RamDA-seqとCas9ベースのrRNA枯渇を利用した細菌単細胞RNAシーケンスの感度向上

バイオサイエンス・バイオエンジニアリング誌
2023年6月11日オンライン公開
In Press, Corrected Proofこれは何だ？
RamDA-seqとCas9ベースのrRNA枯渇を利用した細菌単細胞RNAシーケンスの感度向上

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1389172323001433?dgcid=author

著者リンクオーバーレイパネル西村美香1、竹山晴子1 2 3 4、細川雅仁1 2 3 4
もっと見る
概要
シェア
引用元
https://doi.org/10.1016/j.jbiosc.2023.05.010Get 権利と内容
細菌集団は遺伝子発現の不均一性を示し、ベットヘッジ戦略による不安定で予測不可能な環境に対する生存と適応を容易にしている。しかし、集団レベルの遺伝子発現解析を用いて、希少な亜集団や遺伝子発現の不均一性を解明することは、依然として困難な課題である。シングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）は、細菌集団の希少なサブ集団を特定し、不均一性を捉える可能性があるが、真核生物と原核生物のmRNA量や構造の違いなどから、細菌におけるscRNA-seqの標準手法はまだ開発中である。本研究では、細菌におけるscRNA-seqのために、ランダム置換増幅シーケンス（RamDA-seq）とCas9ベースのrRNA枯渇を組み合わせたハイブリッドアプローチを紹介します。このアプローチでは、低存在量のバクテリアRNAからcDNA増幅とそれに続くシーケンスライブラリ調製が可能です。我々は、Total RNAの希釈系列または大腸菌の選別された単一細胞から、そのシーケンシングリード比率、遺伝子検出感度、および遺伝子発現パターンを評価した。その結果、大腸菌ゲノムの約24%に相当する1000以上の遺伝子を、従来法と比較して少ないシーケンス作業で単一細胞から検出できることが示された。また、異なる細胞増殖状態や熱ショック処理の間で遺伝子発現のクラスターを観察した。本アプローチは、現行の細菌scRNA-seq法と比較して、遺伝子発現解析において高い検出感度を示し、細菌集団の生態を理解し、細菌遺伝子発現の不均一性を捉えるための貴重なツールであることが証明されました。
キーワード
細菌
シングルセルRNA-Seq
CRISPR-Cas9
シークエンシング
バイオインフォマティクス
細菌の遺伝子発現は、同一条件下で培養された集団内でも、本質的に不均一である(1)。この遺伝子発現の不均一性は、細菌集団がベットヘッジ戦略によって不安定で予測不可能な環境に適応し、生き残るために不可欠である（2,3）。機能分化した亜集団は、抗菌剤耐性を獲得するなど、細菌集団の生存に重要な役割を果たす。このような細菌集団の生態を理解し、細菌機能を明らかにするためには、包括的な異種遺伝子発現状態を捉えることが必要である。しかし、集団レベルでの遺伝子発現解析では、希少な亜集団の遺伝子発現状態を明らかにすることは困難である。
シングルセルRNAシーケンス（scRNA-seq）は、希少な亜集団を検出し、細胞集団の不均一性を捉えることができる可能性を持っています（4,5）。scRNA-seqは真核細胞では広く使われていますが（6,7,8,9）、細菌ではまだ発展途上であり、標準的な方法はまだ確立されていません（10,11）。これは、真核生物と原核生物のmRNAの存在量や構造の違いに起因する。各細胞に存在する原核生物のmRNAは、ヒトのmRNAに比べ2桁も少ない。また、ポリ（A）テールを持たないため、全RNAの90%以上を占めるリボソームRNA（rRNA）との分離が困難である(12)。最近、細菌のscRNA-seqの方法がいくつか報告されているが（4,5,13, 14, 15, 16, 17）、いずれも検出感度が低く、全遺伝子の5％程度しか検出されないという問題がある。一方、細菌集団レベルのバルクRNA-seqでは、通常約70-80%の遺伝子が検出されることから、現在の細菌scRNA-seq法の検出感度を向上させる必要があることがわかります。
ポリ（A）テールに依存しない全RNA逆転写法を用いて細菌のmRNAを捕捉することは、細菌のscRNA-seqに有望である。ランダムプライミングに基づく哺乳類のscRNA-seq法であるRamDA-seq（6）は、非ポリ（A）RNAからも全長転写物をほぼ完全にカバーすることができる。捕捉した全RNAのうち、存在量の少ないタンパク質コードRNAを効率よく検出するためには、rRNAを対象とした枯渇処理工程が必要である。rRNA分子を直接標的とする市販のrRNA除去キットもありますが、数ng以上の入力RNAを必要とし、バルクRNA-seq向けに設計されています。細菌細胞1個に含まれるRNA量は約0.2pgであり、これらの従来型キットを細菌のscRNA-seqに適応することは不可能である。Cas9を用いたrRNA枯渇法（18）は、RNAを逆転写しcDNAを増幅した後、相補的DNA（cDNA）分子に対して行うため、rRNA分子を直接標的とする従来の枯渇法と比べて、ngスケールの増幅cDNAに適用できることから、低存在の細菌のmRNAを検出できる可能性があります。
本研究では、RamDA-seqとCas9ベースのrRNA枯渇を組み合わせたハイブリッドアプローチを開発し、細菌scRNA-seqを目指した。大腸菌のtotal RNAの希釈系列を用い、シーケンスのリードレート、遺伝子検出感度、異なるサンプル間の遺伝子発現パターンの相関を評価しました。次に、この方法を固定・選別した大腸菌細胞に適用し、遺伝子検出感度を評価し、処理条件を最適化した。本手法は、単一細菌細胞から大腸菌ゲノムの24%の遺伝子を検出し、異なる細胞状態間の固有の遺伝子発現パターンを明らかにしました。現在の細菌scRNA-seq法と比較して、本手法は高い検出感度を示した。細菌の遺伝子発現の不均一性を捉え、細菌集団の生態を理解するための貴重なツールとなる可能性がある。
