腸内細菌叢からみた乳化剤の安全性の再評価

2023年4月4日 09:35

https://www.researchsquare.com/article/rs-2731923/v1

Suraphan Panyod, Wei-Kai Wu, Chih-Ting Chang, Naohisa Wada, Han-Chen Ho, and more 10
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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-2731923/v1
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投稿日: 2023年04月03日
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アブストラクト
食用乳化剤は様々な疾患との関連性が指摘されている。近年、腸内細菌と宿主の相互作用が健康や疾病に果たす役割が明らかになり、腸内細菌という切り口で食事用乳化剤の安全性を再評価することが求められています。親水性乳化剤（レシチン（LEC）、ショ糖エステル（SUC）、カルボキシメチルセルロース（CMC））および親油性乳化剤（モノおよびジグリセリド（MDG））は、人口に占める曝露レベルが高い一般的な食事性乳化剤です。本研究では、SUCとCMCが高血糖と高インスリン血症を誘発することが証明された。MDGは、循環脂質およびグルコース代謝を障害した。親水性乳化剤と親油性乳化剤の両方が腸内細菌叢の多様性を変化させ、腸内細菌叢のディスバイオシスを誘導した。親水性乳化剤は粘液と細菌の相互作用に影響を与えないが、MDGは内側の粘液層への細菌の侵入を引き起こし、循環するリポポリサッカライドを上昇させることによって炎症の可能性を高める傾向にあった。今回の結果は、食用乳化剤の使用に伴う安全性の懸念を示し、メタボリックシンドロームを引き起こす可能性が示唆された。
健康科学／リスクファクター
健康科学/消化器病学/消化器系/マイクロバイオタ
健康科学/疾患/代謝性疾患
生物科学/微生物学/微生物群集/マイクロバイオーム
レシチン
ショ糖エステル類
カルボキシメチルセルロース
モノグリセリドとジグリセリド
腸内細菌叢
粘液層
メタボリックシンドローム
数値

図1
図2
図3
図4
図5
図6
はじめに
消化管に生息する腸内細菌叢は、健康や病気において不可欠です。バランスのとれた腸内細菌叢は、身体にとって機能的に有益である。一方、腸内細菌叢の異常は、腸内細菌叢、その代謝物、宿主を含むメタオーガニズム-病原経路を介して、心血管疾患、肥満、メタボリック症候群、炎症性腸疾患などの様々な疾病を引き起こす可能性があります1-3。腸管上皮を覆う厚い粘液層は、腸内細菌叢の体内移行を妨げています。外側の粘液層に生息する大腸菌は、粘液の糖鎖を分解し、エネルギー源として利用することができる4。特定のムチン分解微生物群は、特定の糖鎖結合を消化する酵素グリコシルヒドラーゼを有している5。以前の研究で、腸内細菌叢が大腸粘液層の性質に影響を与えることが実証されている6。ある種の微生物は、腸管粘液層の特定の糖鎖を分解・代謝することができる様々な糖質利用遺伝子クラスターを保有している5。粘液層の分解は、腸内細菌叢の侵入を招き、感染や炎症を引き起こす。粘液層の機能不全は、大腸炎患者やげっ歯類で確認されている7。腸内細菌叢の組成の変化は、粘液層の変化に直接影響を及ぼします。さらに、高脂肪食の摂取、食品添加物、プレバイオティクスなどの食習慣は、いくつかの疾患の発症に関連する粘液の変化に直接影響を及ぼします8。したがって、特定の食品や食品添加物は、粘液と細菌の相互作用を乱し、腸の炎症に関連する疾患を促進する可能性があります。
食品添加物は、インスタント香料、保存料、乳化剤などのように、食品の保存期間を延ばし、外観、味、食感を改善するために食品産業で使用されてきた。乳化剤は、炎症性腸疾患やメタボリックシンドロームなど、いくつかの疾患の病因に関与している可能性がある。食品添加物の乳化剤は、親水性部位と疎水性（親油性）部位に分類され、油相と水相の間の界面張力を低下させ、安定したエマルションを形成するための物理的力を取り込むことができる9。カルボキシメチルセルロース（CMC）とポリソルベート80（P80）は、腸管粘液層を薄くして腸内細菌叢の組成を変化させ、腸上皮の透過性とリポポリサッカライド（LPS）レベルを上昇させることにより、腸の炎症とメタボリック症候群を誘発する10。さらに、P80とCMCの両方が、ヒト腸内微生物生態系の粘膜シミュレーター（M-SHIME）において、微生物叢を改変し、炎症誘発能を上昇させることができ、乳化剤処理したM-SHIME懸濁液を無菌マウスに移植すると、低級炎症関連表現型と代謝性疾患が誘発される11。また、別の研究では、健康な参加者にCMCを約2週間介入させると、食後の腹部不快感が増し、腸内細菌叢の多様性が低下し、糞便中の短鎖脂肪酸および遊離アミノ酸が減少し、内粘液層への細菌叢の侵入が促進されることが明らかになりました12。これらの研究により、乳化剤の使用は、健康に悪影響を及ぼし、慢性疾患につながる可能性があるとして、安全性への懸念が高まっています。
乳化剤の食品添加物としての分類は、規制機関や国によって異なっています。数多くの食品添加物が、合同食糧農業機関/世界保健機関食品添加物専門家委員会（JECFA）、コーデックス（Codex Alimentarius）、英国食品基準庁（FSA）、米国食品医薬品局（FDA）によって乳化剤として認められています。しかし、すべての乳化剤がすべての機関で認められているわけではありません（図1a-b）。乳化剤の分類に相違があるため、乳化剤に関する研究の国際的な翻訳が難しく、低乳化剤食の定義が国によって異なるという問題があります9。現在、一般的に使用されている乳化剤の食事暴露評価は不足しています。最近の報告では、モノおよびジグリセリド（MDGs）、レシチン、カルボキシメチルセルロース（CMC）、ショ糖エステル、ポリソルベート80（P80）という7つの乳化剤の食事暴露量の推定が試みられている、ステアロイル乳酸塩（ステアロイル乳酸ナトリウム（SSL）、ステアロイル乳酸カルシウム（CSL））、ポリグリセロールポリリシノレート（PGPR）を、2つの期間（1999～2002年、2003～2010年）で比較しました（図1c）。1c). 乳化剤の暴露量は、期間中一定であった。MDG、レシチン、CMCは、平均値および90パーセンタイルの暴露量が最も高かったが、JECFAはこれら3つの乳化剤の1日摂取許容量（ADI）値に関する報告書を発表していない。逆に、ショ糖エステル、P80、ステアロイル乳酸塩、およびPGPRは、前述の乳化剤よりも低い暴露レベルを示した。乳化剤への暴露量の推定値は、市場価格のデータ（図1d）13と一致する。
