腸から分泌されるペプチドが睡眠からの覚醒を抑制する
腸から分泌されるペプチドが睡眠からの覚醒を抑制する
アイリス・ティトス
アレン・ユギノビッチ
アレクサンドラ・ヴァッカロ
パベル・ゴレリク
オファーマゾル
Dragana Rogulja 2
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Published:March 22, 2023DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.02.022
PlumX メトリクス
ハイライト
食餌性タンパク質の濃縮により、ハエやマウスの睡眠からの覚醒を抑制することができる
食餌性タンパク質がハエの腸内細胞を活性化してペプチドCCHa1を分泌させる
CCHa1が脳内ドーパミンニューロンにシグナルを送り、感覚応答性を調節している。
睡眠中に異なる感覚モダリティが独立したメカニズムでゲートされることがある
概要
睡眠には感覚の抑制が重要であり、より深い睡眠にはより強い感覚の抑制が必要である。睡眠中の動物が周囲の環境をほとんど無視できるようになるメカニズムはよく分かっていない。我々は、睡眠中のハエやマウスの機械的振動に対する反応は、タンパク質が豊富な餌を与えると、より抑制されることを示した。ハエでは、摂取したタンパク質に関する情報が腸から脳に伝わり、覚醒を抑制するのに役立つシグナル伝達経路を説明することができた。腸内のタンパク質濃度が高くなると、ペプチドCCHa1を放出する腸内分泌細胞の活動が活発化する。CCHa1は、脳のドーパミンニューロンの小さなグループにシグナルを送り、その活動を調節する。ドーパミン作動性活動は、動物の振動に対する行動反応性を調節する。CCHa1経路と食物タンパク質は、すべての感覚入力に対する反応性に影響を与えないことから、睡眠中は、独立したメカニズムによって異なる情報の流れがゲートされる可能性があることが示された。
図解抄録
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はじめに
睡眠は、動物の進化の初期に発生し、種を超えて比較可能な特性を有しています。
1
健康には、睡眠の量と質の両方が重要です、
2
睡眠の質は、入眠のタイミング、入眠までの時間、覚醒の頻度や時間、睡眠の深さなどに左右されるためです。
3
,
4
特に回復力の高い深い眠り、
5
は、ほとんどの環境信号が脳を覚醒させないようにすることを要求しています。
6
,
7
寝ても覚めても目覚めが悪い人は、十分な睡眠時間をとっても、疲れがとれないことが多い。
5
睡眠中に覚醒度が抑制されるメカニズムは、どのモデルでも十分に解明されていません。
8
,
9
,
10
,
11
,
12
,
13
睡眠は、遺伝の影響を強く受けます、
14
と、ハエなどのモデル生物を使って複数の睡眠調節遺伝子が同定されています。
15
,
16
また、栄養などの外的要因も重要で、疫学調査では因果関係を証明することはできませんが、特定の食品の摂取と睡眠の変化には相関関係があることが明らかになっています。
17
,
18
,
19
栄養が睡眠に影響を与えるメカニズムを研究する上で、ハエは特に有用であるが、そのほとんどは飢餓状態での研究であった、
20
睡眠が強力に抑制されているときに 飢餓状態ではない通常の状態において、栄養が睡眠にどのような影響を与えるかは不明である。
我々は、睡眠からの覚醒を制御する遺伝子をスクリーニングすることで、食物タンパク質に関する情報が腸から脳に伝達され、感覚的な反応を抑制するのに役立つシグナル伝達経路を発見した。タンパク質を含む食物を摂取すると、ハエの腸にある分泌細胞群が活性化し、ペプチドCCHa1を放出する。CCHa1は、脳のドーパミンニューロン群に信号を送り、その活動が機械的振動に対する反応性を調節している。腸内のタンパク質濃度が高くなるとCCHa1濃度が高くなり、より強い振動でも眠れるようになる一方、腸内のCCHa1が減少すると弱い振動でも簡単に目覚めてしまう。マウスもまた、振動に反応しにくく、タンパク質質の食物でより強固な睡眠をとることができることを示す。これらの結果は、食餌性タンパク質が感覚的な反応を抑制し、より深い睡眠を促進することを示すヒトでの観察と一致するものである。
21
CCHa1経路は振動に対する反応性を強力に調節するが、熱入力に対する反応性には影響を与えないことから、睡眠中に異なる感覚モダリティが別々のメカニズムでゲートされることが示された。
研究成果
覚醒閾値変異体のスクリーニング
我々は、機械的振動を発生させる高スループットの自動化セットアップを用いて、ショウジョウバエの感覚覚醒性を研究した（図S1A、S1B、STAR Methods）。セットアップでは、ラウドスピーカーが電気信号を2秒間の振動に変換し、一晩中30-40分ごとに（慣れを最小限にするためにランダムに）、ハエがいる運動活性モニターを上下に動かすようにする。3分以内に動き出したハエは、刺激によって特別に目覚めたとみなした（STAR Methods、自然覚醒を考慮した）。
図S1図1に関連するCCHa1およびCCHa1R変異体およびRNAi株の実験セットアップと解析結果
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少数のハエ（約20％）または多数のハエ（約95％）を常に覚醒させる振動強度を用いて、覚醒性の遺伝子修飾因子をスクリーニングした（図1AおよびSTAR Methods）。汎ニューロンドライバーelav-Gal4を用いて、約3,400の遺伝子に対するRNAisを発現させた（STAR Methods）、
22
であり、各データポイントの生成には8匹の動物が用いられた。このスクリーニングにより、高覚醒および低覚醒の表現型が発見され（図1A；表S1）、多様な生物学的および分子的機能に関わる遺伝子にマッピングされた（表S2）。睡眠によって体全体が大きく変化することを考えれば、複数の経路が覚醒性を制御していることは当然といえる。
図1CCHa1およびその受容体は睡眠からの覚醒を抑制する
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ペプチドとその受容体が覚醒を制御する
中でも、神経ペプチドCCHa1またはその受容体CCHa1Rが枯渇した場合に生じる強い覚醒亢進表現型は（図1A）、約85％の動物が低強度の刺激に反応して覚醒しました（図1B）。CCHアミド（CCHa1およびCCHa2）は、嗅覚反応と概日行動（CCHa1）、および摂食と成長（CCHa2）を制御します。
23
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24
,
25
,
26
,
27
,
28
CCHa1の受容体は、哺乳類のGタンパク質共役型受容体ガストリン放出ペプチド受容体（GRPR）に相同であることが知られています、
28
は、痒みの感覚を調整するものです、
29
ソーシャル・インタラクション
30
,
31
恐怖記憶の定着
32
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33
,
34
の呼吸をします、
35
食の摂取量です、
30
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36
,
37
とサーカディアンリズムの関係
38
,
39
,
40
RNAisのCCHa1およびCCHa1R（CCHa2およびCCHa2Rではない）に対する特異性は、定量RT-PCRで示されました（図S1C）。
多くの動物のように
41
夜目醒める
42
,
43
をしてから、再び眠りにつく。
44
CCHa1またはCCHa1Rを欠損させた動物は、対照群よりもベースラインでの活動が活発でなく、振動に反応して運動量が増加する傾向があった（図S1D、STAR Methods）。睡眠は感覚を抑制する極端な状態であるが、覚醒中も動物は程度の差こそあれ、感覚世界を調整することができる。
45
このことから、CCHa1は、最もよく知られた覚醒調節因子であるドーパミンと同様に、睡眠・覚醒状態を超えて感覚の覚醒を抑制できることが示唆された。
46
,
47
CCHa1は、ドーパミン作動性細胞の異なる集団を通じて、動物が眠っているときと起きているときの感覚的覚醒を抑制するように作用することを、後で明らかにする。CCHa1またはその受容体をノックダウンすると、他のいくつかのパラメータにも影響を与えた：睡眠がより断片的になった（個々の睡眠時間のわずかな減少とその頻度の増加によって証明される）（図S1D）；睡眠までの待ち時間は、以前にCCHa1枯渇について説明したように増加した
28
CCHa1受容体を枯渇させると、 ;ハエの睡眠は少なくなった（図S1D）。このような睡眠の異なる側面が、同じペプチドによってどのように制御されるのかについては、後ほど説明する。上記の結果は、追加のRNAi系統（図S1EおよびS1F）および突然変異体でも確認された
48
(図1CおよびS1G）。発達後の枯渇は、過覚醒を引き起こすのに十分であった（図S1H）。
CCHa1シグナルは腸に由来する
CCHa1の起源となる細胞を見つけるために、以前に検証されたエピトープに対する抗体を作成しました。
49
と、空間的に制限されたGal4sを用いてペプチドに対するRNAisを発現させた。CCHa1は、神経系で検出されている
28
と腸内分泌細胞の後方亜集団に存在する、
49
分泌細胞は腸内にまばらに分布している。
50
観測されたシグナルは、これまでの報告と一致していた
25
,
28
,
49
,
51
(図2AおよびS2A）、CCHa1プロモーターから発現するGFPのパターンと一致した（図S2B、ヘテロ接合体左）。
図2CCHa1ペプチドは腸からシグナルを発して覚醒性を抑制する
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図S2腸内で産生されるCCHa1は覚醒度を調節するが、睡眠量は調節しない、図2に関連した図
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CCHa1タンパク質とmRNAは、elav>CCHa1-RNAiハエとCCHa1変異体では、神経系と腸で検出されなかった（図2A、S2B、ホモ接合体の右とS2C）。神経細胞と腸内分泌細胞は、発生プログラムを共有している、
50
