自閉症スペクトラム障害児への経口凍結乾燥糞便微生物叢移植後の効果と微生物叢の変化

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オリジナル研究論文
Front. 小児科、2024年05月09日
Sec.小児消化器病学、肝臓病学および栄養学
第12巻-2024年｜https://doi.org/10.3389/fped.2024.1369823
自閉症スペクトラム障害児への経口凍結乾燥糞便微生物叢移植後の効果と微生物叢の変化

https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fped.2024.1369823/full

Youran Li1 Pei Xiao1 Rong Cao1 Jun Le1 Qiao Xu1 Fangfei Xiao1 Lin Ye1 Xufei Wang1 Yizhong Wang1,2* Ting Zhang1,2*
1上海交通大学医学部小児病院消化器・肝臓・栄養部
2上海交通大学医学部小児感染・免疫・クリティカルケア医学研究所（中国・上海市
背景と目的：自閉症スペクトラム障害（ASD）は、社会的コミュニケーション障害と制限的で反復的な感覚運動行動を中核的特徴とする、異質な神経発達障害群である。本研究では、消化管（GI）症状の有無にかかわらずASDの小児における糞便微生物叢移植（FMT）の利用をさらに検討し、FMTの効果を評価し、腸内細菌叢内の細菌および真菌組成の変化を解析することを目的とした。

方法 ASDと診断された合計38名の小児が研究に参加し、経口凍結乾燥FMT治療を受けた。FMTの投与量は、レシピエントの体重1kgあたりドナーの便1gの割合に基づいて決定され、4週間に1回の頻度で合計12週間行われた。さらに、30名の健常対照者（HC）を解析に含めた。FMTの臨床的有効性を評価するとともに、16S rRNAおよびITS遺伝子配列決定法を用いて糞便中の細菌および真菌の組成を決定した。

結果 38名のASD児の年齢中央値は7歳であった。これらの小児のうち84.2％（38人中32人）が男児で、81.6％（38人中31人）に消化器症状がみられ、消化不良、便秘、下痢が最も一般的な症状であった。サンプル採取と評価は、ベースライン時（0週目）、治療後（12週目）、追跡調査時（20週目）に行われた。FMT治療後の追跡調査終了時点で、自閉症行動チェックリスト（ABC）のスコアはベースラインから23％低下し、小児自閉症評価尺度（CARS）のスコアは10％低下し、社会的反応性尺度（SRS）のスコアは6％低下し、小児睡眠障害尺度（SDSC）のスコアは10％低下した。また、短期的な有害事象として2名に嘔吐と発熱が認められたが、これらは自己制限的で24時間以内に消失し、長期的な有害事象は認められなかった。FMT治療前後でASD児のαおよびβ多様性に有意差は認められなかったが、FMT治療によりASD患者の検体中のさまざまな細菌および真菌属の相対量に変化が認められた。ASD患者と健常対照者（HC）を比較した結果、FMTの前後で微生物の存在量に統計学的に有意な差が認められた。Blautia属、Sellimonas属、Saccharomycopsis属、Cystobasidium属はASD患者において健常対照者よりも多く、Dorea属は少なかった。FMT処理後、Blautia、Sellimonas、Saccharomycopsis、Cystobasidiumの濃度は減少し、Doreaの濃度は増加した。さらに、Fusicatenibacter、Erysipelotrichaceae_UCG-003、Saccharomyces、Rhodotorula、CutaneotrichosporonおよびZygosaccharomycesの増加量は、ASD中核症状のスコアと負の相関を示した。

結論 経口凍結乾燥FMTは、ASD児の消化器症状やASD関連症状、睡眠障害を改善し、腸内細菌や真菌の微生物叢組成を変化させる可能性がある。

臨床試験登録 中国臨床試験登録、ChiCTR2200055943。2022年1月28日登録、www.chictr.org.cn。

はじめに
自閉症スペクトラム障害（ASD）は、社会的コミュニケーション障害と制限的で反復的な感覚運動行動を中核的特徴とする、異質な神経発達障害群である（1）。ASDの有病率は地域や年齢層によって異なるが、これはおそらく地域社会の認識、サービス能力、社会人口統計学的要因の相互作用によるものであろう。米国では、ASDは8歳児の約2.3%、成人の約2.2%が罹患している(2)。Global Burden of Disease Study 2019では、ASDの有病率は0.37%（370.00/100,000）であり、女性よりも男性で高い（比率＞3 : 1）ことが報告されている(3)。ASDの世界的な負担は増加し続けており、依然として精神保健上の主要な関心事である(4)。現在、ASDの根治的な治療法はないが、主な治療法は早期集中行動介入であり、応用行動分析学（Applied Behaviour Analysis）の形で最もよく知られている(2)。しかし、ASDに特化した標的薬は開発されていない(5)。

