全身性エリテマトーデスにおける強力なインターフェロン産生能を有する腸内ビロームの乱れ

2023年1月26日 17:02

論文
全身性エリテマトーデスにおける強力なインターフェロン産生能を有する腸内ビロームの乱れ
著者リンクオーバーレイパネルを開くBeidiChenab1XuanZhanga
https://doi.org/10.1016/j.scib.2023.01.021
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要旨
全身性エリテマトーデス（SLE）の病因に腸内細菌叢の乱れが重要な役割を果たすことを示唆する証拠が蓄積されているが、腸内細菌叢については依然として不明である。本研究では、無治療のSLE患者76名と健常対照者75名から分離した糞便中のウイルス様粒子（VLP）を対象に、腸内ビロームのプロファイリングを行った。SLEの腸内ではバクテリオファージの割合が有意に上昇し、変化したウイルス分類群は臨床パラメータと相関していた。SLE患者では、腸内ビロームとバクテリオームが互いに密接に関連していた。腸内ウイルスと腸内細菌のマーカーを組み合わせることで、SLE患者と健常対照者をよりよく識別することができた。さらに、非処置のSLE患者のVLPは、上皮細胞株とヒト免疫細胞においてインターフェロンαの産生を促進しました。興味深いことに、治療後のSLE患者のVLPでは、インターフェロン刺激能が低下していた。今回の発見は、SLEの病態に新たな洞察を与える可能性がある。腸内細菌をさらに深く理解することで、SLE患者のためのバイオマーカーや治療法の開発につながるかもしれない。

図解抄録

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キーワード
全身性エリテマトーデス腸内ビロームウイルス様粒子インターフェロン-α

はじめに
全身性エリテマトーデス（SLE）は、異常な自己抗体産生と多臓器障害を特徴とする典型的な自己免疫疾患である[1]。現在、SLEには治療法がなく、病因の解明が不十分であるため、疾患のフレアを効果的にコントロールすることは困難である[2]。微生物叢を含む複数の環境因子がSLEの病因に関与していることが示唆されています[3]。我々は以前、無治療のSLE患者において、特定の細菌が口腔から消化管へ異常に輸送されることに部分的に起因すると思われる、豊かさと均一性が低下した腸内細菌叢の調節異常を同定しました[4]。腸内細菌叢の異常がSLEの病因となるメカニズムとしては、腸管バリアの破壊 [5] 、分子模倣の誘発 [6] 、微生物代謝産物の産生の変化 [7] 、それに伴う免疫調節の異常 [8] などが考えられています。腸内細菌叢は、細菌、真菌、ウイルスで構成されています。しかし、これまでの研究では、技術的な制約から、豊富な腸内細菌に焦点が当てられており、SLE患者の腸内ウイルスについては、まだ十分に解明されていないのが現状です。

重要なことは、ウイルスの引き金とSLEの病態の関係が十分に明らかにされていることです。例えば、エプスタイン・バー・ウイルス感染はSLEの高いリスクをもたらします[9], [10]。さらに、SLE患者の末梢血単核細胞（PBMC）に存在するウイルスは、健常対照者（HC）と比較して高い多様性を示していました[11]。これらの知見は、SLEにウイルスが関与している可能性を示唆しています。ヒトの腸内ビロームの中には、原核生物（主にバクテリオファージ）と真核生物のウイルスが含まれています。Clostridium difficile感染症の治療における糞便濾過液移植の成功は、腸内ビロームの主要な形態である遊離ウイルス様粒子（VLP）がヒトの病理学に関与する可能性を明らかにした [12] 。実際、糞便ビロームの移植は、糖尿病および肥満のマウスに有益であり [13]、疾患の調節における腸内ビロームの重要な役割を示唆している。バクテリオファージも真核生物ウイルスも、直接的または間接的に宿主の免疫系を調節することができます[14]。腸内ビロームの乱れは、1型糖尿病、炎症性腸疾患、関節リウマチなど、いくつかの自己免疫疾患／炎症性疾患において観察されている [15], [16], [17]。最近、日本人SLE患者47名のメタゲノムショットガン配列データから、細菌細胞に感染するバクテリオファージやプロファージに着目し、腸内ビロームの情報が検索された[18]。しかし、SLE患者におけるVLPに代表される腸内ビロームの情報は、治療による影響も含め、まだ不明な点が多い。

