小腸内細菌叢の特性解析により、過体重または肥満の被験者で異なるプロフィールが明らかに

哉百名

小腸内細菌叢の特性解析により、過体重または肥満の被験者で異なるプロフィールが明らかに：米国消化器病学会雑誌｜ACG

https://journals.lww.com/ajg/fulltext/9900/characterization_of_the_small_bowel_microbiome.1104.aspx

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記事 小腸
小腸マイクロバイオームの特性解析により、過体重または肥満のヒト被験者で異なるプロファイルが明らかになった
Leite, Gabriela PhD1; Barlow, Gillian M. PhD1; Rashid, Mohamad MBChB1; Hosseini, Ava MPH1; Cohrs, Daniel MD1; Parodi, Gonzalo BS1; Morales, Walter BS1; Weitsman, Stacy MS1; Rezaie, Ali MD1,2; Pimentel, Mark MD, FACG1,2; Mathur, Ruchi MD1,3
著者情報
The American Journal of Gastroenterology ():10.14309/ajg.0000000000002790, April 22, 2024. | DOI: 10.14309/ajg.0000000000002790
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指標
概要
はじめに
腸内細菌叢の変化は肥満と関連しているが、その知見は便のデータに基づいている。本稿では、正常体重、過体重、肥満の被験者を対象に、十二指腸マイクロバイオームと血清バイオマーカーを解析した。

方法
結腸前処置なしで標準的な食道胃十二指腸内視鏡検査を受けた被験者から十二指腸吸引液と血清サンプルを得た。Aspirate DNAを16S rRNAおよびショットガンシークエンシングにより解析した。予測される微生物代謝機能と代謝・炎症バイオマーカーの血清レベルも評価した。

結果：
正常体重（N = 105）、過体重（N = 67）、肥満（N = 42）の被験者が同定された。過体重に特異的な十二指腸微生物の特徴として、ビフィドバクテリウム種および大腸菌K-12株の相対存在量（RA）が低く、ラクトバチルス・インテスティナリス、L.ジョンソニイ、プレボテラ・ロエシェイのRAが高かった。肥満特異的な特徴としては、ラクトバチルス・ガセリ（Lactobacillus gasseri）RAの増加、L. ロイテリ（L. reuteri）（rodentium亜種）、アロプレボテラ（Alloprevotella rava）、レプトトリキア（Leptotrichia spp）RAの減少が挙げられる。エスカレーションの特徴（標準体重から肥満への漸進的変化）には、バクテロイデス属菌、スタフィロコッカス・ホミニス属菌、未知のフェカリバクテリウム属菌のRAが減少し、未知のラクトバチルス属菌とマイコバクテリウム属菌のRAが増加し、生物起源アミン代謝の微生物ポテンシャルが減少することが含まれる。脱スケーリングの特徴（正常から過体重、過体重から肥満で変化する方向）には、乳酸菌、L. hominis、L. iners、Bifidobacterium dentiumが含まれる。未知の乳酸菌はIIa型脂質異常症および過体重と関連し、Alloprevotella ravaはIIb型およびIV型脂質異常症と関連している。

考察
十二指腸マイクロバイオームの直接解析により、過体重や肥満と関連する主要な属が同定された。その中には、便において以前に同定されたものも含まれる。特定の菌種や菌株は、エスカレーションや脱エスカレーションの特徴を含め、過体重や肥満と異なる関連を示し、今後の研究や治療法の標的となりうる。

要旨
輸出
はじめに
2001年、世界的な肥満の流行は世界保健機関（WHO）から「globesity」と呼ばれるようになった。2016年までにWHOは、12億5,000万人以上の成人が過体重（体格指数[BMI]が25～29.9kg/m2）、6億5,000万人以上が肥満（BMIが30kg/m2以上）で、それぞれ世界の成人人口の25％と13％を占めると報告した(1)。現在の傾向が続けば、世界の肥満の有病率は2025年までに男性で18％、女性で21％に達する(1-3)。

肥満は、心血管疾患、メタボリックシンドローム、2型糖尿病（T2D）、特定の癌を含む様々な疾患のリスク増加と関連している(4,5)。世界中で、肥満は年間280万人の死亡の原因になっていると推定されている(1)。米国では、肥満または過体重は、タバコの使用に次いで、予防可能な死亡の主要原因の一つである(6,7)。重要なことは、死亡リスクは体重の増加とともに有意に増加するということである： 英国の成人360万人を対象とした集団ベースのコホート研究によると、BMIが25kg/m2未満では、BMIが5kg/m2増加するごとに全死因死亡率のハザード比が0.81（95％信頼区間[CI]0.80-0.82）増加し、BMIが25kg/m2以上では、この比は1.21（1.20-1.22）に増加した(8)。

腸内細菌叢には、ヒトの消化管に生息する細菌、古細菌、真菌、ウイルスが含まれる(9)。腸内細菌集団の不均衡は、肥満関連疾患患者において繰り返し報告されている(10-13)。肥満の表現型が遺伝的に肥満したマウスから無菌マウスへセカル移植によって伝達されることが最初に証明された後(14)、体重増加や肥満に関連する特定の微生物に関する初期の研究では、一般にマウス(14)とヒト(15)の両方で、ファーミキューテス属とバクテロイデス属の比率が増加していることが判明した。しかし、その後の多くの研究では、この所見は支持されなかった(16-18)。より最近の研究では、細菌の豊富さと遺伝子含量が低い個体ほど、全体的な炎症表現型が大きく、また脂肪率、インスリン抵抗性、脂質異常症も顕著であることが示されており、どの特定の細菌種が変化するかは、マイクロバイオームの機能的冗長性、特に宿主の代謝に関与する主要遺伝子に対する影響よりも重要ではない可能性が示唆されている（19）。

重要なことは、現在までに行われた腸内マイクロバイオーム研究のほとんどが、腸内微生物量の指標として便サンプルを用いていることである。しかし、微生物量、pH、通過時間は消化管の長さによって劇的に変化するため、便は腸内細菌叢全体の代用品としては不十分である。小腸は栄養吸収、内分泌調節、免疫機能にとって重要な部位として機能しており(21)、Revealing the Entire Intestinal Microbiota and its Associations with the Genetic, Immunologic, and Neuroendocrine Ecosystem (REIMAGINE)研究は、ヒトの健康と疾患における小腸マイクロバイオームの特異的重要性を検討するために作成された。そのために、唾液によるクロスコンタミネーションを減らし、小腸微生物からのDNA回収率を高めるために最適化された小腸内腔採取法を開発し、検証した(22)。これらの技術を用いて、小腸の微生物集団は以前考えられていたよりも多く（23）、便中の微生物集団とは大きく異なることを示した（24）。

これまでの研究では、肥満における糞便微生物叢の変化について検討されてきたが、肥満者と非肥満者の小腸微生物叢の違いについてはほとんど知られておらず、標準体重から肥満への進行において腸内微生物の生態系に生じるシフトについてはさらに知られていない。この関係を理解することは、特に宿主の栄養吸収と代謝の調節因子としての小腸の重要な役割を考えると、肥満における腸内細菌叢の役割を明らかにし、的を絞った介入策を開発する上で中心的な課題である。本研究では、BMIの上昇に伴って小腸マイクロバイオームがどのように変化するかを特徴付けるために、上述の有効な手法を適用した。

