クローン病患者において腸回腸粘膜のビロームが障害され、マウスの腸炎を悪化させる

2024年2月24日 14:42

本文へスキップ
ネイチャー・コミュニケーションズ
検索
ログイン
コンテンツ
Natureについて
掲載
記事
PDFダウンロード
PDFダウンロード
記事
オープンアクセス
出版：2024年2月22日
クローン病患者において腸回腸粘膜のビロームが障害され、マウスの腸炎を悪化させる

https://www.nature.com/articles/s41467-024-45794-y

曹志瑞、范徳軍、...鄒涛著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ15巻、論文番号：1638（2024）この記事を引用する

メトリクス詳細

要旨
腸内細菌叢の異常は、炎症性腸疾患（IBD）の病因に関与していることが知られている。クローン病（CD）は、広範な粘膜炎症を伴うIBDのサブタイプであるが、バクテリオームと粘膜免疫の経験的調節因子である粘膜ビロームの構成と役割については、依然として不明な点が多い。ここでは、CD患者と健常人をトランスコホートし、小腸（回腸末端部）のビロームとバクテリオームの構成と機能を調査した。CDの回腸ビロームの特徴は、溶菌性バクテリオファージと温和性バクテリオファージ（特に細菌性病原体を標的とするもの）の両方が、特に再燃患者において過少に発現していることであった。一方、CDの回腸粘膜におけるビローム-バクテリオーム生態系は、ビフィドバクテリウムとラクノスピラシアエが主導する細菌とバクテリオファージとの相互作用の欠如によって特徴づけられていた。驚くべきことに、それはCDの寛解期において再燃期よりも顕著であり、CDにおける粘膜炎症の難治性と再発性を強調していた。最後に、CD患者由来の回腸ビリオンは、腸炎に先行する腸内ビローム・バクテリオームの生態系を再構築し（微生物トリガー）、腸細胞における微生物感知／防御経路を増強する（宿主応答）ことにより、IBDマウスモデルにおいて腸炎を悪化させることを立証した。以上の結果から、CD発症における粘膜ビロームの重要性と、CD治療における粘膜ビロームの回復の重要性が明らかになった。

他の人が見ている類似コンテンツ
SIV感染における大腸粘膜関連マイクロバイオーム：バクテロイデス類へのシフトは、粘膜CD4+ T細胞の枯渇と腸細胞の損傷と一致する
論文オープンアクセス 2020年7月2日
クリスティナ・アラーズ、クリスティアン・シュタール＝ヘニッヒ、...トーマス・シュナイダー

プレボテラ属菌による腸内細菌叢の撹乱は、粘膜炎症に対する宿主の感受性を高める
論文公開 2020年5月20日
アイーダ・イルヤゾヴィッチ、ウルミ・ロイ、...ティル・シュトロヴィヒ

ロタウイルス感染による腸内細菌叢組成のわずかな変化は、黄砂性大腸炎感受性に影響しない
論文公開 2021年6月29日
ケディル・フッセン・ハムザ、エマ・デュネール、...カタリーナ・ラール

はじめに
炎症性腸疾患(IBD)は消化管の慢性自己免疫疾患であり、断続的な腸炎症の再燃と寛解を繰り返す進行性の経過が特徴である1。クローン病(CD)と潰瘍性大腸炎(UC)はIBDの2つの主要なサブタイプであり、消化管の異なる部位を侵す。UCが大腸を罹患するのに対し、CDは消化管、特に回腸のどこにでも発症し、その結果、病状や経過がより複雑で重篤な表現型となる1。CDの正確な原因はまだ不明であるが、腸内細菌叢の乱れがCDの病因と病態を支えていることが示された2,3。しかし、CDのマイクロバイオームに関する既存の研究のほとんどは、糞便中のバクテリオームに基づいており、腸粘膜レベルでのビロームの変化や、CDの炎症におけるその因果性・病原性についてはほとんど知られていない。

近年、腸内に生息する重要な微生物として、腸内ビロームがヒトの健康に果たす重要な役割が認識されるようになってきた4。ヒトの糞便ビロームはバクテリオファージと真核生物ウイルスで構成されており、DNAウイルスが優勢である5。しかし、腸粘膜（特に小腸）における腸内ビロームの全体的な構成と機能については、これまでヒトでは描かれていない。ウイルス／細菌は腸粘膜に近接しているため、粘膜関連微生物は、宿主の生理・病態生理において、糞便中の微生物よりも顕著な役割を果たすと考えられている。マウスやin vitroでの逸話的研究から、個々のバクテリオファージが腸の恒常性と炎症において有益な役割も有害な役割も果たすことが報告されている6,7,8。粘液に付着するT4ファージは、そのキャプシドに免疫グロブリン（Ig）様タンパク質ドメインを発現し、腸粘液層のムチン糖タンパク質と結合することができるため、大腸菌による腸上皮の感染を防御する6,7。対照的に、大腸菌バクテリオファージを投与すると、大腸炎マウスの大腸炎症が悪化した8。それにもかかわらず、粘膜ビロームのコミュニティーがヒトの腸炎をどのように制御しているのかについては、まだ不明な点が多い。小腸の末端部である回腸は、様々な偏性嫌気性菌や通性嫌気性菌が存在するCDの主な感染部位である9。一方、CDは、明らかな腸内細菌叢の異常と腸壁（経壁）炎症の高度な関与によって特徴づけられる10。細菌を捕食するバクテリオファージや宿主の免疫を制御するウイルスの性質を理解した上で、本明細書では、粘膜のビロームの乱れがCDの腸炎症の根底にある重要な要素である可能性を仮定した。

CDは多因子性で非常に不均一な疾患であり、宿主の外在的要因（人口地理、食事、薬物、ライフスタイル）と宿主の内在的要因（疾患の経過と表現型）が複雑に関連している10。これらの因子はまた、ヒトの腸内細菌叢を規定する顕著な因子でもある11,12。したがって、CDの病因との関連において、これらの因子が粘膜ウイルス叢に及ぼす影響を明らかにすることが望まれる。CDが粘膜バリア機能障害に由来し、バクテリオファージ／ウイルスがこのプロセスにおいて根源的な役割を果たす可能性があることを考えると、CDにおける粘膜ビロームを理解することは極めて重要である。本研究では、CDおよび健康状態における腸粘膜レベルの腸内ビローム（原核および真核ビロームからなる）の構成と機能を明らかにし、臨床的因子との関連を観察した。我々は、CD患者由来の回腸粘膜ビリオンが、細菌叢-ビロームの生態系を再形成し、炎症性腸型へと変化させることによって、IBDマウスモデルにおいて腸の炎症を悪化させることを明らかにした。この結果は、腸粘膜で破壊されたウイルス-バクテリオームネットワークを回復させることが、今後のCD治療における新たな目標であると考えられる。

研究結果
CDおよび健常人における回腸ビロームのランドスケープ
小腸ビロームの構成を調べるため、中国の広州（n=102）と昆明（n=106）の2つのコホートから合計208人の被験者を登録し（図1a）、各被験者から終末回腸（TI）生検を採取した（各コホートについて表1に要約；個々の被験者のメタデータは補足データ1に詳述）。CD患者は、Harvey-Bradshaw index（HBI、CD活動性指標の簡易版）の臨床的評価に基づいて、寛解または再燃に層別化された：患者の41.6％が臨床的寛解（HBI＜5と定義）であったのに対し、患者の58.4％が再燃（HBI≧5と定義）であった。続いて、TI粘膜からウイルス様粒子（VLP）を濃縮し、超深度ビローム配列決定とプロファイリングを行った（図1b）。同時にバクテリオーム解析を行うため、同じ粘膜標本で16S rDNA配列決定とバクテリオーム・プロファイリングも行った。その結果、ビロームシークエンシングからはサンプルあたり2180万±420万（平均±S.E.）のペアエンドクリーンリードが得られ、16S rDNAシークエンシングからはサンプルあたり82.2±10.8千のペアエンドクリーンリードが得られた。粘膜サンプリングと並行して、参加者の99.52％（n＝207）が、疾患表現型（医師が記録）、投薬（医療記録から検索）、地理的地域、人体計測（参加者が自己申告）、過去3ヵ月の食習慣（管理栄養士の指導の下、参加者が自己申告）に及ぶ46のメタデータ変数からなる質問票調査に回答した。このような地域を超えたコホートと包括的なメタデータプロファイルにより、回腸粘膜ビロームの変化を調査し、CDの臨床的共変数を同定することができた。

図1：研究デザインの概略、CDと健常対照における回腸粘膜ウイルス叢の変化、回腸粘膜ウイルス叢とバクテリオームの共変量。
図1
a 被験者のリクルートとコホートの説明。広州（GZ、HC：n=51、CD：n=51）と昆明（KM、HC：n=54、CD：n=52）の中国2カ所から、クローン病（CD）患者と健常対照（HC）を含む合計208人を募集した。d 回腸粘膜ビローム中のウイルスファミリーの相対的存在量。 e 回腸粘膜ビローム中の温帯性ファージと溶菌性ファージの割合。統計的有意性は、208の独立標本によるt検定で決定した。 f CD群とHC群それぞれの回腸粘膜ビロームの個人間Bray-Curtis非類似度。g ヒト回腸ビロームの変動に対するメタデータ因子の影響度。ヴィロームの共変量はenvfit（vegan）により同定され、両側並べ替え検定（FDR調整p＜0.05）により統計的に有意なものは、事前に定義されたメタデータカテゴリーに基づいて色分けされた（補足図3a、bにも示す）。有意でないメタデータ因子は灰色でプロットした。 i ヒト回腸バクテリオームの変動に対するメタデータ因子の効果量。箱ひげ図では、箱は第1四分位数から第3四分位数（25パーセンタイルから75パーセンタイル）までで、中央値は水平線で描かれている。

フルサイズ画像
表1 被験者とサンプルの特徴
フルサイズの表
まず、HCとCDの回腸ビロームの群集構造景観を調べた。全体として、すべての研究参加者の回腸ビロームの組成プロファイルは連続体を形成しており、個体間で、順序レベルでも家族レベルでも実質的な不均一性を示した（図1cおよび補足図2a、b）。さらに、組成の不均一性は、HCよりもCDの方が有意に高かった（Bartlettの分散の均質性の検定、p = 0.022、図1f）。回腸ビロームは、Petitvirales目、未分類のCaudoviricetes目、Cirlivirales目、Crassvirales目で占められていた（補足図2a）。なお、ウイルス目のCaudoviralesは最近、国際ウイルス分類委員会（ICTV）によって解散され、Crassvirales目、Ackermannviridae科、Chaseviridae科、Herelleviridae科を含む新しい分類群に再分類された13。科レベルでは、回腸粘膜ビロームの大部分はMicroviridae、未分類のCaudoviricetes科、Circoviridae、Anelloviridaeであり、合計すると参加者の74.5％において相対存在量の80％以上を占めた（図1c、d）。

回腸ビロームのウイルス目とウイルス科の大部分は原核ウイルスであったが、研究参加者全体の回腸粘膜における真核ウイルスの存在と原核ウイルスとの比率を評価しようとした。真核生物のビロームの構成は、2つのコホートのすべての研究参加者間で非常に個人差があり（補足図2c、d）、真核生物のウイルスの相対的存在量は0.24％から95.68％（中央値：26.81％、補足図2e）であった。これに対応して、原核生物ウイルスは粘膜ビロームの中でかなり大きな割合を占め、全ビロームの73.19％を占めた（補足図2e）。まとめると、消化管の回腸粘膜部位の腸粘膜ビロームは、溶菌性ファージが優勢であり、個人差が大きい。

回腸ビロームの構成に関連する腸の炎症と宿主の中核因子
全参加者の臨床メタデータと回腸マイクロバイオーム組成プロファイルを基に、46のメタデータ因子が参加者間の回腸ビロームとバクテリオームの変動に及ぼす影響を調べた。これらの因子のうち、腸内炎症（CD寛解対再燃対非炎症）、CD対HC、食事（アルコール飲料、コーヒー、膨化食品の摂取を含む）、薬物（生物学的製剤、免疫抑制剤、グルココルチコイドを含む）、地理的地域を含む9因子が、回腸ビローム組成と有意に関連することが同定された（FDR調整p＜0.05、図1g）。その中でも、腸管炎症は、CD対HCの単なる効果量と比較して、回腸ビロームの変動に対してより強い説明力を有しており（図1g）、CDの炎症経過が回腸ビロームの構成にさらに影響を及ぼしていることを示していた。すべての宿主因子の累積効果量は23.58％であった（図1h）。次に、46の宿主因子をあらかじめ定義された7つのカテゴリーに分類し、各カテゴリーの累積効果量を評価した。ここでも、CDの粘膜炎症が回腸ビロームの構成に最も大きな影響を及ぼし、回腸ビロームの変動の1.5％を占めたが、地理、薬物、食習慣も効果の大きい順に有意な影響を示した（すべてFDR調整p＜0.05、補足図3a）。これらのデータは、腸炎が回腸ビロームの構成に影響を及ぼす主要因である一方で、他の宿主因子が回腸ビロームの中核的な共変量であることを示唆している。

一方、CDでは、地理が回腸内細菌叢の変動に最も大きな影響を及ぼし（図1i、補足図3b）、次いで薬物、食習慣、粘膜炎症が続いた（補足図3b）。健常人の糞便中バクテリオームとビロームの変動を調査した我々の先行研究11と同様に、腸内細菌叢を形成する最も顕著な要因は地理的要因であったが、腸内（糞便中および粘膜中）ビロームは宿主の（病態）生理、特に粘膜レベルの影響をより強く受けていた（図1g、i）。回腸ビロームの構成に関連する宿主因子と、回腸バクテリオームの構成に関連する宿主因子を比較すると、回腸バクテリオームに影響を及ぼす因子が13因子も多いことがわかった（加工食品、フレーバーミルク、制酸剤、5-アミノサリチル酸［5-ASA］の摂取を含む）（図1g, i）。興味深いことに、バクテリオーム組成に関連するこれらの追加因子は、食事成分または薬物に分類され、これらはウイルスよりもむしろ細菌にとって基質および/または調節因子として機能する可能性があった。これらの知見は、MOFA14によるマルチオミクス解析でも検証された。MOFA14は、マルチオミクス粘膜マイクロバイオームデータセットの中で最も多様な特徴を捉えた6つの優勢なマイクロバイオーム因子（補足図3cに示す、ビロームとバクテリオームの変異による寄与の差；原核生物および真核生物のビロームによるさらに詳細な寄与は補足図3e、fに示す）を同定し、患者のメタデータとこれらのマイクロバイオーム因子との関連を突き止めた（補足図3d）。その結果、主にビロームに由来する微生物の変異を捉えたマイクロバイオーム因子2と4は、CDに関連する表現型と有意に関連していた（補足図3d）。一方、マイクロバイオーム因子1は、主にバクテリオーム由来の微生物の変異を捉えており、患者の地理的要因や食習慣関連因子と強固な関連を示した（補足図3d）。これらのデータを総合すると、粘膜バクテリオームは宿主の外因性因子（地理や食生活など）に大きく影響されるのに対し、粘膜ビローム／ファージオームは宿主の病態生理（腸炎症）に狭い範囲ではあるが強く影響されることが示唆される。