汎神経細胞ドライバーの代表格であるelav-Gal4が両方の細胞で発現しているのは、このためかもしれません。
52
(図S2D）。我々は、腸からCCHa1のみを枯渇させること（標準的な腸内分泌ドライバーpros-Gal4の条件付きバージョン、prosを使用）（図2B、S2E、およびS2F）を見て驚いた。
53
は、覚醒度の上昇を引き起こすのに十分であった（図2BおよびS2G）。elav-Gal4で観察されたものとは異なり、睡眠エピソードの数や入眠までの潜伏時間には影響がなかった（図S2G）ことから、神経系で産生されたCCHa1は睡眠の定着とタイミングに影響を与え、腸で産生されたCCHa1は覚醒性を調節することがわかった。CCHa1を腸から枯渇させた場合、摂食や食物処理への影響は見られなかったことから（図S2H）、CCHa1の覚醒性への影響は、食物処理の変化によるものではないことが示唆された。ペプチドは古典的な神経伝達物質よりも遅い時間スケールで作用するため、長時間持続する状態である睡眠は、ペプチド性の調節に理想的に適しているようだ。
54
1つのペプチドが持つさまざまな機能を切り離すことは難しい、
55
が、CCHa1の場合、腸に特化した枯渇は、このペプチドがどのように感覚の覚醒を抑制し、深い睡眠を促進するのかを具体的に研究する機会を与えてくれる。
腸の分泌細胞は覚醒を制御する
以上の結果は、電気的に興奮する腸内分泌細胞の活動を変化させることを示唆しています、
56
,
57
は覚醒性に影響を与えるはずである。腸内分泌ドライバーpros-Gal4を使って神経細胞サイレンシングツールを発現させると、発生致死（条件付きツールでも発生致死、
58
しかし、神経細胞活性化のためのツールをテストすることができた。温度感受性カチオンチャネルTrpA1を用いた腸内分泌細胞の熱発生による活性化
59
は、睡眠中（図2C、黄色）と覚醒中（図S2I）の両方の動物で覚醒性を抑制することにつながった。プロス-Gal4は腸内分泌細胞に加えて一部のニューロンでも発現している（図S2F）ので、表現型がどの程度腸で産生されたCCHa1ペプチドに媒介されているのか質問した。pros-Gal4を用いて、細胞の活性化とCCHa1の枯渇を同時に行うと、覚醒性への影響の多くが抑制された（図2CおよびS2I、黄色と比較してピンク）。pros-Gal4発現細胞の活性化によって生じる別の表現型（睡眠がわずかに少ない、図S2I）は、しかし、CCHa1枯渇によって抑制されなかった（図S2I）。これは、非CCHa1腸内分泌細胞またはpros-Gal4によってラベルされたニューロンの一部で生じることが示唆された（図S2F）。これまでに示した結果から、腸から放出されたCCHa1が覚醒度を抑制することが示唆された（図2D）。
食餌性タンパク質は腸内分泌細胞を活性化し、CCHa1シグナルを制御する
CCHa1シグナルの起源から、その制御には栄養的な合図が関与している可能性が指摘されていた。栄養が睡眠に影響を与えるメカニズムについては、フライで詳細が明らかになりつつある、
20
,
60
しかし、ほとんどの研究は、動物の睡眠時間が短くなる飢餓状態で行われたものです。
61
腸管特異的CCHa1枯渇による睡眠量の変化はなく（図S2G）、標準的な摂食条件下で働くまだ未知のメカニズムが関与していることが示された。後中腸に存在する腸内分泌細胞は、食事のタンパク質やアミノ酸によって活性化される、
57
このことは、CCHa1産生サブセットにも当てはまるのか、また、脂肪や糖の潜在的な影響についても検証しました。
生きた腸の画像化は、臓器の収縮や、内腔内容物による上皮の不明瞭化の可能性など、多くの理由から困難です。CaLexA
62
は、転写変化に依存するツールで、自由に行動する動物で腸の細胞の活動を記録することができる。細胞の活動が活発になると起こる細胞内カルシウム濃度の上昇がGFPの発現を促し、最大24時間安定的に発現させることができる
63
より長く、あるいはより頻繁に細胞を活性化させると、より多くのGFPが蓄積される（図3A）。このツールは腸内分泌細胞でも有効であることが示されている
57
を、ニューロン以外に
64
,
65
CaLexAをpros-Gal4で発現させた、
53
とCCHa1陽性細胞を抗体染色により同定した。細胞の活性化を示すGFPとCCHa1を共発現する細胞の割合は、これまでの報告に基づいて、通常の餌に糖、脂肪、またはタンパク質をいくつかの濃度で補充した24時間後に定量化した
66
,
67
,
68
(STAR Methods）。糖質（グルコース、ガラクトース、フルクトース）と脂肪（ココナッツオイル、プロピオン酸、ヘキサン酸）の3つの供給源をテストしました。タンパク質の補給には、アミノ酸とペプチドを含む部分加水分解食餌性タンパク質ミックスであるペプトンを使用しました（STAR Methods）。
図3CCHa1発現腸内分泌細胞は食事性タンパク質により活性化され、より深い睡眠を促す
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CCHa1陽性腸管細胞の活性とこれらの細胞のCCHa1レベルは、ペプトン補給で特異的に増加した（図3B、3C、およびS3A）。通常の餌100mlに対して、ペプトン補給は40kcalを加えたのに対し、砂糖補給は14kcal、脂肪補給は80kcalだったので、これはカロリーに起因するものではないようだ（STAR Methods）。ハエが24時間タンパク質補給食を摂取できた場合、CCHa1レベルは6時間だけ摂取できた場合よりも増加した（図3D）。このことは、腸内分泌細胞が長期的な食事変化と短期的な食事変化を識別できることを示唆しているが、GFPの産生と分解の動態が関与している可能性も排除できない。ペプトンの補給は、食物の消費量や腸からの排出量に明白な影響を与えなかった（図S3B）。後中腸細胞の中には、活性化の証拠を示さずにCCHa1レベルが高いものがあり（図3B、マゼンタの矢じり）、活性化した細胞の中にはCCHa1陰性であるものがあった（図3B、緑の矢じり）ことに注目する。特定のアミノ酸が関連しているかどうかを調べるために、それぞれのペプトン濃度でそれらを補充した（単独または組み合わせで、STAR Methods）。CCHa1レベルは、全アミノ酸濃度がペプトン中に存在するものと一致する場合にのみ増加した（図3Eおよび図3F）。この結果は、CCHa1産生腸内分泌細胞が、食物が全体としてどの程度タンパク質が多いかをモニターしていることを示唆し、食餌タンパク質の濃縮が感覚の断絶と深い睡眠を促進するはずであることを暗示している。
図S3図3に関連する、異なる栄養素のCCHa1レベルへの影響
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この考えを検証するため、通常の餌とタンパク質の多い餌を与えた動物の反応性を、中間の強さの刺激（どちらかの方向への覚醒性の変化を検出できる設定）を用いて比較しました。ペプトンを添加した餌を24時間与えた場合、通常の餌を与えたハエと比較して、振動に反応して目覚めるハエの数が半分になった（図3G）。また、ペプトンを補充した動物は、刺激時に起きている場合、反応性がわずかに低かった（図S3C）。統計解析によれば、タンパク質補給による基礎運動活性（図S3C）および睡眠量（図3G）への影響が見られたが、その表現型は非常に弱く、その生物学的意義については不明であることに留意されたい。
糖と脂肪の補給はCCHa1のレベルやCCHa1産生腸内分泌細胞の活性に影響を与えなかったが、行動反応性に影響を与える可能性があるかどうかを検証した。CCHa1レベルへの影響と同様に、グルコースまたはプロピオン酸の補給は、動物が機械的刺激に反応する方法に影響を与えなかった（図S3D）。カロリー対特定の栄養素の効果をさらにコントロールするために、等カロリーの補給を行った。それぞれの場合、40kcalの追加カロリーを補給したが、由来が異なる（プロピオン酸、グルコース、ペプトン、またはグルコースとペプトンの組み合わせ（グルコースから2/3カロリー＋ペプトンから1/3カロリー、またはグルコースから1/3＋ペプトンから2/3カロリー）。覚醒度は、添加カロリーの大半が食事性タンパク質由来の場合に最も強く抑制された（図3HおよびS3 E）。このことは、覚醒度の抑制には栄養素の供給源が関係しているという考えを補強している。
そこで、CCHa1を腸内で欠損させたハエにタンパク質を補給することで、CCHa1が食事性タンパク質の覚醒への影響をどの程度仲介しているかを調べた。CCHa1ノックダウン自体が覚醒亢進を引き起こすため、これらの動物のベースライン（すなわち、通常の食事での覚醒度）を親コントロールと一致させるためには、低い振幅の刺激を使用しなければならなかった（親コントロールには低強度の刺激を、CCHa1枯渇動物には中強度の刺激を使用するという逆の条件もテストした［図S3FおよびS3G］）。CCHa1枯渇は、覚醒に対するペプトンの効果を弱めたが（図3IおよびS3F）、表現型の抑制が不完全であることから、食物タンパク質は複数のシグナル伝達経路を活性化するという考えが補強された。まとめると、摂取したタンパク質が腸内のCCHa1産生細胞を活性化して覚醒度を抑制することが示された（図3J）。
食餌性タンパク質は哺乳類において感覚断絶を促進する
マウスをモデルとして、食餌性タンパク質が哺乳類の覚醒性に与える影響を評価した。動物個体は、プラットフォーム上の睡眠記録室に収容され、下から強度を調整できる機械的刺激を与えるシェーカーを設置した（STAR Methods）。2日間連続で、マウスが最も眠るサーカディアンサイクルの明期に、50-70分ごとにランダムな間隔で刺激を与えた。
69
反応性は、脳（脳波、EEG）と筋肉（筋電図、EMG）の電気活動記録を用いて、刺激付与後5分以内に評価された。確認にはビデオ撮影を用いた。刺激伝達の直前に動物が眠っていた事象のみを考慮し、データは自然覚醒について正規化した（STAR Methods）。
マウスを約50％の確率で目覚めさせるのに必要な刺激強度を決定した後、その反応性が食餌に影響されるかどうかを質問した。試験を受ける5日前から、マウスには、体重に影響を与えない、カロリー値が同程度の標準食または栄養強化食を与えた（STAR Methods）（図S4A-S4C）。各実験では、2つのチャンバーを1つのプラットフォーム上に置き、一方には通常食を与えたマウスを、もう一方にはタンパク質強化食を与えたマウスを置いた。ハエと同様に、タンパク質強化食のマウスは目覚めにくかったが（図4A）、刺激が高強度の場合は容易に反応し、一般的な障害を除外した（図4B）。餌を糖分（図4B）または脂肪（図4C）で濃縮した場合、覚醒性に変化は見られなかった。