従来、食品添加物の安全性評価と承認は、GRAS（Generally Recognized As Safe）ガイドラインに従った毒性学的証拠に基づいて行われてきました。しかし、近年、健康や疾患における腸内細菌叢の重要な役割が発見され、研究者の関心は、食品添加物の健康への悪影響を、メタオーガニズム-病態形成経路と腸内細菌叢を介して研究することに移ってきている。このように、腸内細菌と宿主の相互作用に関する食品添加物の安全性を探ることは、現在の文献のギャップを埋め、食品製造を管理する規制をサポートするために必要である。現在、乳化剤が代謝性疾患の発症に及ぼす影響に関する知見は不足しています。本研究では、乳化剤が腸内細菌叢に与える影響や肥満・代謝性疾患との関連性を検討することで、食事用乳化剤の安全性を再確認することを目的としました。本研究では、親水性乳化剤（LEC、SUC、CMC）および親油性乳化剤（MDG）が、腸内細菌叢の異常、粘液層の変化、腸管透過性、腸由来のLPSの循環系への移行など、腸内細菌と宿主の相互作用を通じて肥満および代謝性疾患の発症に与える影響を検討しました。
研究成果
親水性食物乳化剤の摂取は、肥満促進および代謝バイオマーカーに悪影響を及ぼし、高血糖および高インスリン血症を誘発した
我々は、一般的な親水性食事用乳化剤が、肥満、代謝、腸内細菌叢、および胃腸の変化に及ぼす影響を調査した（図2a.）。本研究で調査に使用した一般的な親水性食用乳化剤は、レシチン（LEC）、ショ糖脂肪酸エステル（SUC）、カルボキシメチルセルロース（CMC）であった。15週齢の雄C57BL/6Jマウスに、親水性乳化剤を水に添加した、または添加しない通常のチャウ食を17週間与えた。LECとSUCの投与量設計は、ヒトの食事推定暴露に関する報告13に従った。乳化剤のヒトでの投与量は、マウスでの等価投与量に換算された。親水性乳化剤の用量は、ヒトの1日の暴露量の10倍として模倣され、LECおよびSUCの選択された用量は、それぞれ7523.3および1110 mg/kg bw/日だった。CMC（飲料水中1％）の投与量は、先行研究10に準じて設定した。食事用乳化剤を17週間摂取した結果、親水性乳化剤を補充した群は対照群よりも体重の増加が見られた（図2b）。17週目では、SUCおよびCMCはCON群と比較して体重増加を大幅に増加させた（それぞれP = 0.1563およびP = 0.0322）（Fig. 2c）。同様に、CMCを与えた群では、相対的な脂肪量は増加したが、除脂肪量は減少した。(図2d-e)。さらに、CMC投与群はCON投与群と比較して、血清総コレステロール値およびトリグリセリド値の低下（P = 0.0034およびP = 0.0006）を示し（図2f-g）、CMCが脂質の吸収および代謝を阻害することが示唆された。なお、今回使用した親水性乳化剤は、血清AST、ALT値、脂肪肝、肝臓切片の病理組織学的特徴に変化を与えなかった（補足図1）。経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）では、親水性乳化剤を与えたグループとCONグループとの間で、OGTTの曲線下面積（AUC）に目立った変動は見られなかった（図2h-i）。SUC-およびCMC-fed群は、空腹時血清グルコース（それぞれP = 0.0029およびP = 0.0095）およびインスリン値（それぞれP = 0.0027およびP < 0.0001）の有意な上昇を示した（図2j-k）。インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（HOMA-IR）では、SUCとCMCがHOMA-IR指数を上昇させたことから（図2l）、親水性乳化剤SUCとCMCの摂取がグルコースとインスリンの恒常性調節障害を引き起こすことが示唆されました。マウスにLECを補給すると、血清グルコースとインスリン値、およびHOMA-IR指数が上昇する傾向が見られたが、CON群と比較すると有意差は見られなかった。
親水性食物乳化剤は腸内細菌叢のɑおよびβ-多様性指標を変化させた。
腸内細菌叢は肥満性疾患や代謝性疾患の進行に重要な役割を果たすため、親水性食物乳化剤が腸内細菌叢に及ぼす影響を解明するために、V4 16S rRNA遺伝子シーケンスを用いて腸内細菌叢組成を分析した。QIIME2プラットフォームを用いて生配列を処理し、アンプリコン配列分散（ASV）表を作成し、その後、SILVAデータベース（バージョン138）にアライメントして、各ASVsの分類を得た。ASVs表は、122種と86属に分類される671個のASVsで構成されている。LEC群では、対照群と同様の多様性指数を示した。SUC群は、観察された種が有意に増加し（P = 0.0372）、シャノン多様性指数が大幅に低下した。これは、SUCが特定の腸内細菌群の存在量を増加させ、セカルマイクロバイオームの微生物群集が低い均一性を示したことを示唆している（図3a-c）。CMCは、シャノン多様性指数とシンプソン多様性指数を有意に上昇させ（それぞれP = 0.0229, P = 0.0366）、CMCが腸内細菌叢の多様性をより安定させる可能性を示唆しました。
さらに、β-多様性を計算し、Bray - Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）を行った（図3d）。その結果、すべての親水性乳化剤が腸内細菌叢のシフトに影響を与えることが示された。PCoAは、すべての実験グループ群間で有意な分離を示した（ANOSIM：R = 0.8205, P < 0-001）。LECグループのセントロイドのCONグループに対する距離は最も短く、LECがセカールマイクロバイオームに強く影響しないことが示された。一般に、SUCとCMCは腸内細菌叢のシフトにより大きな影響を与える。SUC群はX軸で見てCON群から明確に分離した（PCoA1；27.32％）のに対し、CON、LEC、CMCはコントロールと比較的類似していた。しかし、CMC群では、Y軸で数えて（PCoA2；20.9％）、はっきりとした隔たりがみられた。また、PCoAプロットに、HOMA-IR、血糖値、インスリン値などのインスリン抵抗性関連バイオマーカーの詳細を追加した。各マウスの円の大きさが大きくなればHOMA-IRの値が高いことを示し、色の濃さが高くなれば血清グルコースやインスリンの値が高いことを表現しました。親水性乳化剤摂取群はすべて円の大きさと色の強さが増加しており、インスリン抵抗性関連パラメータが腸内細菌叢のシフトと相関している可能性が示唆されました。さらに、各属と各マウスの腸内細菌叢の次元空間との関係を推定した。PCoAプロットにおけるベクトルは、関連する属を象徴し（P < 0.01）、その長さは関係の強さを提示した。Olsenella属と関連するCONグループは、除脂肪体重に富んでいる14。LECグループは、Faecalibaculum、Enterorhabdus、Muribaculumと関係を示した。SUC群は[Eubacterium] xylanophilum group、Clostridium sensu stricto 1、Akkermansiaと、CMC群はAlloprevotella、Acetatifactor、Muribaculaceae、Clostridia vadinBB60グループ、Blautia、UCG - 010と相関が見られた。総合すると、親水性乳化剤の摂食は、ɑおよびβ-多様性指標の両方において腸内細菌叢を改変し、各乳化剤はその特定の属およびインスリン耐性バイオマーカーに関連していた。