材料と方法
細菌株と増殖条件
大腸菌K-12株の一晩培養液を新鮮なLB培地に1：50で接種し、37℃で200rpmで振盪しながら培養した。OD600が0.4（対数期）または2.1（定常期）に達した時点で細胞を回収した。対数期細胞を47℃で8分間加熱し、ヒートショックポピュレーションを行った。採取した各細胞懸濁液を4℃、5000×g、5分間遠心分離して上清を除去し、4％PFAでよく懸濁し、4℃、30分間インキュベートした。固定後、細胞を4℃、8000×g、5分間遠心分離して上清を除去し、500μLのPBS（0.05U/μL RNase Inhibitor, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）で2回洗浄した。洗浄後、細胞をRNase Inhibitorを含む500μLのPBSに懸濁した。
単一菌の単離
大腸菌の細胞は、BD FACS Melodyを使用して、RamDA Cell Lysis Kit（東洋紡、大阪、日本）の1μLの溶解バッファーをあらかじめ充填した8ウェルチューブまたは96ウェルプレートに選別された。トータルRNA希釈系列については、代わりに1U RNasein plus (Promega, Madison, WI, USA), 10% RealTime ready Cell Lysis Buffer (Roche, Basel, Switzerland), 0.3% NP40 (Thermo Fisher), and RNase-free water (Takara Bio, Shiga, Japan) を含む溶解バッファーを使用しました。選別された細胞は、4℃、10,000×gで1分間遠心分離し、4℃、2000rpmで30秒間混合し、-80℃で保存した。
ラムダセック
各濃度（20、2、0.2、0.02 pg）に希釈した大腸菌トータルRNA（Thermo Fisher Scientific）を1 μLの溶解バッファーに入れたもの、または-80 ℃ストックから解凍した選別大腸菌細胞を70 ℃で1.5分間インキュベートして氷上に保存しました。
RamDA-seqは、オリジナルのプロトコル(6)に従って実施した。ゲノムDNA消化液（5×RT Buffer（タカラバイオ）0.1μL、DNase I（Thermo Fisher Scientific）0.2μL、RNaseフリー水0.7μL）1マイクロリットルを加えて混合し、30℃で5分間インキュベートし、氷上保管した。RT-RamDA溶液1μL（5×RTバッファー0.5μL、20×Enzyme Mix（タカラバイオ）0.15μL、1mg/ml T4 gene 32 protein（New England Biolabs, Ipswich, MA, USA）0,1μL, 0. 08 μLの100μMランダム6mer（Takara Bio）および0.17μLのRNaseフリー水）を加えて混合し、25℃で10分間、30℃で10分間、37℃で30または120分間、50℃で5分間、および94℃で5分間インキュベートした。2マイクロリットルの第2鎖合成溶液を加えて混合し、16℃で60分間、80℃で15分間インキュベートした。第二鎖合成溶液は、0.5μLの10×NEB buffer 2（New England Biolabs）、0.5μLの2.5mM dNTPs（Takara Bio）、 0.4μL の100μMランダム6mer、 0.15μL のKlenow Fragment（New England Biolabs）、 0.45 μLのRNaseフリーウォーターを含む。生成物は、次のライブラリー調製ステップに進むまで-30℃で保存した。Nextera XT DNA Library Preparation Kit (Illumina Co., San Diego, CA, USA)を用いて精製した第2鎖合成産物を用いてシーケンスライブラリを作成した。AMPure XPビーズ（Beckman Coulter, Brea, CA, USA）を用いて、ビーズとアンプリコンの比率を1：1.2（v/v）でライブラリーを精製した。96ウェルプレートで処理されたライブラリーは、プレートごとにプールされ、その後精製された。精製したライブラリーのフラグメントサイズ分布をD5000 ScreenTape with TapeStation 4200 (Agilent, Santa Clara, CA, USA)で測定し、濃度をQubit dsDNA HS assay kit (Thermo Fisher Scientific) で測定しました。
スマートセック2
5μLで各濃度（20、2、0.2pg）に希釈した大腸菌トータルRNAを、15μLのポリ（A）溶液（1μLの10×ポリ（A）ポリメラーゼ反応バッファー（New England Biolabs）、0. 4 μL of 10 mM ATP (New England Biolabs), 0.1 μL of E. coli Poly(A) Polymerase (New England Biolabs), 12.5 μL of RT-PCR grade water (Thermo Fisher Scientific) and 1 μL of RNase Inhibitor) と共に37℃、10分インキュベートした。ポリアデニル化された大腸菌全RNAを、RNAclean XPを用いて、ビーズとRNAの比率が1：1.8（v/v）の割合で精製した。精製した産物を、SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing（タカラバイオ）を用いて、メーカーの説明書に従って逆転写・増幅させた。Nextera XT DNA Library Preparation Kitの1/4ボリュームを用い、メーカーの説明書に従ってライブラリーを調製した。
