パーキンソン病における腸内細菌叢のショットガンシーケンスのメタ解析

2024年5月24日 10:34

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出版：2024年5月21日
パーキンソン病における腸内細菌叢のショットガンシーケンスのメタ解析

https://www.nature.com/articles/s41531-024-00724-z

西脇宏, 上山純, ...大野欣司著者紹介
npj パーキンソン病 10巻, 記事番号: 106 (2024) この記事を引用する

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指標詳細

概要
我々は、日本のパーキンソン病（PD）患者94人と対照73人の糞便ショットガンシーケンスデータセットを、米国、ドイツ、中国1、中国2、台湾の既報の5つのデータセットとメタ解析することにより、国を超えてパーキンソン病（PD）における腸内微生物の特徴を同定することを目的とした。GC-MSおよびLC-MS/MSアッセイを確立し、それぞれ糞便中の短鎖脂肪酸（SCFA）および糞便中のポリアミンを定量した。6つのデータセットにおいて、PDのα-多様性が増加した。分類学的解析の結果、Akkermansia muciniphila種はPDで増加し、Roseburia intestinalis種とFaecalibacterium prausnitzii種はPDで減少した。経路解析の結果、リボフラビンおよびビオチンの生合成に関わる遺伝子は、交絡因子を調整した後、PDにおいて著しく減少していた。糖質活性酵素（CAZymes）の6つのカテゴリーのうち5つがPDで減少していた。糞便サンプルのメタボローム解析から、PDでは糞便中のSCFAsとポリアミンが有意に減少していることが明らかになった。リボフラビンおよびビオチンの生合成に関与する遺伝子は、糞便中のSCFAsおよびポリアミン濃度と正の相関を示した。日本、米国、ドイツでリボフラビン生合成の低下をもたらした細菌は、中国1、中国2、台湾の細菌とは異なっていた。同様に、ビオチンの生合成の低下も、2つの国のグループでは異なる細菌が占めていた。我々は、SCFAとポリアミンの減少が腸管粘液層を減少させ、その結果、PDの腸管神経叢における異常なα-シヌクレイン線維の形成を促進し、またPDの神経炎症を引き起こすと推測している。

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はじめに
パーキンソン病（PD）は長期にわたる神経変性疾患であり、運動症状だけでなく非運動症状も呈する。PD患者の運動症状には、硬直（筋肉のこわばり）、姿勢不安定、歩行障害、徐脈、安静時振戦などがあり、PD患者の非運動症状には、認知症、うつ病、無嗅覚症、膀胱障害、便秘、起立性低血圧などがある。PDは、黒質のドーパミン作動性ニューロンにおけるα-シヌクレイン線維（レビー小体）の異常蓄積を特徴とする。レビー小体は自律神経系、下部脳幹、大脳皮質、嗅球、皮膚、唾液腺、腸粘膜などの非神経組織にも出現する1。2003年、Braakは、異常なα-シヌクレイン線維が迷走神経の孤束核から出発し、小丘疹を経て最終的に黒質まで上昇するという仮説を立てた2。PD患者は運動症状が出現する約20年前、10年前、5年前に便秘、特発性急速眼球運動睡眠行動障害（iRBD）、うつ病を呈することがあるが3、これはBraakの仮説におけるα-シヌクレイン線維の上昇と一致している。迷走神経全切除術はPDのリスクを約50％減少させる4。つまり、PD患者の〜50％はこの仮説に従うが、他の患者は従わない可能性がある。

PDにおける腸内細菌叢は、qPCR、16S rRNAメタゲノムシークエンシング、ショットガンメタゲノムシークエンシング（shotgun-seq）の3つの異なる方法で解析されている。qPCRは3つの研究で採用された5,6,7。一方、16S rRNA遺伝子シーケンスは20以上の研究で採用されている8,9,10。我々は、16S rRNA遺伝子配列決定データセットのメタアナリシスにより、ムチンを分解するAkkermansia属が増加し、短鎖脂肪酸（SCFAs）を産生するRoseburia属とFaecalibacterium属が国を超えてPDで減少していることを示した8。また、フシカテニバクター（Fusicatenibacter）とフェカリバクテリウム（Faecalibacterium）という2つのSCFA産生属の減少が、2年後の早期PDの急速な進行を予測できることを前向き研究で示した9。一方、Ahoたちは、Prevotellaの減少が2年後のPDの急速な進行と関連することを示した11。PDにおいてショットガン-seqを用いた研究は、5カ国8件12,13,14,15,16,17,18,19であった（補足表1）。健常人の腸内細菌叢は国によって著しく異なる20。国によって腸内細菌叢が著しく異なるため、PD患者における原因関連のある腸内細菌や細菌遺伝子を同定することは困難である。我々はここで、94人のPD患者と73人の対照者の糞便サンプルのショットガンseqを行い、我々のデータセットを既報の5つのデータセットとメタ解析して、国を超えてPDで特異的に変化した細菌分類群、遺伝子、および経路を同定した。糞便中のリボフラビンおよびビオチン生合成遺伝子の減少は、糞便中のSCFAおよびポリアミンの減少と正の相関があった。また、糞便中のリボフラビンおよびビオチン生合成遺伝子の減少には、国によって異なる細菌種が関与していた。