親水性食物乳化剤は腸内細菌叢に悪影響を及ぼす
実験グループ間で有意に異なる属は35種であった。属の階層的クラスタリングは、親水性乳化剤投与群と対照群の違いを特徴付ける3つの主要なクラスタに分類される。その結果、3種類の親水性乳化剤がセカル微生物叢を属レベルで分化させることがわかった（図3e）。ヒートマップの頭部には、実験グループと体重変化率、インスリン、空腹時グルコース値が表示されており、3種類の親水性乳化剤を与えたグループで値が上昇することが示されました。CON群と比較して、LEC群、SUC群、CMC群は18（9↑，9↓）、19（7↑／12↓）、19（9↑／10↓）の有意差属（P＜0.05）である。LEC群では、Streptococcus、[Eubacterium] coprostanoligenes group、Enterobacter、Lachnoclostridium、Desulfovibrio、 [Eubacterium] xylanophilum groupなどの疾患関連属、およびBifidobacterium、Lactobacillus、 Candidatus Arthromitusといった他の属が増加しました。LECはまた、Oscillibacter、Parasutterella、Dubosiella、Turicibacterなどの特定の可能性のある有益な細菌、およびPrevotellaceae UCG - 001、Colidextribacter、Clostridia vadinBB60グループ、Coriobacteriaceae UCG - 002、Tyzzerellaといった他の属の菌を減少させている。SUCを与えた群では、Clostridium sensu stricto 1、Lachnospiraceae UCG - 006、[Eubacterium] xylanophilum group、その他の属- [Eubacterium] ruminantium group, Akkermansia, Lactobacillus, UCG - 010などの疾患関連マイクロバイオームで富んでいた。また、SUCでは、Muribaculaceae、Oscillibacter、Faecalibaculum、Parasutterella、Olsenellaなどの属、Alloprevotella、Acetatifactor、Plevotellaceae UCG - 001、Colidextribacter、Clostridia vadinBB60グループ、EnterorhabdusおよびTyzzerellaといった有用菌が枯渇している可能性があります。CMC群では、Blautia、Staphylococcus、[Eubacterium] coprostanoligenes groupなどのいくつかの疾患関連菌や、Muribaculaceae、Incertae Sedis、Clostridia vadinBB60 group、Enteractinococcus、Candidatus ArthromitusおよびUCG - 010などの他の属の相対存在度が上昇した。また、CMC処理群では、Muribaculum、Faecalibaculum、Parasutterella、Dubosiella、Turicibacter、Prevotellaceae UCG - 001、Coriobacteriaceae UCG - 002、Enterorhabdus、Tyzzerella、 [Eubacterium] siraeum groupなどの有益微生物群が減少した。これらのデータから、一般的な食用親水性乳化剤は、疾患関連微生物を増加させ、特定の有益な微生物を減少させることにより、腸内細菌叢のホメオスタシスに悪影響を及ぼすことが示唆されました。
さらに、ヒートマップに基づいて、意味のある属と肥満誘発性バイオマーカーおよび代謝性バイオマーカーとの関連を評価するために、スピアマンの相関を分析しました。体重の変化は、2つの属と正の相関を示しました： UCG - 010と疾患関連属であるBlautia属です。空腹時血糖値は、Blautia属、Incertae Sedis属、Clostridia vadinBB60グループと正の相関がありました。インスリンとHOMA-IRは、ムチン分解菌であるアケルマンシアと正の相関があった。また、Muribaculum、Faecalibaculum、Parasutterella、Olsenella、Dubosiellaなどのいくつかの有益な細菌は、体重、空腹時グルコースレベル、インスリンレベル、またはHOMA-IR指数の変化と負の相関があることが確認された。ヒートマップと相関の結果から、一般的な親水性乳化剤は腸内細菌叢に悪影響を及ぼし、細菌叢異常の原因となる可能性があることが示されました。
親水性乳化剤は、粘液と細菌の相互作用を阻害したり、腸の炎症に関連する疾患を促進することはなかった
大腸の長さが短くなることは、大腸炎のバイオマーカーと考えられている。親水性乳化剤投与群の結腸長は、対照群の結腸長との間に有意な差は認められなかった（図3f）。周期酸シッフ（PAS）染色した結腸切片を用いて、結腸上皮障害の組織学的スコアを求めました。その結果、乳化剤投与群、対照群ともに腸管上皮細胞は構造的に無傷であり、杯細胞数は正常で、前膜や筋層粘膜には免疫細胞の浸潤はなく、投与した親水性乳化剤は大腸炎を誘発しないことが示唆された（補足図2）。さらに、親水性食用乳化剤が腸管粘膜層の変化や細菌の局在に影響を与えるかどうかを共焦点顕微鏡を用いて検討したところ、親水性食用乳化剤は腸管粘膜層の変化や細菌の局在に影響を与えることがわかりました。親水性乳化剤の介入により、粘液層の薄層化や腸管上皮細胞（IEC）への細菌の距離の短縮は認められず、腸内細菌の粘液層内への侵入がないことが示され、親水性乳化剤は腸の炎症を伴う疾患を促進しなかった（図3gおよび3h）。したがって、親水性食物乳化剤の摂取は、粘液と細菌の相互作用を阻害することはなかった。次に、FITC-デキストラン法の経口投与により、腸管透過性に及ぼす親水性乳化剤の影響を検討した。SUC群は、LECやCMCと異なり、コントロール群と比較して腸管透過性の上昇（P = 0.1491）を示した（図3i）。腸内細菌叢が産生するLPSは、門脈を通じて循環系に移行し、低グレードの全身性炎症をもたらす可能性がある。我々のデータは、乳化剤を与えたマウスにおいて、血清LPSレベルと腸管透過性が一致していることを示した（図3j）；しかし、LPSレベルには統計的な差はなかった。
親油性食物乳化剤MDGは循環脂質およびグルコース代謝を障害する