rRNAの枯渇
精製したライブラリーは、CRISPRclean Pan-Bacterial rRNA Depletion Kit (Jumpcode Genomics, San Diego, CA, USA) を用いて、メーカーの指示に従ってrRNAの枯渇処理を行った。
塩基配列の決定
シーケンスライブラリーのフラグメントサイズ分布をD5000 ScreenTape with TapeStation 4200で測定し、濃度をKAPA library quantification kit (Kapa Biosystems, Wilmington, MA, USA)で測定した。プールしたライブラリーは、Illumina Nextseq2000 system paired-end 2 × 50 cycles configurationを用いて配列決定した。
データ解析
Cutadapt v1.18 (19)を用いて、fastqファイルからアダプター配列とショートリードを除去した。通過したリードは、STAR v2.6.1c (20)を用いてデータベースEnsembl上の大腸菌K-12参照配列 (GCA_000005845)にマッピングされた。カウントデータはfeatureCounts v1.6.4 (21)で取得し、TPMはRSEM v1.3.1 (22)で算出した。大腸菌集団の転写状態の違いを解析するため、カウントデータを正規化し、Seurat v4.2.0 (23)を用いてクラスタリングと差分発現解析を実施した。
データの利用可能性に関する記述
シーケンスデータは、BioProject PRJNA963003としてNCBIデータベースに寄託されている。
結果および考察
抽出された細菌RNAに対するCas9ベースのrRNA枯渇を伴うRamDA-seqの評価
高感度な細菌scRNA-seq法を実現するために、全長total RNAシーケンス法であるRamDA-seqと、完全に調製したシーケンスライブラリに適用する方法であるCas9ベースのrRNA depletionを組み込んだアプローチを開発しました。シーケンシングライブラリーは、RNAから直接グローバルcDNA増幅を行い、Nextera XT DNA Library Preparation Kit (6,23) で調製した。次に、このライブラリーを、細菌rRNAコード領域に相補的な配列からなるガイドRNAを採用したCRISPR-Cas9反応ベースのCRISPRclean Pan-Bacterial rRNA Depletion Kitで処理しました。大腸菌のtotal RNA希釈系列への適用と、少量の細菌RNAからのRNA-seqへの評価を通じて、このアプローチの実現可能性を検証しました。RNAテンプレートは、細菌細胞100個分に相当する20 pgから、細菌細胞1個分の1桁以下の0.02 pgまでであった。平均ライブラリー長が400bp以上、濃度が5μM以上のNextera XTベースのシーケンスライブラリーをすべての条件から取得し、シーケンスした。
最初に、配列決定リード（表S1、各条件のトリプリケート）を参照ゲノムにマッピングして、その注釈を評価した（図1A）。平均マッピング率は20 pg RNAで最も高く、rRNA枯渇なしでは88.5%、rRNA枯渇では80.3%であった。RNAテンプレートの量が減るにつれてマッピング率は低下したが、単一細胞に相当する0.2 pg RNAテンプレートでのマッピング率は、rRNA枯渇なし84.5％、rRNA枯渇あり61.2％だった。PCRの重複の割合は、rRNA枯渇のないサンプルでは60～80％、rRNA枯渇のあるサンプルでは90％以上であった。rRNA欠失でPCR重複の割合が増加した理由は、rRNA欠失反応後にPCR増幅が追加されたためと考えられる。rRNA枯渇によるマッピング率の低下は、他の細菌、ウイルス、ヒトを中心とした真核生物からの汚染RNAによる未マッピングリードが原因であることに気づきました。rRNA枯渇のような実験工程が増えることで、核酸汚染リスクが高まる。そのため、細菌のscRNA-seqでは、クリーンな実験環境で厳密に実験することが必要だと考えました。真核生物のscRNA-seqの確立された手法のマッピング率は60～80％程度であることから（24）、本手法のマッピング率は、遺伝子発現情報を効率的に取得するために十分なレベルであることが証明された。20pgのRNAテンプレートでは、rRNA欠失処理により、マッピングリード中のmRNAリードが18倍（平均）に濃縮され、全リードの36.7%を占めた。2pgのRNAテンプレートでは、rRNA欠失処理によりmRNAリードが15倍（平均）濃縮され、全リードの32.4%を占めた。mRNAリードの濃縮に対するrRNA欠失の効果は、RNAテンプレートの量が減少するにつれて減少する傾向にあった。しかし、100細胞相当のRNAテンプレート20pgから1細胞相当のRNAテンプレート0.2pgまで、効果の減少は有意ではなく、1細胞レベルの低量の細菌RNAで安定したmRNA濃縮が可能であることが示された。
ダウンロード ： 高解像度画像ダウンロード(585KB)
ダウンロード フルサイズ画像のダウンロード