現在のところ、ASDは病因や病態が不明な疾患であり、遺伝的要因、環境要因、微生物叢-腸-脳軸が関係している可能性がある(1)。ASD患者と健常対照群との腸内細菌叢の違いは多くの研究で観察されているが、これらの知見を統合するにはさらなる研究が必要である(6)。対照群と比較すると、ASD児ではバクテロイデス属、ファーミキューテス属、アクチノバクテリア属が多く、バクテロイデス属、パラバクテロイデス属、クロストリジウム属、フェーカリバクテリウム属、ファスコラクトバクテリウム属の存在量は有意に高く、コプロコッカス属とビフィドバクテリウム属の存在量は低かった(7)。腸内細菌叢は、免疫、神経、代謝経路を通じて脳の発達や神経行動に影響を及ぼす(8)。したがって、微生物叢-腸-脳軸はASDにおいて重要な役割を果たしており、ASDの治療ターゲットになると考えられている(9)。

便微生物叢移植（FMT）とは、レシピエントの腸内の恒常性を回復させるために、健康なドナーの便を別の患者の消化管に移植することを指す(10)。現在、クロストリジウム・ディフィシル感染症および再発性クロストリジウム・ディフィシル感染症は、小児におけるFMTの最も適切な適応と考えられている。さらに、FMTは、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群、機能性便秘、非アルコール性脂肪肝疾患、ASD、糖尿病など、他の小児疾患においても有望な治療効果を示している(11)。FMTはさまざまな小児疾患の治療に有望視されているが、依然として研究段階にあり、臨床ガイドラインではまだ承認されていない。動物実験では、健康なヒトの腸内細菌叢に由来するFMTが、ASDマウスの不安様行動や反復行動を有意に改善し、中枢神経系の神経発達やシナプス伝達に重要な役割を果たすケモカインの血清レベルを上昇させることが示された(12)。別の研究では、ナイーブな野生型マウスからのFMTが、Fmr1ノックアウトマウスの記憶障害と社会的引きこもりを効果的に改善することが観察された。この治療介入により、アッカーマンシア・ムチニフィラレベルが野生型マウスで観察されるレベルまで回復し、同時に治療したマウスの脳内のTNF-αとIba1のレベルが低下した（13）。さらに、FMT療法は、プロピオン酸によって誘発されたASDモデルマウスにおける社会的相互作用の障害を修復することが判明している(14)。FMT治療は、糞便微生物叢のクロストリジウム種のバランスを回復させ、海馬の脳由来神経栄養因子の発現を正常化し、脳内のグルタチオンS-トランスフェラーゼレベルを上昇させる能力を示した（14、15）。全体として、FMTは腸内細菌叢を変化させ、ASD動物モデルにおける社会的引きこもり症状や認知障害を改善する有用な手段であり、ASD児に対する有望な治療戦略であると考えられる。

自閉症コミュニティにおける消化器（GI）症状の有病率は30～37.4％であると報告されている(16)。神経健常児と比較すると、ASD児は便秘、下痢、腹痛、鼓腸などの消化器症状を併発する可能性が少なくとも3倍高かった(17, 18)。臨床試験は、GI症状を伴うASD児に対してのみ実施されているが（19、20）、この集団におけるFMTの有効性を検証するためには、より多くのデータが必要である。本研究の目的は、GI症状の有無にかかわらずASD児におけるFMTの利用を調査し、FMTの臨床的有効性を評価し、腸内細菌叢内の細菌および真菌組成の変化を解析することである。さらに、微生物叢-腸-脳軸に着目し、FMTによるASD改善のメカニズムを探る。

参加者と方法
研究デザイン
サンプルサイズの計算に関しては、FMTで効果的な治療を受けた参加者の割合は90%と推定される(19)。PASS 11ソフトウェアを使用し、α=0.05（両側）、検出力=0.90として、算出されたサンプルサイズは35である。研究参加者の脱落率を10％と仮定すると、サンプルサイズは38が必要である。最後に、本研究は、米国精神医学会の「精神障害の診断と統計マニュアル第5版（DSM-5）」の基準で診断された38人のASD児（3～14歳）を対象とし、非盲検臨床試験として実施された。これらのASD児のうち、31人に消化器症状（腹痛、逆流、消化不良、下痢、便秘など）がみられ、7人に消化器症状はみられなかった。研究期間中、すべての子供が12週間のFMT治療を受け、治療終了後8週間の観察期間が設けられた。全試験期間は20週間であった。健常対照（HC）群として、GI症状のない30人の健常児を募集した。健常児は治療を受けず、FMT治療は凍結乾燥カプセルによってASD児全員に経口投与された。FMTの前に、バンコマイシンもプロトンポンプ阻害剤も小児には投与されなかった。研究者らは、群割り付けとアウトカム評価を把握していた。研究デザインを図1に示す。