我々は、一般的な親油性の飼料用乳化剤であるMDG（図4a）について検討した。8週齢の雄C57BL/6Jマウスに、MDG 5.5%飼料を含む飼料を与えた。この実験で使用したMDGの用量は、全身毒性の兆候を示さなかった先行研究に従ったものである15。大豆油とMDGはともに生体にエネルギーを供給する脂肪の一種であり、対照飼料には主に大豆油由来のトリアシルグリセロールが含まれていたため、MDG飼料では大豆油をMDGに置き換えた。マウスにCON食またはMDG食を14週間摂取させた。各マウスで異なる食事摂取量の影響を最小限にするため、マウスは85kcal/weekに制限された16。MDGを17週間介入させた後、14週目の体重の変化に関して有意差は認められなかった（図4b-c）。しかし、MDG群の摂食中の相対脂肪量はCON群のそれよりもわずかに低かったが、相対除脂肪量の変化には有意な差は認められなかった（図4d-e）。MDGの摂取は、CON群と比較して、血清総コレステロール値を上昇させ（P = 0.0139）、血清総トリグリセリド値を低下させる（P < 0.0001）ことにより、血液脂質代謝に干渉した（図4f-g）。しかし、MDGは血清ASTおよびALT値には影響を与えなかった（補足図3）。OGTTにより、MDGは血糖値を有意に上昇させることが明らかになった。OGTTの計算されたAUCは、MDG群がCON群より有意に高かった（P < 0.0020）（図4h-i）。しかし、空腹時血清グルコース値、血清インスリン値、HOMA-IR指数には、MDG群とコントロール群との間に差は認められなかった（図4j-l）。これらのデータは、MDGの摂取がグルコースと脂質の代謝を損なうことを示唆した。
MDGは腸内細菌叢の均一性を低下させ、腸内細菌叢のβ-多様性を変化させた
QIIME2パイプラインによると、V4 16S rRNA遺伝子配列は460個のASVを生成し、110種と80属に割り当てられた。MDGは、観察されたASVには影響を与えなかったが、微生物相の均等性、すなわちシャノン多様性指数とシンプソン多様性指数を低下させた（それぞれP = 0.0751と0.0285）（図5a〜c）。このデータは、MDGが特定のマイクロバイオームの増殖を許容または抑制し、その結果、腸内細菌叢の不均一性をもたらす可能性を示唆しています。Bray-Curtis距離ベースのPCoAでは、MDGが腸内細菌叢のシフトを有意に分離してシミュレーションすることが示された（図5d）（ANOSIM：R = 0.9378, P < 0.001）．MDG群は、X軸（PCoA1：47.88％）において、CON群と区別できるほどの分離を示した。Y軸（PCoA2；15.96％）は、グループ内微生物相のシフトの影響を示している。MDG群のPCoAプロットにおける各マウスの腸内細菌叢は、グループ重心への距離が短く、MDG群がグループ内変動の少ない腸内細菌叢組成をしっかりと調整していることが示唆されました。一方、CON群では、群間変動が大きくなった。PCoAプロットは、体重変化、OGTTのAUC、血清総コレステロールなど、脂質と糖代謝のバイオマーカーも示している。円が大きいほど体重の増加量が多く、色が濃いほどOGTTのAUCやコレステロール値の上昇を示すことがわかった。MDGでは、円の大きさは小さくなるが色の濃さが増す傾向があり、体重、脂質、グルコース代謝バイオマーカーが腸内細菌叢の変化と関連している可能性が示唆された。統計的有意性をP < 0.05としたベクトルの向きによると、MDGグループはLactococcus属、Enterorhabdus属、uncultured属と関連していた。CONグループは、Collinsella、Alistipes、Parabacteroides、Alloprevotella、ASF356、Lachnospiraceae NK4A136グループ、Clostridia UCG - 014、Muribaculaceae、Lachnospiraceae UCG - 006、Coriobacteriaceae UCG - 002およびAkkermansiaと関連していました。したがって、MDGは、血中脂質およびグルコース代謝バイオマーカーの障害と関連する、セカール微生物叢のɑ-diversity均等性およびβ-diversity指数を変化させました。
親油性の食物乳化剤MDGは腸内細菌叢のディスバイオシスを引き起こす
さらに、MDGが腸内細菌叢に及ぼす影響の比較（P < 0.05）について、ウィルコクソンの符号順位検定に基づき、腸内細菌叢を属レベルで統計解析した（図5e）。16属が対照群のものと有意に異なっていた。階層的クラスタリングでは、MDG食群と対照群の非類似性を表す2つの主要なクラスタが見出されました。11属がCON群で有意に減少していたのに対し、5属がMDG摂取群で濃縮されていた。MDG摂取により、Muribaculaceae、Parabacteroides、Lachnospiraceae NK4A136グループ、Akkermansia、Collinsellaなどの有用菌が減少し、Alistipes、Alloprevotella、ASF356、Coriobacteriaceae UCG - 002、A2、Lachnospiraceae UCG - 006などの属もほとんど含まれなかった。しかし、MDG群では、Enterorhabdus、Jeotgalicoccus、Atopostipesなどの疾患関連微生物が増加し、未培養菌やLactococcusなどの他の属の微生物が少なくなっています。したがって、MGDの摂取は、腸内細菌叢の異常をもたらす可能性がある。
7属（Alistipes、Parabacteroides、Lachnospiraceae NK4A136グループ、Alloprevotella、ASF356、Lachnospiraceae UCG - 006、Collinsella）は体重変化と正の相関があったが、Enterorhabdusは負の相関を示していた。OGTTのAUCは、Alloprevotella、ASF356、Akkermansia、Lachnospiraceae UCG - 006と負の相関を示し、Coriobacteriaceae UCG - 002は総血中コレステロールと負の相関を示しました。ヒートマップと相関の結果を総合すると、一般的な親油性乳化剤であるMDGは腸内細菌叢の構成に悪影響を与え、代謝バイオマーカーの変化と関連している可能性があることが示されました。
MDGは、細菌の上皮細胞への距離をわずかに減少させ、循環LPSを増加させることで炎症の可能性を高めた
次に、親油性乳化剤MDGが大腸の生理的変化、腸管透過性、および細菌産物のトランスロケーションにどのような影響を及ぼすかを検討した。MDG投与群のマウスの結腸長は、CON群と比較して有意な差はなかった（図5f）。PAS染色した大腸切片と大腸上皮障害の組織学的スコアから、MDGは大腸炎を誘発しないことが示された（補足図4）。MDG食を与えたマウスでは、CON食を与えたマウスに比べて腸管上皮細胞までの細菌の距離が短い傾向にあることが観察され（P = 0.1780）（図5gおよび5h）、MDGによって変化した腸内細菌が粘液の内層に向かって駆動できることが示唆されました。細菌細胞と上皮細胞との距離が縮まることで、腸の炎症に関連した疾患が促進される可能性があります。さらに、MDGはFITC-デキストランを用いた腸管透過性に影響を与えなかった（図5i）。しかし、MDGを摂取したマウスでは血清LPSが統計的に上昇したことから（図5j）、MDGで変化した微生物叢はLPS産生を増加させる可能性があることが示唆されました。
考察