CDにおける回腸粘膜ビロームの多様性と組成の変化
腸管炎症が回腸ビロームに大きな影響を及ぼすことを認識し、次にCDとHCの回腸ビロームの組成の違いを調べた。まず、回腸ビロームの多様性（α多様性［リッチネスとシャノン指数で測定］とβ多様性の両方）を比較したところ、広州と昆明の両コホートにおいて、CD患者はHCに比べてビロームのリッチネス（ウイルス分類群の数を計算することでα多様性の指標とする）が著しく低下しており（t検定、p＜0.05、図2a）、CDの回腸ビロームではHCに比べてウイルス系統が大幅に枯渇していることが示された。一方、主座標分析（PCoA）は、回腸ビロームのβ多様性（参加者間の個人間ビロームの非類似性、図2b）を評価するために行われた。CDビロームは、広州と昆明の両コホートにおいて、HCビロームとは有意に異なるクラスタリングを示し、PCoAポーションに沿って同じ方向にシフトした（PERMANOVA検定、いずれもFDR p < 0.05、図2b2および3）。これらのデータは、群集構造レベルでの回腸ビロームの構成がCDとHCで有意に異なることを示唆している。さらに、広州と昆明のコホート間で回腸ビロームの組成を形成する有意な地理的効果が観察され（PERMANOVA検定、p＜0.05、図2b4）、以前に糞便ビロームで観察された地理的効果と一致した11。

図2：CDにおける回腸ビロームの多様性と組成の変化。
図2
a 広州コホート（n = 102）と昆明コホート（n = 106）における回腸ビロームのα多様性を、それぞれCDとHCで属レベルで比較した。統計学的有意性はt検定で決定した。 b HC、CD、地理的な回腸ビロームのβ多様性の可視化。各被験者のビロームを分析し、Bray-Curtis非類似度に基づく主座標分析（PCoA）を用いてプロットした。すべての統計的有意性はPERMANOVA検定によって決定された。c 腸炎症に伴う回腸ビロームの変異の距離ベースの冗長性解析（RDA）。効果の大きさ（R2）と方向はバイプロット（実線矢印）で可視化した。R2は並べ替えアプローチで調整し、統計的有意性は並べ替え検定で決定した。Boxplotは、HCとCD間のRDA2軸上の被験者分布の比較を示す。統計的有意性は208の独立標本によるt検定によって決定された。広州（d、n＝102）および昆明（e、n＝106）コホートにおけるHC、CD寛解および再燃の間で比較した回腸ビロームのα多様性を属レベルで示す。グループ間比較はMann-Whitney検定で行った。広州コホート（f）および昆明コホート（g）において、HC、CD寛解期、再燃期で比較した上位10ウイルスファミリーの相対的存在量のサンキープロット。 h CD寛解期および再燃期でそれぞれHCと比較して特徴的な回腸ウイルスファミリーを、MaAsLin2により薬物および食習慣を制御して同定した。濃縮されたウイルスファミリーは赤で、減少したウイルスファミリーは青でプロットされている。バブルの大きさとバブルの濃淡は、ウイルス種と腸の炎症との相関の大きさを示している。黒く塗られたウイルス分類群は原核生物ウイルス／バクテリオファージを、赤く塗られたウイルス分類群は真核生物ウイルスを示す。統計学的有意性は、Benjamini and Hochberg false discovery rate（BH-FDR）調整による両側多変量関連検定によって決定した。BH-FDR q < 0.2（p < 0.05）を有意とみなした。箱ひげ図では、箱は第1四分位数から第3四分位数（25パーセンタイルから75パーセンタイル）までで、中央値は水平線で描かれている。

フルサイズ画像
次に、疾患経過（CD再燃と寛解）が回腸ビロームに及ぼす影響を評価した（冗長性解析［RDA］による、図2c）。その結果、CDフレアアップ群と寛解群の回腸ビロームがHC回腸ビロームに対してシフトする一方で、RDA-PCAプロットではCDフレアアップ群と寛解群のビロームは別々のシフトを示した（図2c）。一方、CDフレアアップビロームのHCビロームとの差は、CD寛解ビロームのHCビロームとの差に比べて大きかった（図2c）。これらのデータから、回腸ビロームの構成は、CD患者のフレアアップと寛解の間で異なっていることが示唆された。そこで、CD患者を再燃群と寛解群に層別化し、この2つの患者群とHC群との回腸ビロームの組成の違いを調べた。回腸ビロームの豊富性は、広州と昆明の両コホートにおいてCD再燃群で寛解群より有意に減少し、シャノン多様性は昆明コホートにおいてCD再燃群で寛解群より有意に減少した（Mann-Whitney検定、すべてp＜0.01、図2d、e）。さらに、CDの再燃と寛解にそれぞれ関連するウイルス分類群を同定するために、回腸ビロームについてMaAsLin2解析（Microbiome Multivariable Associations with Linear Models 2 with the Benjamini and Hochberg false discovery rate (BH-FDR) approach, q < 0.2 [p < 0.05]）を行い、薬剤と食習慣をコントロールした。CDとHCの比較における回腸ビロームの豊富さの減少と同様に、特徴的なウイルス分類群（主にバクテリオファージ）は、HCと比較してCDの再燃期と寛解期の両方で有意に減少していた；この傾向は寛解期よりもCDの再燃期でより顕著であった（ファミリーレベル：図2f-h；属レベル：補足図4）。しかし、広州コホートと昆明コホートのCD患者では、それぞれ2つの異なるウイルス分類群（ファミリーレベル：図2h；属レベル：補足図4）が減少しており、CDの回腸ビロームの構成には、コホート（地理）特異的な影響が顕著であることが示唆された。特徴的なウイルスファミリーのうち、ポドウイルス科は広州コホートと昆明コホートで共通する唯一のファミリーであり、一貫してCD再燃群と寛解群の両方でHC群と比較して存在量が減少していた（すべてp＜0.05、図2h）。対照的に、Gammatorquevirus（アネロウイルス科の真核ウイルス属）は、広州と昆明のコホートにおいて、CD再燃群と寛解群の両方でHC群と比較して増加していた（すべてp＜0.05、補足図4）。Gammatorquevirusは免疫不全者において上昇することが知られており15、CD患者の回腸粘膜におけるGammatorquevirusのHCに対する増加は、CDにおける腸粘膜免疫の調節不全が特定の真核ウイルスの開花と関連している可能性を浮き彫りにしている。このことは、シクロウイルス（もう一つの真核ウイルス属）がCDの再燃においてHCよりも著しく増殖しているという観察結果にも示されている（すべてp<0.001、補足図4）。これらの所見を総合すると、CD患者の回腸ビロームでは、ある種の真核ウイルスの拡大とともに、バクテリオファージの分類群が著しく減少しており、そのパターンは、特にCDの間欠的な再燃と寛解の性質を考慮すると、疾患の経過（再燃と寛解）の間に悪化する可能性がある。

CDの粘膜関連ウイルスを詳細に観察し、CDの再燃に関連するウイルスの系統を特定するために、CDとHCの回腸ビロームを種レベルで調べた。ここでも、広州と昆明の両コホートにおいて、CD患者（再燃期と寛解期の両方）では、HCと比較して多数のウイルス種（n = 186；98.9％がバクテリオファージ）が減少していた（図3a, bおよび補足図5e）。図3bに列挙したように、CDの再燃期と寛解期には増加したウイルス種が多数存在した（ほとんどが各コホートに特有のものであった：広州の再燃期では10種、広州の寛解期では18種、昆明の再燃期では21種、昆明の寛解期では17種）。興味深いことに、CDとHCで増加したウイルス種のうち、真核生物のアネロウイルス科に属するトルク・テノ・ウイルス系統のパネル（-1、-9、-13、-10）は、CDの回腸粘膜、特に再燃粘膜で有意に濃縮されていた（図3cおよび補足図6a、b）。CDとHCでバクテリオファージと真核生物のウイルスが不一致であったことから、CDとHCの粘膜ビロームの生態学的差異を調査することになった。回腸原核ビロームのα多様性は、CD対HC、特にCDフレアアップ対HCで有意な減少が観察された（広東省コホートではリッチネスが減少、p＜0.01；昆明コホートではリッチネスとシャノン多様性の両方が減少、いずれもそれぞれp＜0.05；図3gおよび補足図5a、b）。一方、回腸真核生物のビロームのα多様性は、CDの再燃とHCの再燃で有意な増加が観察された（広東省のコホートではリッチネスとシャノン多様性がともに増加し、いずれもp＜0.05；昆明のコホートではシャノン多様性が増加し、p＜0.05；図3hおよび補足図5c、d）。また、CDが回腸内細菌叢に及ぼす影響についても調べたところ、CDの粘膜細菌叢はHCのそれとは著しく異なっており、広州と昆明の両コホートでプロテオバクテリアの著しい拡大とファーミキューテスの減少が観察された（補足図7a、b、d）。さらに、広州コホートのCD患者では、昆明コホートと比較して、バクテロイーダ菌と脱硫細菌がさらに減少しており（補足図7a、b、d）、CD粘膜細菌叢の形成に地理的な影響があることが示唆された。

図3：CDにおける原核ウイルスの減少と真核ウイルスの増加。
図3
a 広州コホート（左）および昆明コホート（右）において、CD（寛解期および再燃期）における回腸ウイルス種の変化をHCと比較し、MaAsLin2解析により薬物および食習慣を対照として同定した。上位60の有意な関連（BH-FDR q < 0.2 [p < 0.05]）のみをプロットした。濃縮されたウイルス種は赤でプロットされ、減少したウイルスファミリーは青で示されている。バブルの大きさは研究参加者全体のウイルス種の有病率を示し、バブルの濃淡は相関の大きさを示す。黒で塗られたウイルス分類群は原核生物ウイルス／バクテリオファージを、赤で塗られたウイルス分類群は真核生物ウイルスを示す。統計的有意性は、BH-FDR調整による両側多変量関連検定によって決定された。 b グループ間で共有されたウイルス種の数のベン図。c HCと比較したCDにおける特徴的なウイルス種（相対的存在量の増加または減少）を、CD寛解、再燃、コホートに関してプロットした。各特徴的な種の宿主は描かれている。d回腸粘膜バクテリオファージの宿主細菌の分類学的分布を、その捕食者バクテリオファージの相対存在量によってランク付けした。 e HC、CD寛解期、フレアアップ期における、宿主細菌門によって分類されたバクテリオファージの相対存在量。群間比較はt検定で行った。 f HCとCDの間で、宿主細菌種により分類されたバクテリオファージの濃縮度の差。濃縮された菌種はLEfSe解析（LDA > 2、KW p値 < 0.05）により同定されたが、CD再燃では特定の菌種は同定されなかった。宿主菌の予測は、PHYBOX（CHERRY）におけるウイルスコンティグのCRISPRスペーサー解析に基づいて行われた。広州コホート（左、n＝102）および昆明コホート（右、n＝102）において、CD寛解および再燃における回腸原核生物ビローム／バクテリオファージ（g）および回腸真核生物ビローム（h）の豊富さをHCと比較した。群間比較はMann-Whitney検定で行った。箱ひげ図では、箱は第1四分位値から第3四分位値（25パーセンタイルから75パーセンタイル）まで、中央値は水平線で描かれている。

フルサイズ画像
病気の経過に伴ってCD回腸粘膜で減少したバクテリオファージの寄生性を理解するために、これらのCDで減少したバクテリオファージの宿主をVirus-Host DataBaseで検索した。広州コホートと昆明コホートで共通して検出されたCD欠失型バクテリオファージの大部分（12/34；35.29％）は、Junavirus PL1、Lactobacillus phage Lv-1、Tybeckvirus tv521B、Lughvirus lughといった固形細菌門のプロバイオティクス細菌に感染するものであった（図3c、補足データ2、補足図7e）。一方、回腸粘膜バクテリオファージの宿主細菌を調べるために、PHYBOX（CHERRY）16によるCRISPRスペーサー解析に基づくウイルス宿主予測も行った。この解析の結果、回腸バクテリオファージの宿主は、プロテオバクテリア（Proteobacteria）、ファーミキューテス（Firmicutes）、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）が優勢であり（捕食バクテリオファージの存在量の多い順にランク付け、図3d）、ファーミキューテスに感染するバクテリオファージは、CDフレアアップではHCに比べて相対量が有意に減少していた（t検定、p = 0.023、図3e）。これらのCDから枯渇したバクテリオファージ種とファーミキューテス属細菌についてさらに相関解析を行ったところ、HC、CD寛解、フレアアップの各グループで、バクテリオファージと細菌の逆相関が遍在していることが示されたが、相関の頑健性と効果の大きさは異なっていた（補足図7c）。これらのデータは、バクテリオファージと腸管粘膜の細菌との間に餌食-捕食関係が存在する可能性を示唆しているが、逆相関関係はそれ自体非同期的であり、CDの疾患経過を支えている可能性がある。

一方、宿主が病原性細菌であるバクテリオファージには、CDで枯渇したバクテリオファージがいくつかあった。 )、Punavirus SJ46 (宿主: Salmonella enterica serovar Indiana)、Listeria phage B025 (宿主: Listeria monocytogenes)、Samwavirus samW (宿主: Corynebacterium xerosis)、Streptococcus phage EJ-1 (宿主: Streptococcus pneumoniae)などであった（図3cおよび補足図7e）。同様に、PHYBOX（CHERRY）16によるCRISPRスペーサー宿主予測に基づくと、特定の病原体（肺炎桿菌と化膿レンサ球菌）に感染するウイルスは、CDとHCで有意に減少することがわかった（LEfSe解析、KW p値＜0.05、図3f）。これらの宿主病原体の多くは、Klebsiella、Salmonella、Listeria monocytogenes17,18,19など、腸炎および/またはIBD増悪と関連している。これらのバクテリオファージと関連する細菌性病原体との間に有意な相関は認められなかったが、CD粘膜における病原細菌に対するバクテリオファージの枯渇は、特に再燃患者において（補足図7e）、病原体に対する免疫空白を引き起こし、その結果、疾患の進行を悪化させる可能性がある。

CDにおける回腸粘膜ビロームの機能性変化
次に、健常時とCD時の回腸粘膜ビロームの構成性だけでなく、機能性プロファイルを理解しようとした。MaAsLin2解析により、HC、CDフレアアップ、寛解において異なる濃縮を示す回腸ビロームの機能モジュールを同定した。HCでは、回腸ビロームの特徴として、ウイルス内在性機能（ウイルス複製、パッケージ、溶菌・分解決定、動員、統合、接着、侵入）と宿主依存性機能（代謝、シグナル伝達、高分子修飾、抗生物質関連・耐性機能、毒素・抗毒素系、ストレス関連応答、遺伝子発現制御、翻訳、翻訳後修飾）を含む多様なウイルス機能カテゴリーが存在した（図4）。しかし、CDの回腸ビロームでは、HCに比べて機能の多様性が有意に減少しており、CD寛解群、再燃群ともに、HC群に比べて多くのウイルス機能モジュールの発現が低いことが示された（図4）。注目すべきは、ビリオンの集合体形成、溶原性形質転換、およびウイルス放出過程（主にバクテリオファージ由来）に関与するウイルス機能が、CDとHCのビロームで有意に発現低下していたことである（図4）。同様に、CDとHCの回腸ビロームでは、溶原性バクテリオファージと温帯性バクテリオファージの両方が有意に減少していることが、広州と昆明の両コホートで明らかになった（t検定、すべてp＜0.01、補足図7f）。さらに、ウイルスの接着・侵入、DNAの動員・統合、代謝に関連するウイルス機能も、CDとHCの回腸ビロームで有意に消失していた（図4）。これらのウイルス機能の減少の大部分は、CDの回腸ビロームで減少したバクテリオファージ（補足図8で青く塗られたバクテリオファージ種）と、CDとHCで存在量に差のないバクテリオファージ（補足図8で黒く塗られたバクテリオファージ種とCDで減少したウイルス機能との関連で示される）の両方に関連していた。これらのデータを総合すると、CDの回腸ビロームにおける機能性の変化は、ウイルス分類群の種の豊富さの変化と、個々のバクテリオファージの遺伝的構成の変化とが絡み合っている可能性が示唆される。