図1. 単一細胞に相当する低投入総RNAからCas9によるrRNA枯渇を伴うRamDA-seqを用いた細菌RNAシーケンスの評価。(A) 0.02 pgから20 pgの大腸菌total RNAからrRNA枯渇あり(+)となし(-)で得られたシーケンスのリードの割合。パーセンテージはトリプリケートの平均値として計算した。(B) 全ライブラリーで検出された遺伝子数（n = 3, read count > 0）。(C) 全ライブラリーで解析した遺伝子発現パターンの相関性。(D) RamDA-seqライブラリとSmart-seq2ライブラリから得られたspcリボソームタンパク質オペロン（rplNXE-rpsNH-rplFR-rpsE-rpmD-rplO-secY-rpmJ、5531 bp）のマッピングリードの代表的可視化。
検出された遺伝子数（リードカウント＞0）はテンプレート量に比例した（図1B、トリプリケートの平均値）。最も検出された遺伝子数は、rRNAを枯渇させたRNAテンプレートを20 pg用いた場合で、2735遺伝子（2685、2743、2777の平均値）となり、全体の約60％が検出された。0.2pgのRNAテンプレートから検出された遺伝子数は、rRNA枯渇なしが1002（平均989、997、1019）、rRNA枯渇ありは982（平均941、1033、972）でした。抽出したtotal RNAを用いた過去のscRNA-seq研究で検出された遺伝子数は、1細胞あたり500個程度である（17）。先行研究と比較して、本アプローチは、単一細胞に相当する少量の細菌RNAから高感度で転写産物を検出できることを示唆している。また、rRNA枯渇の有無に関わらず、cDNA増幅効率を高めるRamDA-seqの特徴を反映し、高感度の転写物検出が得られている。
次に、遺伝子検出の再現性を評価した（図1C）。RNAテンプレートの量が多いほど、レプリケート間の測定再現性は高くなるが、0.02 pgを除き、異なる量のRNAテンプレート間でも高い相関性を示した（R > 0.96）。これらの結果は、Smart-seq2を用いて得られた結果（20 pg vs. 0.2 pg, R = 0.65）よりも高いものでした。100個の細胞に相当する20 pgのRNAテンプレートから得られた遺伝子発現パターンは、レプリケート間で高い再現性を示した（rRNA枯渇時R = 0.97, rRNA枯渇時R = 0.98）．また、細胞1個分に相当する0.2 pgのRNAテンプレートから得られた遺伝子発現パターンも、リプリケート間で高い再現性を示しました（R = 0.96 以上、R = 0.99 以上、rRNA枯渇時）。少量の細菌RNAから転写物を捕捉する本アプローチの再現性の高さが実証された。
転写物のカバレッジを評価するために、大腸菌のリボソームタンパク質（rタンパク質）をコードする遺伝子を組織するオペロン（rplNXE-rpsNH-rplFR-rpsE-rpmD-rplO-secY-rpmJオペロン、5531 bp）の一つ、spcオペロンというオペロンのマッピング領域（図1D）を可視化しました（図1） (25). RamDA-seqでは、すべてのRNAテンプレートレベルで、rRNA枯渇処理あり（図1D）および処理なし（図S1）のオペロンについて全長カバーが得られた。マップされた配列の幅に有意差がないことから、検出された遺伝子の数はrRNA枯渇の有無にかかわらず同程度であることが裏付けられた（図1B)。一方、配列深度は、rRNA枯渇ありの条件では、rRNA枯渇なしの条件よりも10倍以上大きく、rRNA枯渇ありのmRNAリードの割合が豊富である図1Aの結果と相関しています。一方、同じテンプレート量からSmart-seq2を用いて作成したライブラリーは、RNAテンプレート量20 pgでほぼ全長カバレッジを示したが、RNAテンプレート量2 pg以下では領域カバレッジしか観察されなかった（図1D）。これらの結果から、RamDA-seqによる全トランスクリプトーム増幅は、原核生物のmRNAの特徴であるオペロン単位の長い転写物の検出にも優れていることが示唆されました。
全体として、RamDA-seqは細菌RNAから単細胞レベルで再現性のある偏りのない遺伝子発現情報を得ることができました。検出された遺伝子数は、Total RNAレベルでは従来の方法よりも多かった。また、全長転写産物の捕捉は、細菌の特徴的な転写単位であるオペロンを順次捕捉するのに有効であった。さらに、mRNAの濃縮度を高めるためにrRNAの枯渇が有効であることが確認され、シーケンスの手間を軽減することができた。
細菌単一細胞に対するRNA-seqの反応条件の最適化
RamDA-seqとCRISPR-Cas9ベースのrRNA枯渇を組み合わせたアプローチを、細菌細胞に適用しました。バルク集団から抽出した低インプットのtotal RNAを用いた検証に続き、このアプローチはマイクロチューブまたはウェルプレートでソートした単一の大腸菌細胞で検証されました。細菌scRNA-seqでは、細胞溶解までのサンプル保存や処理に影響されないオリジナルの遺伝子発現情報を取得できるように、細菌細胞を固定することが多い。我々は、固定された細胞と固定されていない細胞について我々のアプローチを評価し、遺伝子検出感度に対する固定の影響を調査した。
total RNAの場合と同じ条件下で、rRNAの枯渇はmRNAの読み取り率を約2.1倍に高め（図2A、平均）、非固定大腸菌細胞では検出遺伝子数を119個増やした（図2B、平均）。固定細胞では、mRNAリード濃縮に対するrRNA枯渇の影響と検出遺伝子数の増加は減衰し、%mRNA (mRNA reads per mapped reads) は非固定細胞の約1/5に減少し、検出遺伝子数は70%未満に減少した（平均）。固定とrRNA枯渇で検出された遺伝子数は、0.2 pgのtotal RNAから検出された遺伝子数の約65%（平均値）であった。
ダウンロード 高解像度画像ダウンロード(326KB)