図S4マウスの体重が食餌条件によって異なることはない；睡眠段階のパターンおよびアーキテクチャ、ならびにデルタ波およびシータ波のパワー、図4に関連する
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図4食事性タンパク質によるマウスの睡眠からの覚醒抑制効果
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食事性タンパク質の強化は、全体の睡眠量には影響を与えませんでしたが（図4D）、より強固な睡眠（より少ない覚醒で中断される長い睡眠）につながりました（図4D、4E、およびS4D）。哺乳類の睡眠は、急速眼球運動（REM）期とノンレム期からなり、ノンレム睡眠は3つのステージからなる。
70
感覚覚醒度の低下という特徴から、睡眠の深さはノンレム睡眠の最終段階とレム睡眠で最大となる。
71
,
72
タンパク質を多く摂取した動物では、レム睡眠エピソードの数が増加し、レム期に費やした総時間が増加した（図4F、4G、およびS4D）。行動反応性に基づく睡眠深度の定義に加え、脳波で測定される脳電気活動のパターンに基づいて行われるものである。
73
しかし、レム睡眠中の動物は、脳活動が覚醒しているように見えるにもかかわらず、なかなか覚醒しないため、脳波パターンがどの程度感覚的反応を形成しているかは不明である。
74
睡眠時と覚醒時の脳活動に及ぼす食事の違いによる影響を評価するため、低周波のシータ波とデルタ波（それぞれリラックスと睡眠に関連する）に着目した脳波パワー解析を実施した
75
). 食事性タンパク質の明白な影響は見られなかった（図S4EおよびS4F）ことから、睡眠中に観察される脳状態の広範な変化を調節するメカニズムとは独立したメカニズムによって、感覚応答性が調節されうることが示唆される。データは表面電極で取得されたものであり、記録しなかったいくつかの特定の脳領域で変化がある可能性を捨てることはできない。
腸が産生するCCHa1シグナルが脳内ドーパミン作動性ニューロンに伝達される
私たちはハエに戻り、腸由来のシグナルが睡眠にどのように影響するかを研究しました。腸内分泌細胞が産生するペプチドは、樹状突起の末端と接触することでシナプス的に、あるいは循環することでホルモン的にシグナルを送ることができます。
76
CCHa1を産生する細胞は、ショウジョウバエの腸の神経支配が不十分な領域に存在する、
50
ホルモン作用が示唆された。このペプチドがどこで受容されて覚醒度を調節しているのかを調べるため、疎な神経細胞集団の受容体を枯渇させ、振動に対する反応性をテストした。コリン作動性細胞（Cha-Gal4）、オクトパミン作動性細胞（Tdc2-Gal4）、グルタミン酸作動性細胞（vGlut-Gal4）、サーカディアン細胞（Tim-Gal4）からCCHa1受容体を枯渇させると、ハエは過覚醒にならなかった（図5A）。あるドーパミン作動性ドライバー（TH-Gal4）は表現型を生じなかったが、別のドライバー（Ddc-Gal4）は睡眠中（図5A）および覚醒中（図S5A）の両方で反応性の増加をもたらした。Ddc-Gal4はドーパミン作動性ニューロンのPAMクラスター（80-90ニューロン/脳半球）を標識するが、TH-Gal4は標識しない、
77
これは、これらが関連する細胞であることを示唆している。PAMクラスターは、CCHa1R調節エレメントの制御下で発現する2つの異なるGal4によって標識されており（図S5B）、受容体がここで発現しているという考えを支持している。
図5CCHa1は脳のドーパミン作動性ニューロンを介して覚醒性を制御する
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図S5CCHa1受容体（PAMMB441Bニューロン）が覚醒度を制御する、図5関連
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PAMドーパミン作動性クラスターにおいてのみCCHa1受容体に対するRNAiを発現させると、基礎的な運動量や睡眠量に影響を与えることなく（図5A）、ハエをより覚醒させるのに十分であった（図S5A）。このことは、CCHa1そのものと同様に、受容体の様々な制御的役割が異なる神経細胞集団で非連携であることを示唆している（図2BおよびS2G）。覚醒反応性への影響は、PAM-Gal4駆動CCHa1R-RNAiでは統計的に有意ではなかったが（表S3）、定性的にはDdc-Gal4で見られたものと同様であった（図S5A）ことに留意されたい。それにもかかわらず、ドーパミンニューロンの異なる集団が、睡眠中および覚醒中の覚醒性に対するCCHa1の効果を媒介することを、以下に示す。
大規模なマッピングとツール作成の努力により、PAMドーパミン作動性ニューロンの亜集団にアクセスできるようになった。
78
となり、CCHa1標的細胞の絞り込みがさらに進んだ。PAMMB441B-Gal4を使ってCCHa1受容体を枯渇させると、ハエは振動で目覚めやすくなった（図5Bおよび図5C）。このドライバーは腸を標識せず（図S5C）、各脳半球では8〜10個の細胞を標識する（図5Bおよび5C）。
78
転写プロファイリングデータによると、CCHa1受容体を発現している。
79
PAMクラスターの他のニューロンの関与を否定することはできないが、強い表現型がこの小さな細胞群にマップされるため、PAMMB441B集団に注目した。PAMMB441BニューロンからCCHa1受容体を枯渇させた場合、食物の消費と腸からの排出は影響を受けず（図S5D）、総睡眠量も影響を受けず（図S5E）、基本的な運動量はわずかに減少した（図S5E）。覚醒動物の反応性は影響を受けず（図S5E）、これはPAMMB441Bニューロンの活性を操作した場合（図5DおよびS5F）およびチロシン水酸化酵素（TH、ドーパミン合成の律速酵素）を枯渇させた場合（図5EおよびS5G）にも当てはまった。これらの観察結果から、CCHa1はドーパミン作動性ニューロンの別の亜集団（同定していない）によって受け取られ、覚醒期間中の覚醒を抑制していることがわかった（図5F）。TH操作の結果は、覚醒に対するPAMMB441Bニューロンの効果が、ドーパミンそのものによって媒介されることを主張している。この分子は、正統的には覚醒を促進すると考えられている、
46
,
80
,
81
,
82
が、我々のデータは、ドーパミンが特定のシナプスに作用して覚醒を抑制できることを示唆しており、いくつかの過去の観察と一致している。
8
食餌性タンパク質が脳のドーパミン作動性ニューロンを活性化させる
もしPAMMB441BニューロンがCCHa1の標的となるなら、CCHa1受容体を枯渇させれば、食事性タンパク質が睡眠中の覚醒を抑制する能力を低下させるはずである。この予測はテストされ、検証された（図6A、S6A、およびS6B）。CCHa1受容体を枯渇させると覚醒能が亢進するので、図3Iと同じ戦略を用い、親コントロールを中強度の刺激に、受容体枯渇動物を低強度の刺激に曝露してベースラインの覚醒能に一致させ、逆の条件もテストした（図S6B）。ペプトン補給により、活性化の証拠を示すPAMMB441Bニューロンが増え（図6B）、この効果はCCHa1受容体のPAMMB441B特異的枯渇で抑制され（図6B）、腸から脳への直接的なシグナル伝達という考え方を支持した。タンパク質摂取は、別のドーパミン作動性集団の活性に変化を起こさなかったことから（図S6C）、PAMMB441B神経細胞活性の増加は、タンパク質摂取のアーティファクトではないことが示唆された。
図6ドーパミン作動性活性は食事性タンパク質とCCHa1の影響を受ける；異なる感覚モダリティは独立してゲートされうる
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図6 PAMニューロンにおけるCCHa1受容体が食餌性タンパク質に応答する覚醒度を制御し、温度上昇に応答する覚醒度を測定する設定（図6と関連する
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センサリー・ゲーティングはモダリティに依存することがある
この結果は、生理的な信号がドーパミン作動性PAMニューロンの活動に影響を与えることを示しているが、感覚入力がこのシステムのどこで交差しているかは、これからは不明である。PAMニューロンは、異なる感覚モダリティからの入力を受け取る脳構造であるキノコボディに投射する
83
,
84
,
85
,
86
,
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,
88
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89
で、睡眠量、摂食、学習、記憶、嗅覚などをコントロールしています。
90
,
91
,
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,
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94
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95
,
96
ドパミン作動性ニューロンは、ケニオン細胞と出力ニューロン間のシナプスを調節し、適切な行動反応を文脈化し、駆動します。
90
,
97
ケニオン細胞は、嗅覚と視覚の情報を伝えます、
88
,
89
,
98
が、機械的な入力を受けているという証拠はまだない。幼虫の
99
,
100
と大人
101
一方、PAMニューロンは、機械的感覚情報の受容体であることが知られている。PAMMB441Bニューロンサブセットが機械的刺激に反応するかどうか、またどのように反応するかを推定するために、これらの細胞にCaLexAを発現させ、覚醒性をテストするのと同じプロトコルを用いて、ハエを一晩振動にさらす（図S6D）。刺激後4時間（ニューロンが活性化した場合のGFP増加を検出するのに十分な時間）、および刺激後28時間（ニューロン活動が低下した場合のGFP分解に十分な時間）、PAMMB441B細胞体におけるGFPシグナルを定量化した（図 S6D）。