方法
研究対象者
対象者はCedars-Sinaiで実施されたREIMAGINE試験で募集され、標準的な上部内視鏡検査（食道胃十二指腸内視鏡検査[EGD]）を大腸前処置なしで受けた18～80歳の男女を対象とした。REIMAGINE試験の詳細は既報の通りである(24-26)。被験者は米国疾病予防管理センターのガイドラインに従ったBMIによりグループ分けされた：

第1群：標準体重-BMI 18.5-24.9；
第2群：過体重-BMI25-29.9；
グループ3：肥満-BMI 30以上。
小腸細菌過剰増殖（SIBO）（27）や抗生物質の使用（23）など、小腸マイクロバイオームに影響を及ぼす可能性のあるバイアスを避けるため、スクリーニング後の段階で、既知の糖尿病、SIBO、胃バイパス手術歴、体重コントロール薬の使用、手術前3ヵ月以内の抗生物質の使用を有する被験者を除外した。

REIMAGINE試験のプロトコールはCedars-Sinaiの施設審査委員会により承認され、全対象者はインフォームド・コンセントを文書で得た。

アンケート
EGDの前に、被験者は、GI疾患および状態、GI症状、薬剤の使用、アルコールおよび娯楽用薬物の使用、旅行歴、食習慣を含む人口統計学的質問票および家族歴/病歴質問票に記入した。被験者から提供されたすべての医療情報は、医療記録の監査により確認された。データは下流の解析の前に非識別化された。

採血および分析
空腹時グルコース、総コレステロール、低比重リポ蛋白（LDL）、高比重リポ蛋白（HDL）、トリグリセリド、総蛋白の血中濃度をCobas Integra 400（Roche Diagnostics, Rotkreuz, Switzerland）で測定した、 空腹時インスリン、Cペプチド、胃抑制性ポリペプチド、総グルカゴン様ペプチド-1、レプチン、グルカゴンのレベルは、Luminex FlexMap 3D（Luminex、Austin、TX）でビーズベースのマルチプレックスアッセイ（EMD Millipore、Billerica、MA）を用いて分析した。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、インターフェロン-γ、インターロイキン（IL）10、IL12P70、IL13、IL1β、IL2、IL4、IL5、IL6、およびIL8、ならびに腫瘍壊死因子α（TNFα）を含むマルチプレックスパネル（EMD Millipore）を用いて、Luminex FlexMap 3D（Luminex）で循環サイトカインおよびケモカインレベルを分析した。

空腹時血糖値＞100mg/dLを糖尿病予備軍とした(28)。総コレステロール値200mg/dL以上、LDL値130mg/dL以上、トリグリセリド値150mg/dL以上を高値とした(29)。

小腸管腔サンプルの採取
EGD中、十二指腸管腔サンプルは、特注設計の滅菌ダブルルーメン吸引カテーテル（Hobbs Medical, Stafford Springs, CT）を用いて採取した。このカテーテルは、口、食道、胃からの汚染を減らすために、内視鏡医が十二指腸の第2部分に入った後にのみ滅菌骨ワックスキャップを通して押し込まれた（22）。

吸引物の処理と微生物培養
十二指腸のバイオマスは比較的少なく、十二指腸の吸引液は粘度が高いため、各吸引液（約1 mL）に等量の滅菌1×ジチオスレイトールを加え、完全に液化するまで（約30秒）試料をボルテックスした。各試料100μLを900μLの滅菌1×リン酸緩衝生理食塩水で連続希釈し、MacConkey寒天培地（Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ）および血液寒天培地（Becton Dickinson）にプレーティングした。プレートは好気性（MacConkey）または嫌気性（血液寒天培地）の条件下で、37℃で16～18時間培養した。コロニーが検出されない場合は、さらに24時間培養した。コロニー形成単位（CFU）は、Scan 500（Interscience, Paris, France）を用いて電子的にカウントした。小腸吸引液に 1,000 CFU/mL 以上が検出された被験者は、SIBO 陽性とみなされた。

各十二指腸吸引液の残り（微生物培養に使用しなかった部分）は、配列決定に使用した。サンプルを最高速度（>13,000 RPM）で5分間遠心し、上清を除去し、滅菌Allprotect試薬（Qiagen, Hilden, Germany）を微生物ペレットに添加した。Allprotect下のペレットは、DNA単離前に-80℃で保存した。

DNA単離と16S配列決定
MagAttract PowerSoil DNA KF Kit (Qiagen)を用い、1×ジチオスレイトールのアリコートを陰性対照として、前述(22)と同様に十二指腸吸引液ペレットからDNAを単離した。陰性コントロールから得られたDNAの濃度は検出されなかった。16S rRNA遺伝子V3/V4領域のライブラリーは、遺伝子特異的プライマー（S-D-Bact-0341-b-S-17およびS-D-Bact-0785-a-A-21）(30)を用いて、前述(22)と同様に調製・増幅した。ペアエンドシーケンス（2×301サイクル）は、MiSeqシステム（Illumina, San Diego, CA）でv3（600サイクル）キット（Illumina）を用い、10％～15％PhiX（Illumina）で行った。CLC Genomics Workbench v.22.0.2およびCLC Microbial Genomics Module v.20.1.1/22.1（Qiagen）を用いて、操作分類単位（OTU）クラスタリングおよび分類学的解析を行った。Trim Reads Tool（Qiagen）を用い、quality limit 0.5、maximum number of ambiguities of 2、およびイルミナアダプターの配列を含むtrim adapter listをパラメータとして配列をトリミングした。トリミングしたリードは、Merge Overlapping Pairs Tool（ミスマッチコスト2、ギャップコスト3、最小スコア30）を用いてマージした。OTUへのクラスタリングは、Amplicon-Based OTU Clustering Toolと97%の配列類似度を用いて行った。新しい OTU の作成は許されなかった。分類はCLC Microbial Genomicsのデフォルト値を使用し、SILVA Database（2019リリース）と比較して割り当てた。低深度サンプル（<5,000配列/サンプル）は除去し、アルファ多様性指数を算出した。Bray-CurtisおよびUniFracメトリクスを用いてサンプル間（β）多様性を算出した。ネガティブコントロール中の豊富なOTUは、既述のようにデータセットから除去した(22)。