ダウンロード フルサイズ画像のダウンロード
図2. 固定した大腸菌単細胞からCas9ベースのrRNAを枯渇させたRamDA-seqにおける遺伝子検出感度の向上。(A) 逆転写（RT）反応時間、細胞固定、rRNA枯渇の条件を変えて構築したすべての単細胞ライブラリーから得られた全シーケンスリードにおけるmRNAリードの割合（+）/（-）。パーセンテージは、レプリケート（n = 4）の平均値として算出した。(B) すべてのシングルセルライブラリーで検出された遺伝子の数（n = 4）。(C) 全シーケンスリードをダウンサンプリングした際に、細胞あたり検出された遺伝子数（リードカウント>0）。各行は異なる単一細胞ライブラリを表す。
これらの結果から、固定された細胞におけるrRNAの枯渇効果は、抽出されたtotal RNAと比較して限定的であることが示されました。これは、固定によるRNAの分解や架橋が原因であると考えられている（26,27）。細胞固定処理下での%mRNAを改善するため、RamDA-seqにおける逆転写（RT）時間を最適化し、cDNAの増幅量を増加させました（6）。RT時間の延長により、%mRNAは非固定条件下で1.5倍、固定条件下で4.6倍、検出遺伝子数は非固定条件下で263遺伝子（平均）、固定条件下で611遺伝子（平均）それぞれ増加しました。
また、RT時間延長とrRNA枯渇の組み合わせにより、%mRNAは非固定条件下で6.2倍（平均）、固定条件下で11.8倍（平均）増加した。また、検出された遺伝子数は、非固定条件下で414遺伝子（平均）、固定条件下で674遺伝子（平均）それぞれ増加した。また、RT時間延長とrRNA枯渇を合わせた固定細胞での検出遺伝子数は、非固定細胞での検出遺伝子数の89％（平均値）であった。これらの結果は、RT時間伸長による増幅cDNA量の増加が固定処理効果を補い、固定細胞におけるrRNA枯渇によるmRNAの濃縮を促進することを示した。rRNA枯渇とRT時間120分条件の固定細胞で検出された遺伝子数は1097個（平均値）であった。これは、大腸菌参照ゲノム遺伝子の約24.4%でした。先行研究(4)の遺伝子検出率が約5%であったことと比較すると、本手法は細菌固定した単一細胞からの遺伝子検出において約5倍の感度を有していることがわかる。in situ逆転写に細胞固定処理を必要とする先行研究（14, 15, 16）と比較して、本手法は非固定細胞にも適用でき、固定細胞でも高感度に遺伝子検出ができるという利点がある。
本手法の検出効率をさらに評価するため、rRNA枯渇、RT時間条件120分の固定細胞において、シークエンス深度の飽和解析を行った（図2C）。シーケンシングリード数を100万リードに減らしても、検出された遺伝子数は最高値（956遺伝子、平均値）の87％にとどまった。本手法の検出効率を、細菌scRNA-seq用に開発された過去の3つの手法（13,15, 16, 17）と比較した。少量の細菌RNAから高感度に遺伝子を検出するために設計されたMiniBac-seq（17）は、1個の細菌細胞に相当する0.1pgの大腸菌全RNAから1000万リードで529±31遺伝子を検出しました。本法で同数の遺伝子を検出するために必要なシーケンスリードは0.2百万であり、miniBac-seqが必要とするシーケンス工数の1/50である。また、プレートベースの細菌scRNA-seq法であるMATQ-seq（13）では、定常期後半のSalmonella enterica serovar Typhimuriumから6240±2090万リードで170±81遺伝子（ゲノムにコードされる遺伝子の3.7～5.5%）を検出しました。本手法で同レベルの遺伝子を検出するために必要なシーケンスリードは0.02万リードで、MATQ-seqの要求値の1/3000-1/4000であった。拡張性の高い細菌scRNA-seq用に設計されたBacDrop（15）は、RNaseHベースのrRNA枯渇により%mRNAを50-90%に濃縮した条件下で、8万リード未満で平均90個の遺伝子を検出した。本法で同数の遺伝子を検出するために必要なシーケンスリードは10,000リードで、BacDropが必要とするシーケンス工数の1/8でした。本手法はBacDropと比較してmRNAの割合が低いものの、より低いシーケンシング工数で高感度な遺伝子検出が可能であることがわかりました。本手法におけるrRNAの枯渇効率をさらに向上させることで、シーケンス工数をさらに削減できることが期待され、高感度かつスループットを実現するプラットフォームへの応用の可能性が示唆されました。これらの比較から、本提案手法は、従来のプレートベースや液滴ベースの手法と比較して、低シーケンスエフォートで細菌単一細胞から高感度に遺伝子検出できることが示された。
大腸菌集団における異なる転写状態の不均一性を明らかにするためのscRNA-seq
RamDA-seqを摂食された大腸菌集団に適用し、単一細胞レベルで異なる転写状態を識別する能力を評価しました。異なる成長段階の大腸菌集団と熱ショックした大腸菌集団を用意し、RamDA-seqと並行して解析した。図3Aに示すように、対数期集団では平均576遺伝子（平均、n = 96）、対数期熱ショック集団では363遺伝子（平均、n = 96）、定常期集団では238遺伝子（平均、n = 96）が単一細胞から検出された。図2Bと比較して検出遺伝子数が少なくなっているが、これは複製数の違いによる反応形式やrRNAの枯渇の違いによるものと考えられ、今後検証していく予定である。UMAPクラスタリング解析により、これらの集団間で異なる遺伝子発現パターンが確認された（図3B）。各クラスタにおいて発現変動が優勢な遺伝子は、対数期集団から234遺伝子、対数期熱処理集団から7遺伝子、定常期集団から20遺伝子であった（Fig. 3C）。例えば、対数期クラスターでは、RNAポリメラーゼαサブユニットをコードするσ70制御遺伝子rpoAが高発現していた（28）。熱ショッククラスターでは、熱ショック遺伝子として知られるdnaKやgroSなどの遺伝子が高発現していた（29）。定常期クラスターでは、リボソーム調節因子をコードする遺伝子で定常期に特徴的なrmfの高発現が見られた(30)。