63
CaLexAは、振動にさらされた動物のPAMMB441B神経細胞活性の低下を報告し（図S6D）、タンパク質が豊富な餌によって誘導される効果とは逆であった。感覚情報と栄養情報の相互作用をより理解するために、まずハエにタンパク質が豊富な餌を24時間与えた後、振動にさらしました。タンパク質の補給は、振動がPAMMB441B神経細胞活性を低下させる能力を抑制しました（図6C）。これらの結果から、外部環境と内部環境に関する情報は、少数のドーパミン作動性ニューロンに収束し、これらのニューロンの活性に反対の影響を及ぼすと考えられる。行動反応のレベルはドーパミン作動性ニューロンの活性に依存するため（図5Dおよび図5E）、これは本質的に感覚ゲートを構成することになる。きのこ体内のフィードバックループを考えると
99
,
102
と、キノコ体細胞が運動に反応していることから、振動によって誘発されるドーパミン活性の変化も、運動反応そのものに影響されている可能性を捨て切れない。
103
睡眠中は、すべての感覚入力が減衰しています、
62
これは、中枢のゲーティング機構によって起こる可能性があります。哺乳類では、感覚ゲーティングは、大脳皮質に到達する前にほとんどの感覚情報が通過する領域である視床で起こると考えられている。
104
,
105
しかし、嗅覚の情報は視床を迂回するにもかかわらず、減衰してしまうのです、
106
このことから、より特殊な制御が行われており、異なる感覚モダリティが少なくとも部分的に独立したメカニズムでゲーティングされている可能性があることが示唆された。我々は、ハエを目覚めさせるために振動の代わりに熱を使用するセットアップを構築し、この可能性をテストした（図6DおよびS6E、STAR Methods）。刺激の強さによって、異なるレベルの行動応答が検出された（図6D、35℃対40℃、どちらの刺激もハエには熱いと認識される
107
)であったが、PAMMB441Bニューロンの活性はいずれの温度にも影響されなかった（図S6D）。CaLexAには技術的な限界があるかもしれないが、熱と機械感覚入力が別々の回路を通して減衰している可能性もある。この可能性は、振動で見られたのとは対照的に、ペプトン補給やPAMMB441BニューロンからのCCHa1受容体の枯渇のいずれによっても熱に対するハエの反応性が影響を受けなかった（図6E、6F、S6F、S6G）ことから、考えられる。特定の条件を調べたに過ぎないが、温度情報と機械感覚情報は独立してゲートされうる（図6G）。これは、温度情報がキノコ体のα′/β′葉を流れることを示す電子顕微鏡データと一致すると結論づけられる、
102
一方、CCHa1受容ドーパミンニューロンはγ葉（特にγ3コンパートメント）を神経支配している。
78
キノコ体出力ニューロンが覚醒度と睡眠量の情報を統合しているかもしれない
γ3コンパートメントからの情報は、各脳半球の2つのニューロンによってさらに運ばれ、これらのニューロンには、キノコ体出力ニューロンドライバー MBONMB083C-Gal4
78
,
90
(図7A）、明らかな腸内発現を持たない（図S7A）。MBONMB083Cを条件付きで阻害すると、ハエは振動で簡単に目を覚ますようになり（図7B）、覚醒閾値が異常に低いことを示した-腸からCCHa1を除去した場合に観察された表現型（図2B）と同じ）。条件付き活性化では逆の効果が見られた（図7B）。これらの表現型は睡眠に特有であり、覚醒時の覚醒性は影響を受けなかった（図S7B）。MBONMB083Cニューロンは、その活性化によって睡眠が抑制されたことから、睡眠量の調節に一役買っているのかもしれない（おそらく直感に反して、動物の睡眠時間は短く、しかし深い）（図S7B）。しかし、この結果は生物学的に重要かどうかは不明である。なぜなら、睡眠量はニューロンのサイレンシングによって影響を受けなかったし、以前の報告ではMBONMB083Cの活性化は
108
(ただし、活性化にはこことは異なる温度条件が使用された)。それにもかかわらず、他の研究
16
のように、ケニオン細胞とMBONが睡眠量の調節に関与していることから、睡眠量と睡眠の深さを知らせる調節の流れが、この部位で統合されている可能性が示唆された。
図7キノコ体出力ニューロンが覚醒性を制御する様子
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図S7MBONMB083Cニューロンを介した睡眠・覚醒度調節の関連図
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CaLexAにより、ペプトン添加の餌を24時間摂取した動物では、通常の餌を摂取した動物と比較して、MBONMB083Cニューロンの活性が高いことがわかった（図7C）。MBONMB083Cニューロンをサイレンシングすると、覚醒度に対するペプトンの効果は抑制された（図7DおよびS7C）。MBONMB083Cニューロンがドーパミン作動性の指示を受けるかどうかを調べるために、ドーパミン受容体を枯渇させ、覚醒度をテストした。MBONMB083CニューロンからDopR1またはDopR2のいずれかを枯渇させ、D2RまたはDopEcRを枯渇させなかったところ、睡眠からの覚醒性が増加した（図7EおよびS7D）。この結果は、PAMMB441BとMBONMB083Cのニューロンがドーパミンを介して通信し、睡眠からの覚醒性を調節しており、DopR1とDopR2がこの文脈に関連する受容体であることを示唆している。ケニヨン細胞もドーパミン受容体を発現しているので、
79
が関与している可能性は否定できません。
ディスカッションの様子
これらのデータから、食餌性タンパク質に関する情報がペプチド性シグナルを通じて腸から脳に伝達され、睡眠からの覚醒を制御するモデルが示唆された（図7FおよびS7E）。睡眠の深さは、脳の電気的活動と刺激に対する行動反応の低下の両方に基づいて定義されている。
74
睡眠は、神経系が未発達だった原始的な動物が起源と考えられているため、
1
ということは、分子シグナル伝達を伴う中核的な睡眠調節メカニズムが存在し、グローバルな脳活動の変化のレベルでは反映されないということである。無脊椎動物モデルの睡眠状態を定義し、研究するために、電気活動は一般的に使用されていません、
109
が、そのようなモデルから哺乳類に移行する際のメカニズム的な知見は良好である。
15
遺伝子スクリーニングの結果、覚醒度と睡眠深度の調節にいくつかの示唆を与えるシグナル伝達経路を発見しました。
腸から分泌されるシグナルが覚醒度を調節する
食料の確保は生存の主要因であり、動物は栄養の必要性に応じて睡眠時間を調節している。
20
,
110
ハエもネズミも飢餓状態では睡眠を犠牲にして覚醒を増加させる、
61
,
111
そして、満腹になるとより眠くなる
112
,
113
睡眠調節におけるさまざまな栄養素の寄与は不明ですが、私たちの研究と合わせて、他の研究では、食事のタンパク質が特に重要であることが示されています。
19
例えば、食後の睡眠は、カロリー値が同等であっても、食事にタンパク質が含まれ、糖分が含まれていない場合に、ハエで促進される。
112
栄養素の中でも、たんぱく質はカロリーあたりの満腹感を最も高めてくれる効果があります、
114
そのため、糖質や脂質よりも睡眠を促し、覚醒を抑制する働きに優れているようです。
腸内分泌細胞はまばらですが、腸管内腔の内容物を監視し、その情報を体の他の部分に伝えるという重要な役割を担っています。
76
これらの細胞がどの程度神経細胞的であるかは、まだ明らかになりつつあるところです。
115
,
116
スクリーニングに用いたelav-Gal4ドライバーは、一般的な神経細胞用ドライバーであるが、腸内分泌細胞でも発現しており、細胞タイプの類似性によるものと推定される。こうして、覚醒度を調節する部位として腸がセレンディピティ的に特定されたのです。腸内分泌細胞は、神経細胞と直接シナプスすることができる
116
またはペプチドを分泌する。
76
ペプチドは、古典的な神経伝達物質と比較して作用様式が緩やかであるため、睡眠などの長時間の状態を調節するのに適しているのかもしれない。
54
CCHa1の受容体は保存されています、
28
とその哺乳類ホモログはかゆみ感覚を制御している、
29
機械的感覚処理の一種である
同じペプチドが睡眠の多面的な制御を行う
CCHa1は、睡眠のさまざまな側面（潜伏時間）を制御していることが明らかになった、
28
量、深さ）であるが、我々のデータは、これらの機能がペプチドの異なる細胞起源にマッピングされていることを示している。腸で作られるCCHa1は覚醒を制御し、本研究の焦点となったが、神経系で作られるCCHa1は睡眠潜時を制御する
28
と睡眠量（覚醒度への影響は、睡眠量への影響よりもはるかに強いことに留意されたい）。睡眠調節の様々な要素を特定することは、最終的に特定の睡眠問題を対象とする治療法を生み出すために重要である。睡眠の様々な側面は連動しないが、今回示唆されたように、睡眠量と深さの調節経路が収束する脳内領域が存在すると考えられる。覚醒度は睡眠時だけでなく覚醒時にも変化し、CCHa1はこれらの状態にまたがって作用することができる。睡眠と覚醒の特異性は、ペプチドが異なるドーパミン作動性ニューロン集団に作用することによって達成される。睡眠中、ほとんどの感覚処理は減衰し、CCHa1シグナルは機械的刺激への反応を制御するが、熱への反応は制御しないことから、少なくとも部分的に独立したメカニズムによって行われることが、我々のデータから示唆される。動物にとって、異なる種類の環境情報は異なる意味を持つため、それぞれの反応性を個別に調整することができれば、生存の可能性が高まるかもしれません。このように、システム全体に見られるモジュール性は、覚醒状態のスペクトルを生成し、行動の柔軟性をもたらすと考えられる。
キノコの体内におけるドーパミン信号が覚醒度を制御する
私たちが説明する覚醒度調節の多くは、調節性ドーパミン作動性ニューロンに支配された複数のコンパートメントを持つ脳構造であるキノコ体で行われます。
78
フェリックス・デュジャルダンは1850年、昆虫に知能が発生する部位はキノコ体であると提唱した
117
は、より大きく複雑なキノコ体が、動物に「反射」ではなく「自由意志」とでもいうべきものを与えていることを発見した。キノコ体では大量の情報が受信されるが、他の脳部位に情報を伝えるニューロンはわずか34個である。
58
,
90