メタゲノム解析のためのライブラリー調製と配列決定
全ゲノム（ショットガン）シーケンス用のライブラリーは、Illumina DNA Prep kit（Illumina）とIDT for Illumina-DNA/RNA UD Indexes（Illumina）を用いて、製造元の指示に従って調製した。ライブラリーの品質は、2200 TapeStation（Agilent）でHigh Sensitivity D5000 ScreenTapeキット（Agilent）を用いてチェックした。0.48nM以上のライブラリのみをシーケンスした。NovaSeq 6000 S2 Reagent Kit v1.5（300サイクル）を用いて、NovaSeqプラットフォーム（Illumina）でペアシーケンスを行った。CLC Genomics Workbench 22.0.2/20.0.3およびMicrobial Moduleを使用して、デマルチプレックスリードを解析した。リードのトリミングはTrim Reads Tool（Qiagen）を用い、以下のパラメーターで行った：Quality Limit 0.5、最大アンビギュイティ数2、イルミナアダプターの配列を含むトリムアダプターリスト。分類学的同定は、CLC Workbenchで利用可能なHomo sapiens hg38 genomic taxpro indexを用いて宿主リードを除去した後、Taxonomic Profiling Tool（Qiagen）を用いて行った。最小シード長は30とした。Autodetect Paired DistancesおよびAdjust Read Count Abundancesオプションをチェックした。4,275種のすべてのアノテーショントラック（CDS、遺伝子など）を含む16GBメモリに最適化されたGenBankから選択されたリファレンスを含むキュレートされたMicrobial Reference Databaseをリファレンスとして使用した。リファレンスデータベースにインタクトなペアとしてマップできないペアリードは除外した。参照データベースにマップされた宿主フィルターリードは、まずマッピングスコアが最も高い全マッピング位置の最小公倍数祖先に割り当てられた。次に、特定の微生物分類群がサンプルに含まれているかどうかを判定するために、各分類群の定性と存在量の定量を行った。定性ステップは、リファレンスが純粋な偶然によってリードを受け取ったのではないという確信スコアに基づいて行われた。信頼スコアが0.995未満の微生物分類群は無視され、その微生物分類群に割り当てられたリードは、最も近い適格な先祖（信頼スコアは1.0に非常に近い）に再割り当てされた。細菌種と菌株の同定を確認するために、より長い配列（コンティグ）にアセンブルしたリードを用いた2回目の分類学的解析も行った。前ステップで宿主フィルターしたリードを、De Novo Assemblyツール（Qiagen）を用いて長い配列にアセンブルした。ミスマッチコスト2、挿入コストおよび欠失コスト3、長さ分率および類似性分率0.8を用いて、リードをコンティグにマッピングした。コンティグが抽出され、ホモ・サピエンスhg38配列に対してコンティグをフィルターすることにより、ホストクリーニングステップが行われた。宿主でフィルタリングされたコンティグは、上述の微生物データベースにマップされた。

データと統計解析
各グループの平均ライブラリーサイズがほぼ等しい場合、および／またはグループ間の倍数差が平均で2～3倍より低い場合に使用される、公表されている推奨事項（31,32）に従って、グループ間で存在量が有意に異なるOTUを同定した。OTUテーブルは、グループ間でライブラリーサイズに差が確認されなかった場合、下流解析のために希釈化されなかった。

CLC Genomics Workbench v.20.0.3/22.0.2およびCLC Microbial Genomics Module v.20.1.1/22.1 (Qiagen)を用いて、16Sデータおよびショットガンデータの多重比較および統計解析を行った。対数変換したフォールドチェンジ（FC）の差は、サンプル間のライブラリーサイズの違いや交絡因子の影響も補正する一般化線形モデルを用いて算出した。各分類レベルでのグループ間の相対存在量（RA）の差を比較するために、不偏分析を行った。負の二項一般化線形モデルを用いて、グループ間のFCの最尤推定値を求め、有意性の判定にはWald検定を用いた。P値は偽発見率（FDR）を用いて補正した。FDRで補正されたP値＜0.05を有意とみなした。同様のパイプラインをメタゲノミクスショットガンデータのダウンストリーム解析にも適用した。

予測される微生物パスウェイと機能の解析は、CLC Workbench 22.0.2のFunctional Analysisツールを用いて、16Sデータセットに対して行われた。機能プロファイルはECデータベースとClusters of Orthologous Genes termsを用いて推定し、パスウェイはMetaCyc Pathway Database (2022-05)を用いて同定した。ランダム化解析は1,000反復で行われ、データ解析にはスーパーパスウェイが含まれた。FDRで補正されたP値<0.1が有意とみなされた。

両側スピアマン相関、統計検定、グラフ作成は、GraphPad Prism 7.02 (GraphPad Software, La Jolla, CA)とIBM SPSS Statistics Version 24を用いて正規化OTU表で行った。

研究データセットは National Center for Biotechnology Information BioProject Repository (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject) の BioProject ID PRJNA1010206 で入手可能である。

結果
被験者の属性
十二指腸マイクロバイオームの配列決定に成功した合計459人の被験者が、本研究に組み入れるための事前スクリーニングを受けた。十二指腸微生物組成に影響を及ぼす可能性のある既知および潜在的な交絡因子を避けるため、既知の糖尿病、SIBO、胃バイパス手術歴、体重コントロール薬、または手術前3ヵ月以内の抗生物質使用を有する被験者は除外された。

これらの除外後、214人の被験者がメインコホートに残り、十二指腸微生物集団と血清バイオマーカーの解析に用いられた（表1）。105人が標準体重（平均年齢：52.5±17歳、女性＝62人［59.6％］）、67人が過体重（平均年齢：56.3±16歳、女性＝21人［31.3％］）、42人が肥満（平均年齢：51.2±16歳、女性＝22人［52.4％］、表1）であった。EGDの適応を表2にまとめた。

表1. - 被験者の属性と空腹時バイオマーカー値
正常体重 過体重 肥満 P値a
被験者数 105 67 42
女性 62 (59.6) 21 (31.3) 22 (52.4)
マスルド 2 (1.9) 4 (6.0) 1 (2.4)
胃食道逆流症 22 (21.0) 38 (56.7) 7 (16.7)
PPI使用 35 (33.3) 35 (52.2) 13 (31.0)
年齢（歳） 52.5 (16.9) 56.3 (15.8) 51.2 (16.4) 0.28
空腹時Cペプチド（pg/mL） 881.2（423.7） 1,332.7（684.3） 1,842.9（926.8） ＜0.0001
GLP-1総量（pg/mL） 144.6（92.5） 149.6（79.5） 173.3（115.7） 0.35
グルカゴン（pg/mL） 23.2（33.4） 33.0（37.7） 22.0（22.2） 0.17
インスリン (pg/mL) 1,209.7 (2,309.4) 1,947.2 (3,505.2) 2,207.9 (4,204.1) 0.18
レプチン（pg/mL） 3,845.9（3,881.0） 7,948.6（9,067.9） 30,742.4（24,526.4） ＜0.0001
総コレステロール (mg/dL) 176.0 (41.5) 187.8 (47.9) 181.6 (55.6) 0.48
グルコース（mg/dL） 97.5（10.1） 98.7（12.0） 107.2（27.4） 0.30
HDL（mg/dL） 58.7（17.2） 53.0（17.0） 46.4（13.5） 0.005
LDL (mg/dL) 101.0 (33.8) 116.1 (40.0) 100.7 (36.5) 0.97
総蛋白(g/dL) 6.8 (0.7) 6.9 (0.6) 7.0 (0.6) 0.35
トリグリセリド（mg/dL） 95.4 (47.9) 119.3 (77.8) 176.6 (184.6) 0.04
VLDL (計算値) 19.1 (9.6) 23.9 (15.6) 35.3 (36.9) 0.04
GM-CSF (pg/mL) 6.7 (8.0) 7.5 (10.9) 5.8 (3.4) 0.54
IFNγ（pg/mL） 12.4（53.8） 22.5（73.7） 3.8（6.8） 0.17
IL-10 (pg/mL) 12.0 (40.6) 9.4 (9.3) 9.3 (8.6) 0.51
IL-12 (p70) (pg/mL) 5.3 (8.0) 7.8 (16.5) 4.0 (1.0) 0.13
IL-13 (pg/mL) 30.1 (94.3) 31.0 (81.2) 34.1 (98.0) 0.57
IL-1β (pg/mL) 2.6 (1.5) 3.1 (3.2) 2.5 (0.8) 0.31
IL-2 (pg/mL) 1.7 (2.3) 2.4 (5.1) 1.2 (0.7) 0.27
IL-4 (pg/mL) 66.8 (206.6) 115.1 (307.1) 81.9 (213.5) 0.60
IL-5 (pg/mL) 5.6 (9.4) 15.4 (58.5) 5.3 (6.8) 0.48
IL-6 (pg/mL) 18.9 (55.0) 27.0 (68.6) 21.2 (57.3) 0.37
IL-8 (pg/mL) 14.0 (18.4) 14.2 (22.9) 12.7 (19.5) 0.33
MCP-1 (pg/mL) 588.5 (284.3) 584.7 (287.3) 656.9 (289.1) 0.50
TNFα (pg/mL) 16.7 (11.1) 16.6 (7.8) 18.9 (11.9) 0.39
データは特に断りのない限り、n（％）または平均値（SD）で示した。
GERD、胃食道逆流症、GLP-1、グルカゴン様ペプチド-1、GM-CSF、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、HDL、高比重リポ蛋白、IFNγ、インターフェロン-γ、IL、インターロイキン、LDL、低比重リポ蛋白； MASLD、代謝機能障害関連脂肪性肝疾患、MCP-1、単球走化性蛋白質-1、PPI、プロトンポンプ阻害薬、TNFα、腫瘍壊死因子-α、VLDL、超低比重リポ蛋白質。
aP値は全群共通。有意な所見は太字で示した。