本研究では、非治療のSLE患者76人の糞便VLPの塩基配列を決定し、腸内ビロームのプロファイリングを行った。また、SLE患者32人と性、年齢、BMIをマッチさせたHC75人の治療後のフォローアップを比較対照とした。我々は初めて、糞便中VLPsプロファイリングによってSLEの腸内ビロームのシグネチャーを明らかにし、その炎症誘発性潜在性と臨床的関連性を探った。この結果は、腸内細菌叢に関連するSLEの病態に新たな洞察を与える可能性があります。

材料と方法
2.1. 研究参加者とサンプル収集
本研究では、過去3ヶ月間、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗マラリア剤を服用していないSLE患者76人と、性別、年齢、BMIをマッチさせたHC75人を対象とした（表S1オンライン）。SLEはAmerican College of Rheumatology (ACR) revised criteria [19]に従って診断された。疾患活動性の評価にはSLE Disease Activity Index（SLEDAI）-2000の基準を用いた[20]．すべての被験者は、サンプル採取の3ヶ月前から抗生物質やプロバイオティクスを服用していなかった。すべての被験者は、他の自己免疫/自己炎症性疾患、活動性感染症、悪性腫瘍、または臓器不全の既往がなかった。非治療のSLE患者の臨床データと糞便は、治療開始前に収集された。SLEのサブグループは、SLEDAIのレベル、罹病期間、一般的な臨床症状（ループス腎炎、麦粒腫疹、関節炎）の有無、または代表的な自己抗体（抗Sm抗体、抗dsDNA抗体、抗RNP抗体）の陽性によって定義されました。さらに、32名のSLE患者について、副腎皮質ホルモン、免疫抑制剤、抗マラリア剤による治療後の臨床データと糞便サンプルの両方を追跡調査することができた（図S1オンライン）。2回目のサンプル採取時に服用していた薬剤は表S2（オンライン）に示されており、コルチコステロイド（28/32、87.5％；プレドニゾンまたはメチルプレドニゾロン）、ヒドロキシクロロキン（29/32、90.6％）、その他の免疫抑制剤（22/32、68.8％；ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、レフルノミド、メトトレキサートまたはタクロリムスなど）である。糞便サンプルは排便直後に採取し、2時間以内に-80℃で凍結した。ヒトが参加する研究で行われたすべての手順は、北京ユニオン医科大学病院の施設審査委員会の倫理基準（JS-1239号）によって承認され、1964年のヘルシンキ宣言とその後の改正に従ったものであった。すべての研究参加者からインフォームドコンセントを得た。

2.2. VLPsの濃縮と配列決定
各被験者の固形糞便約0.5〜1.0gを秤量し、懸濁し、ボルテックスした。この混合物を遠心分離し、上清を採取して 0.22 µm のポリフッ化ビニリデンフィルター（Millipore, Darmstadt, Germany）で 2 回濾過した。VLPを取得するために、濾液を限外濾過チューブ（Millipore）に入れ、4500×g、4℃で遠心分離を行った。残りの濾液は、8 U TURBO DNase I (Invitrogen, Carlsbad, USA) と 20 U RNase A (Qiagen, Hilden, Germany) で37 ℃、30 分間処理した。糞便VLPからウイルス核酸を抽出し、逆転写し、ランダムに増幅した。Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina, Santiago, USA) を用いてショットガンシーケンスライブラリを構築し、NovaSeq 6000 (Illumina) で150 bpペアエンドリードを生成してシーケンサーで解析した。腸内ビロームの生シーケンスデータは、アクセッション番号 NMDC10018133 で National Microbiology Data Center で入手可能である。

2.3. 2.3. ウイルスコンティグの構築と同定
生データ中の低品質リードとアダプター配列をKneadData (v0.10.0) を用いてフィルタリングし、GRCH38ヒトリファレンスゲノムに基づいてホスト配列を除去した。フィルターしたペアエンドリードをSPAdes (v3.15.3, parameters: --meta -t 30)を用いてコンティグにde novoアセンブルした。コンティグをプールし、CDhit (v4.7, parameters: -c 0.95 -n 10 -d 0 -M 640,000 -T 8) を用いて類似度95%で冗長ゲノムを除去しました。長さ5kb以上のコンティグを残し、VirSorter2とDeepVirFinderに提出し、潜在的なウイルス運用分類単位（vOTU）の同定を行った。信頼性を高めるため、VirSorter2による評価でスコア0.9以上のコンティグ、またはDeepVirFinderによる評価でスコア0.9以上でP値<0.05のコンティグを最終的にvOTUとして選択しました。