図4：CDにおける回腸粘膜ビロームの機能性の変化。
図4
MaAsLin2により、CDとHCのビロームの機能差を、薬物、食習慣、地理的条件を制御して同定した。BH-FDR q < 0.2 (p < 0.05)の機能モジュールのみを示した。統計的有意性は、両側多変量関連性検定によって決定され、BH-FDR調整によって調整された。

フルサイズ画像
対照的に、CDフレアアップとHCの回腸ビロームでは、Zinc-hookドメイン含有タンパク質とOB-fold核酸結合ドメイン含有タンパク質（いずれもDNA複製、組換え、修復関連機能）を含む7つのウイルス機能の相対量が増加していた、 AP2ドメインタンパク質と複製ターミネータータンパク質（どちらもタンパク質の翻訳と発現に関連する機能）、主要カプシドS（真核生物ウイルスの構造タンパク質）、カプシド成熟プロテアーゼ（ウイルスのカプシド成熟に関連するプロセス）、グリシルペプチドN-テトラデカノイルトランスフェラーゼ（細胞およびウイルスタンパク質のN-ミリストイル化）などがある（Fig. 4). このデータは、CD回腸ビロームに濃縮されたウイルス機能が、ウイルスや宿主の一般的機能を高めている可能性を示している。興味深いことに、CDビロームにおけるグリシルペプチドN-テトラデカノイルトランスフェラーゼコード遺伝子の増加は、トルクテノウイルスの存在と相関していた（補足図8）。ADPリボシル化因子6（ARF6）のN-ミリストイル化は、GTPアーゼサイクルの間、ARF6を細胞膜上に維持することが報告されており、ARF6は細胞内エンドサイトーシス、上皮バリア破壊、腸炎20,21において重要な役割を果たし、これらはすべて真核生物のウイルス感染に対する宿主防御において重要な機能である。グリシルペプチドN-テトラデカノイルトランスフェラーゼとトルクテノウイルスの相関は、CD患者の回腸粘膜における異常なウイルスの存在と関連して、宿主細胞の生物学的変化を示しているのかもしれない。全体として、原核生物宿主（細菌）と真核生物宿主（すなわちヒト細胞）の両方の代謝と表現型が、CDとHCでは変化していると考えられる。

CDにおける回腸ビロームとバクテリオーム間の領域横断的相互作用
ウイルス（バクテリオファージと真核ウイルス）と宿主（細菌と真核細胞）の間の密接な関係、および領域を越える微生物間の宿主免疫の仲介効果3,24,25を考慮すると、CD患者の腸管粘膜では、HCと比較して、腸内ウイルス-バクテリオームの生態系ネットワークが変化していると考えられた。そこでわれわれは、CD（寛解期および再燃期）とHCにおける回腸ビロームとバクテリオームの間のトランスキングドム相互作用を明らかにした。マイクロバイオームコミュニティレベルでは、回腸ビロームとバクテリオームのα多様性指標間の相関を評価した。ービロームとーバクーバクテリオームのー α多様性指標にービロームとーバクテリオームー α多様性指標ーバクテリオームー α多様性指標ーさらに、HC群では、ビロームの豊かさとバクテリオームのシャノン指数、シンプソン指数、均等性指数との間に有意な正の相関が認められた（すべてp < 0.05、図5a）。しかし、このような相関パターンは、CDの寛解期と再燃期の両方で失われた（図5a）。これらのデータから、ビロームの豊かさとバクテリオームの豊かさは、ともに恒常的な粘膜マイクロバイオーム生態系の基盤であり、その喪失が腸管病態やCD再燃に関連している可能性が示唆される。

図5：回腸ウイルスと細菌間の領域を超えた相互作用。
図5
a HC、CD寛解期、フレアアップ期における回腸ウイルソームとバクテリオームのα多様性指標（リッチネス、多様性［シャノン指数とシンプソン指数］、均等性）の相関。スピアマンの相関係数を計算し、すべての一対比較について統計的有意性を決定した。 b HC、CD寛解期、フレアアップ期それぞれにおける、種レベルの上位50のバクテリオファージと上位30の細菌属との間の領域間相関。相関はFastSparを用いて計算され、統計的有意性はブートストラップ法によってすべての一対比較について決定された。統計的に有意な相関のみをプロットした。赤い泡は正の相関を示し、青い泡は逆相関を示す。大きさと濃淡の強さは相関の大きさに比例する。青く塗られたバクテリオファージは、CDとHCで減少した菌種を示す。紫色で塗られた細菌属は、後のマウス研究（図7jに示す）のバクテリオーム-ウイルス生態学解析でも出現した属を示し、因果関係を立証し、ヒトでの発見を検証している。

フルサイズ画像
ー粘膜ビロームとーバクテリオーム間のー相互作用をー粘膜ビロームとーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームーバクテリオームー我々の解析では、HCにおいて多数のバクテリオファージ-細菌相関が見られ（図5b）、定常状態において粘膜ファージオームとバクテリオームの間に強く広範なクロスキングダム相互作用があることが示唆された。しかし、CD寛解期と再燃期の両方において、相関ネットワークは弱まり、HCで観察された相関ネットワークと比較して、バクテリオファージ-細菌相関の数が著しく減少し、相関効果量も減少していることが示された（図5b）。、ー回腸バクテリオファージとー細菌属ビフィドバクテリウム属、ー分類不能のーLachnospiraceae属Cellulosimicrobium属Bacteroides属Streptococcus属のーCD属のーBacteriophage-ー細菌属のー相関ネットワーク（ー図5b)。対照的に、バクテリオファージとプレボテラ属菌の逆相関は、CD（特に再燃を伴うCD）対HCで濃厚であり、そのうちの複数種のプレボテラ属菌は腸炎において炎症促進作用を持つことが報告されている26。CDとHCのファージオーム-バクテリオームネットワークの弱体化は、CDで枯渇したバクテリオファージ（n = 23）とCDで枯渇していないバクテリオファージ（n = 27）の両方に起因していた（図5b）。ファージオーム-ーバクテリオーム生態ネットワークがファージオームーバクテリオーム生態ネットワークがファージオームーバクテリオーム生態ネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワークネットワーク

驚くべきことに、CDで観察されたファージオーム-バクテリオームネットワークの弱体化は、CD寛解群ではCD再燃群に比べてより顕著であり、CD寛解群のファージオーム-バクテリオームネットワークは、有意な相関の数がより減少し、相関のエフェクトサイズも減少しているという観察結果からも裏付けられた（図5b）。この所見は、真核生物のウイルス-バクテリオーム相互作用にも当てはまった（補足図9a）。これらのデータは、CDの劇症型活動性疾患経過（フレアアップ）後の寛解期には、粘膜ウイルス／バクテリオファージと細菌が互いに歩調を合わせた平衡的な生態系ネットワークを確立していない可能性を示している。さらに、CDの巨視的な寛解（内視鏡的寛解）は、顕微鏡的な寛解（組織学的寛解）を事実上反映していない。したがって、ウイルス・バクテリオームレベルでの生態学的寛解も、CD治療における臨床目標のひとつと考えるべきである。

回腸ビロームの構成に対する薬剤の影響
薬剤は糞便中マイクロバイオーム組成に影響を与える重要な因子であり28、懸念される疾患における腸内細菌叢の調査研究において重要な交絡因子となる。しかし、粘膜レベルでの腸内ビロームに対する薬剤の影響は不明であった。メタデータ-ビローム解析の結果、薬剤は全体として回腸ビロームの分散の1.1％を説明し（VPA解析、並べ替え検定、p < 0.05、補足図4a）、回腸ビロームの構成にささやかながら有意な影響を与えていることがわかった。次に、一般的に処方されている4種類のCD関連薬（生物学的製剤、免疫抑制剤、グルココルチコイド、5-ASA）が回腸ビロームの構成に及ぼす影響を別々に調べた。103人のCD患者のうち、77人（74.76％）が、サンプリング日の前3ヵ月間に、生物学的製剤（n=40、38.83％）、免疫抑制剤（n=33、32.03％）、グルココルチコイド（n=22、21.36％）、5-ASA（n=49、47.57％）を含む、1つ以上の第一選択薬／第二選択薬による治療を受けていた（表1および補足データ1）。MaAsLin2解析により、地理的条件と食事内容をコントロールしながら、各薬物療法に関連するウイルス種を特定した。合計34の瞑想とウイルスの関連が発見され、28のウイルス種がこれらの薬と有意に関連していることが同定された（図6a）。有意な薬物-ウイルス関連（n = 34）のうち、15（44.1％）が生物学的製剤に、13（38.2％）がグルココルチコイドに、4（11.8％）が免疫抑制剤に、2（6.2％）が5-ASAに関連しており、生物学的製剤が回腸ビロームの構成に最も大きな影響を及ぼしていることが示唆された。薬剤に関連したウイルス種（n = 28）のうち、14種（50％）は薬剤に特異的であったが、残りの14種（50％）は薬剤とCDの両方に関連していた（図6a）。興味深いことに、薬剤とCDの両方に関連したウイルス種のうち、7種は生物学的製剤とCDに、3種はグルココルチコイドとCDに、1種は免疫抑制剤とCDに、1種は5-ASAとCDにそれぞれ関連していた（図6a）。これらのデータから、薬剤はCDで歪んだビロームに対して整流効果を持つ可能性があり、生物学的製剤が最も大きな効果を持つ可能性がある。その結果、免疫抑制剤、グルココルチコイド、5-ASAと比較して、生物学的製剤は全体的にCDのビローム-バクテリオームネットワークをHCと同様のレベルまで回復させた（補足図9b）。

図6：薬剤と食事に関連した回腸ウイルス種。
図6
a 薬物関連回腸ウイルス種。ウイルス種と薬剤との関連は、寛解／再燃、食習慣、および地理をコントロールするMaAsLin2によって同定された。有意な関連（BH-FDR q < 0.2 [p < 0.05]）のみをバブルプロットでプロットした。赤いバブルは薬と正の関連を持つ生物種を示し、青いバブルは薬と逆の関連を持つ生物種を示す。バブルの濃淡は、ウイルス種と薬との関連性の大きさを示す。泡の大きさは、研究参加者全体でのウイルス種の有病率を示す。比較のために、これらのウイルス種とCDとの関連もプロットした。統計学的有意性は、BH-FDR調整による両側多変量関連検定によって決定した。

フルサイズ画像
CD治療薬と腸内バクテリオファージの因果関係をさらに調べるために、5人の健常人から採取した糞便微生物叢調製物を目的の治療薬（それぞれ5-ASA、免疫抑制薬アザチオプリン[AZA]、グルココルチコイド薬メチルプレドニゾロン[MP]）とインキュベートし、ヒト患者のCD治療薬との関連が観察されたバクテリオファージのインキュベーション後の存在量の変化を特異的に調べるというin vitroモデルを利用した。大半のバクテリオファージは対象となる3つの薬剤の影響を受けなかったが、多くのバクテリオファージが5-ASAとMPの影響を受けることがわかった（ベフナウイルスBH1は5-ASAによって増加した、補足図10b；ブレビバチルスファージSundanceとラクトバチルスファージLj928はMPによって減少した、補足図10c, f）。このことは、患者における薬剤-ウイルスームの関連で見られたのと同じ方向の存在量の変化を示している。このデータから、CD製剤は定義された一連のバクテリオファージの存在量を因果的に変化させる可能性があるが、多くのバクテリオファージ種は薬剤使用の関数として因果的に変化しない可能性があることが示唆される。生理的条件下での腸内バクテリオファージに対するこれらの薬剤の影響をさらに立証するために、5-ASA、AZA、MPを投与してin vivo実験を行い、薬剤投与後の標的腸内バクテリオファージの存在量変化を調べた（補足図11）。ここでも、バクテリオファージの大部分はこれらの薬剤によって変化しなかったが、一部のバクテリオファージは5-ASAとMPによって影響を受け、in vitro実験（MPの使用でラクトバチルスファージLj928が減少）やヒトでの観察（5-ASAの使用でクロストリジウムファージPhiS63が減少、MPの使用でコエッツェウイルスJL1ファージが減少）で得られた知見と一致した（補足図11b、f、h）。これらのデータを総合すると、薬剤の使用が腸内ファージオームの形成に重大な影響を与えることが立証された。

また、生物学的製剤、免疫抑制剤、グルココルチコイド、5-ASAが回腸ビロームの機能性プロファイルに及ぼす影響も評価した。これらの薬剤と逆相関するウイルス機能の大部分は、DNA複製、組換え、修復、ウイルスDNAパッケージ、形態形成、ビリオンアセンブリに関連する生物学的プロセスに関与していた（補足図12a）。注目すべきは、生物学的製剤、グルココルチコイド、5-ASAが、関連するウイルス機能と逆相関を示したのに対し、免疫抑制剤は正の相関を示したことである（補足図12a）。これらのデータは、CD治療薬に含まれる既存の薬剤のほとんどが、ウイルスの複製と集合を強力に阻害する可能性を示唆している。グルココルチコイドと免疫抑制剤はいずれもCD治療薬において免疫抑制の役割を持つが、ウイルスの複製と集合の機能との関連性の方向性は異なっていた（補足図12a）。メカニズム的には、グルココルチコイドが幅広い白血球を標的とするのに対し、免疫抑制剤は主にT細胞活性化カスケードを標的とする29。このことは、類似した役割を持つ薬剤が、粘膜ビロームの機能性プロファイルに異なる影響を及ぼす可能性を示しており、おそらく各薬剤の様々な免疫調整メカニズムに依存している。回腸ビロームの分類学的構成（図6a）に最大の効果を示した生物学的製剤とは対照的に、グルココルチコイドは回腸ビロームの機能性プロファイルに最大の効果を示した（補足図12a）。このような回腸ビロームの構成性と機能性に対する薬剤の効果の大きさの不一致は、異なる薬剤が粘膜ビロームの分類学的多様性と機能的多様性を調節する上で矛盾した役割を担っていることを示唆している。