ダウンロード 高解像度画像ダウンロード(980KB)
ダウンロード フルサイズ画像のダウンロード
図3. RamDA-seqによる異なる成長またはショック条件下での大腸菌単細胞のトランスクリプトームの特性化。対数期（n = 96）、ヒートショック（n = 96）、定常期（n = 96）の集団から、大腸菌単細胞の遺伝子発現をRamDA-seqで解析した。(A) すべての単細胞ライブラリで検出された遺伝子の数。(B) 対数期、ヒートショック、定常期の細胞から得られた単一大腸菌トランスクリプトームのUMAPエンベッディングを、クラスタの同一性（左）およびサンプルの条件（右）で色分けしたものです。(C) パネルBのUMAPデータを、各クラスタにおける代表的なアップレギュレート遺伝子の相対発現量で色分けしたもの。(D) 各クラスターで発現が上昇した遺伝子のGene Ontology (GO)用語の濃縮。
各クラスターで有意に発現した遺伝子をGene Ontology (GO)で解析した結果、対数期クラスターでは転写・翻訳・生合成関連プロセスが、熱ショッククラスターでは熱ショック・ストレス応答が濃縮されていることがわかった。定常期クラスターでは、栄養飢餓や恒常性関連のプロセスが濃縮されていた（図3D）。これらの結果から、RamDA-seqは細胞状態間の遺伝子発現変動を1細胞レベルで捉えていることが示されました。一方、個々の細胞の視点から見ると、一部の細胞は他の細胞とは異なる遺伝子発現パターンを示し、ほとんどの細胞が形成するクラスターの外にプロットされていることがわかった。RamDA-seqは、細菌集団においてこのような不均一な転写活性を示す細胞集団を効果的に検出することができる。その能力は、より多くの細胞に対してscRNA-seqを実施することで評価することができます。
技術的課題と今後の展望
私たちの細菌scRNA-seqには、いくつかの技術的課題が残っています。一つは、rRNAの枯渇を改善することです。本手法では、CRISPR-Cas9を用いたディプリーションでもmRNAの割合は10%以下にとどまっていました。このため、rRNA枯渇の最適化によりmRNAの割合を増やすことで、シーケンス工数をさらに抑制し、遺伝子検出効率を向上させることが期待されます。RNaseHベースのrRNA枯渇（15,17）や、細菌のrRNAからの逆転写を抑制するように設計されたランダムでないプライマー（6）などは、この実現に役立つと考えられる。もう一つの課題は、scRNA-seqのスループットである。十分な細胞数を持つ細菌集団に適用する場合、処理可能な細胞数が一定以上であることが統計的に望ましいとされている（15）。マイクロ流体液滴のような単一細胞反応の並列化を可能にする既存技術と、低いシーケンス工数で高感度な遺伝子検出を可能にする本手法を組み合わせることで、高感度と高スループットを両立する、より強力な細菌scRNA-seqプラットフォームが提供できると考えられます。このため、これまでSAG-gel（31,32）として報告されてきた細菌単細胞ゲノム配列決定プラットフォームを応用し、ハイスループットな細菌scRNA-seqを可能にします。また、実験間のばらつきを改善するためには、scRNA-seq操作の前に、菌の培養からソーティングプロセスまでの細胞処理の品質を厳密に管理する必要があると考えています。
結論として、RamDA-seqとCRISPR-Cas9を用いたrRNA枯渇により、細菌RNAからシングルセルレベルで再現性のある偏りのない遺伝子発現情報を得ることができました。RamDA-seqによる全長転写物の捕捉は、バクテリアの特徴的な転写単位であるオペロンを順次捕捉するのに有効であった。この方法により、細菌単一細胞から検出された遺伝子数は、参照ゲノム中の遺伝子の約24％であり、細菌scRNA-seqは従来の方法よりも高感度である。また、高感度な遺伝子検出のために必要なシーケンス工数は、従来のプレートベースのバクテリアscRNA-seq法と比較して大幅に削減されました。この高感度バクテリアscRNA-seq法は、単細胞または微量の細胞しか回収できない希少なバクテリアサンプルの分析に特に適しており、これまで検出できなかったレベルの単一細胞内の遺伝子発現変動を捕捉するための実用的なアプローチとなる。スループットが向上すれば、本手法は、感度とスループットを備えた優れた細菌scRNA-seqとして、環境、ヒトマイクロバイオーム、培養細菌株の不均一性解析などに応用されると考えられる。
謝辞
本研究の一部は、文部科学省／日本学術振興会 科学研究費補助金21H01733、科学技術振興機構（JST） FOREST JPMJFR210Fの支援を受けています。スーパーコンピューティングリソースは、ヒトゲノム解析センター（東京大学）より提供されました。RamDA-seq解析の技術支援として、二階堂伊智氏、林哲太郎氏、久世真理子氏（理化学研究所生命システム動態研究センターバイオインフォマティクス研究室）に感謝します。また、バイオインフォマティクス解析支援として、我妻亮太氏（早稲田大学）、鎌田和馬氏（bitBiome, Inc.）に感謝します。
付録A．補足データ
すべての補足ファイルをダウンロードする
これは何でしょう？
以下は、本論文の補足データです。
ダウンロード： Word文書（28KB）ダウンロード
マルチメディアコンポーネント1.