2.4. vOTUの分類学的アノテーションと定量化
Refseq208のウイルス参照データセットに基づき、DIAMONDとMEGANの共同解析により、vOTUの分類学的アノテーションを行った[21]。簡単に説明すると、vOTUの配列を翻訳し、DIAMOND (v2.0.12.151) を用いてRefseq208の全ウイルスタンパク質のアミノ酸配列とアライメントした。分類学的アノテーションの結果は、MEGAN Community Edition (v6.21.10) のツールを用いて、最小公倍数アルゴリズムに基づき解析・抽出された。バクテリオファージは、RefSeqのバクテリオファージタンパク質とvOTUのコンティグをアラインメントして特徴づけ、BACPHLIP [22] を用いてバクテリオファージのライフスタイルを同定した。vOTUの存在量は、FastViromeExplorerを用い、デフォルトのパラメータで計算した[23]。

2.5. メタゲノム配列決定と微生物アノテーション
同じコホートの糞便微生物叢からDNAも抽出し、微生物アノテーションとメタゲノム解析のために配列決定した（PRJNA532888）、以前に記述したように[4]。簡単に説明すると、NEBNext® Ultra™ DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, Île-de-France, France) を用いてシーケンスライブラリを生成するために糞便DNAを抽出した（TIANGEN, Beijing, China）。その後、ライブラリーをIllumina HiSeq Xtenプラットフォームで製造元の説明書に従ってシーケンスした。生リードは、KneadDataを用いた品質管理を行った。分類学的アノテーションは、MetaPhlAn2 [24]によってクリーンリードに対して行われた。

2.6. ヒト初代免疫細胞の単離
健常者由来の初代好中球とPBMCを、製造元の指示に従い、Ficoll-Hypaque密度勾配遠心法により精製した（Solarbio, Beijing, China）。マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、T細胞、およびB細胞は、以下の抗体：抗ヒトCD56-FITC、CD19-PE、CD14-PE fire、CD3-PerCP/Cy5.5、CD11c-APC、およびCD16-BV510を用いて新鮮PBMCからMOFLO ASTRIOS EQフローサイトメーター（Beckman Coulter、カリフォルニア、アメリカ）でソーティングされた。

2.7. 細胞培養および VLP 処理
Caco-2細胞は、10%牛胎児血清（FBS）を含むEagle's minimum essential medium (EMEM) (Gibco, New York, USA)を用いて培養を行った。健常者の末梢血から採取したヒト免疫細胞は、10％FBSを含むRPMI1640培地（Corning, New York, USA）を用いて培養を行った。この細胞を、450μLの培地を用いて24ウェルプレートに、1ウェルあたり104〜105個となるように播種した。24時間後、さらに各群10名の被験者から採取した50μLの糞便VLP混合液に24時間感染させた。

2.8. インターフェロン（IFN）-αのmRNAおよびタンパク質の検出
細胞培養液を遠心分離し、細胞および上清を分離した。RNA isolation Kit (Feijie, Shanghai, China) を用いて細胞の total RNA を抽出し、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo, Tokyo, Japan) を用いて相補的 DNA に逆転写した。IFNAのmRNAは、SYBR Green Realtime PCR Master Mix（東洋紡）を用いて、96ウェルプレートでQuantStudio 3により検出した。異なるサンプルのサイクル閾値は、ΔΔCt計算法に従い、GAPDHに対して正規化した。上清中のIFN-αのタンパク質濃度は、酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）キット（R＆D Systems, Minneapolis, USA）により検出した。タンパク質濃度は、標準曲線に基づいて算出した。

2.9. 細胞死率の測定
VLPに感染したCaco-2細胞を遠心分離で回収し、PBSに再懸濁した後、ヨウ化プロピジウム（PI）で15分間、室温、暗黒下で染色した。PBSで洗浄後、AccuriC6 Plusフローサイトメーター（BD Biosciences, New Jersey, USA）で解析し、PI陽性細胞を死滅細胞とした。

2.10. バイオインフォマティクス解析と統計
アルファおよびベータ多様性解析と並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）は、Rパッケージのveganを使用して実施された。Spearman相関は、RパッケージWGCNAを用いて行った。Procrustes分析は、Rパッケージveganを用いて実施した。SLE診断のためのランダムフォレストモデルは、RパッケージrandomForestを用いて構築された。診断モデルの受信者操作曲線（ROC）と対応する曲線下面積（AUC）は、RパッケージのpROCを用いて取得した。2つのROC間の性能の差はDeLongの検定で検証した。Shapiro-Wilk検定は、データの正規性を確認するために行った。アルファ多様性とファージ量の2群間の差の有意水準は、Wilcoxon rank-sum検定で算出した。遺伝子発現、タンパク質量、細胞死率の2群間の差は、Studentのt検定により解析した。上記の解析は、R 3.5.1またはGraphPad Prism 9.0を使用して行った。群間で有意に変化した微生物は、効果量（LEfSe）の線形判別分析（LDA）により、LDA値＞2.0、P値＜0.05で得られた[25]。

