阻害剤、およびCOX-1/COX-2特異的阻害剤によって抑制された[47, 48]。我々は、ロタウイルス感染12時間後にアスピリンを添加すると、宿主細胞におけるCOX-2の発現が阻害されることを見出した。24時間後、RV感染群と比較して、mRNAのCOX-2発現は増加したが、PGE2の活性は統計的に有意ではなかった。したがって、ロタウイルスに対するアスピリンの阻害効果は、COX mRNA発現やPGE2活性の阻害によるものではない可能性がある。この結果については、後期の実験研究においてさらに詳細な検証を続ける予定である。IL-10は、炎症のマスターネガティブレギュレーターであり、感染症の回復期に炎症性サイトカインの発現を制御・抑制するサイトカインシステムの重要な構成要素であると考えられており、その結果、炎症性サイトカインによって引き起こされるダメージを軽減した[51, 52]。様々な細胞集団に作用するIL-2の能力は、ウイルス感染中のIL-2感受性の変化における炎症反応を促進する可能性がある。ロタウイルスに感染したラットは、IL-2とIL-10の高値を示し、アスピリンを投与するとその上昇は部分的に回復した。
我々はまた、アスピリンの長期投与が腸内細菌叢とロタウイルスの感染性に及ぼす影響をラットで評価した。アスピリンを長期間服用する人の多くは高齢者である。そこで、アスピリンを6ヶ月間継続経口投与したラットを用いて、ロタウイルスの感染性を評価した。ラットに明らかな下痢症状は認められなかったが、ウイルスの複製は検出された。ラットの体重増加は、アスピリンの長期投与およびロタウイルス感染によって影響を受けなかった。しかし、ラットの腸内細菌叢の存在量はアスピリン無投与群と比較して有意に変化し、ロタウイルス感染価も低下した。
本研究では、アスピリン投与によるラットの腸内細菌叢の変化を16 Sシークエンスにより解析した結果、NC群とASP群では腸内細菌叢の組成が異なることが示された。腸内細菌叢に代表される主な門は、バクテロイデーテス門、ファーミキューテス門、放線菌門、プロテオバクテリア門、ベルコミクレビア門である[37, 54]。本研究では、アスピリン長期投与後、ファーミキューテスの発現が有意に増加し、バクテロイデスの発現が有意に減少し、ファーミキューテスとバクテロイデスの割合も有意に増加した。さらに、アスピリンの長期投与は、多くの腸内細菌叢の相対存在量の有意な変化と関連していた。アスピリンは腸内の微生物酵素によって代謝される可能性があり、その代謝は消化管内の微生物叢によって影響を受ける可能性がある。しかし、腸内細菌叢によるアスピリンの生体内変換はまだ明らかにされていない。おそらく、腸内細菌叢はアスピリン代謝に関与しており、腸内細菌叢を変化させることにより、アスピリンのロタウイルス効力阻害を調節できる可能性がある［55］。微生物叢の変化は、抵抗性を付与したり、病原性細菌による感染を促進したりする。病原性細菌は、微生物叢由来の炭素源や窒素源を栄養源や制御シグナルとして利用し、増殖や病原性を促進する [56] 。
我々は、アスピリンの長期経口投与がラットの腸内細菌叢の組成に影響を与え、ロタウイルス感染能力の変化につながると推測している。この影響はおそらく、宿主の違い、ウイルス感染価の違い、感染期間に関連していると思われる。しかし、この推測は今後の実験でさらに研究する必要がある。以上の結果から、アスピリンを長期間服用している高齢者の腸内では、ロタウイルスの感染が抑制されている可能性が示唆された。しかし、腸内細菌叢の変化は腸の機能障害につながる可能性がある。
結論として、アスピリンはin vitroおよびin vivoでロタウイルスの感染と複製を効果的に抑制する。アスピリンがロタウイルス感染を抑制するメカニズムには、ロタウイルスが誘導するCOX-2、IL-2、IL-10の発現抑制が関与している可能性がある。長期にわたるアスピリンの経口投与は、腸内細菌叢の組成を変化させることになり、このことがアスピリンの保護作用の背景にある可能性がある。
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参考文献のダウンロード
謝辞
SA-11株を提供してくださった小林武史博士（大阪大学国際感染症研究センター ウイルス複製研究室）に感謝する。
資金提供
中国国家自然科学基金（第81201285号）、中国遼寧省基金会教育部（助成金番号LJKMZ20221243）、中国遼寧省国家自然科学基金（第2021-MS-334号）。
著者情報
著者情報
Wei Zhao、ZhouPing Li、Mei Ling Yuは本研究に等しく貢献した。
著者および所属
錦州医科大学基礎医学学院、錦州、中国
Wei Zhao、Mei Ling Yu、Yang Liu、Chang Cheng Liu、Xue Jiao Jia、Meng Qi Liu & Yong Gang Li