結果
日本のデータセットと米国、ドイツ、中国1、中国2、台湾の5つのデータセットのショットガンセク解析
我々のデータセットにおいて、7つの特徴（年齢、性別、BMI、便秘、プロトンポンプ阻害薬、H2ブロッカー、抗コレステロール薬）をPDとコントロールで比較した（表1）。BMIは対照群よりPD群で低く、便秘は対照群よりPD群で頻度が高かった。次に、われわれのデータセットを4ヵ国（米国、ドイツ、中国、台湾）の既報の5つのデータセットとメタ解析した。細菌種の主座標分析（PCoA）により、PD患者と対照者はそれぞれの国で異なる重心を作っており（図1a、補足表2）、PERMANOVAによる全体的な細菌組成は国によって異なっていた（補足表2）。また、種レベルでのα-多様性をShannon indexを用いてメタ解析したところ、PDでは対照群に比べてα-多様性が高いことがわかった（図1b）。6つのデータセットにおける種レベルの累積度数プロットは、α多様性の増加は特定の細菌群の減少や増加によって説明されないことを示した（図1c）。むしろ、PDでは対照と比較して細菌種の数が多く、相対的な細菌量はより均等に分布していた。

表1 PD患者と対照者の人口統計学的および臨床的特徴
拡大表
図1：6つのデータセットにおけるグローバルな細菌の特徴。
図1
a 左パネル： Bray-Curtis非類似度による6ヵ国のPDと対照の細菌種のPCoAプロット。丸と三角はそれぞれ対照とPDを示す。国は色分けされている。右のパネル： Bray-Curtis非類似度を有するPDおよび対照の6つのデータセットにおける細菌種全体の組成の重心と標準誤差を示すPCoAプロット。b 6つのデータセットにおける細菌種のα多様性のフォレストプロット。FEMとREMはそれぞれ固定効果モデルとランダム効果モデルを表す。四角の大きさはサンプル数を表す。バーは95％信頼区間を表す。菱形は平均値と95%信頼区間を表す。FEMとREMのP値とI2を示す。 c 6つのデータセットにおける種レベルの相対存在量の累積度数プロット。各データセットにおけるコントロールとPDで同定された細菌種の数は、曲線の端の小さな円で示されている。

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次に、HUMAnN 3.6を用いて酵素委員会（EC）数を解析した。6つのデータセットのメタ解析から、1678個のEC数のうち、42個と31個がPDでそれぞれ有意に減少、増加していることが示された（補足表3）。2種類のパスウェイ解析が適用された：超幾何学的検定と遺伝子セット濃縮解析（GSEA）。まず、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）の各パスウェイについて、増加方向と減少方向に超幾何学的検定を適用した（補足表4）。「リボフラビン代謝」と「ビオチン代謝」はPDで有意に減少していたが、増加したパスウェイは同定されなかった。次に、GSEAを各KEGGパスウェイの増加方向と減少方向に適用した（補足表5）。ビオチン代謝」と「リボフラビン代謝」のダウンレギュレーションは、GSEA解析でも1位と2位であった。年齢、BMI、便秘、病状、性別、抗コレステロール薬のメタデータが得られた我々のデータセットとUSAデータセット17のMaAsLin221を用いた交絡因子解析では、交絡因子を調整した後、「リボフラビン代謝」と「ビオチン代謝」のEC番号に割り当てられた遺伝子がPDで有意に減少していた（補足表6）。

次に細菌種と属について解析した。6つのデータセットのメタ解析から、31種がPDで有意に増加し、7種が有意に減少したことが示された（補足表7）。さらに、24属が有意に増加し、7属が有意に減少した（補足表7）。特に種レベルでは、Akkermansia muciniphilaがPDで有意に増加し、Roseburia intestinalisとFaecalibacterium prausnitziiが有意に減少した（補足図1）。これらの細菌は以前、我々のメタアナリシスで属レベルで同定されていた8。しかしながら、前回のメタ解析とは異なり、データセット間でかなりの不均一性（I2 > 40％）がみられたが、これはおそらく前回の解析8には含まれていなかった中国1（中国・上海；PRJNA43345913）、中国2（中国・襄陽；PRJNA58803514）、および台湾が含まれていたためであろう。我々はまた、我々と米国のデータセットにおける交絡因子を調整した。種レベルでは、交絡因子を調整した後、PDにおいてAkkermansia muciniphilaが有意に増加し、Roseburia intestinalisとFaecalibacterium prausnitziiが有意に減少した（補足表8）。同様に属レベルでは、Akkermansiaが有意に増加したのに対し、RoseburiaとFaecalibacteriumは交絡因子を調整した後、PDで有意に減少した（補足表8）。

次に糖質活性酵素（CAZyme）について解析した。6つのデータセットのメタ解析から、219のCAZymesのうち、72と17がそれぞれ有意に減少、増加していることが示された（補表9）。カテゴリー解析の結果、6つのCAZymeカテゴリーのうち5つが、6つのデータセットを通してPDにおいて有意に減少していた（図2、補足表10）。

図2：6つのデータセットにおける6つのカテゴリーCAZymeのフォレストプロット。
図2
オレンジと青のシンボルはそれぞれPDにおけるCAZymesの増加と減少を表す。正方形の大きさはサンプル数を表す。バーは95％信頼区間を表す。菱形は平均値と95％信頼区間を表す。