結果
3.1. SLE患者における腸管ウイルスの多様性と分類の変化
本研究では、腸内ビロームのプロファイリングのために、非治療のSLE患者76人とHC75人を含み、研究対象者の臨床的特徴を表S1（オンライン）に要約した。全SLE患者のうち、32人はSLE治療を3〜24ヶ月間受け入れた後に再度糞便サンプルを提供し、SLEDAIが有意に減少した（-8.6 ± 7.7, P < 0.0001, Fig. S1 online）。腸管VLPを濃縮し、腸管ビロームのプロファイリングに供した。平均で3,128,912 ± 1,703,255のクリーンペアエンドリードが得られ、コンティグアセンブリとウイルスアノテーションが行われた。その結果、3037個のvOTUが同定され、そのうち2143個のvOTUはゲノムをバクテリオファージの既知のタンパク質とアラインメントすることでバクテリオファージとして特徴づけられ、残りの894個のvOTUは真核生物のウイルスとみなされた。このうち、Caudovirales、Algavirales、Pithovirusの3つのウイルス目に属するウイルスが、注釈付きで発見された。Caudoviralesは相対的存在量の大部分（累積>99.9%）を占めた。注釈付きvOTUの中で最も豊富なウイルスファミリーは、Siphoviridae (45.1%), Myoviridae (35.0%), Podoviridae (10.1%) であった。

非治療のSLE患者とHCの腸内ビロームの違いを探るために、まず、ウイルスコミュニティのアルファおよびベータ多様性を解析した。vOTUの数とコミュニティの豊かさと均一性の指標であるShannon indexは、SLE患者とHCの間で有意な差は見られなかった（vOTUの数、P = 0.051, 図1a、Shannon index、P = 0.300, 図1b）。サブグループ解析については、ループス腎炎を持つSLE患者は、HCと比較してvOTU数が有意に減少した（図S2aおよびオンライン表S3）。一方、マラリア発疹を持たないSLE患者は、HCよりもシャノンインデックスが有意に小さかった（図S2bおよびオンライン表S3）。ベータ多様性はサンプル間のBray-Curtis距離に基づいて計算され、PERMANOVAはSLE患者とHCのウイルスコミュニティの間（R2 = 0.007, P = 0.163, 図1c）や臨床徴候によって定義されたSLEサブグループの間の有意な区別を発見しなかった（表 S4 online）。治療前後のSLE腸内ビロームの比較では、α多様性（vOTU数でP = 0.832、Shannon指数でP = 0.224、図1d、e）、β多様性（R2 = 0.014, P = 0.892、図1f）の差は見られなかった。

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図1. SLE患者および健常対照者における腸内ビロームの多様性。(a) 無治療のSLE患者と健常対照者の腸内細菌群のvOTU数と(b)シャノン指標を表示した箱ひげ図。(c) SLE患者および健常対照者の異なるサンプルの腸内ビロームのBray-Curtis類似度に基づくPCoAプロット。(d) SLE患者の治療前後の腸内ビロームのvOTU数および(e) Shannon指標を表示した箱ひげ図。(f) SLE患者の治療前後の異なるサンプルの腸内ビロームの間のBray-Curtis類似度に基づくPCoAプロット。Wilcoxon rank-sum test (a, b) および paired Wilcoxon rank-sum test (d, e) を用いて、2群間比較の有意性を判断した。

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図2. SLE患者における腸内細菌群の分類学的特徴およびその臨床的意義。(a)SLE患者と健常対照者の腸内バクテリオファージの相対量を示す箱ひげ図。2群間比較の有意水準はWilcoxon rank-sum検定で評価した。*P < 0.05. (b, c) SLE患者と健常対照者の間で腸内ビロームの多さが異なるウイルスのファミリー/サブファミリーおよび属/種を示す棒グラフ。各棒の長さは、各分類群のLDA効果量を表している。群間におけるウイルス分類群の有意な変化のみを示した。(d) 多量に存在する腸内ウイルスの属または種と臨床的メタデータとの間のスピアマン相関を示すヒートマップ。どの臨床指標にも有意に関連しない分類群は、ヒートマップから除外した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. WBC、白血球、LYM、リンパ球、HGB、ヘモグロブリン、PLT、血小板、ALT、アラニンアミノトランスフェラーゼ、ALB、アルブミン、TBIL、総胆汁酸、DBIL、直接胆汁酸、CR、C反応タンパク質、ESR、赤血球沈降速度、ANA、抗核抗体、SLEDAI、SLE疾患活動性指数。