本研究により、親水性乳化剤および親油性乳化剤は、代謝異常や腸内細菌叢異常の原因となる可能性があり、乳化剤の違いにより健康関連バイオマーカーに特定の影響を及ぼすことが示されました。親水性乳化剤のうち、SUCとCMCは、LECよりも健康関連バイオマーカーに大きな影響を与えた。SUCとCMCの摂取は、肥満関連バイオマーカーと代謝関連バイオマーカーに悪影響を及ぼし、体重増加、空腹時血清グルコースと血清インスリン値、HOMA-IR指数を増加させて高血糖と高インスリン血症を誘発しました。CMC群は、コントロール群と比較して、相対的な脂肪量を増加させ、除脂肪量を減少させ、血清総コレステロール値およびトリグリセリド値を低下させることにより、脂質の吸収および代謝を阻害した。一方、LECの補給では、血清グルコースとインスリン値、HOMA-IR指数の有意な上昇は見られなかった。また、親油性の食事用乳化剤であるMDGは、血清コレステロールを増加させる一方でトリグリセリドを減少させ、それによってOGTTの血糖値を上昇させるという血中脂質およびグルコース代謝に影響を及ぼすことを検討した。
人体では、SUCの酵素消化により、スクロースと脂肪酸、またはフルクトース、グルコース、脂肪酸が生成される。高ショ糖食や高フルクトース食の介入は、インスリン感受性を低下させ、空腹時血糖値やインスリン濃度を上昇させることで血糖代謝に影響を及ぼす17,18。したがって、SUC群における異常高血糖および高インスリン血症は、糖および脂肪酸の取り込みが増加することによって引き起こされる。さらに、食事性甘味料のスクラロースやサッカリンの補給は、健康な成人においてマイクロバイオームと関連した血糖応答を損なうとされている19。CMCやP80は、腸管粘膜層を薄くし、腸内細菌叢の構成を変化させ、腸管上皮の透過性とLPSレベルを上昇させることにより、メタボリックシンドロームと腸内炎症を誘発する10。CMCやP80による腸内細菌叢の変化は、無菌マウスモデルにおいて、低悪性度炎症関連表現型や代謝性疾患につながる11。CMCは、食後の腹部不快感を増加させ、腸内細菌叢のシフトに影響を与え、有益な糞便代謝物を低下させ、ヒトでは内側粘液層への細菌の侵入を促進させる12。また、別の研究では、CMCとP80が、男性と女性で異なるメカニズムで腸内細菌叢のシフトとともに、不安関連行動や社会的行動などの生理・行動に悪影響を及ぼすことがわかりました20。しかし、すべての食用乳化剤が健康に悪影響を及ぼすわけではありません。中鎖モノアシルグリセロールであるモノデカン酸グリセロールは、腸内細菌叢にプラスの影響を与え、脂質代謝、インスリン感受性、炎症を改善する21。
最近のいくつかの研究では、食品乳化剤が腸内細菌叢の組成を変化させ、炎症性腸疾患やメタボリックシンドロームなどいくつかの慢性疾患の進行に関与していることが示されました。本研究では、親水性乳化剤と親油性乳化剤が、腸内細菌叢のɑおよびβ-多様性指標を再構築することを明らかにした。LECは他の親水性乳化剤に比べて腸内組成への影響が小さいのに対し、SUCとCMCは腸内細菌叢への影響がより顕著であった。以前の研究では、LECはMiniBioReactor Arrayモデルのex vivoにおいて、微生物相に有意な影響を与えないことが報告されている22。一方、SUC群は腸内細菌叢の観察種を増加させたが、均等性指数を減少させた。CMCは、腸内細菌叢の均整度を増加させた。親水性乳化剤処理群のβ-diversityは、インスリン抵抗性関連バイオマーカーと関連していた。さらに、疎水性乳化剤MDGは腸内細菌叢の均等性を低下させ、β-diversityで腸内細菌叢を形成し、血中脂質およびグルコース代謝バイオマーカーの障害と関連していた。
一般に、親水性および親油性の食物乳化剤は、腸内細菌叢に属レベルで悪影響を及ぼし、腸内細菌叢のディスバイオシスを引き起こした。以前の研究では、20種類の乳化剤がヒトの微生物叢のシフトに及ぼす影響をex vivoモデルで調べ、ほとんどの乳化剤が微生物叢の構成と機能に有害な影響を及ぼすことを明らかにした22。CMC、P80、大豆レシチン、ソホロリピッド、ラムノリピッドの5つの乳化剤の影響を調べた研究では、すべての乳化剤が選択的に推定病原体の存在量を高め、フラジェリンを増加させることが明らかになった23。本研究では、LEC群は、Streptococcus、[Eubacterium] coprostanoligenes group、Enterobacter、Lachnoclostridium、Desulfovibrio、 [Eubacterium] xylanophilum groupなどの疾患関連属を濃縮し、Oscillibacter、 Parasutterella、Dubosiella、Turicibacterなどの健康細菌候補が減少したことを明らかにしました。LEC群に濃縮された疾患関連マイクロバイオームについて、以下のように説明する。化膿レンサ球菌は、非浸潤性後遺症を含む非浸潤性疾患と浸潤性疾患の両方を引き起こす可能性のある病原体である24．大腸癌の発生はStreptococcus gallolyticusのコロニー形成と関連している25。ホモシスチン尿症患者には、Eubacterium coprostanoligenes groupが多数認められる。腸内細菌科は、炎症性腸疾患（IBD）の病態や進行と関連することが報告されている26。Enterobacter aerogenesとEnterobacter cloacaeは、いくつかの病院内感染症のアウトブレイクで発見されました27。Lachnoclostridiumは肥満と関連しており28、Lachnoclostridiumが豊富な場合、内臓脂肪の増加と関連する循環酢酸のレベルが低くなることが、大規模な集団ベースのコホートで報告されている29。Desulfovibrioは、腸管透過性と肝CD36発現を増加させることにより、NAFLDの病因に重要な役割を果たす30。[Eubacterium] xylanophilum groupは、高塩分誘発性高血圧マウスで濃縮されている31。一方、LECで枯渇する健康なマイクロバイオームについては、以下のように説明されている。Oscillibacterは、高脂肪糖質制限食を与えた糖尿病マウスに豊富に存在することから、有益な細菌である可能性がある32。Parasutterellaは、胆汁酸の維持とコレステロール代謝に潜在的な役割を果たすことが報告されており33、健康な人の低密度リポタンパク質の改善と関連している34。DubosiellaはDSS誘発大腸炎マウスで相対量が減少していることがわかり、潰瘍性大腸炎改善菌として利用できる可能性があります35。Turicibacterは、肥満げっ歯類よりも痩せげっ歯類に多く存在し、抗炎症性分類群である可能性がある36。
また、SUC群では、Clostridium sensu stricto 1、Lachnospiraceae UCG - 006、[Eubacterium] xylanophilum groupなどの疾患関連属の濃縮が見られた。また、SUCグループでは、Muribaculaceae、Oscillibacter、Faecalibaculum、Parasutterella、Olsenellaなどの有益と考えられる属の減少がみられた。SUCグループの疾患関連属、例えばClostridium sensu stricto 1は、十二指腸狭窄の被験者37で存在量が増加し、高脂肪食を与えたマウスではLachnospiraceae UCG-00638の存在量が増加することが判明しています。SUCグループにおける潜在的な有益属： SUCグループの潜在的な有益属：Muribaculaceaeは、痩せたマウスで濃縮されており39、複合糖質の分解に関与している可能性がある40。Faecalibaculum rodentiumなどのFaecalibaculum属は、腸内好酸球の生存を助けるレチノイン酸の発生を弱めることにより、上皮の増殖とターンオーバーを刺激することができる41。