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糞便中のSCFAおよびポリアミンの定量化
SCFA 産生菌は、16S rRNA 遺伝子配列決定の5つのデータセットのメタアナリシスで有意に減少していた8。今回のショットガンseqの6つのデータセットのメタアナリシスにおいても、PDにおいて同様の種および属（補足表7）が減少していた。そこでわれわれは、独自の質量分析付きガスクロマトグラフィー（GC-MS）ベースのアッセイシステム22,23を用いて、糞便中のSCFA、ならびに糞便中の乳酸とピルビン酸を定量した。その結果、PDでは3種類のSCFA（酢酸、プロピオン酸、酪酸）の糞便中濃度が有意に低下していたが、バレレートは低下していなかった（図3a）。一方、分岐鎖脂肪酸（iso-酪酸とiso-吉草酸）はPDで有意に増加した（図3b）が、そのメカニズムはまだ不明である。腸内細菌によってSCFAに変換される乳酸とコハク酸は、PDで有意に減少した（図3c）。

図3：対照群（C）とPD群（P）の糞便中代謝産物。
図3
対照群とPD群における糞便中の（a）短鎖脂肪酸、（b）分岐鎖脂肪酸、（c）乳酸およびコハク酸、（d）ポリアミンのバイオリンプロット。濃度は糞便凍結乾燥試料1g当たりのmg（mg/g FD）で示した。中央値と四分位範囲を示す。サンプルサイズは、酢酸、プロピオン酸、酪酸、バレレート、iso-酪酸、およびiso-バレレートが92（PD）および72（対照）、乳酸およびコハク酸が91（PD）および70（対照）、ポリアミンが86（PD）および66（対照）であった。P値はWilcoxon順位和検定により算出した。*P < 0.05.

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上記のPDにおける「リボフラビン代謝」と「ビオチン代謝」の低下に加えて、GSEAはPDにおける「アルギニンとプロリン代謝」の有意な低下も示した（補足表5）。アルギニン・プロリン代謝」にはアルギニン、プロリン、グルタミン酸、ポリアミンを生成する103遺伝子が含まれていたため、MetaCycデータベース24からアルギニン関連サブパス-ウェイを5つ、グルタミン酸・プロリン関連サブパス-ウェイを2つ、ポリアミン関連サブパス-ウェイを3つ抽出した。10個のMetaCycパスウェイをGSEAでメタ解析したところ、3個のポリアミン関連サブパスはすべてPDで有意に減少していた（補足表11）。実際、タンデム質量分析を用いた液体クロマトグラフィー（LC-MS/MS）ベースのアッセイにより、3種類のポリアミン（プトレシン、スペルミジン、スペルミン）の糞便中濃度がPDで有意に低下していることが示された（図3d）。

リボフラビン代謝」または「ビオチン代謝」のメタゲノム遺伝子と、糞便中のSCFAまたはポリアミンとの相関性
リボフラビン代謝」（図4）または「ビオチン代謝」（図5）のメタゲノム遺伝子のCPM（copies per millions）と、糞便中のSCFAsまたはポリアミン濃度との間のスピアマンの順位相関係数を計算した。リボフラビン代謝」と「ビオチン代謝」のいずれにおいても、メタアナリシスでPDで有意に減少したメタゲノム遺伝子は、糞便中のSCFAsやポリアミン濃度と正の相関があった（図4と図5）。

図4：リボフラビン代謝経路の概略図。
図4
酵素は四角のEC番号で示す。代謝産物は緑の文字と開いた円で示す。KEGGパスウェイは丸い四角で示す。矢印はPDの減少または増加を示す。有意な変化は太い矢印で、有意でない変化は細い矢印で示す。有意に変化した5つの酵素について、6つのデータセットのフォレストプロットを示す。右上のヒートマップは、有意に変化した5つの酵素と糞便中のSCFA/ポリアミンとの間のスピアマンの順位相関係数を示す。正方形の大きさはサンプル数を表す。バーは95%信頼区間を表す。菱形は平均値と95%信頼区間を表す。同じEC番号をa-eで示す。

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図5：ビオチン代謝経路の概略図。
図5
酵素は四角のEC番号で示す。代謝産物は緑色の文字と開いた円で示す。KEGGパスウェイは丸い四角で示す。矢印はPDの減少または増加を示す。有意な変化は太い矢印で、有意でない変化は細い矢印で示す。有意に変化した4つの酵素について、6つのデータセットのフォレストプロットを示す。右上のヒートマップは、有意に変化した4つの酵素と糞便中のSCFA/ポリアミンとの間のスピアマンの順位相関係数を示す。正方形の大きさはサンプル数を表す。バーは95%信頼区間を表す。菱形は平均値と95%信頼区間を表す。同じEC番号をa-dで示す。

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"リボフラビン代謝 "と "ビオチン代謝 "の減少を説明する腸内細菌種
"リボフラビン代謝 "と "ビオチン代謝 "の遺伝子の細菌起源を調べた。これらの代謝で有意に減少した9つのEC番号（図4と5）それぞれについて、各細菌が寄与したCPMの割合を計算した（補足表12）。各EC番号について、6つのデータセットから最も影響力のある5つの細菌を選んだ。各データセットにおけるPDと対照の分画CPMの差をヒートマップに示した（図6a）。リボフラビンおよびビオチンの代謝低下をもたらした腸内細菌は、国によって異なっていた。リボフラビン代謝の減少に最も影響力のある細菌は、日本、米国、ドイツではFaecalibacterium prausnitziiであり、中国1、中国2、台湾ではPhocaeicola vulgatus（以前はBacteroides vulgatusと呼ばれていた）であった。同様に、ビオチン代謝に関わる遺伝子の減少は、日本、米国、ドイツではBlautia obeumの減少、中国1、中国2、台湾ではPhocaeicola vulgatusの減少によるものが多かった。実際、Faecalibacterium prausnitziiは日本、アメリカ、ドイツで著しく減少し、Phocaeicola vulgatusは中国1と中国2で著しく減少した（図6b）。