次に、腸内ビロームの分類学的変化を検討した。SLE患者では、バクテリオファージの割合がHCよりも有意に高かった（P = 0.032、Fig.2a）。バクテリオファージでは、病原性ファージと温和なファージの相対的な存在量にSLE患者とHCの間で差は見られなかった（図S3オンライン）。LEfSeを行い、群間で有意差があり（P < 0.05）、LDA値が2.0以上である鑑別分類群を同定した（オンラインの表S5）。SLE患者の腸内ビロームでは、DemerecviridaeとPhycodnaviridaeのウイルスファミリーがHCと比較して増加していた（図2b）。亜科レベルでは、SLEの腸内ビロームでSlopekvirinaeとErmolyevavirinaeが増加し、RakietenvirinaeはHCの腸内ビロームと比較して減少していた（図2b）。ウイルスの属と種については、SLE患者ではDrulisvirus、Thermoanaerobacterium phage THSA-485A、Caeruleovirus、Bacillus virus JBP901が、HCではclAss-like virusとその1種Cellulophaga phage phi14：2が最も多く検出された（Fig. 2c）。さらに、変化したウイルスの属や種とSLE関連の臨床指標との関係を検証した。SLEに濃縮されたDrulisvirusの腸内存在量は抗核抗体の血清中力価と正の相関があった（r = 0.239, P = 0.048）(図2d). さらに、SLE濃縮ブドウ球菌ファージΦRS7の腸内存在量は、SLEDAI（r = 0.279, P = 0.015）と同様に、C反応性タンパク質（CRP）（r = 0.291, P = 0.020）および赤血球沈降速度（ESR）（r = 0.296, P = 0.015) を含む炎症指標と正に関連することが示された。

3.2. 腸内ビロームとバクテリオームの相互相関とSLEの複合診断価値
我々は以前、このコホートの同じ被験者の腸内メタゲノムのプロファイリングを行っており[4]、腸内細菌群の情報も本研究に含めて、腸内ビロームとペア解析を行った。プロクラステス解析の結果、腸内細菌叢のウイルスと細菌の間には、領域を超えた有意な関連があることが明らかになった（M2 = 0.661, P < 0.001, 図3a）。さらに、SLE患者において変化したウイルス属/種と変化した細菌属の相関を解析した（図3b）。ウイルスの中のバクテリオファージの中には、宿主ではない細菌属と共役しているものがあり、腸内ウイルスとバクテリオームが複雑に絡み合っていることが示唆された。例えば、前述のDrulisvirusは、SLEに富むAtopobiumとは正の相関を示したが、SLEに乏しいEubacteriumやCollinsellaとは負の相関を示した。また、crAss様ウィルスはSLEが減少したDesulfovibrioと正の相関を示したが、SLEが増加したLactobacillusやEikenellaと負の相関を示した。

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図3. SLE患者における腸内ビロームとバクテリオームの相互相関。(a) SLE患者と健常対照者の腸内細菌とバクテリオームのProcrustes解析を示すPCoAプロット。(b)SLE患者と健常対照者で異なる量の腸内ウイルス属または種と、異なる量の腸内細菌属の間のスピアマン相関を示すヒートマップ。他と有意な相関がない分類群はヒートマップから除外した。*P < 0.05.

次に、ランダムフォレストアルゴリズムを利用して、ウイルス属・種と細菌種の腸内存在量に基づくSLEの診断モデルの確立を試みました。モデル構築とテストのために、被験者の70％をトレーニング群、残りをテスト群として無作為に選択した[26]。10倍のクロスバリデーションにより，18種類のウイルス属/種と19種類の細菌種を選択した（図4a, b）．各モデルについてROCを構築し、対応するAUCを算出してモデルの精度を測定した（Fig.4c-e）。トレーニング群（AUC, 0.929 vs 0.853; P = 0.108）、テスト群（AUC, 0.804 vs 0.716; P = 0.369）のいずれにおいても、SLE患者とHCを区別する上でウイルスマーカーと細菌マーカーの間に明らかな違いは見られませんでした。しかし、トレーニング群では、腸内細菌とビロームの組み合わせは、腸内ビローム単独（AUC, 0.948 vs 0.853; P = 0.022）および腸内細菌単独（AUC, 0.948 vs 0.929; P = 0.056 ）よりもSLE患者のHCからの識別に優れていた。この結合モデルも、治療済みのSLE患者32人とHC75人を区別するのに優れた性能を示し、AUCは0.978であった（図S4aオンライン）。したがって、32人のSLE患者において複合モデルによって計算された各被験者のSLEと診断される確率は、治療前と治療後では差がなかった（図S4bオンライン）。