ダウンロード ： Acrobat PDFファイルのダウンロード (123KB)
マルチメディアコンテンツ2.
おすすめ記事
参考文献
1
M.B. Elowitz，A.J. Levine，E.D. Siggia，P.S. Swain
単一細胞における確率的遺伝子発現
サイエンス, 297 (2002), pp.1183-1186
ScopusGoogle Scholarで見る
2
A. エルダー、M.B.エローウィッツ
遺伝子回路におけるノイズの機能的役割
ネイチャー, 467 (2010), pp.167-173
クロスリーフScopusGoogle Scholarで見る
3
A. ラジ、A.ファン・ウーデナールデン
自然か、育ちか、偶然か：確率的な遺伝子発現とその結果
セル, 135 (2008), pp.216-226
PDFを見る記事を見るScopusGoogle Scholarで見る
4
C. ホムバーガー、L. バークイスト、J. フォーゲル
細菌におけるシングルセル・トランスクリプトミクスの新時代を告げる
microLife, 3 (2022), p. uqac020
Google Scholar
5
F. イムダル、A.E.サリバ
微生物群集のシングルセルRNA-seqの進歩および課題
Curr. Opin. Microbiol., 57 (2020), pp.102-110
PDFを見る記事を見るScopusGoogle Scholarで見る
6
T. 林、尾崎博之、笹川陽子、梅田稔、檀野秀明、二階堂一郎
単細胞全長RNAシーケンスによる再帰的スプライシングとエンハンサーRNAの動態解明
Nat. Commun.、9 (2018), p. 619
ScopusGoogle Scholarで見る
7
S. ピチェリ、A.K.ビョークランド、O.R.ファリダニ、S.サガッサー、G.ウィンバーグ、R.サンドバーグ
単一細胞における高感度全長トランスクリプトームプロファイリングのためのSmart-seq2
Nat. メソッズ, 10 (2013), pp.1096-1098
クロスレフゴールスカラー
8
H. つゆざきひろ、細川真理、有川和彦、依田拓也、岡田直樹、竹山博之、佐藤正樹
タイムラプス単細胞トランスクリプトミクスにより、分裂酵母の休眠打破に関わるヒストンH3の変調が明らかになった。
Nat. Commun., 11 (2020), p. 1265
ScopusGoogle Scholarで見る
9
E.Z. Macosko, A. Basu, R. Satija, J. Nemesh, K. Shekhar, M. Goldman, I. Tirosh, A.R. Bialas, N. Kamitaki, E.M. Martersteck, その他6名