CMC群では、疾患関連属であるBlautia、Staphylococcus、[Eubacterium] coprostanoligenes群が濃縮された一方、Muribaculum、Faecalibaculum、Parasutterella、Dubosiella、Turicibacterといったいくつかの善玉微生物が相応に減少していることが示された。BlautiaはNASH患者で濃縮され、LPSレベルの上昇と関連している42。しかし、Blautiaは、成人では内臓脂肪の蓄積と関連し43、小児では肥満と血中インスリン値の上昇と関連している44。黄色ブドウ球菌は病原性細菌であり、腸内細菌叢の競合が乏しいため、乳児の腸内で容易にコロニー形成される45。ムリバクラムは、マウスの腸の状態を正常に保つと推測されている。
親油性の食物乳化剤であるMDGの投与も、腸内細菌叢の異常を引き起こした。MDGは、Muribaculaceae、Parabacteroides、Lachnospiraceae NK4A136グループ、Akkermansia、Collinsellaなどのいくつかの潜在的に有益な細菌を減少させました。一方、MDGの摂取により、Enterorhabdus、Jeotgalicoccus、Atopostipesなど、病気に関連するいくつかの微生物群の増殖が促進されました。Parabacteroides distasonisは、コハク酸や二次胆汁酸を産生することにより、肥満や代謝異常を緩和することが報告されている46。Lachnospiraceae NK4A136 groupは、高脂肪食マウスで減少することが判明した、潜在的なプロバイオティクスである47。低温殺菌したAkkermansia muciniphilaのサプリメントは、太りすぎ/肥満のインスリン抵抗性ボランティアにおいて、インスリン感受性を高め、インスリン血症、血漿総コレステロール、および肥満を減少させる48。食物繊維の摂取量が少ないとコリンセラが増加し、その存在量は過体重および肥満の妊婦における循環インスリンレベルと相関する49。コリオバクテリウムUCG - 002は抗炎症機能を示し、コリオバクテリウムUCG - 002の存在量が増加すると、有益な細菌代謝物の短鎖脂肪酸が増加します50。糖尿病予備軍では、Enterorhabdusの相対的な存在量が増加する51。Jeotgalicoccusは、糖尿病ラットのインスリン濃度と正の相関がある52。Atopostipesは、四塩化炭素誘発肝障害マウスで濃縮されている53。まとめると、これらのデータは、一般的な食用親水性乳化剤および親水性乳化剤が、疾患関連細菌属を増加させ、有益な微生物群の相対的存在量を減少させることによって、腸内細菌群の恒常性に悪影響を及ぼすことを示唆した。
親水性乳化剤は、大腸の長さの変化、大腸炎の誘発、粘液層の薄層化、細菌と腸管上皮細胞との距離の短縮をもたらさないことが明らかになった。SUCは、腸管透過性とLPSレベルを増加させる傾向があった。これらのデータから、親水性乳化剤は粘液と細菌の相互作用を阻害したり、腸の炎症に関連する疾患を促進するものではないことが示唆された。親水性乳化剤と同様に、親油性乳化剤であるMDGは、結腸の長さを変化させず、大腸炎を誘発することはなかった。しかし、MDGは細菌と腸管上皮細胞との距離を縮め、腸の炎症に関連した疾患を促進する可能性がある。さらに、MDGは腸管透過性を変化させなかったが、血清LPS濃度を上昇させたことから、MDGは腸内細菌叢の構成を変化させ、LPS生成を増加させることができ、全身性の炎症につながる可能性が示唆された。CMCとP80は、微生物叢の侵入を誘導し、細菌組成を変化させ、腸管透過性とLPSレベルを増加させることにより、マウスの低悪性度炎症、メタボリック症候群、大腸炎を促進する。同様の表現型を持つ無菌マウスモデルにおいて、改変された腸内細菌叢が検証された10。本研究では、CMCが代謝障害を引き起こし、細菌組成を変化させたが、腸管上皮細胞に最も近い細菌細胞の距離を減少させなかったことを示した。我々のデータは先行研究の結果と一致しないが、これはおそらく腸内細菌叢の組成、居住環境、場所の違いによるものであろう。腸内細菌叢による過剰なムチン分解は、内腔の抗原が腸管免疫系に移行することを可能にする腸障害を引き起こす可能性がある54。ムチン分解微生物は、特定の糖鎖結合を消化できるグリコシルヒドロラーゼを持つ。Akkermansia glycaniphilaとmuciniphilaは、ムチン分解遺伝子を持つ5。AkkermansiaではSUCが増加したが、SUCを与えたマウスでは細菌と腸管上皮細胞との距離が縮まることが観察された。Akkermansia属以外にも、様々な系統のムチン分解グリコシルヒドロラーゼ遺伝子を保有する24属の細菌が文献で報告されている。残念ながら、これらの属はMDG飼育マウスでは検出されず、細菌と腸管上皮細胞との距離が縮まっていることが示された。
乳化剤を含むこれらの食品添加物の悪影響は、数多くの研究によって発見されていますが、食品業界では食品添加物の使用量は増え続けています。各国とも、食品添加物の使用を管理するために独自の規制を設けています。国によっては、科学的根拠に基づいて設定されたGRASガイドラインに従って、ある物質を食品添加物として認可する場合もあります。過去10年間に腸内細菌叢が健康に及ぼす影響が発見されて以来、研究者は、食品添加物が腸内細菌叢、その機能、およびその代謝産物に及ぼす影響に着目しており、これらの物質は食品添加物と相乗的に協力して健康に悪影響を与え、最終的にはメタオーガニズム-病因経路を経て慢性疾患の発症に至る可能性があります。したがって、腸内細菌叢と宿主との相互作用に関する食品添加物の安全性について、既存の文献のギャップを埋め、食品製造を管理する法律をサポートするために、さらに調査する必要があります。
本研究の結果、親水性乳化剤は、肥満や代謝異常を誘発する可能性があり、高血糖や高インスリン血症を引き起こすことが明らかになった。一方、親油性乳化剤は、循環脂質およびグルコース代謝を阻害することがわかった。親水性乳化剤と親油性乳化剤の両方が、腸内細菌叢の組成の複雑さをリモデリングし、疾患関連微生物叢を増加させ、腸内細菌叢異種症を促進させた。しかし、親水性乳化剤は、粘液-細菌相互作用に影響を与えず、腸炎症関連疾患を促進することもなかった。一方、親油性乳化剤であるMDGは、腸管上皮細胞への細菌の侵入を促進し、循環するLPSを上昇させることで炎症の可能性を高めました（図6）。本研究は、食用乳化剤の使用に関連する安全性の懸念に関する情報を提供し、食品安全政策や食品製造を管理する法律を見直すのに役立つと考えられる。しかし、これらの結果は、ヒトでの更なる検証が必要である。