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図4. SLEに対する腸内ビロームとバクテリオームの診断価値。(a)ランダムフォレストモデルにより得られたSLE患者と健常対照者の最も識別力の高い腸内ウイルスの属または種と(b)腸内細菌の種を示す棒グラフ。各棒の長さは、各分類群の平均減少精度を表す。各バーの色は、各分類群が由来するウイルス科（a）または細菌門（b）を示している。(c-e）腸内細菌マーカー（c）、腸内細菌マーカー（d）、および両マーカー（e）に基づくランダムフォレストモデルのROCプロットは、SLE患者を健常対照者から識別している。各ROCプロットにおいて、黒い折れ線は実際のROCを表し、周囲の青い領域は95%信頼区間を表す。

3.3. 非治療のSLE患者の腸管VLPで処理するとIFN-α産生が誘導される
SLE患者における腸内ビロームの乱れの臨床的関連性を調べるために、SLEの病原因子としてよく知られているIFN-αを誘導する腸管VLPの能力を試験した。無作為の非治療SLE患者10人または無作為のHC10人の腸管VLPをそれぞれ混合した。VLPs混合物は、解剖学的および機能的に腸管上皮細胞に類似し、IFN-αを産生する能力を有するヒトクローン性大腸腺癌細胞株であるCaco-2細胞への感染に利用された[27]。非治療SLE患者の腸管VLPによって誘導されたCaco-2細胞におけるIFN-αのmRNAおよびタンパク質レベルは、HCのものと比較して有意に増加した（P < 0.001 および P = 0.004 、Fig. 5a）。興味深いことに、Caco-2細胞におけるIFN-αの発現を誘導する能力は、患者が副腎皮質ホルモンや免疫抑制剤による治療を受けた後、SLE VLPにおいて著しく低下し（P < 0.001 and P = 0.004, 図5a）、HCのVLPによって誘導されたものと同程度であった。対照的に、非治療SLE患者、治療SLE患者、またはHCからの腸管VLPは、細胞死を誘導することにほとんど差がなく（図S5aオンライン）、SLE VLPによって誘導されたIFN-α発現の増加は、細胞死の変化によるものではないことが示された。

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図5. SLE患者および健常対照者の腸管VLPによる上皮細胞および免疫細胞への感染。(a) VLPを感染させていないCaco-2細胞（モック）、健常対照者、非治療SLE患者、治療SLE患者の腸管VLPを感染させた場合のIFN-αのmRNAレベル、その上清中のIFN-αのタンパク質レベル。(b) VLPを感染させていない健常者（モック）、健常者、非治療SLE患者、治療SLE患者の腸管VLPを感染させた健常者の末梢血中の好中球（左）、T細胞（中）、B細胞（右）におけるIFN-αのmRNAレベルとその上清中のIFN-αのタンパク質レベルを示す。各群のIFNAのmRNAレベルは、モック群のそれに対する相対値として計算した。データは生物学的複製（n = 3）の平均±標準偏差として示されている。両側無対称のStudent's t-testを適用した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

さらに、腸管VLP混合液でヒト末梢血の異なる免疫細胞を刺激した。非治療のSLE患者からのVLPは、HCからのものと比較して、好中球（P < 0.001 および P = 0.012 ）、T細胞（P = 0.016 および P = 0.009 ）、B細胞（P = 0.029 および P = 0.016 ）において有意に高いmRNAおよびタンパク質レベルのIFN-αを誘導した（図5b）。Caco-2細胞で観察されたのと同様に、SLE VLPで刺激した好中球（P < 0.001 および P = 0.012）およびT細胞（P = 0.036 および P = 0.007）のIFN-αのmRNAおよびタンパク質レベルは、処理前に比べて低くなった（図5B）。それにもかかわらず、3つのグループの腸管VLPに感染した単球、樹状細胞、およびナチュラルキラー細胞におけるIFN-αのmRNAレベルは、同様の傾向を示したが、統計的に有意ではなかった（図S5bオンライン）。まとめると、非治療のSLE患者の腸管VLPはより強力なIFN-α産生誘導能を有していたが、SLE患者では治療後に正常に回復したことから、SLE腸管ビロームのこの炎症促進特性は疾患活動性と関連していることが示唆された。