食事に関連する回腸ビロームの特徴
食事は腸内細菌叢を形成する重要な因子であり、ヒトの糞便微生物叢変動の20％に寄与していると報告されている30。図1gのメタデータとビロームの相関分析では、23の食事成分のうち、アルコール飲料、コーヒー、パフ食品の摂取がそれぞれ回腸ビロームの変動と有意な関連を示した。そこで次に、アルコール飲料、コーヒー、膨化食品と回腸ビロームの構成および機能との関連を個別に検討した。まず、気になる食事成分の摂取頻度と回腸ビロームのα多様性、あるいは気になる食事成分の摂取者／非摂取者と回腸ビロームのα多様性との関係を評価した。その結果、週1回のコーヒー摂取者は、コーヒー摂取頻度が低い人と比較して、回腸ビロームの多様性が増加した（p < 0.05、補足図13c, d）。対照的に、パフ入り食品の摂取者は、パフ入り食品の非摂取者と比較して、回腸ビロームの濃度と多様性の両方において有意な減少を示した（いずれもp < 0.01, 補足図13e, f）。これらのデータは、コーヒーの飲用と膨化食品の摂取が、回腸ビロームの構成景観に異なる影響を与えることを示唆している。

次に、疾患（CD対HC）、地理、薬剤を調整した上で、アルコール飲料、コーヒー、パフ食品にそれぞれ関連するウイルス種を同定した。合計83のウイルス種がアルコール飲料、コーヒー、および膨化食品の摂取と関連しており、その大部分（79/83、95.2％）はバクテリオファージであった（図6b）。これらのウイルス種のうち、49のウイルス種（49/83、59.0％）は食事成分特異的であり（図6b1）、一方、34のウイルス種（34/83、41.0％）はCDによっても同時に影響を受けていた（図6b2）。全体として、膨化食は様々なウイルス種の実質的な減少と関連しており（図6b）、その多くはCDによって減少したウイルス種でもあった（図6b1）。食餌-ウイルス機能相関分析でも、膨化食は様々なウイルス機能の実質的な枯渇と関連しており、その多くはウイルスのライフサイクルと代謝に関連するCD欠乏ウイルス機能でもあった（補足図12b）。パフュームドフードは脂肪分や食品添加物（膨張剤、乳化剤、保存料を含む）を豊富に含んでおり、これらはすべて腸内細菌叢に悪影響を及ぼし、腸の炎症を悪化させることが報告されている31。この観察に基づくと、膨化食品の有害作用は、腸の炎症に関連する腸粘膜レベルで回腸ビロームに一般化される可能性がある。

対照的に、コーヒーを飲むとサーコウイルス属（真核ウイルス）が減少し、バクテロイデスファージB124-14と未分類のエポナウイルス属（どちらもバクテリオファージ）が増加した（図6b2）。興味深いことに、CDはこれらのウイルス種すべてにおいて、コーヒー飲用と逆の関連性を示した（図6b2）。ビロームの機能性レベルでも、コーヒー飲用は一連のウイルス機能と有意な関連を示したが、これらについてもCDとは逆の関連を示した（補足図12b）。ヒトやマウスを対象とした先行研究では、コーヒーの飲用がIBDの予防因子であることが報告されている32,33。これらのデータを総合すると、コーヒー飲用によるIBD予防効果は、腸管粘膜ビロームの構成および機能の両レベルにおいて、その効果に一部起因している可能性が示唆される。アルコール飲料の摂取は、バクテロイデスファージB124-14、未分類のアンドロメダウイルス種、未分類のKungbxnavirus種（いずれもバクテリオファージ、図6b2）と逆相関していた。一貫して、CDもこれら3種と逆相関を示した（図6b2）。バクテロイデスファージB124-14の宿主菌である腸内毒素原性バクテロイデス・フラジリスは、CDで増加し、プロテアーゼ活性を通じて腸の炎症を悪化させることが報告されている34,35。アルコールが主に消化管粘膜で吸収されることを考慮すると、アルコールがバクテロイデスファージB124-14に悪影響を及ぼし、CDにおけるバクテロイデス・フラギリスの開花と粘膜炎症につながる可能性がある。

ヒトCDの回腸VLPはマウスの腸の炎症を悪化させた。
IBDにおける小腸粘膜ビロームの障害と腸炎症の因果関係を明らかにするため、CD患者（n = 4）および非CD対照（n = 4）から回腸VLPを単離し（補足図14a）、それぞれマウスに投与した後、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）処理により腸炎症を誘発した（マウスIBDモデル、図7a）。CD回腸VLPを投与したマウスは、DSS処理後に非CD回腸VLPを投与したマウスよりも有意に重度の腸炎を示し、結腸長の短縮、組織学的炎症スコアの上昇、内視鏡的炎症の悪化によって示された（Mann-Whitney検定、それぞれp = 0.015, p = 0.027、図7b-dおよび補足図14b, c）。一方、炎症性サイトカインおよびケモカインのmRNA発現レベルも、CD回腸VLP投与マウスでは、非CD回腸VLP投与マウスよりも、Il-1α、Il-1β、Ccl3、Ccl8などの増加が見られた（Mann-Whitney検定、すべてp＜0.05、補足図14d）。これらの表現型は、別のDSSマウス（補足図15）でも、新しいIBDマウスモデルであるTNBS誘発腸炎（CDの炎症をより反映したモデル、補足図16）でも再現された。同様に、TNBSモデルでは、CD回腸ビロームの投与は、非CD回腸ビロームの投与と比較して、より顕著な腸炎を誘発した（補足図16）。これらのデータを総合すると、CD患者由来の回腸VLPがマウスの腸管炎症を悪化させ、乱れた粘膜ビロームと腸管炎症の悪化との因果関係が立証された。

図7：ヒトCD回腸VLPは、バクテリオーム-ウイルス叢の生態系を再構築し、宿主の微生物感知を増強することにより、マウスの腸管炎症を悪化させる。
図7
b, c 非CD-VLP投与マウスとCD-VLP投与マウスの大腸長および代表的な画像。平均値±S.E.M.で表し、統計的有意性は両側Mann-Whitney検定で決定した。d 非CD-VLP投与マウスとCD-VLP投与マウスの代表的な内視鏡画像。 e 非CD-VLP投与マウスとCD-VLP投与マウスの腸内で発現が異なる遺伝子のヒートマップ。炎症反応や微生物の感知・防御反応に関連する遺伝子は、茶色または濃い緑色で色分けした。f CD-VLP投与マウスと非CD-VLP投与マウスで発現が上昇したシグナル経路をGene ontology解析で解析。g CD-VLP非投与マウスとCD-VLP投与マウスの糞便ビロームのDSS前とDSS後の豊富さ。箱ひげ図では、箱は第1四分位数から第3四分位数（25パーセンタイルから75パーセンタイル）まで、中央値は水平線で描かれている。グループ間比較は、各グループに10匹のマウスを用い、シダックの多重比較検定による両側二元配置ANOVA検定によって実施した。 h LEfSe分析によって同定された、DSS処理後の非CD-VLP投与マウスとCD-VLP投与マウスの糞便間の濃縮ウイルス種の差のボルケーノプロット。統計的有意性は両側Kruskal-Wallis検定（LDA > 2, KW p値 < 0.05）で決定した。 i 10日目の非CD-VLP投与マウスとCD-VLP投与マウスで濃縮されたウイルス種の数。j CD-VLP非投与マウス（j1, 2）とCD-VLP投与マウス（j3, 4）における糞便ビロームとバクテリオーム間の領域間相互作用。0日目のビローム-バクテリオームネットワーク（j1, 3）は、VLP投与後、DSS投与前に再構築されたトランスキングダムエコロジーを示す。10日目のビローム-バクテリオームネットワークは、DSS投与による腸内炎症誘発後のトランスキングダムエコロジーを表す。相関はRパッケージggClusterNetを用いて計算した。統計的有意性はブートストラップ法によりすべての一対比較について決定し、統計的に有意な相関と相関係数>0.15をプロットした。

フルサイズ画像
CD-VLP投与マウスと非CD-VLP投与マウスの腸内組織についてRNA-seqを行った。CD-粘膜VLPによってアップレギュレートされたシグナル伝達経路の上位は、微生物（以下に例示するウイルス／細菌）および宿主の炎症反応（Il1f9、Il22、Ccl3、Ccl4、Cxcl3、Nfam1、Cebpeをコードする遺伝子を含む）に対する防御反応に関与するものであった（図7e、f）。アップレギュレートされた微生物防御経路の中で、微生物センシングとエフェクター機能をコードする遺伝子が強力にアップレギュレートされ、その中には細菌および／またはウイルスセンサー（Siglec-1、Lbp、Ifi204、Ifi209など；これらの遺伝子は貪食細胞／上皮細胞で高発現している）、および下流の微生物防御エフェクター機能遺伝子（Oas2、Fcgr1、Nlrp1a、Adamts5、HPなど）を含む（Fig. 図7e, f）。これらのデータは、CD粘膜VLP投与によって引き起こされる宿主の微生物感知・防御カスケードの増強が、マウスの腸炎悪化に大きく寄与している可能性を示している。

CD-VLP投与マウスで有意に発現が上昇した微生物センサー遺伝子には、細菌とウイルスの両方を認識するものが含まれていた（細菌のLPSを認識するLbp、ウイルスの多糖類とグリコシル化タンパク質を認識するSiglec-1など）、 Ifi204とIfi209は細菌とウイルスのdsDNAを認識する）、CD-VLPを投与したマウスで腸の炎症が悪化したのは、CD-VLPが腸のウイルソームとバクテリオームを調節し、免疫反応を増強したためではないかと推論した。この仮説やヒトCD患者における我々の知見と一致して、CD-VLP投与マウスは、非CD-VLP投与マウスと比較して、DSS投与後の糞便ビロームの豊富さと多様性が大幅に低下した（Mann-Whitney検定、p＜0.001およびp＜0.01、それぞれ、図7gおよび補足図14e）。さらに、ビロームの多様性が低いマウスは、大腸の長さ（腸内炎症の特徴）が短かった（スピアマン相関R = 0.5, p = 0.03、補足図14f）。CD-VLP投与マウスで有意に減少した17種類のウイルスのうち、5種類（29.4%）はCD患者で減少したウイルスと共通していた（図7h, i）。興味深いことに、腸内ビロームの豊富さと多様性は、DSS投与前0日目では、CD-VLP投与マウスと非CD-VLP投与マウスの間で差がなかった（図7gと補足図14e）。このことから、投与されたCD-VLPは、炎症発症前に腸内細菌叢および/または細菌叢-ウイルス叢の生態系を再構築する上で重要な影響を及ぼし、それによってレシピエントマウスがDSS誘発腸炎に対して異なる感受性を示すのではないかと推測された。そこで、DSS投与前（0日目）と投与後（10日目）における、バクテリオーム組成とバクテリオーム-ウイルス生態系の変化を調べた。我々の推測を支持するように、DSS投与前（0日目）の糞便中バクテリオーム濃度は、CD-VLP投与マウスが非投与マウスよりも有意に低かったが（Mann-Whitney検定、p < 0.001）、DSS投与後（10日目、補足図17a, b）には有意差は観察されなかった。一方、DSS投与前の糞便中バクテリオーム濃度が低いほど、結腸の長さが短かった（Spearman相関R = 0.49、p = 0.026、補足図17c, d）。これらのデータは、CD回腸VLPが黄砂による腸内炎症に先行してバクテリオームを再形成し、バクテリオームの再形成の程度が炎症の重症度と相関していることを示している。さらに、バクテリオーム-ウイルス間の相互作用ネットワーク解析から、CD回腸VLP投与により、DSS投与前（0日目）のバクテリオーム-ウイルス間の生態系が、CD-VLP非投与マウスで観察されたネットワークよりも弱まっていることが示された（図7j1）。DSS投与後（10日目）、損なわれたバクテリオーム-ウイルスネットワークはさらに弱まり、CD-VLP投与マウスでは非CD-VLP投与マウスよりも顕著であった（図7j2, 4）。全体として、非CD-VLP投与マウスでは、DSS投与前（0日目）と投与後（10日目）の両方で、ビフィズス菌-ビロームおよびラクノスピラチア菌-ビロームの相関によって、バクテリオーム-ビロームネットワークが特徴付けられた（図7j1, 2）。対照的に、CD-VLP投与マウスでは、ビフィドバクテリウムとラクノスピラ科細菌が優勢であったこれらの細菌群-ウイルス群の相互作用は著しく弱まり、これらのクロスキングダム相関の数が少ないことが示された。注目すべきは、DSS投与前0日目に、CD-VLP投与マウスではプレボテラ-ウイルス間の相互作用が非CD-VLP投与マウスよりも強まったことである（図7j1, 3）。全体として、マウスにおけるこれらのデータは、ヒトのCD患者におけるビフィドバクテリウム-ビローム相互作用とラクノスピラチアエ-ビローム相互作用が弱まる一方、プレボテラ-ビローム相互作用が健常対照と比較して強まるという我々の観察と類似している（図5b）。

考察
CDは断続的な腸粘膜炎症によって特徴づけられる自己免疫疾患であり、腸内細菌叢の異常がCDの病因に大きく関与していることが報告されている。バクテリオームとは別に、腸内には多数のウイルスやファージが存在し、病原体の侵入に対する防御、バクテリオームの生態系の調節、腸管バリアにおける粘膜免疫の調節に寄与している。本研究では、粘膜ビロームの乱れが、CDの発症や病気の経過を規定すると仮定している。既存の腸内ビローム研究のほとんどは、糞便ビロームが中心であった。IBDの糞便ビロームに関するこれらの研究36,37では、CDとUCの両患者は、HCと比較して、ビロームの豊富さと多様性が増加し、Caudoviralesの拡大、Microviridaeの減少が特徴的であることが示された。このような所見は、小児CD患者の糞便や腸内組織においても、小規模なコホートに基づいて観察された38,39,40。さらに、CDの糞便中ビロームでは、HCに比べて温帯性ファージが優勢であることが判明した41。しかし、ファージオームと真核生物のビロームの両方からなる粘膜ビロームについては、健康な状態でもCDでも、特に小腸レベルでは不明な点が多い。本研究では初めて、健常成人およびCD患者における回腸ビローム（小腸粘膜レベル）の構成と機能を、薬物、食事、地理的条件など様々な臨床的因子との関連において検討した。われわれの研究では、回腸ビロームの豊富さは、CDとHCを比較すると全体的に有意に減少しており、寛解期よりも再燃期の患者においてより顕著であった。さらに、バクテリオファージの濃度は減少し、一方、真核生物のウイルスの濃度は増加していた。このことは、バクテリオファージと真核生物のウイルスが、CDの病態形成と疾患経過において相異なる役割を担っている可能性を示唆している。重要なことは、CDの回腸粘膜ウイルスがIBDマウスの腸の炎症に影響を与えていることを明らかにしたことである。乱れたビロームは、腸内細菌叢と細菌-ビロームの生態系を再構築し、微生物の感知／防御における炎症性免疫反応を増大させ、その結果、腸炎を悪化させた。