方法
親水性食物乳化剤投与によるC57BL/6Jマウスモデル
動物は、国立台湾大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（承認番号：NTU107-EL-00121）のガイドラインに従って取り扱われた。雄のC57BL/6 Jマウスは、国立実験動物センター（台湾、台北市）から購入した。マウスは、23±2℃で12時間の明暗サイクルを持つ動物室で飼育された。馴化後、15週齢のマウスをランダムに4つの実験グループ（n＝3〜4／ケージ）に分けた： (i）コントロール［CON］、（ii）レシチン［LEC、7523.3mg/kg bw/day］、（iii）ショ糖脂肪酸エステル［SUC、1110mg/kg bw/day］、（iv）カルボキシメチルセルロース［CMC、1%）。CMCの投与量は、先行研究10に基づき選択した。LECとSUCの用量は、ヒトにおける食事暴露の推定に関する報告13に従って選択され、対応するマウスの用量に変換された。本実験の投与量は、ヒトの1日当たりの暴露量の10倍を模したものである。乳化剤は、Gemfont Corporation（台湾、台北市）から購入した。マウスには普通飼料（MFG；オリエンタル酵母工業株式会社、東京、日本）を与え、すべての食用乳化剤は飲料水に補充した。各実験群のマウスは、17週間、餌と水に自由にアクセスすることができた。安楽死させる前に、マウスは12時間絶食させ、その後、CO2による窒息死でマウスを犠牲にした。血液は、シリンジを用いた心臓穿刺により採取した。臓器はその後の解析のために採取した。
親油性食物乳化剤投与C57BL/6Jマウスモデル
マウスは、既述の条件を備えた動物飼育室で飼育した。6週齢の雄C57BL/6Jマウスを、2週間の適応期間を経て実験に採用した。8週齢の雄C57BL/6Jマウスを、食餌に基づいて2つのグループに分けた：（i）対照食（CON）グループ、および（ii）モノグリセリドおよびジグリセリド食（MDG）［5.5％］グループ。この実験でのMDGの投与量は、5.5%のジアシルグリセロール（DAG）の効果を調べた以前の研究に従ったもので、全身毒性の兆候は見られなかった15。コントロールマウスには、AIN-93M成熟齧歯類飼料を与えた。MDG飼料は、AIN-93M mature rodent diet（#D10012M；株式会社リサーチダイエット）を大豆油をMDGに置き換えてカスタマイズしたもので、MDG組成は飼料中5.5%である。マウスは85kcal/weekに制限された16。カロリーコントロールは、MDGの効果のみを観察するために、マウスの食事摂取量の違いを最小限に抑えるために実施した。実験開始から14週間後にマウスを犠牲にした。CO2窒息後、シリンジを用いた心臓穿刺により血液を採取し、その後の解析のために臓器を採取した。
体組成分析
除脂肪体重と脂肪体重の両方の体組成は、Minispec LF50 TD-NMR 体組成計（Bruker, Billerica, MA, USA）を用いて測定した。相対的な脂肪量または除脂肪量は、それぞれ体重に対する脂肪量または除脂肪量として計算された。
マウスの血液生化学的分析
血液を1000×gで15分間、4℃で遠心分離することにより血清を抽出した。血清中の総コレステロール、総トリグリセリド、高密度リポタンパク質（HDL-c）、AST、ALT、グルコースなどの生化学バイオマーカーは、自動血液分析装置（Spotchem EZ）で市販のテストストリップ（Spotchem II reagent strips; Arkray Inc.、京都、日本）を使用して測定した。
経口ブドウ糖負荷試験(OGTT)
マウスは、OGTT実験前に5時間絶食させた。血液サンプルを顎下静脈から採取した。その後、2g/kgのグルコースを経口投与してから0、15、30、60、90、120分後にグルコメーター（ACCU-CHEK® Performa, Roche, Basel, Switzerland）を用いて血糖を分析した。
腸管透過性解析
腸管透過性プローブ-fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran; MW 4,000; Sigma-Aldrich, 46944)を用いたガベージにより、腸管障壁透過性を行った。4時間の絶食後、マウスに0.2mLのFITC-デキストラン溶液（リン酸緩衝生理食塩水に15mgのFITC-デキストラン）をガブ飲みさせた。3時間後に採血し、1000×gで15分間、4℃で遠心分離して血清を抽出した。血漿FITC-デキストラン蛍光強度は、黒色96ウェルプレートで蛍光光度計を用い、励起波長485nm、発光波長538nmで測定した（Fluoroskan Ascent FL, Thermo Fisher Scientific, USA）。FITC-デキストラン濃度は、マウス血清中のFITC-デキストランを連続希釈して作成した標準曲線に対して測定した。
過ヨウ素酸シッフ染色および病理組織学的解析
マウスの大腸を摘出し、Carnoy's solutionで24時間固定し、その後パラフィンに包埋した。大腸切片は、Periodic acid-Schiff staining methodで染色した。肝組織のスコアリングは、獣医学大学動物疾病診断センター（National Chung Hsing University, Taichung, Taiwan）の経験豊富な病理学者によって行われた。
粘液層と共局在する細菌を可視化した
(i) カルノア固定によるパラフィン包埋
包埋は、無水メタノールに30分、100%エタノールに20分、キシレンに15分と2回浸漬し、最後にパラフィンワックス（Leica、ドイツ）に56-58℃で3時間ずつ浸漬した。ブロックは室温で固めた。切片は4μm厚にスライドさせ、40-45℃の水浴上で浮遊させ、スライドに移した。
(ii) 蛍光in situハイブリダイゼーション
スライドをキシレンに15分ずつ、100%エタノールに5分ずつ2回浸漬して脱パラフィンした後、サンプルを37℃で15分間プロテアーゼK（5μg/mL）で処理し、蛍光in situ Hybridization（FISH）の準備として、処理サンプルを0.9M NaCl、20mM Tris pH7.4に10分浸漬した。細菌細胞を標的としたFISHは、カスタム合成したオリゴヌクレオチドプローブEUB338（5'-GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3'、5' Alexa 647ラベル付）を用いて行った（Li-Tzung Inc.、台湾）。ハイブリダイゼーションバッファー（0.9M NaCl, 0.02M Tris-HCl pH7.4, 0.01% SDS, 30% formamide）と2μMプローブで46℃、2.5時間インキュベートし、サンプルを48℃、15分間過剰洗浄バッファで洗浄した後ハイブリダイゼーションした。(0.215 M NaCl, 0.02 M Tris-HCl pH 7.5, 5 mM EDTA）。
(iii) Hoechst 33258および小麦胚芽アグルチニン(WGA)による蛍光染色