図6：リボフラビンおよびビオチンの代謝に最も影響力のある細菌
図6
a 各データセットにおける最も影響力のある5つの細菌について、PDとコントロール間の分画CPMの差を示すヒートマップ。 b 6つのデータセットにおけるFaecalibacterium prausnitziiとPhocaeicola vulgatusのフォレストプロット。

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考察
PDにおける腸内細菌叢のショットガン-seq研究は8件報告されているが、共通の特徴を容易に認識することはできない。我々は、日本のPD患者と健常同居人を対象にショットガンセク解析を行い、バッチ効果を調整した上で、ドイツ12、中国13,14、台湾15、米国17の既報の5つのショットガンセク解析データセットとメタ解析を行った。細菌種のPCoA（図1a）およびPERMANOVA（補足表2）により、全体的な細菌組成が各国間で、また各国のPDと対照間で有意に異なることが示された。メタ解析の結果、菌種レベルでのα多様性はPDで有意に増加し（図1b）、これはコントロールと比較してPDでは菌数が多く、菌量がより均等に分布していることで説明された（図1c）。16S rRNA遺伝子配列決定データセットを用いた属レベルのα多様性に関する以前のメタアナリシスでは、7つのデータセットのうち5つでPDにおいてα多様性が増加する傾向が見られたが、総合スコアでは有意性は認められなかった25。12の疾患における腸内細菌叢の4347件のショットガンセクエンスデータのメタ解析によると、9つの疾患ではα多様性は変化せず、3つの疾患（クローン病、肥満、2型糖尿病）では減少していた26。我々の知る限り、PDは腸内細菌叢のα多様性が増加する最初の疾患であり、α多様性の減少が消化器疾患、免疫疾患、代謝疾患の糞便マーカーであるという考え方とは対照的である26。

6つのデータセットのメタアナリシスでは、1678個のうち73個のEC数が有意に変化していた（補足表3）。GSEAによるパスウェイ解析では、PDにおける「リボフラビン代謝」と「ビオチン代謝」の有意な減少がそれぞれ1位と2位であった（補足表5）。同様に、「アルギニンとプロリンの代謝」の有意な減少は6位であった（補足表5）。リボフラビン代謝」と「ビオチン代謝」でのみ有意性が認められたが、これら3つのパスウェイも超幾何検定によるパスウェイ解析で減少していた（補足表4）。交絡因子の解析から、3つのパスウェイにおけるEC数の有意な減少は、確かにPDによって説明されることが示された（補表6）。

ヒトのリボフラビン（ビタミンB2）は食物および腸内細菌叢に由来する。治療的には、リボフラビンはPD発症に関連する酸化ストレス、ミトコンドリア機能障害、神経炎症、グルタミン酸興奮毒性を改善する27。ある臨床研究では、リボフラビンの大量投与によりPD患者の運動障害が改善された28。別の疾患では、クローン病患者にリボフラビンを補充すると、全身の酸化ストレス、炎症作用、疾患活動性が低下した29。腸内細菌叢によるリボフラビン産生低下を補うためにリボフラビンを補充することは、PD患者にとって有益であると考えられる。

ビオチン（ビタミンB7）は抗炎症物質を産生し、炎症を減少させるため、アレルギー、免疫学的症状、炎症性腸疾患の緩和につながる30。PDに対するビオチンの効果は、我々の知る限りでは報告されていない。一方、多発性硬化症では、オープン31試験や二重盲検32試験で、ビオチンが運動障害や光学的障害を改善することが示されている。

アルギニンとプロリンの代謝」には103もの遺伝子と多数の代謝産物が含まれるため、10のサブパスウェイを解析したところ、「ポリアミン生合成」のサブパスウェイが有意に減少していた（補足表11）。プトレシン、スペルミジン、スペルミンの順に酵素的に生成される。糞便中のポリアミンを定量すると、PDでは3つのポリアミンが有意に減少していた（図3d）。PDにおける血漿のメタボローム解析では、血漿スペルミジンが増加する一方で血漿スペルミンが減少し、スペルミン／スペルミジン比が著しく低下することが以前に示されている33。ポリアミンは食物から取り込まれるか、宿主細胞の代謝によって生成されるか、あるいは腸内細菌叢34によって生成されるため、糞便中のポリアミン濃度が血漿中のポリアミン濃度に単純に反映されるとは限らない。しかし、PDにおいてスペルミンの減少が血漿と糞便に共通する特徴であることは興味深い。