真核生物のビロームの豊富さの増加に伴い、CD患者、特に再燃患者において、アネロウイルス科のトルクテノウイルスの同調した増加が観察された。さらに、広州コホートではHuman-associated Cyclovirus 10、昆明コホートではAvon Heathcote Estuary-associated circular virus 15など、CD患者ではコホート特異的に異なる真核ウイルスが濃縮されていた。同様に、糞便ビロームのレベルでは、CD患者の別の中国人コホート（n=14）とUC患者のベルギー人コホート（n=64）で行われた2つの別々の研究でも、健常対照と比較して患者における真核生物のウイルスの増加が認められた37,42。私たちや他の研究43,44,45で示されたように、腸内ビロームには集団/地域特異的な構成があるかもしれないが、IBD患者において一貫して観察された真核生物のウイルスの増加は、IBDが慢性的なウイルス感染に関連した免疫異常疾患である可能性を示唆している。CD患者の回腸粘膜におけるアネロウイルス科の豊富さ（特に再燃患者において；また免疫抑制剤やグルココルチコイドの投与とは無関係に；補足図6c, d）は、IBDにおける真核ウイルスと活発な粘膜炎症との間の魅力的な関連性を示している。最近の研究で、Orthohepadnavirus（ヘパドナウイルス科に属するもう一つの真核ウイルス）のタンパク質がUC患者の腸管粘膜に存在し、ex vivoおよびin vivoの実験で実証されたように、腸管バリアを障害する可能性があることがわかった46。さらに、真核ウイルスの糞便ビロームの濃度が増加することは、UC患者における糞便微生物叢移植（FMT）の治療失敗と関連することが判明した42。これらの所見を総合すると、持続的な真核生物のビロームの増加は、IBDの難治性・難治性の性質を強調している可能性が示唆される。この仮説と一致して、われわれのデータは、既存のIBD治療薬、生物学的製剤、免疫抑制剤、グルココルチコイド、5-ASAは、回腸におけるトルクテノウイルスの存在量を変化させる有意な効果を示さないことも示した。従って、IBDの治療薬には、GI粘膜に残存する真核生物のウイルス群の減少という治療目標／エンドポイントを加えるべきである。

原核生物ウイルスレベルでは、CD寛解期および再燃期の回腸粘膜において、病原性細菌を宿主とするものも含めて、HCと比較してバクテリオファージ分類群の広範な減少が認められた：ジェデュナウイルスKpV80（宿主：クレブシエラ属菌）、バクテロイデスファージB124-14（宿主：B. fragilis）、リステリアファージB025（宿主：リステリア菌）、ストレプトコッカスファージEJ-1（宿主：肺炎球菌）などである。組織培養細胞を用いたin vitro研究では、粘液に付着したバクテリオファージが侵入してくる病原性細菌を防御し、下層の上皮を保護することが実証されている6,7。したがって、CDの病原性細菌を宿主とするバクテリオファージの粘膜枯渇は、腸内の宿主細菌の増加につながる可能性がある。この仮説を支持するものとして、Klebsiella sp.、B. fragilis、Listeria monocytogenesはいずれもIBD患者の糞便中で増加していることが報告されている18,34,47。さらに、回腸粘膜ビロームにおける溶菌性ファージの豊富さは、CDではHCに比べて有意に減少していることが観察された。これらの所見を総合すると、粘膜バクテリオファージは病原性細菌の侵入を防ぐ「歩哨」の役割を果たしている可能性があり、これらのバクテリオファージが失われると、バクテリオームが抑制されなくなり、CDの疾患経過の根底にある可能性が示唆される。注目すべきは、腸粘膜では溶菌性ファージよりも温帯性ファージの存在量が少ないことである（中央値：22％対78％）。これは、糞便ファージオーム48に含まれる温帯性ファージの20％から50％の範囲内であり、低い方である。回腸の微小環境は内腔や糞便のそれとは異なることから、回腸粘膜のファージは、哺乳類の上皮細胞、宿主細菌、ストレス分子によって同時に抑制されている。その上、溶菌性ファージはカプシド上のIg様ドメインを介して腸の粘膜層に付着し、病原性細菌の侵入を防ぎ、上皮の恒常性を維持している6,7。これらすべての要因が作用して、粘膜ファージオームは糞便ファージオームとは組成が異なることが予想される。

その結果、ファージオーム-バクテリオーム相互作用ネットワークは、生態学的見地から、CDの再燃および寛解期では、HCで観察されたネットワークと比較して大幅に弱まっていることが判明した。しかし、ファージオーム-バクテリオーム相互作用ネットワークの弱体化は、CD再燃時よりもCD寛解時の方がより深刻であった。これらのデータは、CDにおける腸内炎症の寛解は、腸管粘膜のマイクロバイオーム（ファージオームとバクテリオームの両方）の回復を意味するものではなく、寛解期にファージオーム-バクテリオーム生態系が悪化し、その結果、CD患者において腸内炎症の再発（再燃）を引き起こす可能性があることを示唆している。最近の研究では、静止期CDにおける不安定なバクテリオーム動態は、CDの再燃に有意に先行することが報告されており49、CDにおける腸内ホメオスタシスにとっての微生物生態の重要性を裏付けている。バクテリオームだけでなく、ファージオームもまた、疾患経過の基礎となる微生物生態系において重要であることが明らかになった。したがって、ファージオームとバクテリオームの生態系を腸粘膜レベルで回復させることを目的としたテーラーメード治療（ファージカクテル療法など）が、IBD治療のために今後提案されることになる。

本研究では、バイオインフォマティクス解析と実験の両方から、薬剤が回腸ビロームの構成に大きな影響を及ぼし、CDと独立した影響と相互依存的な影響の両方を示すことも見出した。CDの治療薬の中では、生物学的製剤が回腸ビローム組成との関連性が最も大きく、グルココルチコイド、免疫抑制剤、5-ASAがそれに続いた。5-ASAは最近、腸内細菌に発現するアセチルトランスフェラーゼによって無効化され、IBD治療における臨床効果の低下につながることが証明された50。しかし、既存のIBD治療薬がマイクロバイオームとどのように協調して臨床効果を発揮しているのかは、ほとんどわかっていない。本研究では、CDのウイルス-細菌叢ネットワークは生物学的製剤によって他の3つの薬剤よりも良好に回復したが、それでもHCのウイルス-細菌叢ネットワークと同程度の強固なレベルには達していなかった。

本研究は、健康時とCD時の腸管粘膜ビローム、特に小腸粘膜レベルのビロームを調査した最初の試みの一つである。とはいえ、本研究にはいくつかの限界があった。第一に、腸内細菌叢に関する確立された知識とは異なり、腸内ビロームは、ウイルス（特に原核生物ウイルス、すなわちバクテリオファージ）の分類学的および機能性が全体的に不明確であるため、現在のところ腸内細菌叢の重要な「ダークマター」である（本研究では、ウイルスコンティグを既知のウイルス種に分類学的に割り当てることができたのはわずか47.8％であった）。さらに、バクテリオファージのゲノムの乱雑さ、宿主のジャンプイベント、宿主細菌と絡み合う多様なライフサイクルは、腸内ファージオームの多様性の仮想分類学と機能性を調べる努力をさらに複雑にしている。第二に、RNAビロームについては、先行研究ではDNAビローム51に比べて糞便ビロームにおけるRNAビロームの割合がかなり低いことが示されていたが、本研究では調査しなかった。第三に、腸内ウイルスの大部分（真核生物ウイルスとバクテリオファージの両方）は、現在までのところ分離も培養も不可能である。例えば、トルク・テノ・ウイルスは培養に難渋する37,52。このため、疾患におけるこれらのウイルスの個々の役割について、下流でメカニズム的に調べることは決定的に制限されている。第四に、回腸生検検体中のウイルス／ファージの存在がごくわずかであることを考慮し（ウイルス濃縮にもかかわらず、SYBR GOLDによるVLPの染色が微妙であったことからも明らかである）、本研究では塩基配列を決定する前に、抽出したDNAに対してウイルスDNA増幅を行った。

まとめると、CD患者とHC患者の回腸ビロームに関するこのトランスコホート研究では、腸粘膜において、バクテリオファージが大幅に減少し、アネロウイルス科の真核ウイルスが拡大していることが判明した。薬物療法と食事療法は、腸粘膜のビロームの形成に重要な影響を及ぼしており、CDのビロームの回復に一役買っている可能性がある。再燃後のCD寛解期における回腸粘膜の持続的なビローム-バクテリオームネットワークの乱れの観察から、ビローム-バクテリオーム相互作用の生態学的回復は、内視鏡的および組織学的レベルでの粘膜炎症の消失という目標を超えて、IBDにおける追加の治療エンドポイントとして考慮されるべきであることが示された。

研究方法
コホートの概要と組み入れ基準
クローン病（CD）患者の2つのコホートが本研究に登録され、それぞれ地理的に異なる2つのセンター、孫文大学附属病院（中国広州市）と昆明医科大学第一附属病院（中国昆明市）から募集された。患者は標準的な内視鏡的、X線的、組織学的基準に基づいて診断された。また、年齢と性別を一致させた健常対照者（HC）の第2群も、2つのセンターからそれぞれ登録され、日常的な身体評価体制によって登録された。全体として、合計208人のCD患者とHCがリクルートされた（表1および補足データ1）：広州コホートではCD患者51人とHC51人（n=102）が登録され、昆明コホートではCD患者52人とHC54人（n=106）が登録された。本研究は、孫中山大学六附属病院研究倫理委員会のIRB（Institutional Review Board）（資料番号：2021ZSLYEC-245）および昆明医学院第一附属病院研究倫理委員会のIRB（資料番号：2022.L.94）によりそれぞれ承認された。CD患者の包含基準は、CDの臨床診断が3ヶ月以上3年未満であること、本研究への参加に同意すること、インフォームド・コンセントに署名すること、環境・疾患・食事に関するアンケートに回答できることなどであった。CD患者の除外基準には、最近3ヵ月間に抗生物質／プロバイオティクス／プレバイオティクスを使用したこと、腸の手術歴（サンプリング日より3年以上前に盲腸の手術歴がある人を除く）、感染症、癌診断が含まれた。すべてのHCは内視鏡評価を受け、腸粘膜表面に炎症／異常が認められないことが確認された時点で組み入れられた54。HCの参加者は、明らかな慢性疾患（糖尿病、高血圧、自己免疫疾患を含む）、消化器疾患または機能不全（腹部膨満、腹痛、下痢を含む）がある場合は除外された。参加者は全員、書面によるインフォームド・コンセントを行い、内視鏡による回腸末端の粘膜検体の提供に同意した。18歳未満の参加者については、法的に認められた代理人（LAR）からインフォームドコンセントを得た。本研究に登録された参加者全員に対して補償が提供された。回腸粘膜ビロームのファミリーレベルおよび種レベルに基づくサンプル飽和曲線解析により、本研究のサンプルサイズ（n＝208）は、全体的なビロームの多様性を捉えるのに十分であることが示された（補足図1b）。

すべての参加者は、臨床調査（疾患の経過［寛解と再燃］、Harvey-Bradshaw Index55、投薬、腸内炎症評価を含む）、メタデータ（年齢、性別、人体計測的特徴［身長、体重、BMIを含む］、地理的地域、ライフスタイルを含む）、食習慣に関するアンケート（市場食品と農場食品、様々な食品カテゴリーの摂取頻度を含む、すべて補足データ1に要約）に回答した。研究参加者の臨床的表現型とメタデータは開業医が入手した。食事アンケート調査は管理栄養士が行った。内視鏡による評価、回腸生検の採取、検体の保存の手順は、施設間で共有された標準操作手順（SOP）に従った。センター間およびバッチ間の影響を避けるため、全サンプルは孫中山大学六附属病院の消化管マイクロバイオーム研究室に搬送され、その後、ビロームの濃縮とDNA抽出が一括して行われた（詳細は以下の通り）。

粘膜ウイルス粒子（VLP）の濃縮、DNA抽出、配列決定
ウイルス様粒子（VLP）は、以前記載したプロトコール43,45,56を改良して、回腸粘膜サンプルから濃縮した。回腸末端生検のそれぞれを消化バッファー（2 µl Collagenase D [Roche]、10 µl DNase I (10 mg/ml) [Roche]、988 µl 滅菌生理食塩水マグネシウムバッファー[SM buffer, 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4, 50 mM Tris {pH 7. 5}、0.002%ゼラチン{w/v}）を37℃で1.5時間、20分ごとに集中的にボルテックスした。混合液の2/3はウイルスDNA抽出用に回収し、残りの1/3は細菌DNA抽出用に保存した。生検懸濁液を5000×gで10分間遠心分離して残渣と細胞を除去し、上清を0.22μmのフィルターに通して残存するヒト細胞と細菌細胞を除去した。その後、サンプルをリゾチーム（pH6.0-9.0）で処理し、37℃のシェーカーで30分以上インキュベートした。その後、クロロホルム処理を室温で10分間行い、残存する細菌とヒトの細胞膜を分解した。その後、非膜保護DNAをBaseline zero DNase（Epicentre社製）を用いて37℃で15～30分間分解し、STOP緩衝液（30mM EDTA）を用いて37℃で10分間DNA分解を停止した。ウイルス粒子（VLP）を3.8% SDSと100 µg/mlプロテアーゼKで56 °C、40分間溶解し、CTAB（0.5 M NaCl添加2.5% CTAB）で65 °C、10分間処理した。残ったタンパク質はクロロホルム処理（サンプルと同量）で除去し、続いて同量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（PCI）処理を行い、核酸を水相に溶解した。抽出した DNA を DNA Clean & Concentrator kit（Zymo Research 社製）で精製・濃縮した。VLPs DNAをPhi29 DNAポリメラーゼ（GenomiPhi V2キット、GEヘルスケア）で4時間増幅した後、塩基配列を決定した。各サンプルについて、3回の独立した反応を行い、DNA精製のためにプールした。Agilent 5400による品質管理評価の後、すべての適格なDNAサンプルは、NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit (New England Biolabs, USA, #E7370L )を用いたメタゲノムライブラリー調製に供され、すべての適格なライブラリー（n = 208）は、Illumina NovaSeq 6000プラットフォーム（Novogene, Beijing, China）でシーケンスされた。

シーケンス処理および品質管理
生リードをTrimmomatic（v0.39）57で処理し、品質管理、アダプターのトリミング、低品質リードや複数のN塩基を持つリード（品質3以下）の除去、長さ50 bp未満の配列の除去を行った。ヒトリードの混入は、KneadData（v0.7.4）58を介してヒトゲノムリファレンスデータベース（GRCh38 p12）にアライメントすることで除去した。コンティグアセンブリーのために、合計4億5,200万のペアクリーンリードが得られた。

ウイルスコンティグのアセンブルと同定
クリーンリードのアセンブルには、超高速でメモリ効率に優れていることから次世代シーケンサー（NGS）アセンブラーとして広く使われているMEGAHIT（v1.2.9）59を用いた60。コンティグアセンブリー後、CD-HIT（v4.7）を用いて、他のコンティグと90％以上の配列類似性を持つ冗長なコンティグを除去した61。1.5kb以上の冗長でないコンティグは、ウイルスコンティグの同定のためにVirSorter2（v2.2.3）62、DeepVirFinder63、CAT（v5.2.3）64にかけた。5kb以上のコンティグ、または1.5kb以上で環状のコンティグ（環状のウイルスコンティグはCheckV（v1.0.1）65を用いて同定された）は、VirSorter2および/またはDeepVirFinderを用いて（DeepVirFinderではスコア≥0.7およびp < 0.05の基準に基づいて）、RNAウイルスと誤同定されたものを除外しながら、異なるウイルスカテゴリーを識別するためにソートされた。これらのコンティグのうち、VirSorter2のスコアが0.5以上かつDeepVirFinderのスコアが0.8以上かつp < 0.05のもの、またはVirSorter2のスコアが0.9以上かつDeepVirFinderのスコアが0.7以上かつp < 0.05のものを、ウイルス由来の候補コンティグとして分類した。次に、残りのコンティグをCATで処理し、CATで真核ウイルスと分類されたコンティグもウイルス由来とみなした。