ナノリットル液滴を用いた個々の細胞の高並列ゲノムワイド発現プロファイリング
セル, 161 (2015), pp.1202-1214
PDFを見る記事を見るScopusGoogle Scholarで見る
10
Y. カン、M.H.ノリス、J.ザルジッキ＝シーク、W.C.ナイアマン、S.P.ドナチー、T.T.ホアン
トランスクリプトーム解析のための単一細菌からの転写産物の増幅
ゲノム研究, 21 (2011), pp.925-935
CrossRefScopusGoogle Scholarで表示する。
11
J. Wang, L. Chen, Z. Chen, W. Zhang
RNA-seqを用いた細菌単細胞のトランスクリプトーム解析
Integr. Biol.、7 (2015), pp.1466-1476
Scopusで見るGoogle Scholar
12
C. ワンサヌワット、K.A.ヒーム、E.リュー、M.A.オマリー、S.S.デイー
リボソームRNA枯渇による低入力サンプルからの効率的かつ費用対効果の高い細菌mRNAシーケンスの実現
BMC Genomics, 21 (2020), p. 717
Scopusで見るGoogle Scholar
13
F. イムダル、E. ヴァファダルネジャド、C. ホムバーガー、A. E. サリバ、J. ヴォーゲル
シングルセルRNAシーケンスにより、個々のバクテリアの成長条件特異的なグローバルトランスクリプトームが報告される
Nat. Microbiol., 5 (2020), pp.1202-1206
CrossRefScopusGoogle Scholarで表示する。
14
A. クチーナ、L.M.ブレットナー、L.パレオログ、C.M.ロコ、A.B.ローゼンバーグ、A.カリニャーノ、R.キブラー、平野正人、R.W.デパロ、G. シーリッグ
スプリットプールバーコードによる微生物単細胞RNA配列決定
サイエンス, 371 (2021), p. eaba5257
Scopusで見るGoogle Scholar
15
P. Ma, H.M. Amemiya, L.L. He, S.J. Gandhi, R. Nicol, R.P. Bhattacharyya, C.S. Smillie, D.T. Hung.
細菌液滴を用いた単一細胞RNA-seqにより、抗生物質に関連した異質な細胞状態が明らかになった
Cell, 186 (2023), pp.877-891 e814
クロスリファレンス Google Scholar
16
S.B.ブラットマン、W.ジアン、P.オイコノモウ、S.タバゾエ
in situコンビナトリアルインデキシングによる原核生物単細胞RNA配列決定
Nat. Microbiol., 5 (2020), pp.1192-1201
CrossRefScopusGoogle Scholarで表示する。
17
T. ワン、シェン、チャイ、ヘ、リュウ
MiniBac-seqによる超低インプットからの細菌トランスクリプトームプロファイリング
Environ. Microbiol., 24 (2022), pp.5774-5787
CrossRefView in ScopusGoogle Scholar
18
G. Prezza, T. Heckel, S. Dietrich, C. Homberger, A.J. Westermann, J. Vogel
Cas9を用いたリボソームRNAリードの枯渇による細菌RNA-seqの改善
RNA, 26 (2020), pp.1069-1078
CrossRefScopusGoogle Scholarで表示する。
19
M. マーティン
Cutadaptはハイスループットシーケンスリードからアダプター配列を除去する
EMBnet J., 17 (2011), pp.10-12
CrossRefGoogle Scholar
20
A. Dobin, C.A. Davis, F. Schlesinger, J. Drenkow, C. Zaleski, S. Jha, P. Batut, M. Chaisson, T.R. Gingeras
STAR：超高速ユニバーサルRNA-seqアライナー
バイオインフォマティクス, 29 (2013), pp.15-21
CrossRefScopusGoogle Scholarで表示する。
21
Y. リャオ、G.K.スマイス、W.シー
featureCounts：配列リードをゲノムの特徴に割り当てるための効率的な一般目的プログラム
バイオインフォマティクス, 30 (2014), pp.923-930
CrossRefScopusGoogle Scholarで表示する。
22
B. リー、C.N.デューイ
RSEM：参照ゲノムの有無にかかわらず、RNA-Seqデータからの正確な転写物の定量化
BMCバイオインフォマティクス, 12 (2011), p. 323
ScopusGoogle Scholarで見る
23
Y. Hao, S. Hao, E. Andersen-Nissen, W.M. Mauck 3rd, S. Zheng, A. Butler, M.J. Lee, A.J. Wilk, C. Darby, M. Zager, その他15名
マルチモーダルなシングルセルデータの統合解析
Cell, 184 (2021), pp.3573-3587.e29
PDFを見る記事を見るScopusGoogle Scholarで見る
24
V. バーガヴァ、S.R.ヘッド、P.オルドウカニアン、M.マーコラ、S.スブラマニアム
低インプットRNA-seq手法における技術的バリエーション
Sci. Rep., 4 (2014), p.3678.
Scopusで見るGoogle Scholar
25
D.P. Cerretti, D. Dean, G.R. Davis, D.M. Bedwell, M. Nomura
大腸菌のリボソームタンパク質オペロン：リボソームタンパク質遺伝子とタンパク質輸出遺伝子の配列と共転写性
核酸研究, 11 (1983), pp.2599-2616
CrossRefScopusGoogle Scholarで表示する。
26
M. 山崎、細川護煕、松永英明、有川賢治、高持和也、鈴木啓介、林哲也、神原博之、竹山博之
ホルマリン固定パラフィン包埋肺腺癌における腫瘍の多様性を理解するための遺伝子変異と遺伝子発現の統合空間解析
Front. オンコル, 12 (2022), 記事 936190
Scopusで見るGoogle Scholar
27
H. 松永英樹、有川浩一、山崎正樹、我妻亮太、井手和彦、A.Z. Samuel、高持和也、鈴木啓介、林哲也、細川護、神原浩、竹山博之
空間的遺伝子発現解析のためのホルマリン固定パラフィン包埋組織からの再現性・高感度マイクロ組織RNAシーケンシング
Sci. Rep., 12 (2022), Article 19511
ScopusGoogle Scholarで見る
28
M.A. ワグナー、D. ザール、G. リーザー、G. コライマン
大腸菌におけるσ32レギュロンの成長期および細胞分裂に依存した活性化・不活性化について
J. バクテリオール, 191 (2009), pp.1695-1702
Scopusで見るGoogle Scholar
29
D. ロンカラティ、V. スカルラート
細菌における熱ショック遺伝子の制御：シグナル感知から遺伝子発現出力まで
FEMS Microbiol. Rev., 41 (2017), pp.549-574.
CrossRefGoogle Scholar
30
M. 山岸、松島秀樹、和田晃、坂上正樹、藤田直樹、石濱昭彦
リボソーム調節因子をコードする大腸菌rmf遺伝子の制御：成長段階および成長速度に依存する制御
EMBO J., 12 (1993), pp.625-630
CrossRefScopusGoogle Scholarで表示する。
31
Y. 西川、粉川、細川、我妻、峯田、高橋、井出、由良、ベザド、五條堀、竹山
ゲルビーズを用いたシングルセルゲノムシーケンスプラットフォームの土壌・海水への応用の検証
ISME Commun., 2 (2022), p. 92
Google Scholar
32
R. 千々岩、細川眞一郎、粉川眞一郎、西川祐子、井手健一郎、坂梨千恵子、高橋和也、竹山博之
未培養菌のシングルセルゲノミクスにより、マウスの腸内細菌叢における食物繊維レスポンダーが明らかになった
マイクロバイオーム, 8 (2020), p. 5
ScopusGoogle Scholarで見る
引用者: (0)
アブストラクトを見る
© 2023 日本生物工学会. All rights reserved.
ScienceDirectについて
リモートアクセス
ショッピングカート
広告掲載
お問い合わせ・サポート
ご利用条件
個人情報保護方針
当社は、サービスの提供や強化、コンテンツや広告のカスタマイズのためにCookieを使用しています。継続することで、クッキーの使用に同意することになります。
Copyright © 2023 Elsevier B.V.またはそのライセンサーもしくは貢献者。ScienceDirect® はElsevier B.V.の登録商標です。