SCFAは腸内で食物繊維を発酵させて作られる。SCFAはFOXP3の遺伝子発現を促進し、ヒストン脱アセチル化酵素を阻害することによって、ナイーブT細胞を制御性T（Treg）細胞に分化させる35。SCFAは、GLP-136を誘導することにより、ミクログリアが介在する神経炎症を抑制する。SCFAは腸上皮の粘液層の形成に関与している。SCFA産生菌は肥満、耐糖能異常、2型糖尿病でも減少する37。代謝性疾患と同様に、PDにおけるSCFA産生菌は、16S rRNA遺伝子配列決定8およびショットガン配列決定のメタアナリシスにおいて著しく減少していた（補足表7および8）。先行研究7,15および今回の研究で、PDでは確かにSCFAsの糞便中濃度が低下していた（図3a）。また、SCFAの基質である乳酸とコハク酸も有意に減少していた（図3c）。

パスウェイと代謝産物との相関分析では、「リボフラビン生合成」と「ビオチン生合成」が、糞便中のSCFAsおよびポリアミン濃度と正の相関があることが明らかになった（図4および5）。まず、リボフラビンは、酪酸を生成する酵素であるブチリル-CoAデヒドロゲナーゼの電子伝達フラボタンパク質複合体を構成している38。さらに、リボフラビンを欠乏させると、いくつかのSCFA産生菌の増殖が低下する39。同様に、リボフラビンを3週間欠乏させたマウスでは、リボフラビンを再補給することで糞便中のSCFA含量が著しく回復した40。健康な被験者では、50または100mg/日のリボフラビンを2週間経口補給すると、糞便中のSCFAsの生合成が増加した41。第二に、ポリアミンの生合成に対するリボフラビンの効果は、ビタミンB6によって媒介される。リボフラビンから生成されるフラビンモノヌクレオチド（FMN）は、ピリドキシン5′-リン酸（PNP）オキシダーゼの補酵素として作用し、PNPとピリドキサミン5′-リン酸（PMP）から活性型ビタミンB6であるピリドキサール5'-リン酸（PLP）への変換に必要である42。観察研究では、リボフラビンがヒトにおいて十分なビタミンB6を維持するための制限栄養素であることが示唆されている43。L-オルニチン脱炭酸酵素（ODC）はPLP依存性のアミノ酸脱炭酸酵素であり、プトレシン、スペルミジン、スペルミンが生成されるポリアミン生合成経路の第一段階を触媒する44。したがって、リボフラビンの減少は、ビタミンB6の減少を通じてポリアミンの減少につながる可能性がある。第三に、ビオチンは必須補酵素として働くことで、SCFAとポリアミンの生合成に影響を与える可能性がある。しかし、ビオチン依存性酵素の解析はこれまであまり行われておらず、ビオチン欠乏時にどの酵素が欠損するのかは不明である。

リボフラビンやビオチンの生合成を低下させる原因菌は国によって異なっていた（補表12）。特に、日本、米国、ドイツで最も影響力のある細菌は、中国1、中国2、台湾の細菌とは異なっていた（図6a）。健康な被験者を対象とした以前の解析では、細菌量は被験者によって著しく異なるものの、Cluster of Orthologous Genes（COG）パスウェイは被験者間で類似していることが示され、このことは変動性の高い細菌が同様の生物学的機能を発揮していることを示していた45。同様に、われわれの解析では、異なる国のPDにおいて、異なる細菌群の減少が同一のパスウェイの減少につながることが示された。このことは、腸内細菌叢の属および種レベルでのメタ解析および系統的レビューにおいて、別の負担をもたらすものである。

4490人の対照群とPD、アルツハイマー病、多発性硬化症患者における腸内細菌叢のショットガンセクスのメタ解析が、最近bioRxivに寄託された（https://doi.org/10.1101/2023.12.05.569565）。その結果、機械学習モデルによって、対照群、PD、アルツハイマー病、多発性硬化症における腸内細菌叢が区別されることが示された。PD患者では、環境暴露とPDリスクの上昇を関連付ける疫学的証拠と一致する、異種生物物質の生体内変換を行う微生物経路が濃縮されていた46。しかし、我々のメタアナリシスでは、これらの経路は統計学的有意差なしに、発現量が増加または減少していた。

本研究のまとめと推測の視点を図7に示す。本研究では、リボフラビンとビオチンの糞便中生合成がPDで低下していることを示したが、その原因は2つの国のグループで異なる細菌によるものであった。また、糞便中のリボフラビンおよびビオチンの生合成の減少が、糞便中のポリアミンおよびSCFAの減少と相関していることも示した。我々の知見と先行研究から、以下のような推測が得られた。SCFAsとポリアミンが減少すると粘液層が薄くなり47、腸管透過性が増加する。実際、PD5,48では腸管透過性が亢進していた。腸管透過性の亢進は、腸神経叢を農薬や除草剤などの毒素にさらし49、α-シヌクレイン線維の異常凝集を引き起こす可能性がある。さらに、SCFAとポリアミンはM2マクロファージの分極化を促進し、M1マクロファージを相対的に減少させる50。したがって、PDにおける腸内細菌異常症は、SCFAsとポリアミンの糞便産生量の減少を引き起こし、腸管αシヌクレイン線維形成と神経炎症を亢進させるという仮説を立てた。

図7：本研究のまとめと推測の視点。
図7
実線の矢印は今回の研究で観察された関連を示す。破線の矢印は過去の報告に基づく推測を示す。細菌の記号の大きさは、ビオチンとリボフラビンの生合成への影響を表す。F.p.はFaecalibacterium prausnitzii、B.o.はBlautia obeum、B.w.はBlautia wexlerae、P.v.はPhocaeicola vulgatus、B.ov.はBacteroides ovatus、P.d.はPhocaeicola dorei、B.f.はBacteroides fragilis。