表2. - 食道胃内視鏡検査の適応
正常体重（N = 105） 過体重（N = 67） 肥満（N = 42）
食道疾患（GERD、Barrett病、インレットパッチ、嚥下障害、アカラシア、輪状咽頭結節、狭窄） 25 24 12
食道病変（粘膜病変、癌） 2 4 3
胃（ポリープ、胃下垂、潰瘍、腸管形質転換） 14 1 2
機能性（腹部膨満感、IBS、SIBO、消化不良、疼痛） 26 5 4
小腸（セリアック病、憩室、ポリープ、IBD、カプセル所見） 18 19 10
膵胆道（胆管造影、膵病変） 10 7 6
その他（貧血、画像所見、静脈瘤、PEG、Zenker's、肥満） 10 7 5
GERD：胃食道逆流症、IBD：炎症性腸疾患、IBS：過敏性腸症候群、PEG：経皮内視鏡的胃瘻造設術、SIBO：小腸内細菌過剰増殖。

血清：炎症マーカー
循環中の抗炎症性サイトカインと炎症性サイトカインを空腹時血清サンプルで定量した。正常体重の被験者と比較して、過体重および肥満の被験者では絶対値に差は認められなかったが（P > 0.05）、循環TNFα値はBMIと正の相関を示した（Spearman R = 0.171、P = 0.029）。

血清：グルコースとインスリン
平均空腹時グルコース値は、標準体重（97.5±7.2mg/dL）と過体重（98.7±11.9mg/dL、P = 0.55）および肥満（107.21±27.4mg/dL、P = 0.14）の間で同程度であった。 14）、空腹時グルコース上昇の発生率は、予想通り、肥満の被験者（48.3％）対正常体重の被験者（33.8％、χ2P = 0.17、空腹時グルコース範囲≧100mg/dL、表1）でわずかに高かった。グルコース・チャレンジは行わなかったが、空腹時C-ペプチドの平均値は、標準体重の被験者（0.88±0.42ng/mL）に対して、過体重の被験者（1.33±0.68ng/mL、P＜0.0001）および肥満の被験者（1.84±0.93ng/mL、P＜0.0001）で徐々に高くなった（表1）。実際、肥満の被験者のほぼ半数（45％）は空腹時C-ペプチド値が2ng/mLを超えており、これはこれらの被験者の相対的なインスリン抵抗性を反映しているのかもしれない。

血清：脂質
空腹時総コレステロール、コレステロール分画、トリグリセリドのレベルも群間で比較された。過体重の被験者（トリグリセリド＝119.29±77.82mg/dL、総コレステロール＝187.83±47.85mg/dL）と標準体重の被験者（トリグリセリド＝95.44±47.88mg/dL、P＝0.217、総コレステロール＝175.96±41.51mg/dL、P＝0.224、表1）を比較すると、トリグリセリドと総コレステロールの平均値に差はみられなかった。コレステロール分画を個別に分析すると、標準体重の被験者と比較して、過体重の被験者はLDLが高く（P = 0.039）、HDLが低い（P = 0.056）ことがわかった（表1）。

フレデリクソン表現型による脂質異常症のパターンも決定された。脂質異常症を示した正常体重の被験者（N = 12）のうち、75％がIIa型（LDL上昇のみ）、25％がIIb型（LDL上昇と超LDL［VLDL］上昇）であった。このグループでは他の脂質異常症は同定されなかった。過体重の被験者における脂質異常症は、IIa型（41％、オッズ比［OR］2.4、95％CI 0.88-6.75、P = 0.08）、IIb型（41％、OR 7.3、95％CI 2.05-26.17、P = 0.0017）、IV型（VLDLのみの上昇、18％、P = 0.003）であった。

総コレステロールの平均値は、肥満（181.59±55.61mg/dL）と標準体重（175.96±41.51mg/dL、P＝0.75、表1）では差がなかったが、画分を分けて分析すると、HDL値は肥満の方がはるかに低かった（P＝0.02、表1）。さらに、トリグリセリドの平均値は、肥満の被験者（176.63±184.57mg/dL）と標準体重の被験者（95.44±47.88mg/dL、P = 0.014、表1）では高く、肥満の被験者における脂質異常症のパターンはIV型（31％、P = 0.0002）にシフトしていた。 0002）、IIa型（31％、OR 1.8、95％CI 0.55-6.07、P = 0.36）またはIIb型（38％、OR 6.77、95％CI 1.46-27.02、P = 0.0069）であった。

小腸：過体重と肥満に関連するマイクロバイオームの変化-門レベル
小腸（十二指腸）の16S微生物プロファイルを、SIBOを発症していない被験者214人を対象に解析した。ライブラリーのサイズや分布に群間差は認められなかった（OTUに分類されたリードの平均数-標準体重：216,540、過体重：202,431、肥満：178,190、P = 0.18）。そこで、Wald検定と調整P値（有意性＜0.05）を用いて、各群における十二指腸微生物の共有的特徴と条件特異的特徴の両方を決定した。十二指腸微生物の多様性は、体重過多の被験者と標準体重の被験者では高かったが（P = 0.04）、肥満の被験者と体重過多の被験者では差は認められなかった（P = 0.3、補足図1、補足デジタルコンテンツ1、https://links.lww.com/AJG/D239）。

十二指腸マイクロバイオームの分類学的および機能的ポテンシャルは、体重過多および肥満と標準体重の間で有意に異なっていた。十二指腸で最も優勢な門（24）であるファーミキューテス門のRAは、グループ間で差はなかった（補足図2、Supplementary Digital Content 1, https://links.lww.com/AJG/D239）。十二指腸マイクロバイオーム全体の構造では小さな存在であるにもかかわらず、シアノバクテリア門の光合成生物の漸減は、過体重および肥満と関連していた（FC過体重対標準体重＝-2.38、Adj-P値＝3.04E-4；FC肥満対標準体重＝-2.35、Adj-P値＝5.31E-3）。この門に割り当てられた配列は、葉緑体またはシアノバクテリア細胞の摂取に由来するゲノム物質を表すとしばしば仮定される(9,33)が、本研究での違いは、植物由来の葉緑体配列に関連するASVをフィルタリングした後に同定された。したがって、この差は食餌に関連したものではない。十二指腸マイクロバイオームのもう1つの小さな担い手であるSynergistetes門のRAも、BMIの変化と関連しているようであった（Spearman = -0.127、P = 0.063）。興味深いことに、この門のRAは、標準体重と比較して過体重の被験者においてのみ低く（FC = -1.15、P値、9.89E-3、Adj-P値 = 0.05）、標準体重と比較して肥満の被験者では有意差は小さかった（FC = -1.2、P値 = 0.02、Adj-P値 = 0.12）。