考察と結論
本研究では、非治療のSLE患者における腸管VLPのビロームの特徴を描き出した。その特徴は、真核生物ウイルスよりもバクテリオファージが異常に濃縮されており、臨床的に関連性のある多数の妨害バクテリオファージが存在することであった。腸内ウイルスは腸内細菌と密接に関連しており、SLE患者の腸内では2つの生態学的コミュニティがダイナミックに平衡していることが示された。SLEに関連する腸内細菌叢の細菌マーカーにウイルスマーカーを組み込むことで、SLEの診断モデルをより高い精度で構築することができました。高い精度と入手のしやすさから、バクテリオームとバイロームを組み合わせた腸内細菌叢のシグネチャーは、現在のSLE診断パネルの重要な補足となる可能性があります[28]。重要なことは、SLEに関連する腸内VLPの異常なインターフェロン刺激傾向が明らかになったことで、異常な腸内ビロームがSLE発症に寄与している可能性が示されたことである。

腸内細菌叢[29], [30], [31]とは異なり、腸内細菌叢は、SLE患者では、健康な人と比べて、また副腎皮質ホルモンや免疫抑制剤による治療の前後で、αおよびβ多様性によって評価すると、コミュニティレベルでは大きな変化を示さなかった。しかし、これらの結果は、必ずしもSLEに関連する腸内ビロームのコミュニティーレベルでの変化がなかったことを意味するものではありません。なぜなら、健康な集団において腸内ビロームの不均一性は腸内細菌群のそれよりも高いことが証明されているからです [32]. したがって、SLEのビロームの研究には、その違いを明らかにするために、より大規模で十分なサンプルサイズが必要かもしれません。さらに、腸内ビロームは腸内細菌群よりも宿主に関連した内在的・外在的共変量に対する反応性が高く、これが個人差の大きさを説明するのかもしれない [32], [33].

特に、細菌に感染する腸内ウイルスの主成分であるバクテリオファージが、非治療のSLE患者の腸内ビロームの中で相対的に増加していることがわかった[33]。SLE患者コホートで変化したウイルス分類群もほとんどがバクテリオファージであった。同様に、1型糖尿病に罹患しやすい小児では、真核生物ウイルスではなく、バクテリオファージが経時的に変化していました[34]。さらに、バクテリオファージ療法は、病原体が抗生物質に耐性を持つ一部の細菌感染症の治療に有効であることが既に証明されています[35]。SLEの病因に腸内細菌の異常が関与していることから[36]、バクテリオファージ療法による腸内細菌の調節はSLEの治療の可能性を持っていると思われます。

SLE患者とHCの腸内ビロームの分類学的な違いの中で、SLEに濃縮されたDrulisvirus属は、病原体Klebsiella pneumoniaeに定着し、成熟バイオフィルムを溶解することによってその感染を制限すると報告されました[37]。腸内では報告されていませんが、SLE患者の皮膚病変部ではK. pneumoniaeが減少していました[38]。SLEに濃縮されたStaphylococcus phage phiRS7に関しては、その存在量がSLEDAI、ESR、CRPのレベルと正の相関があり、その宿主のStaphylococcusはSLE皮膚病変で増加していると報告されており[38]、その唾液の存在量もSLEDAIと正の相関がある[39]。ヒトの腸内に最も多く存在するウイルスの一つであるcrAss様ウイルス[40]は、SLE患者で有意に減少していることがわかりました。このことは、関節リウマチ[18]や炎症性腸疾患[41]の患者で観察された結果と一致しており、これらの自己免疫／炎症疾患においてcrAss様ウイルスが有益であると考えられることを示唆しています。ヒトの微生物叢、特にSLEに関する知識が限られているため、SLEの病因における特定のウイルスの役割について確固たる結論を出すことはほとんどできません。今後、少なくとも疾患モデルを用いた機能的な研究により、腸内細菌叢のメカニズム解明が急務である。

機能的には、SLEの腸内細菌と、抗ウイルス作用を持つI型IFN（IFN-I）の主成分であるIFN-αの産生促進との間に関連があることを発見した。SLEでは、IFN-Iシグナルの持続的な活性化が自己抗体産生、細胞死、臓器障害を促進し、極めて重要な発症特性である[42], [43]. 本研究では、SLE腸管VLPが上皮細胞およびヒト初代免疫細胞、特に好中球、T細胞、B細胞において有意に高いIFN-αを誘導することを見出した。興味深いことに、SLE VLPのインターフェロン刺激特性は、有効な治療後に減少し、SLEの疾患活動性と並行して進化していることが示唆された。