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リボフラビンとビオチンの糞便中生合成が低下すると、リボフラビンとビオチンの糞便中濃度が低下すると考えられる。以前に報告されたPD患者におけるリボフラビンの大量投与による良好な効果28は、リボフラビンおよび/またはビオチンの補充がPD患者の一部において有益である可能性が高いという考えを支持するものである。

方法
対象患者
すべての研究は、名古屋大学大学院医学系研究科（承認番号2016-0151）、岩手医科大学附属病院（承認番号H28-123）、岡山県立極東病院（承認番号kyoIR-2016002）、福岡医療専門学校（承認番号2016M027）の倫理審査委員会（ERC）の承認を得た。すべてのPD患者およびPD患者と同居する健常対照者（同居者）から書面によるインフォームドコンセントを得た。糞便サンプル、患者情報、およびERC承認番号は、16S rRNA遺伝子配列決定に関する以前の研究8と同じであった。

2015年9月から2018年2月までに同居していた特発性PD患者94人とその健常配偶者73人を募集した。各PD患者はMovement Disorder Society（MDS）のPD基準に従って診断された。糖尿病、心不全、肝硬変、悪性腫瘍、血液疾患、自己免疫疾患などの慢性疾患を有する被験者は除外した。また、過去4週間に抗生物質を服用したと主張する被験者も除外した。

サンプル採取、DNA単離、データセットのショットガンseq
参加者の自宅で糞便サンプルを採取し、前述のように保温ジャーに氷嚢を入れて0℃に保ちながら名古屋大学に運んだ8。糞便サンプルは凍結乾燥機（FDU-2110, EYELA, Shanghai, China）を用いて凍結乾燥し、QIAamp PowerFecal DNA Kit（QIAGEN,Hilden,Germany）を用いて20 mgの凍結乾燥（FD）糞便からDNAを製造元の指示に従って抽出した22。プロトコールは一部変更し、ボルテックスミキシングの代わりにLysing Matrix E Beads（MP Biomedicals, Irvine, CA, USA）とFastPrep-24 5G（MP Biomedicals）を用い、6.0 m/sで60秒間を3サイクル行った。NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB, Ipswich, MA, USA）を用いて、メーカーのプロトコールに従ってシーケンスライブラリーを作成し、インデックスコードを付加してシーケンス断片を各サンプルに帰属させた。ライブラリーの品質はTapeStation（Agilent, Santa Clara, CA, USA）を用いて評価した。メタゲノムシーケンスは、HiSeq 2500シーケンスプラットフォーム、HiSeq Rapid SBS Kit v2およびHiSeq PE Rapid Cluster Kit v2（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いて行い、2×150 bpペアエンドリードによりサンプルあたり3 Gbpを得た。

メタ解析のための6つの既報ショットガン-seqデータセット
2022年12月にドイツ・ボン（アクセッション番号、ERP019674）12、中国・上海（本明細書では「China1」）（PRJNA433459）13から入手可能であった6つの既報ショットガン-seqデータセットをダウンロードした；中国・襄陽（以下「中国2」）（PRJNA588035）14；台湾・台北（SUB10308106）15；韓国・ソウル（PRJNA743718）16；米国・アラバマ州バーミンガム（PRJNA834801）17（補足表1および13）。我々のデータセットを含む被験者総数は、PD患者813人、対照558人であった。サンプルあたりの平均リード数は約900万から6,000万リードであった。

ショットガンセクスの解析
まず、fastp（v0.23.4）を用いて品質管理を行い、bowtie2（Version 2.5.0）を用いてヒトゲノム（GRCh38）をデフォルトパラメータで除去した。HUMAnN 3.6を用いて各EC番号のCPMを算出した。また、MetaPhlAn 4を用いて各細菌の属および種レベルでの相対存在量を算出した。HUMAnN 3.6とMetaPhlAn 4の分類学的データベースが異なるため、2つのツールで異なる分類学的名称が得られた。次に、CAZymesの糖質代謝における各遺伝子のCPMを計算した。この目的のために、MEGAHIT（v1.2.9）を用いてショートリード断片からコンティグをデフォルトのパラメータで作成した。このコンティグをdbCAN3 (https://github.com/linnabrown/run_dbcan)の3つの配列類似性検索ツール（HMMER, eCAMI, DIAMOND）を用いてCAZymesデータベースに割り当てた。2つ以上のツールでCAZymesデータベースに割り当てられたコンティグを下流の解析に使用した。ショートリードをBowtie 2でCAZymesに割り当てられたコンティグにマッピングし、コンティグあたりのマッピングリード数を算出した。重複するマップリードは、Picard (3.1.0) tool kit (https://broadinstitute.github.io/picard/)のMarkDuplicatesにより、デフォルトのパラメータを用いて除去した。コンティグあたりのマップリード数はCPMで正規化した。

6つのデータセットのメタ解析
実験方法と人口統計学的特徴を補足表1に示す。韓国16のデータセットは、156サンプル中96サンプル（61.5%）で、単一のEC番号2.1.1.43が全CPMの25%以上を占めたため、メタ解析から除外した。