細菌由来の偽陽性コンティグを除去するために、細菌ユニバーサルシングルコピーオーソログ（BUSCO）66へのヒット数を評価することにより、各コンティグにおける細菌遺伝子の濃縮度を評価した。細菌のBUSCO遺伝子の一部はウイルスゲノムにも存在する67ため、BUSCO（v5.3.2）68を用いてウイルスゲノム（viral_refseq_v212）内に存在するBUSCO遺伝子（BUSCOデータベース[https://busco.ezlab.org/]のbacteria_odb10）を評価し、BUSCO比の値（各ウイルスRefSeqゲノムの総遺伝子数に対するBUSCOヒットの割合69）は0-0.01の範囲であった。次に、各ウイルスコンティグのBUSCO比を評価し、ウイルスRefSeqのBUSCO比値と比較した。さらにウイルス遺伝子の濃縮度を評価するために、全てのコンティグをウイルスプロテインファミリーモジュール（VPF）71に対してhmmsearch70を行い、e-value ≤ 0.05でヒットと定義した。BUSCO比≦0.01、またはBUSCO比＞0.01、または少なくとも3つのVPFがヒットしたコンティグのみが最終的にウイルスコンティグとして同定された。残りのコンティグも、既知のssDNAウイルスと同定され、CATによってウイルスゲノム間で95%以上のヌクレオチド同一性を共有するものは、ウイルスコンティグとみなされた69。最終的に、アセンブルされた非冗長コンティグの3.01%がウイルスコンティグと同定された。

オープンリーディングフレーム（ORF）は、Prodigal（v2.6.3）72を用いて予測・同定され、最小閾値100アミノ酸長のアミノ酸配列がさらなる解析のために選択された。長さが10 kbを超え、二本鎖（ds）DNAと同定されたウイルスコンティグは、diamond（v2.0.11）74に基づくパイプラインvContact2（v0.11.3）73を用いて、RefSeq-v211でクラスタリングされ、既知のウイルス分類に割り当てられた。次に、ORFの残りの予測アミノ酸配列を、以前に報告されているように、blastp (v2.12.0, e-value < 10-5)75を用いて、ウイルス参照タンパク質のみを含むRefSeq-v212データベースの標準サブセットとマッチングさせた43,76。各コンティグには、異なる分類レベルでのウイルス分類学割り当てのための投票システム76,77を使用して分類学が割り当てられた。この投票システムは、各ウイルスコンティグに最もヒットしたウイルス分類群に注釈を付け、次に関心のあるコンティグ内のORFの分類学的割り当てを比較し、多数派のORF割り当てに基づいてコンティグに注釈を付けた。アミノ酸配列の中でORFの分類学的割り当てが多数派でないコンティグは、次に、分類学的割り当てが多数派になるまで、より高い分類学的レベルで比較された。また、10kbあたり1ORF未満のコンティグは、既知のウイルスとの類似性が低いため、分類学的な注釈は付けなかった77。真核生物またはssDNAウイルスと同定された残りのウイルスコンティグについては、CAT (v5.2.3)を用いてウイルス分類を行った。

ウイルスの存在量は、Bowtie2（v2.3.5.1）78を使用して、クリーンリードをキュレートされたウイルスコンティグにアライメントすることで計算し、配列数をBBMap（v38.84）（BBMap-Bushnell B.-sourceforge.net/projects/bbmap/）を使用してRPKM（reads per kilobase million）に標準化した。これらの値を用いて、異なる分類レベルでのウイルス存在量表を作成した。解析のフローチャートを補足図1aにまとめた。

ーウイルス機能解析
Prokka（v1.12）79を用いて、ウイルスのコンティグをアミノ酸配列とそれぞれのCoding Sequence（CDS、タンパク質のアミノ酸を直接コードする塩基配列）に翻訳した。diamond(v2.0.11)74とblastp(v2.12.0)を用いて、ウイルスコンティグ由来の全アミノ酸配列をアノテーションし、Uniprot知識ベース(release 2022_04)80のウイルスタンパク質配列と機能モジュールにアライメントすることで、ウイルスゲノム機能を予測した。予測された機能は、Gene ontologyの用語81,82とPfamタンパク質ファミリーの同一性83に基づいて分類され、ビニングされ、存在量はBowtie2アライメントとBBMap変換によってRPKMで表された。ウイルス機能の有無を確定するため、上位250の豊富なタンパク質とその機能モジュールのみをさらに解析した。

バクテリオファージのライフスタイル予測および細菌宿主予測
ディープラーニングに基づくバクテリオファージライフスタイル予測パイプラインであるPhaTYP84により、バクテリオファージのライフスタイル（溶菌性か温帯性か）を予測した。確信度の高い予測スコアが0.5を超えるウイルスコンティグのライフスタイルカテゴリを、さらなる解析に使用した。

目的のバクテリオファージの宿主細菌は、Virus-Host DB（https://www.genome.jp/virushostdb/note.html）85を検索して同定し、その結果を補足データ2に示した。さらに、CRISPRスペーサーアラインメントと機械学習モデルに基づくバクテリオファージの細菌宿主予測のための最先端のパイプラインであるPHYBOX（https://phage.ee.cityu.edu.hk/）16のCHERRYアルゴリズム（予測スコア＞0.9）を用いてウイルス／バクテリオファージ宿主予測を行った。

粘膜細菌DNA抽出と16S rDNA配列決定
ウイルスDNA抽出と並行して、細菌DNA抽出を同じ腸生検（ビロームDNA抽出手順中の生検調製物の残りの1/3混合物）に対して行った。腸管生検からの細菌DNA抽出において、急性の機械的細胞破砕（ビーズビート）は利点がないという以前の報告86を考慮し、われわれは粘膜細菌抽出プロトコールにおいて、化学的および酵素的溶解と組み合わせた穏やかな機械的破砕を選択した。生検懸濁液を100×gで1分間遠心分離し、大きな破片と組織を除去し、上清を68℃のTris-EDTA緩衝液で10分間処理してDNase消化を停止した。その後、各サンプルにリゾチームを加え、37℃のシェーカー（200rpm）で90分間インキュベートし、20分ごとに断続的にボルテックスした。上清を回収チューブのZymo-Spin™ III-Fフィルターに移し、8000×gで1分間遠心した。すべての上清がフィルターを通過した後、1200μlのGenomic Lysis Buffer（Zymo Research、D3004-1-100）を回収チューブの濾液に加え、よく混合した。その後、すべての混合液をZymo-Spin™ IICR Columnに移し、10,000×gで1分間遠心した。Zymo-Spin™ IICR Column に回収された DNA は、Pre-Wash Buffer (Zymo Research, D3004-5-15) および g-DNA Wash Buffer (Zymo Research, D3004-2-50) で洗浄後、DNA Elution Buffer で溶出した。その後、回腸粘膜から抽出したDNA調製物をMGISEQ-2000（BGI、深セン、中国）プラットフォームで16S rDNA配列決定（V4領域、PE300）に供した。

細菌の16S rDNA配列決定データ解析
細菌16S rDNAシーケンス結果はQiime2（v2022.2.0）87を用いて以下のように解析した： (1)リードのトリミング、クオリティフィルタリング、キメラの除去を含むノイズ除去、(2)配列の複製除去（同一性100％で配列のクラスタリングを実施）、(3)フィーチャーテーブルの確立、(4)SILVA SSUデータベース（SILVA 138 SSU Ref NR 99）に基づく分類88。最終的に、さらなる解析のための細菌組成表が作成された。

ビローム／バクテリオームの変動を伴うメタデータの分類と共変量
すべてのメタデータ因子は、人体計測（身長、体重、BMI）、一般的メタデータ（年齢、性別、喫煙者、動物との接触、その他のライフスタイル因子）、地理（広州対昆明）、疾患（HC対CD）、腸内炎症（非炎症対CD寛解対再燃）を含む7つのカテゴリーに分類された、併存疾患（高血圧、アレルギー性疾患、盲腸）、薬剤（グルココルチコイド、5-アミノサリチル酸［5-ASA］、免疫抑制剤、生物学的製剤、漢方薬、制酸剤、過去3ヵ月間の血圧降下剤など）、食習慣（加工肉、果物、野菜など）（補足データ1）。

ウイルス／バクテリオームの共変量は、vegan Rパッケージのenvfit関数（FDR＜0.05の偽発見率で999回の順列）を用いて、メタデータ（連続変数、カテゴリー変数、論理変数を含む）からすべての宿主因子とウイルス／細菌組成データとの関連を計算することにより同定した89,90。envfit関数は、連続変数とカテゴリー変数について、それぞれ線形相関とMANOVA分析を行った。再定義した7つのカテゴリーに分類したときの宿主因子の複合効果量は、Rのveganパッケージを介して分散分割分析関数91で推定した（999回の順列；R二乗はオブザベーションの数と適合モデルの自由度の数で調整した92）。

ーマイクロバイオームデータ解析
ビロームおよびバクテリオームの存在量表を相対存在量表に変換し、以下の解析に使用した。パイプラインMulti-Omics Factor Analysisツール（MOFA）14により、原核・真核のビロームおよびバクテリオームにおけるマルチオミクスの変動と分散の原因を、患者のメタデータと組み合わせて調査した。HCとCD（寛解と再燃を含む）の全体的な組成の違いは、Bray-Curtis非類似度メトリクスを用いて評価し、Rのampliconパッケージとggplot2パッケージを用いてPCoAプロットで可視化した。ウイルス-細菌α多様性相関は、ggcorを介してRを使用して計算および可視化され、ウイルス-細菌存在量相関はFastSpar（v1.0.0）93を使用して実行された。グループ化因子（HC対寛解対再燃）とウイルス分類群の相対的存在量との関係を説明するための冗長性解析（RDA）は、R94のveganパッケージを用いて行った。メタデータ変数（HC対CD、腸内炎症、投薬、食事要因）に関連する特徴的分類群は、R95のMaAsLin2パッケージを用いて同定した。これらの結果は、Rのggplot2パッケージを用いて可視化（boxplot、violin plot、column plot、volcano plot、point plot、jitter plot）し、ヒートマップはRのComplexHeatmapパッケージを用いて作成した。ベンプロットはEvenn（http://www.ehbio.com/test/venn/#/）96を用いて作成した。

動物経口摂取用のヒト患者サンプルからの粘膜VLP調製
CD患者（n = 4）または大腸がん患者（非CD対照、n = 4）の外科的切除回腸標本から粘膜VLPを単離し、濃縮した。患者の検体は、倫理規定に従って各患者からインフォームド・コンセントを得た上で、第六附属病院消化器外科から採取した。新鮮回腸切除標本は専任の消化器外科医の指導のもとに採取され、CD回腸切除標本の炎症は臨床病理医によって確認・評価された。非CD対照には、大腸癌のために回腸部分切除術および上行結腸切除術を受けた患者が含まれ、回腸切除標本の組織学的特徴は臨床病理医により正常であることが確認された。回腸切除標本100 mgの粘膜層を滅菌メスで静かに掻き取り、500 ulの0.02 μm濾過SMバッファーで洗浄し、700 × gで3分間遠心分離して大きな有機粒子を除去した後、3200 × gで30分間遠心分離して細菌とウイルスを分離した。その後、ウイルス上清を0.45μmのフィルターと0.22μmのフィルターに通し、残った細菌を除去した。その後、ウイルス上清を50 kDaのCentriprep®フィルターで濃縮し、残留代謝物を除去した。

その後、ウイルス製剤をVLP定量した97。ウイルス上清を10倍に連続希釈し、0.02 µm Anodiscフィルター（Cytiva、6809-6002）で固定した。その後、VLPを0.02 μm濾過1x SYBR GOLDで15分間染色し、0.02 μm濾過Milli-Q Water 1 mlで洗浄した。染色したVLPの画像をLeica TCS SP8共焦点顕微鏡（100倍）で撮影した。直径が0.5μm未満の粒子をVLPとみなし、その後列挙した。陰性対照としてSMバッファーにも同様の操作を行った。各製剤について5枚の画像を撮影した（補足図14a）。

マウス
本研究で用いた6～8週齢の雄性C57BL/6Jマウスは、すべてBeijing Vital River Laboratory Animal Technology Corporation（北京、中国）から購入した。マウスは、中山大学または中山大学六附属病院の標準ケージ（温度：18～25℃、湿度：50～60％、14時間明期／10時間暗期サイクル）に収容し、異なるバッチの動物実験に使用した。手順は、中山大学（No.2023001439）および中山大学六附属病院（IACUC-2021101101）のInstitutional Animal Care and Use Committee（IACUC）により承認された動物使用プロトコルおよび動物倫理規定に従って実施した。すべてのマウスは、各動物実験の開始前にマイクロバイオームを均質化するために1週間同居させた。

DSS誘発急性腸炎モデルについては、年齢と体重をマッチさせたマウスを無作為に割り付け、非CD-VLP-ギャベージ群、CD-VLP-ギャベージ群、プラセボ（SM緩衝液、VLPなし）群に割り付けた（それぞれ非CD群、CD群、プラセボ群と呼ぶ；各群n = 10匹）。図7aおよび補足図15aに時系列と模式図をまとめた。非CDおよびCD患者由来の回腸VLPをSYBR GOLD染色で定量し、SM緩衝液で2×109 VLP/mlの濃度に希釈した。VLP投与前に、100μlの1M NaHCO3を胃内投与してマウスの胃酸を中和し、その15分後に非CDまたはCD VLPを経口投与した（各マウス200ul、約4×108 VLP）。全体として、マウスは8週齢までヒト回腸VLPを1日おきに計6回経口投与された。VLPを2週間経口投与した後、すべてのマウスに2%DSSを6日間投与し、その後4日間のDSS/洗浄期間を設けた。屠殺前（DSS/washout期間の3日目）に全マウスに内視鏡評価を行い、その1日後に屠殺した。疾患活動性指標（DAI）は、体重減少（0：1％未満、1：1～5％、2：5～10％、3：10～20％、4：20％以上）、便の硬さ（0：正常、2：緩い便、4：下痢）、直腸出血（0：陰性、2：潜血、4：肉眼的出血）の測定を含め、犠牲の日に評価した。すべてのマウスの大腸組織と糞便を採取した。実験期間中、すべてのマウスに同じ滅菌飼料と水を与えた。

2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）誘発急性腸炎モデルマウスについては、以前の報告98に従ってマウスを処置した。年齢と体重をマッチさせたマウスを非CD-VLP群、CD-VLP群に無作為に割り付け、ヒト回腸VLPを1日おきに6回経口投与した。時系列と模式図は補足図16にまとめた。5日目に、150μlのTNBS前感作液でマウスを免疫した（TNBS前感作液は以下のように調製した：アセトンとオリーブ油[MAKLIN, O815211]を4:1の容量比でボルテックスで混合し、アセトン/オリーブ油混合液4容量に5%[w/v]TNBS[Sigma, p2297]溶液1容量をボルテックスで添加した。1週間後の12日目に、50%エタノールで希釈した2.5%(w/v)TNBS 100μlをカテーテルから結腸内に4cm投与し、4日後に全マウスを犠牲にした。全マウスの大腸組織および糞便を採取し、上記と同様にDAIスコアを評価した。