小腸：過体重と肥満に関連するマイクロバイオームの変化-家族レベル
ファミリーレベルでは、FCカットオフ値1.5、FDR P値カットオフ値0.05を用いると、33ファミリーおよび28ファミリーのRAが、正常体重と比較して、体重過多および肥満の被験者で統計的に異なっていた（補足図3A、補足デジタルコンテンツ1、https://links.lww.com/AJG/D239）。十二指腸で最も広範に存在する上位15細菌ファミリーのうち、2ファミリー（ファミリーXIおよびFusobacteriaceae）のRAは、標準体重と比較した場合、過体重の被験者ではわずかに低かったが（FC = -0.73、Adj-P-value = 0.03、FC = -0.78、Adj-P-value = 0.03）、肥満の被験者では変わらなかった（補足図3B、補足デジタルコンテンツ1、https://links.lww.com/AJG/D239）。肥満の被験者では、最も広く分布する15科のうち2科が異なっており、正常体重と比較すると乳酸菌科のRAが高く（FC = 3.18, Adj-P-value = 7.96E-5）、レプトトリキア科のRAが低かった（FC = -0.95, Adj-P-value = 0.03、補足図3B, Supplementary Digital Content 1, https://links.lww.com/AJG/D239）。これらの違いはいずれも、体重過多の被験者には見られなかった。

小腸：太りすぎと肥満に関連するマイクロバイオームの変化-属および種のレベル
属および種のレベルでは、137の特徴のRAが、体重過多の被験者と標準体重の被験者で有意に異なっていた（図1）。また、肥満と正常体重の比較では113の特徴が、過体重と肥満の比較では65の特徴が有意に異なっていた（図1）。これらの微生物の変化のほとんどが、いくつかの例外を除いて、小腸ではあまり流行していないファミリーであったこと（おそらくグループの異質性を反映している）、また肥満が進行性の多因子疾患であることを考慮し、疾患の進行との関連で関連する特徴を絞り込む試みとして、（16Sデータセットについて）属および種レベルでの解析に別のアプローチを適用した。過体重および肥満の被験者と標準体重の被験者における、病態特異的な微生物的特徴と共有される微生物的特徴の両方を同定するために、多群間比較が行われた(34)。病態特異的な特徴は肥満特異的または過体重特異的であった（図1）。共有微生物の特徴は、エスカレーション特徴（標準体重から過体重へ、過体重から肥満へと同じ方向に向かう）、または脱エスカレーション（安定化）特徴（逆方向に向かう）のいずれかであった（図1）。全ゲノム（ショットガン）シーケンシングは、種の確認のみを目的として、各グループの被験者のサブセットに適用された（正常体重N = 26、過体重N = 12、肥満N = 14）。

F1
図1： 正常体重、過体重、肥満の各被験者における小腸微生物の属レベルでの違い。FDR、偽発見率。
小腸：体重過多の被験者における特異的微生物の特徴
合計103の微生物の特徴が体重過多特異的であると同定され、そのほとんどが小腸ではまれな属であった（約96％、図2）。最も広く分布している属のうち6つの属（補足図4、補足デジタルコンテンツ1、https://links.lww.com/AJG/D239 参照）のRAの変化は、体重過多の被験者に特異的であった。これには、パラプレボテラ（FC = -9.20、Adj-P値 = 5.67E-32）、エシェリヒア・シゲラ（FC = -6.89、Adj-P値 = 4. 44E-27）、Escherichia属からEscherichia coli（FC=-5.20、Adj-P-value=9.43E-17）と同定された未知の種、Pseudomonas（FC=-1.45、Adj-P-value=0. 05）、Prevotella（FC=1.05、Adj-P-value=0.03）、Lactobacillus属の未知種（FC=2.96、Adj-P-value=1.63E-5、図2）のRAが高かった。興味深いことに、Lactobacillus属のRAは、過体重でIIa型脂質異常症の被験者（N = 9）では、過体重で脂質異常症のない被験者（N = 9, FC = 3.77, P = 0. 04、図2）、乳酸桿菌のRAが高いほど全身のHDLが低いこと（Spearman R = -0.273、P = 0.002）と関連していた。この属の菌種は、便検体を用いた研究（35）において、以前より脂質プロファイルの良好な結果と関連していたにもかかわらずである。

F2
図2： 太りすぎ特有の特徴と微生物代謝経路。
被験者のサブセットで行われた全ゲノム（ショットガン）配列決定では、Paraprevotella属の種は同定されなかったが、K-12株とゲノム上の類似性を共有する大腸菌株のRAが、標準体重の被験者に対して過体重の被験者では低いことが明らかになった（FC = -15、Adj-P値 = 2.2E-14）。合計12菌種と数株のシュードモナスがショットガンで同定され、緑膿菌を含む3菌種を除き、これらの菌種のほとんどのRAが、体重過多の被験者と標準体重の被験者で低いことが確認された（Adj-P値＜0.05）。また、これらの菌種のうち7菌種のRA値は、体重過多の被験者と肥満の被験者とでは低かったが、標準体重と肥満との間では差がなかった。従って、これらの菌種は潜在的な除菌の特徴として再分類された（「小腸：微生物の除菌の特徴」の項を参照）。対照的に、これらのPseudomonasのうち2種-P. parafulvaおよびP. psychrotolerans-は、体重過多の被験者に特異的であることが確認された。

同定されたPrevotella属菌の大部分（95％）は、標準体重と比較した場合、過体重の被験者と肥満の被験者との間に差はなかったが、Prevotella loescheiiのRAは過体重の被験者で高いことが確認された（FC＝5.01、Adj-P-value＝0.01）。合計31種のLactobacillusがショットガンシーケンスで同定され、そのうち4種のRAが体重過多の被験者の十二指腸で高かった： L.acidophilus（FC=20.63、Adj-P値=2.51E-33）、L.hominis（FC=14.71、Adj-P値=5.07E-23）、L.intestinalis（FC=14.13、Adj-P値=7.47E-16）、L.johnsonii（FC=5.65、Adj-P値=3.91E-3）であった。また、L. intestinalisとL. johnsoniiのRAは、肥満と標準体重の間で高かったが（それぞれFC = 14.71、Adj-P値 = 1.91E-18、FC = 6.19、Adj-P値 = 7.69E-4）、過体重と肥満の間に有意差はなく、過体重の被験者に特異的であることが確認された。一方、L. acidophilusとL. hominisのRAは、ショットガンシーケンスから、肥満の被験者と標準体重の被験者の間で差はなかったが、肥満の被験者と標準体重の被験者の間で低かった。したがって、L.アシドフィルス菌とL.ホミニス菌は、潜在的な脱スケーリングの特徴として再分類された（「小腸：微生物の脱スケーリングの特徴」の項を参照）。

十二指腸に最も広く存在する属の上位25には含まれていなかったが、ビフィドバクテリウム属のRAは、より健康的なマイクロバイオームに関連し、体重減少に関連する可能性のある属として広く研究されており、正常体重の被験者と過体重（FC = 4.91、Adj-P値 = 1.79E-18）および肥満（FC = 4.03、FDR P値 = 1.33E-9）の被験者の十二指腸で高かった。合計15種のBifidobacteriumがショットガン配列決定により同定された。これらのうち11種のRAは、標準体重の被験者と過体重および肥満の被験者の十二指腸で高かったが、過体重の被験者と肥満の被験者では差がなかったことから、過体重特異的であることが確認された。