図1
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図1. 研究デザインのタイムライン。この研究では、12週間のFMT治療期間と、FMT終了後の8週間の観察期間を設定している。検体採取とGI、行動、睡眠の評価は、模式的なタイムラインで示されるように、特定の間隔で行われた（下；健常対照群とASD群はそれぞれ赤と青で色分けされている）。

この臨床研究は、上海交通大学上海小児病院の倫理審査委員会によって承認された。本研究に登録する前に、各参加者の保護者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。さらに、本研究はChinese Clinical Trial Registry（www.chictr.org.cn）に登録された。治験実施計画書は登録番号ChiCTR2200055943で閲覧可能である。

被験者募集
ASD児は、主に上海小児病院のFMT集学的クリニックの患者から募集した。健常児は研究者の知人の家族から募集した。被験者の組み入れ基準には、18歳未満でカプセルを飲み込むことができること、DSM-5のASD診断基準および一般的に使用されている診断尺度に合致していること、研究者が臨床データとサンプルを収集することに同意し、インフォームド・コンセントを十分に理解して署名する法的保護者がいること、継続的に研究に参加し追跡調査が可能であることが含まれる。除外基準には、ライ症候群またはその他の精神疾患と確定診断されていること、脳外傷、脳性麻痺、脳炎、その他の脳の器質的疾患の明らかな既往歴があること、過去3ヵ月間にプロバイオティクス、抗生物質、プロトンポンプ阻害薬、その他の腸内細菌叢に影響を与える薬剤を使用していること、先天性巨大結腸症、腸閉塞、腸重積症などの他の重篤な消化器疾患や腸の器質的病変があること、コンプライアンスが悪いことなどが含まれた。健常児にはASD、注意欠陥多動性障害、うつ病、不安障害などの精神障害はなく、ASDの第一度近親者もいなかった。ASD児からは便、尿、唾液、血液が採取され、健常児からは最初の便、尿、唾液のみが採取された。参加者全員の保護者は、インフォームド・コンセントを理解し同意することができ、参加者全員が8週間の追跡評価を受けることができた。

便ドナーの選択とFMTの準備
便ドナーのスクリーニングを受けたボランティアの病歴を確認し、検査結果を収集した。便ドナーとなるためには、以下の基準を満たさなければならなかった：年齢が15歳から30歳であること；全体的に健康であること；体格指数（BMI）が18.5kg/m2から23.9kg/m2であること；1日1回または2回の定期的な排便があり、ブリストル便スコアが4型であること。除外基準は、消化器疾患、慢性全身疾患、悪性新生物、放射線化学療法を受けた既往があること、進行中の疾患を合併していること、過去3ヵ月間に抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクス、プロトンポンプ阻害薬、免疫抑制剤、血液製剤を使用していることなどであった； A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、ヒト免疫不全ウイルス、梅毒、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルスの血清検査陽性、細菌、ウイルス、寄生虫の糞便検査陽性、広域β-ラクタマーゼ、カルバペネマーゼ、コリスチン耐性などの多剤耐性遺伝子の検出(21)。本研究では、スクリーニングの結果、2名のドナーを採用した。

新鮮なドナーの便サンプルを採取するために使い捨てのボトルを使用した。100gの糞便を500mlの生理食塩水と混合し、自動精密ろ過装置（GenFMTer、南京、江蘇省、中国）を用いて6時間以内に均一化した。その後、糞便懸濁液を所定のスケジュールに従って装置内でろ過処理した(22)。精密ろ過後、懸濁液を50mlのチューブに集め、1,500gで3分間遠心した。上清を除去し、沈殿物を通常の生理食塩水に溶解して糞便菌液とした。凍結乾燥保護剤を糞便菌液に添加し、低温凍結乾燥機で凍結乾燥して粉末化した。凍結乾燥された最終粉末は、サイズ00のヒプロメロースカプセル（Anhui Huangshan Capsule, Xuancheng, Anhui Province, China）に二重カプセル化され、-80℃で保存された。糞便カプセルは経口投与の約2時間前に-20℃に移した。