睡眠中のハエの感覚覚醒に関する最近の研究では、キノコ体が重要な調節部位であることも指摘されている
118
嗅覚の情報はγ5コンパートメントで受け取られ、機械感覚はγ3コンパートメントで受け取られるからである。ドパミン作動性ニューロンは、キノコ体の出力部位で調節的な影響を及ぼす、
78
,
97
睡眠量と深さを調節するメカニズムが集約されているようです。ドーパミンは、一見するとすべての神経系機能に関与しているように見えます、
119
シナプスと受容体の利用可能性を調節することで、必要性と状況に応じて舵取りをすることができます、
120
,
121
,
122
が、ドーパミンのシグナル自体がどのように制御されているかはあまり知られていない。私たちの研究は、腸からの直接的なシグナル伝達によってドーパミン作動性ニューロンの活性が制御されることを示しています。
本研究の制限事項
覚醒時の覚醒性を制御するドーパミン作動性ニューロンの亜集団は特定されておらず、力学的感覚情報が睡眠系にどのように伝達されるかは明らかにされていない。我々はCaLexAを用いて神経細胞や腸内分泌細胞の活性を報告したが、このツールは転写に依存する間接的な測定であることを認めるものである。我々の研究では、異なる濃度の異なる多量栄養素を食品に補充し、タンパク質の補充のみが覚醒度を変化させたが、他の多量栄養素の供給源、他の濃度が有効である可能性を排除することはできない。マウスでもハエと同様にタンパク質強化食品が覚醒度を低下させるが、これが腸やCCHa1/CCHa1Rホモログからのシグナルによって制御されているのかどうかはわからない。
閉会の辞
本作品は、睡眠調節について考えるための最新のフレームワークを提供します。睡眠は全身を消費しますが、この状態を理解するためのほとんどの努力は、神経系に焦点を合わせています。ここで述べられている観察結果は、他の新たな発見と共に
123
,
124
,
125
は、生物学の最大の謎を解くためには、神経系だけでなく他の臓器も考慮したより統合的なアプローチが必要であると主張しています。消化器系と神経系が正常な生理や病気において決定的に結びついているという、何世紀にもわたる考え方
126
は、特に注意が必要なようです。
STAR★メソッド
キーリソース表
REAGENT or RESOURCEIDENTIFIERRAntibodiesrabbit anti-CCHa1This studyN/Amouse anti-BruchpilotDHSB (Developmental Studies Hybridoma Bank)Cat# nc82; RRID: AB_2314866chicken anti-GFPAvesCat# GFP-1020; RRID: AB_10000240mouse anti-prosperoDSHBCat# pros; RRID. AB 528440mouse anti-tyrosine hydroxylaseImmunoStarCat# 22941; RRID: AB 572268Rabbit anti-β-galactosidaseMP BiomedicalsCat#56033 LOT#06026Alexa Fluor 488 goat anti-chickenLife technologiesCat# A11039; RRID. AB 142924Alexa Fluor 488 goat anti-rabbitLife technologiesCat# A11034; RRID: AB_2576217Alexa Fluor 647 goat anti-rabbitLife technologiesCat# #A21244 ; RRID: AB 2535812Alexa Fluor 647 donkey anti-mouseLife technologiesCat# A31571; RRID. AB 162542Chemical、peptides、recombinant proteinsCoconut oilSpectrum essentialsCat# L215562P-006Propionic acidSigma-AldrichCat# P1386; CAS: 79-09-4Hexanoic acidSigma-AldrichCat# P21530; CAS 142-62-1GlucoseSigma-AldrichCat# 158968-1KG;CAS. 492-62-6FructoseSigma-AldrichCat# F0127; CAS:57-48-7GalactoseSigma-AldrichCat# G0750; CAS: 59-23-4PeptoneApexCat# 20-260Single amino acidsSigma-AldrichCat# LAA21-1KTFD&C Blue #1SpectrumCat # FD110; CAS. 3844-45-9Triton X-100AmrescoCat# M143; CAS: 9002-93-1PBS 10xSeraCareCat# 5460-0030Ethanol (pure)KopticCat# V1001; CAS: 64-17-5PFA (16%)Electron Microscopy SciencesCat# 15710; CAS: 30525-89-4BSAGeminiCat# 700-101P; CAS. 9048-46-8顕微鏡用スライドガラスElectron Microscopy SciencesCat# 63421-10顕微鏡用カバースリップElectron Microscopy SciencesCat# 72230-01Prolongゴールド抗フェードメディウムInvitrogenCat# 1942345TRIzolThermo fisherCat# 15596026iScript cDNA合成BioradCat# 1708890Sybr GreenBioradCat# 170- 8880重要なコマーシャルアッセイDirect-zol RNA MicroprepZymo ResearchCat# R2061DNAse Turbo DNA-free kitThermo fisherCat# AM1907実験モデル： 生物／株野生型iso31Kyunghee KohN/Aelav-Gal4Kyunghee KohN/AUAS-TrpA1Kyunghee KohN/AUAS-ShitsKyunghee KohN/Aelav-Gal4;UAS-Dcr2N/APAM-Gal4BDSC (Bloomington Drosophila Stock Center)RRID.Nicholas Stavropoulosからのギフト： BDSC_41347UAS-CCHa1-RNAiBDSCRRID: BDSC_57562UAS-CCHa1-RNAi #2VDRC (Vienna Drosophila Recourse Center)RRID:SCR_013805 #104074UAS -CCHa1R-RNAiBDSCRRID: BDSC_51168UAS-CCHa1R-RNAi #2VDRCRRID :SCR_013805 #103055UAS -GFP-RNAiBDSCRRID. BDSC_41552UAS-DopR1-RNAiBDSCRRID：BDSC_31765UAS-DopR2-RNAiBDSCRRID：BDSC_65997UAS-D2R-RNAiBDSCRRID：BDSC_36824UAS-DopEcR-RNAiBDSCRRID．BDSC_31981Tdc2-Gal4BDSCRRID: BDSC_9313vGlut-Gal4BDSCRRID: BDSC_26160PAMMB441BBDSCRRID: BDSC_68251MBONMB083CBDSCRRID: BDSC_68287CaLexABDSCRRID: BDSC_66542UAS-nlsGFPBDSCRRID: BDSC_4776UAS-TH-RNAiBDSCRRID: BDSC_25796UAS-Dcr2BDSCRRID. BDSC_24650CCHa1 mutant Mi{MIC}CCHa1MI09190BDSCRRID：BDSC_51261CCHa1R mutant Mi{MIC}CCHa1RMI08118BDSCRRID：BDSC_44750TI{2A-GAL4}CCHa1-R[2A-GAL4]BDSCRRID. BDSC_84601P{GMR23H07-GAL4}attP2BDSCRRID: BDSC_47498UAS-CD8GFPGift from Michael CrickmoreN/AUAS-nlsLacZGift from Michael CrickmoreN/ATH-Gal4Gift from Michael CrickmoreN/Addc-Gal4Gift from Michael CrickmoreN/ACha-Gal4Gift from Michael CrickmoreN/ATim-Gal4Gift from Michael YoungN/ATH-. D4-Gal4Gift from Michael CrickmoreN/Apros-Gal4Gift from Norbert PerrimonN/ACBA/CaJ mouseJackson LaboratoriesJAX 000654OligonucleotidesCCHa1 (F-ACTGACGTCGGACAATTTGC and R-ACGAATGTCCGTATTCCA)ID TechnologiesCustom madeCCHa1R (F-) GTTCCAAACCTACATTTTATCACおよびR-CGGATAATGCAGTCAGCGTA）ID TechnologiesCustom madeCCHa2（F-AAACAGCAACAGCAGCAAAC およびR- AGGACCACGTGCAGATAAC）ID TechnologiesCustom madeCCHa2R（F-CATACCCAACATACTCTTTC およびR- GAAAGGCGTCAGTGTAAA）IDテクノロジーカスタムmaderp49（F-A ATCGGTTACGATCGAACAA and R-GACAATCTCCTTGCGCTTCT)ID Technologiesカスタムメイドソフトウェアとアルゴリズム睡眠記録ショウジョウバエTriKineticsN/AArousal threshold stimulation delivery Drosophilas本研究N/ASleep analysis DrosophilaVaccaro et al.