合計65の微生物パスウェイが、体重過多の被験者と正常体重の被験者との間で有意に異なっていたため、十二指腸微生物の変化に関連する最も重要なパスウェイを分離するために、第二の解析アプローチを適用し、高頻度に存在し、豊富なパスウェイ（サンプルあたりの頻度が100％）のみを解析した。過体重の被験者における十二指腸微生物代謝ポテンシャルは、ポリミキシン耐性（FC = -2.06、P値 = 7.36E-5、Adj-P値 = 0.08）、スルホキノボース分解I（FC = -1.79、P値 = 3.05E-4、Adj-P値 = 0.09）、ウルソデオキシキノボース分解I（FC = -1.79、P値 = 3.05E-4、Adj-P値 = 0.08）に関与する経路の減少によって特徴付けられた。 09）、ウルソデオキシコール酸生合成（細菌）（FC＝-1.95、P値＝3.68E-4、Adj-P値＝0.09）、胆汁酸エピメリゼーション（FC＝-1.95、P値＝3.64E-4、Adj-P値＝0.09）、および生体アミン代謝に関与するいくつかの経路（P値＝1.43E-3、Adj-P値＝0.1、図2）。

小腸：肥満患者における特異的微生物の特徴
合計39の十二指腸微生物の特徴が肥満に特異的であると同定された（図3）。これらの分類群のほとんど（60％）のRAが、肥満の被験者の十二指腸では、標準体重の被験者に比べて高かった。十二指腸で最も広く分布している25属（補足図4、補足デジタルコンテンツ1、https://links.lww.com/AJG/D239）において、3つの特徴のRAの変化が肥満に特異的であった。そのうちの1つは、ショットガンによりL. gasseri（FC=4.5、Adj-P値=8.54E-3、図3）と同定された未知のLactobacillus属（Adj-P値<0.05）のRAが高かったことである。一方、L. reuteriの特定1株（rodentium亜種）のRAは、肥満の被験者で低く（FC = -6.75、Adj-P値 = 1.67E-16）、ショットガンシークエンスで確認された（FC = -7.03、Adj-P値 = 1.05E-4、図3）。Leptotrichia属のRAは肥満の被験者でわずかに低かった（FC＝-0.95、FDR P値＝0.03）。ショットガンシークエンシングではLeptotrichia trevisaniiのRAがわずかに低いことが確認された（FC＝-2.61、Adj-P値＝0.1）が、この属の未同定種のRAが肥満の被験者の十二指腸で正常体重の被験者に対して12.67倍低いことも明らかになった（Adj-P値＝2.6E-12）。また、Alloprevotella属のRAは、ショットガンシーケンスによりA. ravaと同定されたが、これも肥満の被験者では低かった（FC = -2.93、Adj-P値 = 0.02、図3）。興味深いことに、Alloprevotella属のRAが低いことは、体重とは無関係に、VLDLとトリグリセリドに関連した脂質異常症（IIbとIV）の被験者と関連しているようであった。体重が正常でIIb型の脂質異常症の被験者と、体重が正常でLDL、VLDL、トリグリセリドが正常範囲の被験者とでは、この属のRAが低いことが確認された（FC = -5.35、P値 = 8.85E-3）。 85E-3）、過体重でIIb型脂質異常症の被験者と過体重でLDL、VLDL、トリグリセリドが正常範囲の被験者では（FC＝-5.26、P値＝6.62E-3、図1）、肥満でIV型脂質異常症の被験者では（FC＝-6.38、P値＝1.32E-3、図3）であった。最後に、肥満被験者の十二指腸微生物代謝能は、生体アミン代謝（FC = -4.62、P値 = 1E-13、Adj-P値 = 1.27E-10）およびスルホアセトアルデヒド分解（FC = -5.02、P値 = 2.54E-13、Adj-P値 = 1.61E-10、図3）に関与する経路の減少によって特徴付けられた。

F3
図3： 肥満特異的特徴と微生物代謝経路。FDR、偽発見率。
小腸：微生物エスカレーション特徴
合計5つの特徴がエスカレーション特徴として分類された（図4）。エスカレーション特徴とは、変化の方向（増加または減少）が標準体重から過体重、肥満のスペクトラムを通して持続する特徴と定義した。 50, Adj-P値=6.48E-29; 肥満 vs 体重過多 FC = -2.56, Adj-P値=0.03; 体重過多 vs 標準体重 FC = -6.94, Adj-P値=6.72E-24）、ブドウ球菌（肥満 vs 標準体重 FC = -6. 29, Adj-P値=2.67E-12;肥満 vs 過体重 FC = -2.92, Adj-P値=0.01;過体重 vs 標準体重 FC = -3.37, Adj-P値=2.65E-9、図4）。2つの特徴のRAは体重の増加とともに徐々に増加し、その中にはMycobacterium属の未知の種も含まれていた（肥満 vs 標準体重 FC = 3.34, Adj-P-value = 2.39E-8; 肥満 vs 過体重 FC = 1.82, Adj-P-value = 6.32E-3; 過体重 vs 標準体重 FC = 1. 52、Adj-P-value = 0.02、図4）、未知の乳酸桿菌種（肥満vs標準体重FC = 4.69、Adj-P-value = 6.17E-14、肥満vs過体重FC = 2、Adj-P-value = 8.73E-3、過体重vs標準体重FC = 2.69、Adj-P-value = 3.21E-6、図4）であった。

F4
図4： 図4：過体重および肥満の被験者の小腸におけるエスカレーションの特徴（標準体重から過体重へ、過体重から肥満へと同じ方向に進む）。FDR、偽発見率。
全ゲノムシークエンシングによる解析では、B. pyogenesとS. hominisの2種が、体重の増加に伴って徐々に減少する種として同定されたが、Faecalibacterium属内の種同定のための情報は得られず、ショットガンシークエンシングでは同属自体も検出されなかった。未同定のマイコバクテリウム属は、未同定種としてデータセットに含まれていたにもかかわらず、ショットガンでは同定できなかった。そのRAは、標準体重と比較して、肥満（FC = 14.47、Adj-P値 = 1.16E-16）および過体重（FC = 15.36、Adj-P値 = 3.09E-17）の被験者でも高かった。さらに、前述のように、いくつかの乳酸桿菌種のRAは、肥満および過体重の被験者と正常体重の被験者とで高かったが、これらのいずれも、より少ないサブセットの被験者から得られたショットガンデータセットを用いて、エスカレーションの特徴として分類することはできなかった。

小腸：微生物の脱エスカレーション特徴
合計29の特徴が脱エスカレーション特徴として分類された（図5）。脱スケール特徴とは、標準体重から過体重になるにつれて見られる変化の方向（増加または減少）が、過体重から肥満になるにつれて逆になる微生物の変化と定義した。このうち、ラクトバチルス属、プレボテラ属、シュードモナス属の未知の3種は、十二指腸で最も広く分布している属の上位25位に入っていた。