6つのデータセットでコントロールとPDの違いを示すために、細菌種のPCoAを実施した。6つのデータセットにおけるバッチ効果を除去するために、MetaPhlAn 453によって生成された6つのデータセットの細菌種にMMUPHin52を適用した。MMUPHin解析では、疾患状態（PDまたはコントロール）を共変量に設定し、データセット間の細菌量の差をバッチ効果に設定した。PCoAは、距離測定としてBray-Curtis非類似度を使用し、R 4.2.3上のvegan（バージョン2.6-4）のvegdist関数と、R 4.2.3上のstats（バージョン3.6.2）のcmdscale関数でプロットした。PERMANOVAは、R 4.2.3上のvegan（バージョン2.6-4）のadonis2の関数で実行した。

HUMAnN 3.6のEC番号、MetaPhlAn 4の属・種レベルの分類群、CAZymesは以下の条件でフィルターした。各データセット中の各EC番号、各分類群、各CAZymeについて、それぞれEC番号のCPM、相対分類学的存在量、CAZymeのCPMが0でないサンプル数を数えた。次に、このようなサンプル数が各データセットで20%以上であるEC番号、分類群、CAZymesをフィルターにかけた。その結果、すべてのデータセットで20%の閾値を超えたEC番号1678個、129種、84属、219CAZymesを選んだ。我々は以前、5カ国のPDにおける腸内細菌叢のノンパラメトリック16S rRNA遺伝子配列決定データセットをメタ解析する方法を報告した8。同じメタ解析法を6つのショットガン-seqデータセットに採用した。各EC番号、種、属、およびCAZymeについて、国、保存方法、便DNA安定化剤などの違いから生じるバッチ効果を除去するために、数値データを対照とPDの間の効果量に変換した。各データセットが等しくメタ解析に寄与するように、各データセットに重み付けを行った。また、R (4.2.3)パッケージのphyloseq (version 1.42.0)を用いて、フィルタリングされていない全種を用いて、6つのデータセットのα多様性をシャノン指数でメタ解析した。EC数のメタ解析では、固定効果モデル（FEM）とランダム効果モデル（REM）の両方で、p値がBonferroni補正後0.05未満で、異質性を表すI2が40%54未満である場合に、EC数が有意であるとみなした。分類群およびCAZymesのメタ解析では、FEMとREMの両方でBenjamini-Hochberg法による偽発見率（q値）が0.05未満の場合、分類群またはCAZymeは有意であるとみなした。

交絡因子分析
本データセット、米国データセット17、ドイツデータセット12のメタデータが利用可能であった。6つの特徴（年齢、BMI、便秘、疾患状態、性別、抗コレステロール薬）は、日本と米国のデータセットでは利用可能であったが、ドイツのデータセットでは利用できなかったので、交絡因子の可能性があるものとして設定した。2つのデータセットにおける交絡因子は、メタ解析において対照群とPD群で有意差が認められた73のEC番号、31の属、38の種のそれぞれについて、正規化や変換を行わずに、R 4.2.3上のMaAsLin221のCPLM（複合ポアソン線形モデル）を用いて解析した。米国と日本の差は、MaAsLin2解析のランダム効果に設定した。メタデータが不足していたため、MaAsLin2で解析した総サンプル数は851であった。対照とPDの間のP値は、73のEC番号、31の属、38の種の各分析についてBenjamini-Hochberg法で正規化した。統計的有意性はq値 < 0.05とした。

パスウェイ解析
KEGG パスウェイデータベース（2020-1-14）55 を用いて 2 種類のパスウェイ解析を行った。一つは超幾何学的検定（R 4.2.3の "dhyper "機能）を用いたパスウェイ濃縮分析で、もう一つは GSEA（v4.3.2 for Windows）である。超幾何検定では、メタ解析で有意に変化したEC数をパスウェイごとに評価し、バックグラウンド遺伝子は適切に調整した56。GSEA解析では、既報の方法57に従った。簡単に説明すると、まず各データセットにおける各経路のp値をGSEAで計算した。次に、各パスウェイについて統合p値を計算した。PDで減少したKEGGパスウェイの解析では、データセット中のPDでパスウェイが減少している場合は実際のp値を用い、データセット中のPDでパスウェイが増加している場合はp値を1.00とした。PDで増加したKEGGパスウェイの解析では、同様のルールを逆に適用した。Benjamini-Hochberg法によるq値の有意閾値は0.05とした。

糞便中のSCFAとポリアミンの定量
我々は以前、GC-MSを用いた糞便SCFAレベルの定量法を確立した22。簡単に説明すると、20 mg の糞便を 1000 µL の 5 mmol/L NaOH および 300 µL の H2O と混合した。混合物をジルコニアビーズで10分間激しく振とうし、13,200×g、4℃で20分間遠心分離した。上清（333 µL）を200 µLのH2O、50 µLのヘキサン-6,6,6-d3酸溶液（内部標準）、200 µLの2-メチル-1-プロパノール、133 µLのピリジン、および67 µLのクロロギ酸イソブチルと混合した。得られた溶液を1分間混合した。その後、混合物を0.3 mLのヘキサンに加え、10分間激しく振とうし、1900×gで5分間、室温で遠心分離した。定量分析は、Agilent 5975不活性質量分析計（Agilent Technologies）を装備したAgilent 7890A GCを用いて行った。すべての SCFA 定量の精度は、相対標準偏差（RSD）8.4%未満であった。