RNA単離、定量的RT-PCRおよびトランスクリプトミクス配列決定
TRIzol試薬（Invitrogen, 15596026）を用いてマウスの大腸粘膜から全RNAを抽出し、HiScript III RT SuperMix for qPCR（Vazyme, R323-01）を用いてcDNA合成を行った。定量的PCRは、炎症性サイトカインとケモカインの遺伝子発現を定量するために、2×Hieff® qPCR SYBR Greenマスターミックス（Roxなし）を用いて、QuantStudio 7 Flex装置（Applied Biosystems）で行った。さらに、トランスクリプトミクスシーケンス（RNA-seq）をIllumina Novaseq 6000プラットフォーム（PE150、Magigene、広東省、中国）を用いて実施し、遺伝子をMus musculusゲノム（アセンブリGRCm39）にマッピングしてHISAT299でアノテーションした。DESeq2100を用いて差次的発現遺伝子（DEG）解析を行い、FDR調整p < 0.05、fold change >2の基準を満たす遺伝子を差次的発現遺伝子とした。すべての差次的発現遺伝子は、Gene Set Enrichment Analysis（GSEA）およびGene Ontology分析（生物学的プロセスにフォーカス）のインプットとして利用され、ggplot2 Rパッケージで可視化された。定量的RT-PCRのプライマーペアを補足表1に示す。

マウスの腸内ビロームとバクテリオームの解析
前半はビロームDNA抽出とビローム解析に、後半はメタゲノムDNA抽出とバクテリオーム解析に用いた。ビロームDNA抽出では、糞便をSM緩衝液に懸濁し、上記の方法に従ってVLPの単離、DNA抽出、ビローム配列決定、データ解析を行った。マウスビロームのデータ解析のために、トリミングされ修飾されたリードは、上述のようにヒトで構築されたライブラリー内のウイルスコンティグにアライメントされた。バクテリオーム解析では、Quick-DNA faecal/Soil Microbe Kits（Zymo Research社、D6010）を用いて、糞便DNAを抽出・精製した。Agilent 5400で品質管理評価を行った後、NEB Next Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（New England Biolabs、米国、#E7370L）を用いて、すべての適格なDNAサンプルをメタゲノムライブラリー調製に供し、すべての適格なライブラリー（n = 40）をIllumina NovaSeq 6000プラットフォーム（Novogene、北京、中国）でシーケンスした。メタゲノムデータ解析（バクテリオーム部分）のために、生リードをTrimmomatic（v0.39）57で処理し、アダプターのトリミングと低品質リードの除去を行った。ヒトリードのコンタミネーションは、KneadData（v0.7.4）58を介してヒトゲノムリファレンスデータベース（GRCh38 p12）にアライメントすることで除去した。全体として、各サンプルについて平均4,527万±0.34万（平均±S.E.）のクリーンリードが得られた。MetaPhlAn4(v4.0.4)101を用い、デフォルト設定(min_map_q_val: 5; stat_q: 0.2; read_min_len:70)で細菌分類を行った。

腸内ビロームに対する薬剤の影響を調べるin vitroおよびin vivo実験
薬剤が腸内ビロームに及ぼす影響をin vitroで調べるため、ヒトマイクロバイオーム調製物を目的の薬剤で培養した。健康な被験者5人から糞便サンプルを採取し、ボルテックスで還元性の10％Brain Heart Infusion（BHI）培地に溶解した。その後、糞便から大きな微粒子を除去するために、懸濁液を700×gの速度で遠心分離した。細菌とウイルスからなる懸濁液を、嫌気条件下で200 mMの5-アミノサリチル酸（5-ASA）、50 uMのアザチオプリン（AZA）、100 uMのメチルプレドニゾロン（MP）、または陰性対照（10％DMSO）と12時間培養した。共培養後、ウイルスDNAを抽出し、標的バクテリオファージをqPCRで定量した。プライマー（補足表1に示す）は、ヒトビロームのデータセットから自社でアセンブルしたビロームのコンティグから設計した。各試験で、標的バクテリオファージの相対存在量を評価するために、1 ngのDNAを全投入量として使用した。

腸内ビロームに対する薬剤の影響を調べるin vivo実験では、マウスに各対象薬剤を1日おきに合計6回投与した。これらの薬剤には、5-ASA（100mg/kg/日）、AZA（1.5mg/kg/日）、MP（10mg/kg/日）が含まれる。糞便サンプルは、投薬前（9日目）と投薬後（21日目）に採取した（補足図11a）。その後、ビロームDNAの抽出と標的ファージの定量を上記のように行った。

ー報告概要ー
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。

、ャンパクターのャンパクターのャンパクター
本論文で報告した生配列データは、中国科学院生物情報センター（China National Centre for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences）のゲノム配列アーカイブ（Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021）（Nucleic Acids Res 2022）に、バイオプロジェクト番号PRJCA018565で寄託されている（GSA-Human: HRA005245, https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/submit/hra/subHRA007362/; GSA： CRA012045, https://ngdc.cncb.ac.cn/gsub/submit/gsa/subCRA018827/、CRA011968, https://ngdc.cncb.ac.cn/gsub/submit/gsa/subCRA018805/）。また、本論文では以下の公開データベースも使用した： Virus-Host DB (https://www.genome.jp/virushostdb/note.html), Uniprot knowledgebase database (release 2022_04, https://www.uniprot.org/help/uniprotkb), SILVA SSU database (SILVA 138 SSU Ref NR 99, https://www.arb-silva.de/), RefSeq-v212 database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/), and BUSCO database (bacteria_odb10, https://busco.ezlab.org/) and human genome reference database (GRCh38 p12, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/genome/). ソースデータは本論文とともに提供される。

ーコード
本研究で利用したコードは、以下のGitHubリポジトリで公開されている：https://github.com/ouczt/Crohn_disease_virome_Zuotao_Lab。また、https://doi.org/10.5281/zenodo.10538381。

ー参考文献
Torres, J., Mehandru, S., Colombel, J.-F. & Peyrin-Biroulet, L. Crohn's disease. Lancet 389, 1741-1755 (2017).

ー記事

年

ーGoogle Scholar

健康、疾患、および臨床応用における腸内細菌マイクロバイオームと腸内細菌マイクロバイオームアセンブリとの関連。Lancet Microbe 3, e969-e983 (2022).

年

Google Scholar

Cao、Z.ら、腸内ビローム：健康と疾患における新たなマイクロバイオーム構成要素。EBioMedicine 81, 104113 (2022).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

ファージ-細菌-真核生物の関係の再考とヒトの健康への影響。Cell Host Microbe 29, 681-688 (2021).

論文

パブコメ

Google Scholar

ヒトのウイルソーム：アセンブリー、組成、宿主との相互作用。Nat. Rev. Microbiol. 19, 514-527 (2021).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

粘液に付着したバクテリオファージは非宿主由来の免疫を提供する。Proc. Natl Acad. Sci. 110, 10771-10776 (2013).

論文

ADS

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Barr, J. J. et al. 粘膜表面におけるバクテリオファージの亜拡散性運動は細菌との遭遇頻度を増加させる。Proc. Natl Acad. Science. 112, 13675-13680 (2015).

論文

ADS

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Gogokhia, L. et al.バクテリオファージの増殖は腸の炎症と大腸炎の悪化に関連している。Cell Host Microbe 25, 285-299.e8 (2019).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Yilmaz, B. et al.成人ヒト小腸ストーマ微生物叢の可塑性。Cell Host Microbe 30, 1773-1787.e6 (2022).

Clooney, A. G. et al. 炎症性腸疾患におけるマイクロバイオームの変動ランキング：大規模な大陸間縦断的研究。Gut 70, 499-510 (2021).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Zuo, T. et al.地理的、民族的、都市化に伴うヒト腸管DNAウィロームの変異。Cell Host Microbe 28, 741-751.e4 (2020).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Shkoporov, A. N. et al. ヒト腸内ビロームは多様性が高く、安定で、個体特異的である。Cell Host Microbe 26, 527-541.e5 (2019).

ゲノムに基づくファージ分類学のロードマップ。Viruses 13, 506 (2021).

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Argelaguet, R. et al. マルチオミクス因子解析-マルチオミクスデータセットの教師なし統合のためのフレームワーク。Mol. Syst. Biol. 14, e8124 (2018).

論文

PubMed

PubMed Central

Google Scholar

Kaczorowska, J. et al. 乳幼児におけるアネロウイルスによる早期のコロニー形成。Viruses 14, 865 (2022).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

CHERRY: a Computational metHod for accuratE pRediction of virus-prokarYotic interactions using a graph encoder-decoder model. 簡潔。Bioinforma. 23, bbac182 (2022).

論文

Google Scholar

炎症性腸疾患の発症におけるサルモネラ菌感染の潜在的役割。Front. Immunol. 8, 191 (2017).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Federici, S. et al. 腸炎症治療のためのファージコンソーシアによるヒトIBD関連腸内細菌叢常在菌の標的化抑制。Cell 185, 2879-2898.e24 (2022).

論文

パブコメ

Google Scholar

腸管侵入性消化管病原体としてのリステリア菌。Curr. Top. Microbiol. Immunol. 337, 173-195 (2009).

CAS

PubMed

グーグル奨学生

NMT1とNMT2はARF6のGTPaseサイクルを制御するリジンミリストイルトランスフェラーゼである。Nat. Commun. 11, 1067 (2020).

論文

ADS

CAS

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

C1orf106は上皮接着結合の安定性を制御する大腸炎リスク遺伝子である。Science 359, 1161-1166 (2018).

論文

ADS

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Brüssow, H., Canchaya, C. & Hardt, W.-D. ファージと細菌病原体の進化：ゲノム再編成から溶原性転換まで。Microbiol. Mol. Biol. Rev. 68, 560-602 (2004).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

宿主細胞のタンパク質合成におけるウイルス感染の影響。Annu. Rev. Biochem. 56, 317-332 (1987).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

糞便微生物叢移植における腸内ビロームとマイコバイオームの役割。Lancet Gastroenterol. Hepatol. 7, 472-484 (2022).

論文

PubMed

グーグル奨学生

Zuo, T. et al. SARS-CoV-2感染と重症化におけるヒト腸内RNAおよびDNAビロームの時間的ランドスケープ。Microbiome 9, 91 (2021).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

プレボテラ属による腸内細菌叢の撹乱は、粘膜炎症に対する宿主の感受性を高める。Mucosal Immunol. 14, 113-124 (2021).

論文

パブコメ

Google Scholar

再発難治性クローン病における微生物ネットワークの障害。Nat. Med. 25, 323-336 (2019).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Klünemann, M. et al. ヒト腸内細菌による治療薬の生物濃縮。Nature 597, 533-538 (2021).

論文

ADS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Ingawale, D. K. & Mandlik, S. K. グルココルチコイドの新規抗炎症作用機序に関する新たな知見。Immunopharmacol. Immunotoxicol. 42, 59-73 (2020).

論文

パブコメ

Google Scholar

Rothschild, D. et al. ヒトの腸内細菌叢の形成において宿主の遺伝学よりも環境が優勢である。Nature 555, 210-215 (2018).

論文

ADS

CAS

PubMed

グーグル・スカラー

Bancil, A. S. et al. 食品添加物の乳化剤と腸内細菌叢、透過性、炎症への影響：炎症性腸疾患におけるメカニズム的洞察。J. Crohns Colitis 15, 1068-1079 (2021).

論文

PubMed

Google Scholar

Persson、P.-G., Ahlbom、A. & Hellers、G. 食事と炎症性腸疾患：症例対照研究。Epidemiology, 3, 47-52 (1992).

カフェインの経口投与は腸上皮細胞におけるキチナーゼ3様1の発現を抑制することにより急性大腸炎を改善する。J. Gastroenterol. 49, 1206-1216 (2014).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Becker、H. E. et al.クローン病増悪におけるバクテロイデス・フラジリスの高い有病率と上皮抵抗性のひずみ依存的増加。Front. Microbiol. 12, 598232 (2021).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Cao, Y. et al. 腸内毒素原性バクテロイデス（bacteroides fragilis）は、エクソソームにパッケージされたmiR-149-3pを阻害することで、腸の炎症と悪性腫瘍を促進する。Gastroenterology 161, 1552-1566.e12 (2021).

論文

パブコメ

Google Scholar

炎症性腸疾患における腸内ビロームの疾患特異的変化。Cell 160, 447-460 (2015).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

クローン病における便のDNAおよびRNAビロームのディスバイオーシス（Dysbiosis of the stool DNA and RNA virome in Crohn's disease）。J. Med Virol. 95, e28573 (2023).

論文

パブコメ

Google Scholar

Liang, G. et al. 超早期発症炎症性腸疾患における便ビロームの動態。J. Crohns Colitis 14, 1600-1610 (2020).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Wagner, J. et al.小児クローン病患者の腸内サンプル中のバクテリオファージ：454パイロシーケンスを用いたメタゲノム解析。Inflamm. Bowel Dis. 19, 1598-1608 (2013).

論文

PubMed

グーグル奨学生

Liang, G., Cobián-Güemes, A. G., Albenberg, L. & Bushman, F. 炎症性腸疾患における腸内ビローム。Curr. Opin. Virol. 51, 190-198 (2021).

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

Clooney, A. G. et al. 全ウィローム解析により、炎症性腸疾患におけるウィルスのダークマターに光が当たる。Cell Host Microbe 26, 764-778.e5 (2019).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Conceição-Neto, N.ほか. 低真核生物ウイルスの豊富さは、UC患者における糞便微生物叢移植の成功と関連する。Gut 67, 1558-1559 (2018).

論文

PubMed

Google Scholar

Tao、Z. ヒト腸内DNAビロームの地理的・民族的・都市的変異。Cell Host Microbe 28, 741-751.e4 (2020).

論文

Google Scholar

Guo, J. et al. ChinaMAPの10,585人の血液ビローム。Cell Discov. 8, 113 (2022).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Zuo, T. et al. 潰瘍性大腸炎における腸粘膜ビロームの変化。Gut 68, 1169-1179 (2019).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Massimino, L. et al. 腸内ビロームコロニーシスOrthohepadnavirus属は潰瘍性大腸炎の病態と関連し、in vivoで腸炎を誘導する。Gut 72, 1838-1847 (2023).

論文

パブコメ

Google Scholar

クローン病におけるウイルスおよび細菌抗原の免疫組織化学的検索。J. Crohns Colitis 7, 161-166 (2013).

論文

PubMed

Google Scholar

Sausset、R.、Petit、M.A.、Gaboriau-Routhiau、V.、De Paepe、M. 腸内ファージに関する新たな知見。Mucosal Immunol. 13, 205-215 (2020).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Braun, T. et al. 腸内細菌叢の個体差動態はクローン病の再燃に先行する。Am. J. Gastroenterol. 114, 1142-1151 (2019).

論文

PubMed

グーグル奨学生

Mehta, R. S. et al. 腸内細菌による5-ASAの代謝は、炎症性腸疾患における臨床効果を低下させる。Nat. Med. 29, 700-709 (2023).

論文

パブコメ

Google Scholar

Shkoporov, A. N. & Hill, C. Bacteriophages of the human gut: the "Known Unknown" of the microbiome. Cell Host Microbe 25, 195-209 (2019).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Kaczorowska, J. & van der Hoek, L. Human anellovirus: diverse, omnipresent and commensal members of the virome. ーFEMS Microbiol. Rev. 44, 305-313 (2020).