123
N/AArousal閾値解析ショウジョウバエ本研究N/AS睡眠記録マウスPinnacle Technology Inc9000-K5-S; 8200-K1-iSLS 睡眠スコアリングマウスPinnacle Technology IncSirenia Sleep Pro
新しいタブでテーブルを開く
リソースの確保
リードコンタクト
さらに詳しい情報、リソースや試薬のリクエストは、リードコンタクトのDragana Rogulja (dragana_rogulja@hms.harvard.edu)までお願いします。
材料の入手方法
本試験で作製された抗体は、ご要望に応じてご提供いたします。
実験モデルおよび被験者の詳細
フライズ
ハエは、特に指示がない限り、25℃で12時間明期：12時間暗期サイクルで生育させた。実験は、Percival Scientific Inc.のインキュベーター（DR36VLモデル）で行った。ハエは、コーンミール-寒天培地で飼育した。
123
簡単に説明すると、私たちの通常の餌は、（重量（g）／容量（100ml）の割合で測定）1.57％（wt/vol）の寒天（Spectrum）、2.72％（wt/vol）の酵母（MP Biomedicals）、11.96％（wt/vol）の砂糖（Domino）および5.14％（wt/vol）のコーンミル（Bunge）、を含む。原料を攪拌しながら温度が97℃になるまで加熱した。溶液の温度が75℃まで下がった後、2.5% Tegosept、23.8 g/L Ethanol (Koptic #V1001 ) 、および蒸発を補うための水を加えた。
本研究で使用した全てのショウジョウバエのストックは、主要リソース表に記載されている。行動実験に使用した全てのストックは、少なくとも5回、アイソジニアス（iso31）遺伝的バックグラウンドにアウトクロスされたものである。UAS-CCHa1-RNAi（BDSC #57562 ）および UAS-CCHa1R-RNAi（BDSC #51168 ）の場合、同じライブラリからの UAS-GFP-RNAi をコントロールとして使用した（BDSC #41552 ）. CCHa1Rに対する2つのRNAisは、重複しないコーディング配列をターゲットとしています： VDRC #103055はヌクレオチド16 -333を、BDSC #51168はヌクレオチド375 -397をターゲットとする。CCHa1に使用されるRNAは、部分的に重複するコード配列をターゲットとしています： VDRC #104974KKはヌクレオチド241 -539を、BDSC #57562はヌクレオチド525 -547をターゲットにしています。全てのGal4/UAS実験では、ヘテロ接合体のコントロールが使用された（UASはGal4遺伝的背景と交配し、Gal4はUAS遺伝的背景と交配）。
マウス
2ヶ月齢の雄性CBA/CaJ（JAX 000654）マウスは、連邦政府のガイドラインに従い、ハーバード大学動物飼育常任委員会が承認した標準プロトコルに従って飼育された。動物施設に到着後、マウスは病原体を含まないケージ（最大5匹/ケージ）に入れられ、23℃、湿度50％の環境で12時間の明暗サイクルで飼育された。餌と水は自由に摂取させた。
メソッドの詳細
フライズ
覚醒閾値スクリーン
遺伝子スクリーニングには、京都ストックセンター、ウィーンショウジョウバエリソースセンター、トランスジェニックRNAiプロジェクト（TRiP）（ブルーミントンショウジョウバエストックセンターで入手可能、Norbert Perrimonの研究所から惜しみなく提供された）のランダムRNAi株を使用した。さらに、神経ペプチド、神経伝達物質、睡眠量の表現型に関連する、我々の研究室ですでに使用されているRNAi株もスクリーニングした。すべてのRNAi株をelav-Gal4を発現するハエと交配した。3-5日齢の雄8匹を、以下に述べるシステムで試験した。すべてのグラフにおいて、各ドットは8匹のハエの平均的な行動を表している。つまり、覚醒度（睡眠時または覚醒時のいずれか）を計算するためには、8匹のハエのデータを含める。ハエは、1日目の夜に低振幅の刺激（0.2V）を、2日目の夜に高振幅の刺激（2V）を与えた。
スクリーン結果の解析
スクリーンからのヒットを識別するために、覚醒度値は遺伝子型間で平均化された（弱い振動と強い振動で別々に）。高覚醒性ヒットとは、表現型が平均値から2標準偏差を超えるものである（弱い振動を使用した場合）。低誘発性ヒットとは、表現型が平均値から2標準偏差を超えるもの（強い振動を使用した場合）である。破壊によって低覚醒性または高覚醒性の表現型が生じた遺伝子について、遺伝子オントロジー（GO）解析を実施した。GO Term Mapper (https://go.princeton.edu/cgi-bin/GOTermMapper) を用いて、個々のGOカテゴリーをより一般的な用語にビニングした。異なる GO 用語を正規化するために、ゲノムにおける表現（すなわち、その用語がその生物のすべての遺伝子に出現する頻度）を考慮した。各GO用語について、その用語を含むヒットの割合を、その用語を含む全ゲノム中の遺伝子の割合に正規化した。データはlog10スケールで表現されている。
運動量と睡眠のモニタリング
運動活性は、Drosophila Activity Monitoring System (DAM3, TriKinetics, Waltham, MA)を用いて記録した。ハエは、特に指示がない限り、長さ65mmのガラス管（TriKinetics, Waltham, MA）に、約40mmのコーンミール-寒天食品を入れた状態で個々に収容された。このため、ハエが前後に歩くためのスペースが約25 mm残っていた。赤外光はこの空間を2等分し、ハエが通り抜けると遮られるようになっており、これは自動的に移動とみなされる。睡眠は5分間の活動停止と定義した。
42
,
43
睡眠の定量化は、カスタムMATLAB（The MathWorks, Natick, MA）ソフトウェア（GitHubのhttps://github.com/CrickmoreRoguljaLabs/SleepAnalysis）で実施した。
機械的振動による覚醒閾値のプロービングのためのセットアップ
DAMは、大型低音ラウドスピーカー（381mm、Delta 15 LFA、Eminence、Eminence、KY）の上に設置された特注のプラットフォームに取り付けられた。各スピーカー/プラットフォームには、最大8個のDAMが搭載されている。ハエを刺激するために、MATLABで書かれたカスタムプログラム（Good Morning、GitHubでhttps://github.com/IrisTitos/Atanalysis/blob/master/Goodmorning.md）が、多機能デバイス（USB-6211、National Instruments、Austin、TX）を使ってマルチサイン信号（40 Hz - 200 Hz）を生成します。この信号は、スピーカーに接続されたアンプ（SLA-1, Applied Research, and Technology, Rochester, NY）に供給される。応答の周波数特異性を避けるために、さまざまな周波数が使用された。このセットアップでは、スピーカーの機械的な振動が、DAMを搭載したプラットフォームの上下の動きに変換されます。加速度計（ADXL335、Analog Devices、Norwood、MA）は、すべてのモニターで振動が均一になるように、プラットフォーム上の異なる位置で、個々のDAMの動きを測定します。実験では、消灯から1.5時間後（夜間（暗期）10時間）から、30～40分ごとにランダムな間隔で2秒間の振動を与えた。データは、DAMの運動データとともにMATLABで処理した（GitHubのhttps://github.com/IrisTitos/Atanalysis/blob/master/ReadDamsPullDown, https://github.com/ArousalThreshold/Software で公開）。
睡眠からの覚醒度のスコアリング
睡眠からの覚醒度を計算する際には、刺激を与えたときに眠っていた（5分以上運動していない）ハエのみを考慮した。振動発生から3分以内に運動活性が誘発された場合、そのハエは刺激によって目覚めたとみなされた。睡眠構造（バウト数および／またはバウト長）に影響を与える遺伝子操作において、自然覚醒の可能性が高まることを抑制するため、自然覚醒について正規化した：刺激によって目覚めたハエの割合＝100＊（目覚めたハエの合計％-自然覚醒％）／（100-自然覚醒％）．自発的覚醒の算出には、同じ夜、同じハエの活動データを用いて、「目覚めるハエ合計%」を算出した。正規化すると、刺激後の覚醒よりも自然覚醒の方が頻度が高い場合、パーセンテージ値がマイナスになることがあります。これは弱い振動でよく見られ、偶然の結果であると思われます。刺激時刻を刺激前10分ずつずらしたタイムスタンプファイルを修正し、自発的覚醒を算出した。修正後のタイムスタンプで眠っていたハエのみを解析対象とし、修正後のタイムスタンプから3分以内に運動活性を示したハエを覚醒とみなした。
覚醒期間中の覚醒度のスコアリング
覚醒時の覚醒度を算出する際には、刺激を与えたときに覚醒していた（すなわち、刺激前5分間に活動を示した）ハエのみを考慮した。これらのハエについて、刺激前3分間の平均活動量と刺激後3分間の平均活動量を計算した。刺激前の平均活動量よりも刺激後の平均活動量の方が高い場合、ハエは刺激に反応していると判断した。
温度による覚醒閾値のプロービングの設定
温度による覚醒性を調べるために、ハエの入ったチューブを水平に寝かせた平型マルチビーム活動モニター（DAM5M、TriKinetics、Waltham、MA）を使用した。PID温度コントローラ（Omega CN 7800, Norwalk, CT）で制御されたヒーティングパッド（McMaster-Carr 35765K469, Elmhurst, IL）がモニター表面を覆っています。MATLABカスタムメイドソフトウェア（https://github.com/ArousalThreshold/Temperature）が、夜間にランダムな間隔（30～40分）で、加熱パッドをオンにして、温度を40℃に2分間上昇させる（特に指示がない場合）。機械的なセットアップについて説明したのと同じプロトコルを使用して、熱で目覚めたハエの割合を算出した。
摂食実験
3～5日齢の雄バエを、特に断りのない限り、点灯後約10時間（すなわち、12時間明：12時間暗サイクルのZT10）で通常の餌から異なる餌条件へ移した。24時間後、解剖または行動検査を行った。
コーンミール-寒天食品を溶かし、これらの最終濃度になるように異なる成分を添加した： 10％のココナッツオイル、1％のプロピオン酸（図3H、S3A、およびS3D）、0.5％のプロピオン酸（図S3E）、0. 5％ヘキサン酸、200mMグルコース（図3C、3H、S3D）、566mMグルコース（図S3E、グルコース40kcal）、377mMグルコース（図S3E、2/3グルコース）、189mMグルコース（図S3E、1/3グルコース）、200mM果糖、200mMガラクトース、10%ペプトン、3. 3%ペプトン（図S3E、1/3ペプトン）、6.7%ペプトン（図S3E、2/3ペプトン）、または単一アミノ酸のそれぞれについてペプトンと同じ濃度にした。なお、補食に液体が添加されていることをコントロールするため、コントロールに使用した通常食に同量の水を添加した。
食物摂取量の測定
3～5日齢の雄バエを通常の餌から、2%(wt/vol)のFD&C Blue #1 (Spectrum #FD110 )を含む通常の餌、または同じ濃度のFD&C Blue #1を含むペプトンを補充した通常の餌に移した 。24時間後、ハエを-20℃で凍結した。凍結したハエを断頭し（眼の色素が測定に干渉するのを避けるため）、1% Triton X-100 (Amresco #M143 ) 1X-PBS (Phosphate Buffered Saline 10X SeraCare #5460 -0030) 50μlを含むEppendorfチューブに5グループ分注し、電動乳棒（Argos #9950 -901）で均質化しました。サンプルを遠心分離し、上清をNanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific)で660nm（A660）で測定した。青色色素の連続希釈液を用いて標準曲線を作成し、その曲線からサンプルの色素濃度を外挿した。
フードクリアランスアッセイ
ハエにタンパク質の多い餌を与えたとき、あるいはCCHa1やその受容体をノックダウンしたときに、食物の消化が変化するかどうかを評価するために、食物排泄アッセイを実施した。簡単に説明すると、ハエに青色色素を含む餌を24時間与えた後、寒天のみを入れたバイアルに6時間移し、その後、-20℃で凍結した。食餌摂取量測定と同じプロトコルで、腹部に存在する残りの青色色素濃度を定量化した。
免疫組織化学
雄成虫を二酸化炭素で麻酔し、70％エタノール（Koptic #V1001 ）で短時間洗浄した後、1X-PBS（Phosphate Buffered Saline 10X SeraCare #5460 -0030）中で解剖した。腸は4%パラホルムアルデヒド(PFA, Electron Microscopy Sciences #15710 )を含むPBS中で4℃にて一晩固定した。解剖した脳と腹部神経系を4%PFAで30分間室温で固定した。組織を0.2%Triton X-100 (Amresco #M143 )を含む1X-PBSで20分間3回洗浄し、1X PBS, 0.2%Triton X-100, 2% bovine serum albumin (BSA Gemini #700 -101P) で2時間室温でブロッキングしました。サンプルは、1X PBS、0.2%Triton X-100、2%BSA中、4℃で一次抗体と一晩（Bruchpilot（Brp）抗体を含む場合を除き、その場合サンプルは約48時間インキュベートされた）、指示した希釈率で培養した。組織を1X-PBS、0.2% Triton X-100で20分間3回洗浄し、次に二次抗体とブロッキング液中、室温で2時間、指示した希釈度でインキュベートした（ただし、ブルックプロットが染色に含まれる場合は、4℃で約48時間インキュベートされた）。その後、サンプルを1X-PBS、0.2% Triton X-100で20分間3回洗浄し、Prolong Gold Antifade medium (Invitrogen #1942345 ) でスライドガラスとカバーリップ (Electron Microscopy Sciences #72230 -01 and 64321-10) の間にマウントしました。
ウサギの抗CCHa1抗体は、ペプチドQIDADNENYSGYELTに対して上昇した
49
をGenscript社でアフィニティ精製した。
使用した一次抗体：マウス抗Bruchpilot（1：7、DSHB nc82）、ウサギ抗CCHa1（1：50）、チキン抗GFP（1：1000、Aves #GFP -1020）、マウス抗prospero（1：50、DSHB pros）およびマウス抗チロシンヒドロキシラーゼ（TH）（1：1000 ImmunoStar #22941 ）、ウサギ抗βガラクトシダーゼ（1：1000 MP Biomedicals #56033 ）。
使用した二次抗体 Alexa Fluor 488 goat anti-chicken (1:1000 Life technologies #A11039 ), Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit (1:1000 Life technologies #A11034 ), Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit (1:1000 Life technologies #A21244 ) Alexa Fluor 647 donkey anti-mouse (1:1000 Life technologies #A31571 ).