切片をPBS中のHoechst 33258（10 µg/mL）およびWGA（40 µg/mL）Alexa Fluor 488コンジュゲート（Thermo-Fisher Inc.、米国）で15分間染色し、洗浄バッファ（0.112 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.4, 5 mM EDTA, 0.01% SDS）でそれぞれ3分間のインキュベートを二回行った。その後、スライドを水で洗浄し、乾燥させるか、50%、80%、96%(v/v)のエタノールにそれぞれ3分間浸し、乾燥させた。その後、スライドをProlong anti-fade mounting media（Life Technologies）でマウントし、マウントメディウムが固まるまで室温の暗い環境に置いた。画像はLeica TCS SP5 II共焦点顕微鏡（Joint Center for Instruments and Researches, College of Bioresources and Agriculture, National Taiwan University, Taiwan）を用いて取得した。
(iv) 粘液の厚さの測定
粘液層は、Fijiを用いて、WGAで明るく染色された領域の幅を測定し、宿主上皮の内側に決定した55。微分干渉コントラスト（DIC）を用いて宿主上皮の境界を可視化し、チャンネルを統合して距離を測定した。
血清LPSおよびインスリン濃度の測定
Pierce LAL Chromogenic Endotoxin Kit (#88282, Thermo Scientific, USA)を用いて、血清中のLPS濃度を検出した。血清中のインスリン濃度は、Mercodia ABから供給された市販のキット（#10-1247-01, Mouse Insulin ELISA kit, Mercodia, Sweden）を用いて測定した。
腸内細菌叢の解析
セカルサンプル DNAは、QIAamp PowerFecal DNA Kit（Qiagen、オランダ）を用いて、製造者の説明書に従って抽出された。16S rRNA V4領域のPCR増幅は、515F／806R細菌プライマーペア（515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGTAA-3′および806R：5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）を使用して、25μLの2X Taq Master Mix（Thermo Scientific、米国）を含む50μL反応容量、0． 2Mの各フォワードおよびリバースプライマー、および20ngのDNAテンプレートを含む50μLの反応量であった。サーマルサイクリングは、95℃で5分間の初期変性、98℃で20秒間の変性、57℃で15秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長を25サイクル行い、72℃で10分間の最終ホールドを行った。次に、増幅産物を2%アガロースゲル電気泳動に供した。増幅されたPCR産物は、Nextera XT Indexキットを用いてイルミナシーケンスアダプターを装着し、AMPure XPビーズを用いて精製した。ライブラリーの定量はDNA 1000キットと2100 Bioanalyzer装置（Agilent Technologies, USA）を用いて行い、シーケンス（シングルエンドリード）はIllumina NextSeq（Illumina, USA）を用いて完了した。生配列は、QIIME2パイプラインに従って処理された。生配列は、QIIME2 dada2プラグインを使用して、品質フィルター、トリミング、ノイズ除去、マージ、およびキメラ配列の除去を行った。アンプリコン配列の分散（ASV）は、SILVAデータベース（バージョン138）に対してアライメントした。観察されたASVとShannon指数およびSimpson指数を含むα多様性は、Rのveganパッケージを使用して計算した。Bray-Curtis距離を使用して主座標分析（PCoA）を実施した。さらに、グループ間の腸内細菌叢の不均一性を明らかにするために、類似性分析（ANOSIM）を行った。最後に、Rのheatmap3パッケージを用いて、属レベルでのヒートマップを作成した。
統計解析
データは平均値±標準偏差(SD)で示した。群間の統計的に有意な差の判定には、Tukeyの範囲検定またはStudentのt-testを伴う一元配置分散分析(ANOVA)を用いた。腸内細菌データセットの評価には、一元配置分散分析に続いてTukeyの範囲検定、Studentのt検定、Wilcoxonの符号順位検定、Kruskal-Wallis検定が使用されました。すべての統計解析は、R Studio（バージョン1.2.5001）、R（バージョン3.6.1）、またはGraphPad Prism（バージョン9.5.1）を使用して解析された。
宣言
データの可用性
本研究における腸内細菌関連の数値は、16S rRNAシーケンスの生データを用いて作成したもので、NCBI Short Read Archiveで対応するアクセッション番号を用いてアクセスすることができる： BioProject： PRJNA944655、およびBioSample： SAMN33757824です。
コードの入手方法
本研究の「方法」セクションでは、利用したバイオインフォマティックツール、ソフトウェアのバージョン、パラメータ、オープンソースコードについて説明しています。解析を再現するためのコードに関するより詳細な情報は、ご要望に応じて提供します。
謝辞
本研究は、台湾科学技術部（109-2327-B-002-005, 109-2314-B-002-103-MY3, 109-2314-B-002-064-MY3, 110-2327-B-002-007, 111-2628-B-002-047, 111-2327-B-002-008, 106-3114-B-002-003, 107-2321-B-002-039, 108-2321-B-002-051, 107-2321-B-002-017) により助成された。
競合利益
著者らは、競合する利害関係がないことを宣言する。
著者貢献
S.P.は、実験の指示と補助を行い、バイオインフォマティクスと統計解析を行い、結果を解釈し、原稿を作成した。W.K.W.は、実験の設計と指示を行い、さらに原稿のレビューと修正を行った。C.T.C.は、動物実験を行った。N.W.とH.C.H.は、粘液層における細菌の共局在を可視化する実験において技術支援を行った。R.A.C.、H.S.H.、Y.H.C.はすべての実験に協力した。P.Y.L.はバイオインフォマティクス解析をサポートした。H.L.C.はマウス実験において技術的なサポートを行った。T.C.D.S.、S.L.T.、C.T.H.は原稿を批判的に検討しました。M.S.W.とL.Y.S.は、実験の設計、研究資金の提供、原稿の修正を行った。すべての著者は、本研究のすべてのデータにアクセスすることができ、出版に向けた投稿の責任を負う。
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