論文

CAS

PubMed

年

Google Scholar

Smith, S. E. et al. ウィローム研究における新たな技術。Curr. Opin. Virol. 54, 101231 (2022).

論文

CAS

パブコメ

Google Scholar

Wilcox、C. M., Muñoz-Navas, M. & Sung, J. J. Atlas of Clinical Gastrointestinal Endoscopy： Expert Consult-Online and Print (Elsevier Health Sciences, 2012).

Harvey、R. F. & Bradshaw、J. M. クローン病活動性の簡単な指標。Lancet 315, 514 (1980).

論文

Google Scholar

移植片対宿主病における糞便微生物叢移植後の腸内細菌叢、マイコバイオームおよびウイルス叢の縦断的動態。Nat. Commun. 12, 65 (2021).

論文

PubMed

生殖細胞

Google Scholar

Bolger、A. M., Lohse、M. & Usadel、B. Trimmomatic: イルミナ配列データ用の柔軟なトリマー。バイオインフォマティクス 30, 2114-2120 (2014).

論文

パブコメ

年

Google Scholar

McIver, L. J. et al. bioBakery: a meta'omic analysis environment. Bioinformatics 34, 1235-1237 (2018).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

Li, D., Liu, C. M., Luo, R., Sadakane, K. & Lam, T. W. MEGAHIT: an ultra-fast single-node solution for large and complex metagenomics assembly via succinct de Bruijn graph. Bioinformatics 31, 1674-1676 (2015).

論文

PubMed

Google Scholar

Li, D. et al. MEGAHIT v1.0: a fast and scalable metagenome assembler driven by advanced methodologies and community practices. Methods 102, 3-11 (2016).

論文

PubMed

Google Scholar

Cd-hit：大規模なタンパク質配列や塩基配列のクラスタリングと比較のための高速プログラム。バイオインフォマティクス 22, 1658-1659 (2006).

論文

パブコメ

Google Scholar

VirSorter2：多様なDNAおよびRNAウイルスを検出するためのマルチクラシファイア、エキスパートガイドアプローチ。Microbiome 9, 37 (2021).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Ren, J. et al. ディープラーニングを用いたメタゲノムデータからのウイルス同定。Quant. Biol. 8, 64-77 (2020).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

von Meijenfeldt, F. A. B., Arkhipova, K., Cambuy, D. D., Coutinho, F. H. & Dutilh, B. E. CATとBATを用いた未知の微生物配列とビンの頑健な分類学的分類。Genome Biol. 20, 217 (2019).

論文

グーグル・スカラー

Nayfach, S. et al. CheckV assesses the quality and completeness of metagenome-assembled viral genomes. Nat. Biotechnol. 39, 578-585 (2021).

論文

パブコメ

Google Scholar

BUSCOの品質評価から遺伝子予測、系統解析への応用。Mol. Biol. Evol. 35, 543-548 (2018).

論文

CAS

PubMed

Google Scholar

多数の培養ウイルスと未培養ウイルスがリボソームタンパク質をコードしている。Nat. Commun. 10, 752 (2019).

論文

ADS

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

真核生物、原核生物、ウイルスゲノムのスコアリングのための、より広範で深い系統学的カバレッジとともに、新しく合理化されたワークフロー。Mol. Biol. Evol. 38, 4647-4654 (2021).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Gregory,A.C.ら. 腸内ウイルスメデータベースから明らかになったヒト腸内ウイルスメ多様性の年齢依存性パターン. Cell Host Microbe 28, 724-740.e8 (2020).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Eddy, S. R. プロファイルHMM検索の高速化。PLoS Comput. 7, e1002195 (2011).

論文

ADS

MathSciNet

CAS

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

Paez-Espino, D., Pavlopoulos, G. A., Ivanova, N. N. & Kyrpides, N. C. Nontargeted virus sequence discovery pipeline and virus clustering for metagenomic data. Nat. Protoc. 12, 1673-1682 (2017).

論文

PubMed

Google Scholar

Hyatt, D. et al. Prodigal: prokaryotic gene recognition and translation initiation site identification. BMC Bioinforma. 11, 119 (2010).

論文

Google Scholar

Bin Jang, H. et al. 未培養原核生物ウイルスゲノムの分類学的割り当ては、遺伝子共有ネットワークによって可能になる。Nat. Biotechnol. 37, 632-639 (2019).

論文

グーグル・スカラー

Buchfink, B., Reuter, K. & Drost, H.-G. DIAMONDを用いた生命樹スケールでの高感度タンパク質アラインメント。Nat. Methods 18, 366-368 (2021).

論文

パブコメ

パブメッドセントラル

Google Scholar

Camacho, C. et al. BLAST+: アーキテクチャとアプリケーション. BMC Bioinforma. 10, 421 (2009).

論文

Google Scholar

Hannigan, G. D. et al. ヒト皮膚二本鎖DNAビローム：地理的・時間的多様性、遺伝的濃縮、宿主マイクロバイオームとの動的関連性。

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

ヒト腸内細菌叢の急速な進化。Proc. Natl Acad. Science. 110, 12450-12455 (2013).

論文

ADS

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Langmead, B., Wilks, C., Antonescu, V. & Charles, R. Scaling read aligners to hundreds of threads on general-purpose processors. Bioinformatics 35, 421-432 (2019).

論文

PubMed

Google Scholar

Prokka: 迅速な原核生物のゲノムアノテーション。バイオインフォマティクス 30, 2068-2069 (2014).

論文

PubMed

Google Scholar

UniProtコンソーシアム。UniProt：2023年の普遍的タンパク質知識ベース。Nucleic Acids Res. 51, D523-D531 (2022).

論文

Google Scholar

遺伝子オントロジーコンソーシアム. 遺伝子オントロジーリソース：GOld鉱山を豊かにする。Nucleic Acids Res. 49, D325-D334 (2021).

Gene Ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium. Nat. Genet. 25, 25-29 (2000).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Paysan-Lafosse, T. et al. 2022年のInterPro。Nucleic Acids Res. 51, D418-D427 (2023).

PhaTYP：BERTを用いたバクテリオファージのライフスタイルの予測。Brief. Bioinform. 24, bbac487 (2022).

ウイルスゲノムと宿主分類学とのリンク。Viruses 8, 66 (2016).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

腸管生検からの微生物DNA抽出は、機械的な細胞破壊を避けることで改善される。J. Microbiol. Methods 87, 125-127 (2011).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Bolyen, E. et al. QIIME 2を用いた再現性、対話性、拡張性のあるマイクロバイオームデータサイエンス。Biotechnol. 37, 852-857 (2019).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

SILVAリボソームRNA遺伝子データベースプロジェクト：改良されたデータ処理とウェブベースのツール。Nucleic Acids Res. 41, D590-D596 (2012).

論文

PubMed

パブメドセントラル

西暦2012年

Benjamini、Y. & Hochberg、Y. 誤発見率のコントロール：多重検定への実用的で強力なアプローチ。J. R. Stat. Soc. Ser. 57, 289-300 (1995).

MathSciNet

ーGoogle Scholar

Dixon, P. VEGAN, a package of R functions for community ecology. J. Veg. Sci. 14, 927-930 (2003).

ー記事

ー Google Scholar

Legendre, P. & Legendre, L. Numerical Ecology (Elsevier, 2012).

Peres-Neto, P. R., Legendre, P., Dray, S. & Borcard, D. Variation Partitioning of species data matrices: estimation and comparison of fractions. Ecology 87, 2614-2625 (2006).

、、、西アフリカの北アフリカの山地の北東部の北東部の山麓の山麓集落の山麓地域（島根県立自然史博物館蔵

、フウライウオのフウライウオ

ーGoogle Scholar

生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学、分子生物学 Bioinformatics 35, 1064-1066 (2018).

PubMedセントラル

微生物生態学における多変量統計技術の応用。、ーMol. Ecol. 25, 1032-1057 (2016).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

多変量解析による集団規模のメタオミクスにおける関連性の発見。PLoS Comput. Biol. 17, e1009442 (2021).

論文

パブコメ

パブメドセントラル

Google Scholar

EVenn：再現性があり編集可能なベン図とベンネットワークをオンラインで簡単に作成できる。J. Genet. Genomics 48, 863-866 (2021).

論文

PubMed

Google Scholar

SYBR Gold染色によるウイルスの定量（症例2）。(2016).

Wirtz, S. et al. 化学的に誘導された急性および慢性腸炎モデルマウス。Nat. Protoc. 12, 1295-1309 (2017).

論文

PubMed

Google Scholar

HISAT2とHISAT-genotypeを用いたグラフベースのゲノムアライメントとジェノタイピング。Nat. Biotechnol. 37, 907-915 (2019).

論文

CAS

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

DESeq2によるRNA-seqデータのフォルドチェンジと分散のモデレート推定。ゲノム生物学 15, 550 (2014).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

Truong, D. T., Tett, A., Pasolli, E., Huttenhower, C. & Segata, N. Microbial strain-level population structure and genetic diversity from metagenomes. Genome Res. 27, 626-638 (2017).

論文

PubMed

パブメドセントラル

Google Scholar

参考文献ダウンロード

謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（NSFC助成金第82172323号、第32100134号、第82060107号）、広州市重点研究開発プログラム（助成金第202206010014号）、中山大学第六附属病院および中山大学シードファンド（2022JBGS03）、雲南省応用基礎研究プロジェクト（202201AW070019）の共同研究によるものである。図1aはmapdata RパッケージおよびBioRender.comにより、図1b、7aおよび補足図10a、11a、c、e、15a、16aはBioRender.comにより作成した。

著者情報
著者ノート
これらの著者は同等に貢献した： Zhirui Cao, Dejun Fan, Yang Sun.

著者および所属
中国広東省広州市、教育部、中山大学ヒトマイクロバイオーム・慢性疾患重点研究室

曹志瑞、黄紫玉、李岳、蘇倫平、張鳳、蘭萍、呉小建、鄒涛

中国広東省広州市中山大学中山大学第六附属病院広東消化器研究所

曹志瑞、范徳軍、黄紫雨、李岳、蘇倫平、張鳳、蘭萍、呉小建、郭涛

中国広東省広州市、中山大学第六附属病院、糞便微生物叢移植研究センター

曹志瑞、黄紫玉、李岳、蘇倫平、張鳳、蘭萍、呉小建、鄒涛

中国広東省広州市、中山大学第六附属病院バイオメディカルイノベーションセンター

曹志瑞、黄紫玉、李岳、蘇倫平、張鳳、蘭萍、呉小建、鄒涛

中国広東省広州市中山大学中山大学第六附属病院消化器内視鏡科

デジュン・ファン

中国広東省中山大学第六附属病院大腸・骨盤底疾患研究室

デジュン・ファン、ピン・ラン、シャオジアン・ウー

中国・雲南省昆明市・昆明医科大学第一付属病院消化器科

ヤン・スン、ヤン・ホンジュ、ミャオ・インレイ

雲南省消化器病臨床研究センター（中国・雲南省昆明市

楊孫・苗英蕾

中国雲南省昆明市雲南老人医療センター

ヤン・スン＆ヤン・ホンジュ

中国・広東省広州市・中山大学第六附属病院消化器科

李青

中国・広州市済南大学生命科学技術学院食品科学工学科

張芬

中国広東省広州市中山大学中山大学第六附属病院大腸肛門外科

Ping Lan & Xiaojian Wu

貢献
TZが研究を考案した。ZRCはデータ解析を行い、原稿を作成した。DJFとYSは被験者のリクルートを行い、臨床サンプルとデータを収集した。ZYH、YL、FZ、RPSはウイルスと細菌のDNAサンプル調製を手伝った。YS、HJY、YLMはサンプル収集とアンケート調査に協力した。PLとQLは原稿執筆に多大な知的貢献をした。TZとXJWは研究の立案、監督、原稿の校閲を行った。

責任著者
Yang Sun、Xiaojian WuまたはTao Zuoまで。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

査読
査読情報
Nature Communications誌は、Federica Ungaro氏、および本著作の査読に貢献した他の匿名の査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。

追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報
補足情報
査読ファイル
追加補足ファイルの説明
補足データ1
補足データ2
報告概要
ソースデータ
ソースデータ
権利と許可
オープンアクセスこの記事は、クリエイティブ・コモンズ表示4.0国際ライセンスの下でライセンスされている。このライセンスは、原著者および出典に適切なクレジットを与え、クリエイティブ・コモンズ・ライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられた場合はその旨を示す限り、いかなる媒体または形式においても、使用、共有、翻案、配布、複製を許可するものである。この記事に掲載されている画像やその他の第三者の素材は、その素材へのクレジット表記に別段の記載がない限り、記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれています。この記事のクリエイティブ・コモンズ・ライセンスに含まれていない素材で、あなたの意図する利用が法的規制によって許可されていない場合、あるいは許可された利用を超える場合は、著作権者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを見るには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/。

転載と許可

この記事について
アップデートを確認する。CrossMarkで通貨と真正性を確認する
この記事を引用する
Cao,Z.、Fan,D.、Sun,Y.他、クローン病患者において腸回腸粘膜のビロームが障害され、マウスの腸炎を悪化させる。Nat Commun 15, 1638 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-45794-y

引用文献のダウンロード

受領
2023年7月20日

受理
2024年02月01日

掲載
2024年2月22日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-024-45794-y

この記事を共有する

以下のリンクをシェアすると、誰でもこのコンテンツを読むことができます：

共有可能なリンクを取得
コンテンツ共有イニシアチブSpringer Nature SharedItにより提供されています。

テーマ
消化器疾患
微生物叢
コメント
コメントを投稿することで、利用規約とコミュニティガイドラインを遵守することに同意したことになります。誹謗中傷や規約・ガイドラインに反する投稿があった場合は、不適切な投稿としてフラグを立ててください。

ネイチャー・コミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723（オンライン）

サイトマップ
ネイチャー・ポートフォリオについて
ネイチャーについて
プレスリリース
プレスオフィス
お問い合わせ
コンテンツを見る
ジャーナルA-Z
テーマ別記事
プロトコル交換
ネイチャー・インデックス
出版ポリシー
Natureポートフォリオポリシー
オープンアクセス
著者・研究者サービス
別刷りと許可
研究データ
言語編集
科学編集
ネイチャー・マスタークラス
研究ソリューション
図書館・機関
図書館員サービス＆ツール
図書館員ポータル
オープンリサーチ
図書館への推薦
広告とパートナーシップ
広告
パートナーシップとサービス
メディアキット
ブランドコンテンツ
プロフェッショナル育成
ネイチャー・キャリア
ネイチャーコンファレンス
地域ウェブサイト
ネイチャー・アフリカ
ネイチャー・チャイナ
ネイチャーインド
ネイチャー・イタリア
日本のネイチャー
ネイチャー韓国
ネイチャー中東
プライバシーポリシークッキーの使用お客様のプライバシーの選択/クッキーの管理法的通知アクセシビリティに関する声明利用規約お客様の米国におけるプライバシー権
シュプリンガー・ネイチャー
© 2024 シュプリンガー・ネイチャー

閉じる

その日最も重要な科学記事を無料でお届けします。
ネイチャーブリーフィングに登録する

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？