F5
図5： 過体重および肥満の被験者の小腸における脱スケール（安定化）の特徴（逆方向に進む）。FDR、偽発見率。
ショットガン解析により、脱スケーリングの特徴として3種の乳酸菌が同定された（図5）。L.アシドフィルス菌とL.ホミニス菌のRAは、体重過多の被験者と標準体重の被験者とでは（それぞれFC = 20.63, Adj-P-value = 2.51E-33; FC = 14.71, Adj-P-value = 5.07E-23）、肥満の被験者では（それぞれFC = 20.34, Adj-P-value = 3.38E-23; FC = 14.44, Adj-P-value = 1.48E-15）高かったが、肥満の被験者と標準体重の被験者とでは有意差はなかった。第3の種であるL. inersのRAは、体重過多の被験者と標準体重の被験者（FC = -15.06、Adj-P値 = 1E-11）および肥満の被験者（FC = -14.26、Adj-P値 = 4.64E-9）では低かったが、肥満の被験者と標準体重の被験者との間に有意差はなかった。

前述のように、ショットガンシーケンスにより、同定されたPrevotellaのほとんどの種（95％）は、肥満の被験者でより高いRAを示したPrevotella loescheiiを除いて、グループ間で差がなかった。2菌種（ショットガンでは未同定のまま）のRAは、体重過多の被験者と標準体重および肥満の被験者とでは高かったが、肥満の被験者と標準体重の被験者とでは有意差はなかった（P値＜0.05、Adj-P値＜0.05）。

P.putidaおよびP.fluorescensを含む7種のPseudomonasのRAは、体重過多の被験者と標準体重および肥満の被験者とでは低かったが、肥満の被験者と標準体重の被験者とでは有意差はなかった。

ビフィドバクテリウム属の1種であるB. dentiumは、標準体重（FC = -19.23、Adj-P-value = 3.42E-11）および肥満（FC = -17.55、Adj-P-value = 5.04E-7）に対する過体重の被験者では、十二指腸におけるRAが低く、脱スケールの特徴として同定されたが、肥満と標準体重（FC = 1.68、Adj-P-value = 0.98）の間に有意差はなかった。

考察
本論文では、代謝活性の高い小腸内の特定の微生物と過体重および肥満とを関連付けた、これまでで最大規模の研究を紹介する。肥満は進行性の疾患であり、特定の小腸微生物はさらにエスカレーションまたは脱エスカレーションの特徴に分類することができ、それらは過体重から肥満への進行の悪化または減衰・安定化に関連する可能性があることも示した。興味深いことに、ほとんどの知見は小腸に特有のものであるが、ビフィドバクテリウム属やラクトバチルス属など、便サンプルを用いた研究で以前から肥満と関連していた属も、小腸マイクロバイオームの主要な担い手として同定された。例えば、ビフィドバクテリウム・デンティウム（Bifidobacterium dentium）は、脱肥満機能として分類され、正常体重の被験者の小腸マイクロバイオームで濃縮されている。Lactobacillus属に関する知見は種に大きく依存し、脱エスカレーション機能として分類される種（L. acidophilusなど）もあれば、肥満の被験者で濃縮される種（L. gasseriなど）もある。

肥満は複雑な多因子疾患であり、しばしばメタボリックシンドローム、高脂血症、T2Dなどの病態を伴う(4,5)。現在、肥満の病態生理には、食物摂取とエネルギー消費に影響を及ぼす内因性因子（遺伝学、エピジェネティクス、腸内細菌叢、腸内ホルモンなど）、環境因子、社会経済的因子、心理社会的因子が相互に関与していると理解されている(36)。腸内微生物は、代謝と食物吸収に影響を及ぼすもう一つの因子であり、微生物に基づく治療薬の開発が急速に進んでいる。しかし、肥満に対する微生物ベースの治療薬のほとんどは、腸内細菌叢全体の代用として便を用いた研究に基づいて開発されたものである。

なぜ小腸マイクロバイオームに注目するのか？食物代謝や栄養吸収に関連する多くの機能が小腸に集中しており、また内分泌機能や免疫機能も肥満の発症に影響を及ぼす可能性があるため（37）、結果として小腸の微生物集団のバランスが乱れると、体重増加に大きな影響を及ぼす可能性がある。さらに、上述のように、小腸の微生物集団は便の微生物集団とは異なっている。例えば、バクテロイデーテス門は小腸ではかなり少なく、肥満のマーカーとしてよく挙げられるファーミキューテス門：バクテロイデーテス門の比率が小腸で何らかの関連があるという証拠はない。実際、我々は、過体重または肥満の被験者において、ファーミキューテス属を含む十二指腸で最も一般的な門のRAに変化を認めなかった。ファーミキューテス門の中では、ラクトバチルス属が便の研究で肥満と強く関連している。しかし、十二指腸の乳酸菌集団は、過体重や肥満と種および菌株特異的な関連を示し、L. intestinalisとL. johnsoniiは過体重の被験者に特異的であるのに対し、L. reuteriとL. gasseriは肥満の被験者に特異的であるようである。L. reuteriとL. gasseriの異なる菌株を用いたこれまでの介入研究では、体重管理に関連した相反する結果が得られているが、これはおそらく特定の菌株の炭水化物代謝能と脂質代謝能に重要な違いがあるためであろう（38-41）。世界中で様々な乳酸菌含有製剤が広く消費されていることを考慮すると、体重増加／減少とのこうした菌株特異的な関連性は特に重要である。

さらに、今回同定された体重増加に関連する乳酸菌株は、チオラーゼのような脂質代謝に関与する酵素を保有しており、最終的には小腸での脂肪消化・吸収の効率化につながる可能性がある(39)。脂肪の代謝と吸収は胆汁酸によって促進され、胆汁酸プールの多様性と組成の乱れは、主に腸内細菌によって調節される(42)が、脂質代謝の調節異常や過体重・肥満とも密接に関係している(43,44)。例えば、Alloprevotella ravaは体重とは無関係にIIb型およびIV型の脂質異常症と関連しており、一方、未同定の乳酸桿菌1種は特に太り過ぎの被験者におけるIIa型の脂質異常症と関連している。また、これらの被験者では、小腸における胆汁酸のエピマー化に関連する微生物経路も障害されているようである。

我々の研究では、L.アシドフィルスを含む3種の乳酸菌がさらに脱スケーリングの特徴に分類されている。この菌種は、ヒトを対象とした介入研究において、より一貫した転帰と関連しており、L.アシドフィルス菌の単一菌株による単剤療法は、動物実験において体重増加と関連していた(45)。脱エスカレーションの特徴は安定化のマーカーである可能性があり、体重管理治療薬の潜在的なターゲットとなる。B.dentiumとゲノムの類似性を持つビフィドバクテリウム属の1種もまた、脱エスカレーション機能として同定され、他の11種のビフィドバクテリウム属のRAは、過体重や肥満の被験者と比較して、正常体重の被験者の十二指腸でより高い。これらの所見は、B. longum、B. bifidum、B. breve、B. infantisなどのビフィズス菌種が抗肥満作用を持ち、内臓脂肪組織、BMI、ウエスト周囲径、血中トリグリセリド、脂肪肝と逆相関することを示したいくつかの研究と一致している（46,47）。

慢性的な低悪性度の全身および局所炎症は、インスリン抵抗性の亢進や脂質異常症など、肥満に関連する複数の代謝性疾患の病因における重要な構成要素である(48)。細菌株は、炎症性サイトカインの減少（L. rhamnosusやParabacteroides distasonisなど）や生体アミンの産生・代謝（B. animalisなど）など、様々な方法でこれらの影響を調節する。生体アミンは、全身および局所的な腸の炎症を制御し、活性酸素を消去することで酸化ストレスを防ぎ、炎症性サイトカインの放出とインフラマソームの形成を抑制し、脂肪形成を制御する上で中心的な役割を果たしている(49)。本研究では、過体重および肥満の被験者の十二指腸では、微生物による生体アミンの代謝能が低下しているようであり、炎症が亢進する可能性が示唆された。これと一致して、BMIの高値と全身TNFα値の高値との間に関連が認められた。