中国、錦州市、錦州医科大学第一附属病院
李周平
貢献
WZとYGLは、本書の出版につながるプロジェクトを構想し、すべてのプロジェクトの監督者である。WZとYGLは研究の構想を練り、原稿の編集と修正を行った。MLY、ZPL、YL、CCL、XJJ、MQLはデータ取得と実験プロジェクト全体に参加した。著者全員が最終版を読み、承認した。
責任著者
Yong Gang Liまで。
倫理申告
倫理承認と参加同意
本研究では、錦州医科大学実験動物科のSDラットを使用した。錦州医科大学実験動物センター（中国遼寧省）より、2ヶ月齢の病原体フリーSDラット40匹（平均体重200g、雄雌ランダム）を提供された。すべての実験ラットは、同じ病原体フリールームの個別換気オートクレーブケージ（IVC）に収容した。動物の世話と使用に関する手順は、錦州医科大学実験動物倫理委員会（中国遼寧省錦州市）の承認を得ており、動物の倫理的使用に関して適用されるすべての機関および政府の規制に従っている。(承認ID：202014）。すべての動物感染および感染作業は、バイオセーフティレベル2の施設で行われた。
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社ノート
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。
電子補足資料
下記は電子補足資料へのリンクです。
補足図1
. アスピリンのin vitro細胞毒性。アスピリンのin vitro細胞毒性は、生理学的に活性な細胞で評価された： MA104（A）、Caco-2（B）、CV-1（C）。滴定曲線は、各細胞株について12時間（黒）、24時間（赤）、36時間（青）、48時間（緑）の各直列希釈で3反復を用いて決定した用量依存的細胞毒性を示す。
補足図2.
ASP-RV群では6、12、18、24、30日目にウイルス力価およびウイルスRNAを蛍光測定法で評価した。ASP-RV群では蛍光は検出されなかった。
補足図3.
アスピリンとウイルスのラットモデルへのスケジュール方法
権利と許可
オープンアクセス 本論文はクリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされており、原著者および出典に適切なクレジットを付与し、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合にはその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても使用、共有、翻案、配布、複製を許可する。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを閲覧するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。クリエイティブ・コモンズ・パブリック・ドメインの権利放棄（http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/）は、データへのクレジット表記に別段の記載がない限り、この記事で利用可能となったデータに適用されます。
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この記事の引用
Zhao, W., Li, Z., Yu, M.L. et al. Aspirin inhibits rotavirus replication and alters rat gut microbial composition. Virol J 20, 237 (2023). https://doi.org/10.1186/s12985-023-02199-5
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受領
2023年08月07日
受理
2023年10月02日
発行
2023年10月17日
DOI
https://doi.org/10.1186/s12985-023-02199-5
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腸内細菌叢
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ラットモデル
ウイルス学雑誌
ISSN: 1743-422X
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投稿に関するお問い合わせ: beverly.mapua@springernature.com
一般的なお問い合わせ: info@biomedcentral.com
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