また、GC-MSを用いた糞便中のコハク酸および乳酸レベルの定量法も報告した23。簡単に説明すると、20mgの糞便を400μLのH2O、10μLのスルホサリチル酸溶液（1mg/μL）、および内部標準溶液（ヘキサン酸-6,6,6-d3）と混合した。混合物をジルコニアビーズで10分間激しく振とうし、13,200×g、4℃で20分間遠心した。上清を20μLの6mol/L HClと2ml μLのジエチルエーテルと混合した。サンプルを再度遠心分離し、上層を新しいガラス試験管に移した。試料を40℃で窒素ガスにより乾燥した。残渣を300μLのジエチルエーテルに溶解した。20μLのN-tert-ブチルジメチルシリルイミダゾールを加えた後、60℃で30分間誘導体化反応を行った。最後に、溶液を上記のようにGC-MSを用いて分析した。乳酸およびコハク酸の定量精度は、それぞれ16％RSDおよび2％RSD未満であった。

糞便ポリアミン（プトレシン、スペルミジン、スペルミン）は、Xiongら58が提案したプロトコールに従って、LC-MS/MSで定量した。簡単に説明すると、N-(9-フルオレニルメト-オキシカルボニルオキシ)スクシンイミドで誘導体化した後、Agilent 1200 infinity LCとAgilent 6430 Triple Quadrupole LC/MS System (Agilent Technologies)を組み合わせたLC-MS/MSでポリアミンを分析した。1,6-ジアミノヘキサンを内部標準として使用した。すべてのポリアミンの定量精度は、4.9% RSD 未満でした。

各EC番号における各細菌のCPM寄与率
リボフラビン代謝」および「ビオチン代謝」において有意に減少した9つのEC数の細菌起源を調べるため、各EC数について各細菌が寄与したCPMの分率を算出した。各EC番号の各細菌について、コントロールの分画CPMの中央値からPDの分画CPMの中央値を引いてΔfCPMを算出した。最も負のΔfCPMを持つ細菌が、特定のデータセットにおけるEC数の減少の大部分を占めると仮定した。各EC番号の各細菌について、ΔfCPMを6つのデータセットで平均した。各EC番号について、平均したΔfCPMを昇順にソートし、上位5菌を選択した。

統計解析
腸内細菌の相対量は、Python 3.11.2のscipy.statのmannwhitneyu機能を用いて、マッチしないペアに対するWilcoxon順位和検定で解析した。多重比較分析では、3つの異なる閾値を設定した。EC数のメタ解析では、ボンフェローニ補正後のp値の有意閾値をFEM、REMともに0.05未満、I2の有意閾値を40％未満とした。分類群とCAZymesのメタ解析では、Benjamini-Hochberg法によるq値の有意閾値をFEM、REMともに0.05未満とした。交絡因子解析では、Benjamin-Hochberg法によるq値の有意閾値は0.05未満とした。

データの利用可能性
本データセットの塩基配列データは、DNA Data Bank of Japan (DDBJ)のアクセッション番号DRA016410で公開されている。

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参考文献のダウンロード

謝辞
名古屋大学大学院医学系研究科の大塚圭吾氏、小関かれん氏、児玉晴美氏、山田智美氏に技術協力をいただいた。また、ショットガンメタゲノム解析の技術協力をいただいた名古屋大学大学院医学系研究科医工学部門、名古屋市立大学大学院薬学研究科の奥野裕介氏に感謝する。　本研究は、日本学術振興会科学研究費補助金（H.N.にJP22K17343、M.I.にJP23K06412、T.H.にJP22K15394、 K.O.にJP23H02794）、厚生労働省（K.O.に23FC1014）、日本医療研究開発機構（K.O.にJP22ek0109488）、国立精神・神経医療研究センター（K.O.に5-6）。

著者情報
著者および所属
名古屋大学大学院医学系研究科神経疾患・がんセンター神経遺伝学部門

西脇洋、伊藤美香子、浜口智成、大野欣司

名古屋大学大学院医学系研究科病態生理検査学分野

上山淳、滝本圭一、平山正明

岩手医科大学医学部内科学講座神経・老年医学分野

前田哲也

岡山神経内科クリニック

樫原健一

福岡大学神経内科

坪井義雄

国立遺伝学研究所先端ゲノム医療センター（日本、三島

森洋・黒川健

名古屋大学大学院医学系研究科神経内科

勝野正久

中部大学生活科学部作業療法学科（日本、春日井

平山正明

名古屋学芸大学大学院栄養科学研究科（日本、名古屋

大野欣司

寄稿
H.N.、M.H.、K.O.が本研究を発案した。M.I.、T.M.、K.T.はショットガンメタゲノム実験を行った。J.U.は糞便中の代謝物を定量した。T.M.、K.K.、Y.T.、M.K.、M.H.は糞便サンプルと臨床データを提供した。すべての著者が原稿を校閲し、承認した。

連絡先
西脇博史、平山正明、大野欣司のいずれかにご連絡ください。

倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。

追加情報
出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

補足情報
補足資料
報告-概要
権利と許可
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パーキンソン病における腸内細菌叢のショットガンシーケンスのメタ解析. 10, 106 (2024). https://doi.org/10.1038/s41531-024-00724-z

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受領
2024年2月18日

受理
2024年5月10日

掲載
2024年5月21日

DOI
https://doi.org/10.1038/s41531-024-00724-z

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対象
遺伝子データベース
パーキンソン病
パーキンソン病 (npj Parkinsons Dis.) ISSN 2373-8057 (オンライン)

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