この研究は、過体重および肥満における十二指腸マイクロバイオームに関するこれまでで最大の研究であるが、いくつかの小規模な研究では、肥満および関連する代謝状態における小腸マイクロバイオームについても検討されている（Steinbach et al (50)に総説あり）。残念なことに、レビューの著者が指摘しているように、サンプリング技術や場所、研究対象集団、研究条件の違いにより、結果を比較することはほとんど不可能である。研究コホートは10人から66人で、高血糖被験者と正常血糖被験者（51）、Homeostatic Model Assessment for Insulin Resistanceが低いか高い被験者とメトホルミンを服用しているT2D被験者（52）、さらに肥満（53-56）、肥満とT2D（53,54）を比較した。これらの研究のうち1件以外はすべて、十二指腸管腔サンプルではなく空腸サンプルまたは十二指腸生検を用いており、そのうちの数件は、被験者が微生物叢を変化させる可能性のある超低カロリー食を摂取した後、肥満手術または胃バイパス手術の際に得られたものであった(50)。十二指腸腔サンプルを使用した唯一の研究は、試験食条件下でサンプルを採取したもので、著者は腸内細菌叢の研究用に設計されたものではないことを認めている(56)。当然のことながら、われわれの所見とこれらの先行研究で得られた所見との間には、正常体重の被験者におけるビフィズス菌種の減少（54）、高血糖の被験者におけるTNFαレベルの上昇（51）を除いて、ほとんど一致点はなかった。しかしながら、様々な研究著者らは、小腸を研究することの重要性とともに、これまでの吸引採取法の限界、特に口腔内や食道内の微生物による汚染の重大な危険性を認識していた。われわれの研究は、滅菌ダブルルーメンカテーテルと粘液溶解剤を用いて小腸粘液中の微生物を放出させた初めてのものであり、この分野でこれまで満たされていなかったニーズに応えるものである。

この研究にはいくつかの限界がある。第一に、われわれの対象集団は不均一であり、上部内視鏡検査の適応も異なっていた。食事はコホート全体で標準化されていなかったが、これは十二指腸では重要な制限ではないかもしれない(57)。さらに、ショットガンシークエンシングは被験者のサブセットでのみ実施されたが、これらは大規模コホートをできるだけ代表するように慎重に選択された。ショットガンシークエンシングでは確認できなかった生物種もあり、より詳細なシークエンシングを行えば、これらの生物種を明らかにできた可能性がある。最後に、サンプルは1つのタイムポイントでのみ得られたため、明確な因果関係を確立することはできない。

結論として、我々は、過体重および肥満と関連する小腸微生物種、ならびに治療標的として選択される可能性のあるエスカレーションおよび脱エスカレーションの特徴を同定した。乳酸菌種は、非エスカレーション特徴として同定された3種、L. acidophilus、L. hominis、L. inersを含む、明確かつ重要な役割を担っているようである。ビフィズス菌の短鎖脂肪酸産生における役割とその抗肥満作用の可能性を考えると、これは興味深いことである。これらの知見は、便研究は非常に貴重なデータを提供することが可能であり、これまでも提供してきたが、小腸の直接分析により、さらなる研究のための特定のターゲットが得られたことを示している。次のステップとしては、同定された微生物の特徴を動物モデルで試験し、潜在的な治療戦略を開発することである。

利益相反
本論文の保証人： Ruchi Mathur医学博士。

特定の著者の貢献： R.M.およびM.P.：概念化。A.H.およびM.R.：リソース。G.L.、G.B.、G.P.、S.W.、W.M.：調査。G.L.、A.R.、M.P.：形式分析。G.B.、M.P.、R.M.：プロジェクト管理。G.L.、G.B.、D.C.、R.M.：執筆（初稿）。G.L.、G.B.、A.R.、M.P.、R.M.：執筆-校閲・編集。

資金援助： 本研究の一部はThe Monica Lester Charitable TrustおよびThe Elias, Genevieve, and Georgianna Charitable Trustからの資金援助を受けた。

競合する可能性のある利益： 報告すべきものはない。

研究ハイライト

知っていること
便の研究から、過体重や肥満では腸内微生物の集団が変化していることが示されている。
便の研究により、アッカーマンシア、ビフィズス菌、乳酸桿菌の変化が肥満と関連している。
小腸マイクロバイオームの構成は便のそれとは大きく異なる。
過体重や肥満における小腸内微生物の役割はよくわかっていない。
ここでの新事実
小腸（十二指腸）マイクロバイオームは、過体重および肥満の被験者と正常体重の被験者とで有意に変化している。
特定の微生物変化は過体重特異的あるいは肥満特異的であり、その他はエスカレーションあるいは脱エスカレーションの特徴である。
ビフィドバクテリウム・デンチウムは脱エスカレーション特徴であり、既知の抗肥満効果と一致する。
ラクトバチルス・ガセリの変化とL.ロイテリの減少は肥満特異的であるが、L.アシドフィルスとL.ホミニスは非エスカレーション的特徴である。
✓ 特定の乳酸菌種はIIa型脂質異常症に、Alloprevotella ravaはIIb型およびIV型脂質異常症に関連している。
謝辞
著者らはREIMAGINE Study Groupの試料入手の協力に感謝する。REIMAGINE Study Groupには、Christopher Almario MD, FACG, Benjamin Basseri MD, Yin Chan MD, Bianca Chang MD, Derek Cheng MD, Pedram Enayati MD, Srinivas Gaddam MD, Laith Jamil MD, FACG, Quin Liu MD, Simon Lo MD, Marc Makhani MD、 Deena Midani MD, Mazen Noureddin MD, FACG, Kenneth Park MD, Shirley Paski MD, Nipaporn Pichetshote MD, Shervin Rabizadeh MD, Soraya Ross MD, Omid Shaye MD, Rabindra Watson MD, Ali Rezaie MD, Mark Pimentel MD, FACG. また、Maria Jesus Villanueva-Milan（PhD）、Maritza Sanchezにはサンプル処理と解析を手伝ってもらった。最後に、MASTプログラムを寛大に支援してくれたFrank Lee、Monica Lester Charitable Trust、Elias, Genevieve, and Georgianna Charitable Trustに感謝する。

参考文献

  1. ファクトシート-肥満と過体重。世界保健機関： スイス、ジュネーブ、2020年
    引用はこちら

  2. 疾病対策予防センター。成人肥満の実態。2020. (https://www.cdc.gov/obesity/data/adult.html). 2023年7月12日アクセス。
    引用：Google Scholar

  3. 米国疾病予防管理センター。体重過多と肥満。2022. (https://www.cdc.gov/obesity/index.html). 2023年7月12日アクセス。
    参考文献一覧を見る
    キーワード
    小腸マイクロバイオーム；肥満；過体重；ビフィズス菌；乳酸菌；生体アミン代謝；脂質異常症

補足デジタルコンテンツ
AJG_2024_04_02_MATHUR_23-2490_SDC1.pdf; [PDF] (872 KB)
著作権 © 2024 著者(複数可). 米国消化器病学会（The American College of Gastroenterology）の委託によりウォルターズ・クルワー・ヘルス社（Wolters Kluwer Health, Inc.
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