蛍光顕微鏡観察
蛍光画像は、Leica SP8共焦点顕微鏡で取得した。すべての撮影条件は各実験で一定であり、Zスタック開始と終了の設定のみ各サンプルで個別に調整した。Zスタック間の平均距離は100ミクロンであった。
画像の定量化
すべての画像はブラインドで採点した。
CCHa1レベルおよびCaLexA実験に関する腸の定量化
CCHa1およびGFPシグナルの定量化は、Fijiを使用して行った。すべての画像について、腸全体のZスタックサムネーション投影を取得した。腸内のCCHa1抗体染色を定量化するために、CCHa1シグナルを使用して関心領域（ROI）を定義した。そのROIの平均画素強度と面積を測定した。ROIに隣接する同様の面積を持つ領域を選択し、平均背景画素強度を測定した。CCHa1シグナルからバックグラウンドを差し引き、CCHa1 ROI面積を乗じることで、CCHa1の量を定量化した。
図3C〜3F、およびS3Aについては、腸内のCCHa1シグナルを常食に正規化した。そのために、個々の実験ごとに、通常の餌にさらされたハエのすべての腸内のCCHa1シグナルの平均を計算した。そして、その平均値を用いて、すべての実験値を分割した。
図3CおよびS3Aについては、CaLexA依存性GFPレベルに基づいて、腸内の活性化CCHa1細胞の割合を算出した。まず、Fijiの「counter」機能を用いて、後中腸にCCHa1発現細胞が何個存在するかを定量化した。次に、それらの細胞のうち、何個がGFPシグナルも持っているかをカウントした。活性化されたCCHa1細胞の％を決定するために、数式を使用しました： (CCHa1およびGFP陽性細胞/全CCHa1陽性細胞)∗100.
CaLexA実験のための脳内定量化
図6B、6C、7C、S6C、S6DのGFP強度を定量化するために、目的の細胞を含むZスタックの総和を投影した。各細胞を手動で選択し、GFP信号の平均画素強度を定量化した。対象細胞の隣にある、GFP陽性細胞を含まない領域をバックグラウンド信号の測定に使用した。GFPシグナルを算出するために、以下の式を用いた： (細胞からのGFP平均画素強度-GFPバックグラウンド平均画素強度）。
定量的RT-PCR
各条件について、3-5日齢の雄のハエ全体2匹、脳5匹、または内臓10匹のいずれかを解剖し、直ちに氷冷したTRIzol（Thermo fisher #15596026 ）の100μlに一つずつ移し、ドライアイス上で瞬間冷凍し、-80℃で保存した。RNAを抽出するために、サンプルを氷上で20秒間乳棒（Argos #9950 -901）でホモジナイズしてから、200μlのTRIzolと60μlのクロロホルムを加える。次に、サンプルを15000rpmで15分間、4℃で遠心分離した。上清を回収し、等量のエタノール99％（Koptec #V1001 ）で希釈して混合し、精製カラム（Zymo kit Direct-zol R2061）へ移した。RNA精製とその後のDNAse処理については、製造元の指示に従った（DNAse Turbo DNA-free kit AM1907）。RNAはNanoDropを使用して定量した。500ngのRNAを逆転写酵素反応に使用した（Biorad iScript cDNA Synthesis #1708890 ）．DNA生成物を1:10に希釈し、Sybr Green (Biorad #170 -8880) を用いた定量PCR反応の設定に使用した。プライマーはID Technologies社から入手した：
CCHa1（F-ACTGACGTCGGACAATTTGCおよびR-ACACGAATGTCCGTATTCCA）。
25
CCHa1R（F-GTTCCAAACACCTACATTTTATCAC および R-CGGATAATGCAGTCAGCGTA)
25
CCHa2（F-AAACAGCAACAGCAGCAAACおよびR-AGGACCACGTGCAGATAAC）。
25
CCHa2R（F-CATACCCAACATACATTCTTTC および R- GAAAGGGCGGTCAGTGTAAA)
25
rp49（F-ATCGGTTACGGATCGAACAAおよびR-GACAATCTCCTTGCGCTTCT）
条件付き実験
Gal80の温度感受性対立遺伝子を用いて、CCHa1またはその受容体の成体特異的なノックダウンを実現した、
127
Gal4阻害剤（Gal80ts）とelav-Gal4またはpros-Gal4のいずれかを組み合わせた。Gal80tsが安定でGal4機能を阻害する温度である21℃でハエを飼育した。孵化の2日後、温度はGal80tsが分解され、Gal4ドライバーが機能する温度である29℃に上げられた。
TrpA1およびshitsの実験では、ハエはTrpA1およびshitsが活性化しない温度である21 °Cで飼育した。ハエは行動解析のために27℃に移された。図2CとS2Iでは、Gal4-UASシステムは温度に依存するため（Gal4発現は高温で高くなる）、CCHa1-RNAi発現を確実にするために、実験は25℃以上で行う必要があった。TrpA1は25℃を超える26℃という低い温度でも活性があることが報告されているためです、
24
しかし、25℃でTrpA1の活性化が起こるという可能性を完全に否定することはできない。
マウス
食品・ダイエット
動物施設に到着後、マウスには標準的なPico Lab Rodent Diet 20 # 5053を与えた。手術後、ベースライン睡眠記録の5日前に、その食餌を「標準食」（#D11112201、Research Diets, Inc.）、または「タンパク質強化食」（#D1311070、Research Diets, Inc.）のいずれかに変更した。レシピは1071.05gの食品を基準に算出しています。標準的な食事は、次のように構成されています： カゼイン200g、L-シスチン3g、コーンスターチ381g、マルトデキストリン10 110g、デキストロース150g、セルロースBW200 75g、イヌリン25g、大豆油70g、ミネラルミックスS10026 10g、第2リン酸カルシウム13g、5． 5 g炭酸カルシウム、16.5 gクエン酸カリウム、10 gビタミンミックスV10001、2 gコリンビタートレート、0.025 g黄色色素#5 FD&C、0.025 g青色色素#1 FD&C。タンパク質強化食は、次のように構成されています： カゼイン600g、L-シスチン9g、コーンスターチ50g、マルトデキストリン10 35g、デキストロース150g、セルロースBW200 75g、イヌリン25g、大豆油70g、ミネラルミックスS10026 10g、リン酸二カルシウム13g、炭酸カルシウム5.5g、クエン酸カリウム 16.5g 10gビタミンミックスV10001、コリンビタレート 2g、レッドダイ#40FD&C 0.05g。糖質強化食品は、次のように構成されている： カゼイン200g、L-シスチン3g、マルトデキストリン10 41g、スクロース600g、セルロースBW200 75g、イヌリン25g、大豆油70g、ミネラルミックスS10026 10g、リン酸二カルシウム13g、炭酸カルシウム5.5g、クエン酸カリウム16.5g、ビタミンミックスV10001 10g、コリンビタレート2g、レッドダイ#40FD&C 0.04g およびブルーダイ#1 FD&C0.01g 。脂肪強化食品は、次のように構成されている： カゼイン200g、L-シスチン3g、マルトデキストリン10 41g、デキストロース150g、セルロースBW200 75g、イヌリン25g、大豆油25g、ココナッツオイル245g、ミネラルミックスS10026 10g、リン酸二カリウム13g、5． 5 g炭酸カルシウム、16.5 gクエン酸カリウム、10 gビタミンミックスV10001、2 gコリンビタートレート、0.01 g黄色色素#5 FD&C、0.04 g赤色素#40 FD&C。すべての種類の食事において、1071.05gの食品は4084kcalを含んでいた。動物は試験終了まで、それぞれの飼料を摂取した。マウスは、飼料変更開始から試験終了まで、毎日体重を測定した。
睡眠モニタリング
睡眠をモニターするため、3チャンネルのテザー式EEG/EMGシステム（Pinnacle Technology 8200-K1-iSL）を備えた円形ケージ（Pinnacle Technology 9000-K5-S）に雄1匹を入れた。ヘッドマウントプリアンプ（Pinnacle Technology 8201-SS）は外科的に植え込まれた。脳波／筋電図（EEG/EMG）については、マウスをイソフルランで麻酔し、手術用の定位装置（Kopf社製）に装着した。頭部を剃毛し、ブレグマの前方約3.5mmから1.5cmの吻側-尾側の切開を行い、EEG/EMGヘッドマウントをLoctite 404 Instant Adhesive（Fisher Scientific #NC0619400 ）で乾いた頭蓋骨の表面上に接着させました。海馬および皮質脳波記録用に、ヘッドマウントの対応する穴にネジ（Pinnacle Technology 8209, 8212）を頭蓋骨に穿孔した。EMGワイヤーを挿入するために、胸筋に小さなポケットが作られた。EEG/EMGリードを保護し絶縁するために、C&B Metabond Adhesive Luting Cement (Parkell)をヘッドマウントに適用した。ヘッドマウント周囲の皮膚を縫合し、マウスを1週間回復させ、翌週中に行動テストを行った。移植したマウスを睡眠記録室（Pinnacle Technology 9000-K5-S）の3チャンネルEEG/EMGシステムに繋ぎ、ベースライン睡眠記録の前に2日間馴化させるようにした。記録は48時間にわたって取得された。