通常、ウイルス感染時にヒトの細胞が真核生物のウイルスの病原体関連分子パターン（PAMP）（例：ウイルスRNAやDNA）をパターン認識受容体（PRR）で感知すると、IRF3やIRF7などの転写因子が誘導され、その後、下流のIFN-I系が活性化されます[44]。興味深いことに、細菌を宿主とするバクテリオファージは、哺乳類細胞によるIFN-α産生を直接駆動することも可能である。例えば、緑膿菌の糸状バクテリオファージは、白血球にエンドサイトーシスされ、PRRであるTLR3を刺激することによってIFN-α産生を駆動することができる[45]。この場合、SLE患者の糞便VLPに含まれる制御不能な真核生物ウイルスとバクテリオファージの両方が、PAMP-PRR認識などのメカニズムでIFNα産生促進に関与している可能性がある。SLE患者の腸管VLPには、いくつかのStaphylococcus属とLactococcus属のファージが濃縮されていることがわかった。Staphylococcus属とLactococcus属は、ヒトの細胞でIFN-Iを活性化することが知られており[46]、[47]、これはそれらが保有するバクテリオファージに起因しているかもしれません。消化管におけるIFN-αの過剰産生におけるSLEに関連するウイルスの正確な寄与は、さらに調査される価値がある。

要約すると、我々の研究は、SLEにおいても腸内ビロームの乱れがあることを示し、自己免疫疾患における腸内ビロームとバクテリオーム全体の同時解析の重要性を強化するものであった。さらに、SLEにおける腸内細菌群の乱れがIFN-I反応を促進することを示し、SLEの病態に関する新しい知見を提供することができた。今後、ヒトの体内におけるウイルス群集の研究が進めば、SLEの病因における微生物相の乱れの役割についてより深い知見が得られ、将来のバイオマーカーや治療薬の開発に役立つと期待される[48]。

利益相反について
著者らは、利益相反がないことを宣言する。

謝辞
本研究は、科学技術部重点研究開発計画（2022YFC3602000）、中国国家自然科学基金（82230060、81788101、82201978、32141004、82171798）、中国科学アカデミー戦略重点研究プログラム（XDB29020000）の支援を受けて実施された。中国科学院医学科学イノベーション基金（CIFMS）（2021-1-I2M-017, 2021-1-I2M-047, 2021-1-I2M-040, 2021-1-I2M-016, 2021-1-I2M-026）、首都の健康増進研究基金（2020-2-4019）である。研究参加者の皆様に感謝いたします。

著者による貢献
Xuan ZhangとJun Wangが研究の設計と指導を行った。Beidi ChenとMin Wangは、サンプルを収集し、臨床分析を行った。Jiabao CaoとYuqing Zhangは糞便中のVLPを分離した。Wei LiuとYudong Liuは、細胞実験を行った。Beidi ChenとJiabao Caoは、バイオインフォマティクスと統計解析を行った。Fei XiaoとJie Maは結果について議論するのを手伝った。Beidi Chen, Jiabao Cao, Wei Liu, and Yuqing Zhang は原稿を作成した。Xuan Zhang, Jun Wang, and Yudong Liu が原稿を修正した。

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引用元: (0)

陳碧迪は北京大学第三病院の研修医である。2021年に北京ユニオン医科大学から博士号を取得。研究テーマは、リウマチ性疾患、特に全身性エリテマトーデスおよび全身性硬化症における微生物叢である。

Jiabao Caoは、中国科学院微生物学研究所の常勤博士研究員です。2022年に医学博士号を、2019年に修士号を取得。研究テーマは、疾患におけるヒト腸内ビロームおよびバクテリオームの役割と、マイクロバイオームにおける第三世代シーケンサーの応用。

Wei Liuは、Peking Union Medical Collegeで免疫学の博士号を取得した。現在、北京病院にてポストドクターを務める。研究テーマは、リウマチ性免疫障害の臨床的特徴と分子メカニズム。

2022年、中国科学院大学卒業。現在、中国科学院微生物研究所の博士課程に在籍。彼女の研究の関心は、ヒトの微生物と宿主の相互作用にある。

Jun Wang 中国科学院微生物研究所病原微生物学・免疫学CAS重点実験室主任研究者。2014年にドイツのマックス・プランク進化生物学研究所で博士号を取得。研究テーマは、マイクロバイオームの比較とマイニング、先進的なシーケンシング手法、マイクロバイオームにおける人工知能の応用など。

Xuan Zhang 北京病院教授、中国医学科学院・北京ユニオン医科大学臨床免疫学センター長。研究テーマは、自己免疫疾患、特に全身性エリテマトーデスや関節リウマチの臨床研究およびトランスレーショナル・リサーチである。

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これらの著者はこの仕事に等しく貢献した。

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