睡眠スコアリング
睡眠記録は、睡眠分析ソフトウェアSirenia Sleep Pro（Pinnacle Technology）を用いて、48時間にわたり10秒のエポックでスコア化した。ノンレム脳波エポックは、低周波（0.5～4Hzの範囲）、高振幅（±150～250μV）のデルタ波と低振幅のEMG波として採点された。レム脳波エポックは、シータ波（5.5-8.5Hz範囲）、低振幅（±50-100μV）、平坦なEMG波を主とした混合周波数が含まれていた。ウェイクエポックは、高周波数（8-50Hz）、低振幅（±50-100μV）の脳波と高振幅のEMGとしてスコア化した。自動採点されたエポックは、各エポックがノンレム、レム、ウェイクの定義に従って採点されていることを確認するために視覚的に検査され、設定されたルールで採点されなかったエポックは手動で採点されました。運動アーチファクトを含むエポックは削除された。
標準食とタンパク質強化食を与えたマウスの24時間睡眠関連行動パターンをよりよく比較するために、Sirenia Sleep Proソフトウェアを使用して、ベースライン記録中（機械刺激前）に、覚醒および睡眠（ノンレム、レム）段階に費やした時間の時間平均値、ならびに覚醒および睡眠（ノンレム、レム）発作の長さと回数を計算しました（図S4D）。同様に、24時間平均および時間毎（24時間中の各時間の平均）のデルタ（0.5-4Hz）およびシータパワー（5.5-8.5Hz）は、標準およびタンパク質強化食を与えたマウスのSirenia Sleep Proを使用して、ベースライン記録中に計算した（図S4EおよびS4F）。パワー分析は高速フーリエ変換アルゴリズムに基づいており、EEGパワーは信号の特定の周波数帯における活動量を表しています。
128
ベースラインの日次および時間単位のグラフは、48時間の記録の平均を示します。波のパワースペクトルは、信号の周波数コンテンツまたは周波数に対する信号パワーの分布を反映しています。
129
波動パワーの表現には、記録装置に存在するEEG1チャンネルとEEG2チャンネルのデータを平均化した。
覚醒閾値の測定
マウスの覚醒度を調べるために、加振器（VWR VS-2500）を台車に乗せた機械装置を使用しました。加振器による振動（低強度の加速度計データ： X=0.029, Y=0.066, Z=-0.987; High intensity. X=0.176、Y=0.32、Z=-0.878）の振動は、睡眠記録室を乗せたカートの横移動に変換される。加振器は、明期（マウスが最も眠る時期である）の2日間連続で、50～70分を中心としたランダムな間隔で15秒の刺激を、最大11時間与えるようにプログラムされた。脳波/EMG記録（詳細は「睡眠スコアリング」を参照）を用いて覚醒と睡眠をスコア化した。行動の変化はビデオ録画で確認した。少なくとも5分間の睡眠が先行した刺激のみが考慮された。各マウスについて、機械的刺激後5分以内に睡眠から覚醒に移行した事象の数として覚醒度を定量化した。自発的な覚醒の違いについてデータを正規化するため、各刺激の20分前に、個々のマウスの無秩序な行動を分析した。その時点で、動物が自発的に睡眠から覚醒に移行した事象の割合を定量化した。刺激による覚醒の割合はハエと同様に計算したが、この場合は個々の動物について次のように計算した：刺激による覚醒割合＝100＊（個々の動物が目覚めるイベントの合計％-動物の自発的覚醒割合）／（100-動物の自発的覚醒割合）.
定量化および統計解析
統計解析は、GraphPad Prism software 7 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA)を用いて実施した。スクリーン（図1A）、図3E-Fおよび5Aを除き、すべての実験は少なくとも3回独立して行われた。データは正規性を検定し、すべての統計検定は両側であった。すべての図において、＊p<0.05、＊＊p<0.01、＊＊＊p<0.001。実験条件／遺伝子型がすべてのコントロールと異なる場合のみ、統計的検定を図に示した。
グラフデータは、平均値±SEMで示した。サンプルサイズ、テスト、p値については、表S3を参照されたい。
データおよびコードの利用可能性
データは対応する著者からリクエストに応じて入手可能です。睡眠解析 (https://github.com/CrickmoreRoguljaLabs/SleepAnalysis), 刺激生成 (https://github.com/IrisTitos/ATanalysis/blob/master/Goodmorning.md), 刺激解析 (https://github.com/IrisTitos/ATanalysis/blob/master/ReadDamsPullDown, https://github.com/ArousalThreshold/Software) のコードはGitHubで公開されています。
謝辞
原稿に対するアドバイスやコメントをいただいた当研究室とMichael Crickmoreの研究室に感謝します。Benjamin Sanchezは、機械的刺激の制御と行動反応性の分析に使用したソフトウェアを開発しました。Alexa Soaresはスクリーンをアシストしてくれた。Alejandra Laureanoはマウス実験に協力した。ハエの株については、Michael Crickmore、Nicholas Stavropoulos、Kyunghee Koh、およびNorbert Perrimonに感謝する。Pedro Saavedraには、定量的RT-PCRを手伝ってもらった。スケマティックはBioRender.comの助けを借りて作成した。I.T.はMahoney and Brooks postdoctoral fellowshipの支援を受けている。D.R.は、New York Stem Cell - Robertson investigatorである。この研究は、New York Stem Cell Foundation、NIH (DP2 OD022385) 、Pew Scholars Program in the Biomedical Sciencesから支援された。
著者の貢献
I.T.とD.R.は、本研究を発案し開始した。O.M.とP.G.は、覚醒閾値設定装置の設計と製作に協力した。I.T.、A.J.、K.N.、A.V.、D.R.は実験の設計とデータの分析を行った。I.T.、A.J.、K.N.、A.V.は実験を実施した。I.T.とD.R.は、他の著者の意見を取り入れながら原稿を執筆した。
利害関係の宣言
著者は利益相反がないことを宣言している。
補足情報
ダウンロード.pdf (.09 MB)
pdfファイルに関するヘルプ
表S1および表S2
図1に関連する、elav-Gal4でノックダウンした際に低覚醒または高覚醒の表現型を示すスクリーンからの遺伝子のリスト；および図1に関連する、elav-Gal4でノックダウンした際に低覚醒または高覚醒の表現型を示すスクリーンからの遺伝子（表S1に示す）の生物過程および分子機能についての遺伝子オントロジー解析。
ダウンロード .xlsx (.1 MB)
xlsxファイルに関するヘルプ
表S3. 図1、2、3、4、5、6、7およびS1〜S7に関連するサンプルサイズと統計解析結果
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掲載されました： 2023年3月22日
受理されました： 2023年2月16日
改訂版として受理された： 2022年8月26日
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図S1図1に関連するCCHa1およびCCHa1R変異体およびRNAi株の実験セットアップと解析結果
図1CCHa1とその受容体は睡眠からの覚醒を抑制する
図2CCHa1ペプチドの腸からのシグナルで覚醒度を抑制する
図S2腸内で産生されるCCHa1は覚醒度を調節するが、睡眠量は調節しない、図2に関連した図
図3CCHa1発現腸内分泌細胞は食事性タンパク質で活性化し、深い眠りを促す
図S3図3に関連する、CCHa1レベルに対する異なる栄養素のエフェクト
図S4マウスの体重は食事条件によって差がない；睡眠段階のパターンとアーキテクチャ、デルタ波とシータ波のパワー、図4に関連する
図4食事性タンパク質によるマウスの睡眠からの覚醒抑制効果
図5CCHa1が脳内ドーパミンニューロンを介して覚醒度を調節している様子
図S5CCHa1受容体（PAMMB441Bニューロン）が覚醒度を制御する、図5関連
図6ドーパミン活性は食物タンパク質とCCHa1の影響を受ける；異なる感覚モダリティは独立してゲートされうる
図6 PAMニューロンにおけるCCHa1受容体が食餌性タンパク質に応答する覚醒度を制御し、温度上昇に応答する覚醒度を測定する設定（図6と関連する
図7キノコ体の出力ニューロンが覚醒度を調節する様子
図S7MBONMB083Cニューロンを介した睡眠・覚醒度調節の関連図
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