ASDに対するFMTの投与量と治療期間は現在も研究中であり、過去の文献では投与量と治療期間にばらつきがあることが報告されている。各コースのFMT投与量は、ドナーの便の重量とASD児の体重をもとに、レシピエントの体重1kgあたりドナーの便1gの割合で決定した。我々の小児疾患に対するFMT治療の研究から、FMTの投与量は概ね現在の比率に沿っており、有効性が示されている。さらに、FMT前後の患者の動的変化の分析を通じて、微生物叢移植の期間は約4週間である。そこで、腸内細菌叢のコロニー形成を促進するために、3回の治療コースを選択した(23-25)。各コースのカプセルは食前の空腹時に服用し、3日以内に終了し、4週間ごとに1コースの頻度で、12週間にわたって合計3コース行った。

評価とサンプル採取
ASDの参加者は、試験開始0週目に身体検査を受けた。16s rRNAおよび真菌類のITS配列決定による腸内細菌叢の組成と存在量を分析する目的で、試験開始0週目、12週目、20週目にASD参加者から便サンプルが採取された。尿と唾液のサンプルは0週目、12週目、20週目に採取された。血液サンプルは0週目と12週目に採取した。尿および血液サンプルは、神経伝達物質代謝に関連するメカニズムに関するその後の研究のために、また唾液サンプルは、その後の口腔内細菌叢検出のために採取された。便サンプルは16s rRNA配列決定のため、研究開始時に健康な小児から採取した。採取した検体は直ちに処理し、-80℃で保存した。FMT治療後、各参加者に電話で面接を行った。治療後に質問があったり、有害な症状が現れたりした場合には、追加の面接や診察が行われた。

消化器症状の評価
各参加者の消化器症状を評価するため、両親にGastrointestinal Symptoms Rating Scale（GSRS）の記入を依頼した。GSRSは、7段階のリッカート尺度を用いた自己報告式の質問票であり、次のような記述指標がある： 1（無症状）、2（軽度）、3（軽度）、4（中等度）、5（中等度から重度）、6（重度）、7（非常に重度）の7段階リッカート尺度で胃腸症状の重症度を評価する。当初は、一般的な胃腸症状を評価するための対面式質問用の階層的尺度としてデザインされた。その後、自己管理質問票を作成するために修正された。GSRSは15項目の質問紙で、参加者が過去2週間に経験した5つの次元の消化器症状（腹痛、逆流、消化不良、下痢、便秘）を評価する。各次元のスコアは、その次元内の全項目の平均スコアとして計算され、1～7の範囲である。

ASD関連症状と睡眠症状の評価
ASDに関連する症状を評価するために、以下の3つの尺度を用いた： 自閉症行動チェックリスト（ABC）、小児期自閉症評価尺度（CARS）、社会的反応性尺度（SRS）である。ABCには57の項目があり、ASD児によく見られる5つの領域における問題行動を評価する。これらの領域とは、感覚、関連、身体と物の使用、言語、社会性、自助である。CARSは15項目の尺度であり、ASDの診断と症状の全体的な重症度の評価の両方に利用できる。SRSは、両親または養育者が記入する65項目の質問紙で、社会的コミュニケーション、社会的認知、社会的動機づけ、自閉的マンネリズムを評価する。小児睡眠障害尺度（Sleep Disturbance Scale for Children：SDSC）は、小児の睡眠問題を評価するための質問紙である。SDSCは26項目からなり、睡眠障害の6つの領域を評価する。ABC、CARS、SRS、SDSCはすべて、ベースライン（0週目）、治療4週間後（12週目）、評価期間の最終時点（20週目）の3つの異なる時点で参加者に行われた。

微生物DNA抽出
QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen, Hilden, Germany）を用いて、糞便サンプルから微生物DNAを抽出した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）プライマー338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）および806R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）を用いて、細菌16S rRNA V3-V4超可変領域を増幅した。真菌内部転写スペーサー（ITS）領域は、プライマーITS1F（5′-CTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′）およびITS2R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）を用いて増幅した。PCR産物はAxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences, Union City, CA, USA)を用いて精製した。精製したアンプリコンのペアエンドシーケンスは、Majorbio Bio-Pharm Technology Co. (Ltd.（中国、上海）で行った。

16S rRNAおよび真菌ITS配列決定
FLASH (v1.2.11)を用いて生の16S rRNAとITS遺伝子の配列を結合し、fastp (0.19.6)を用いてクオリティフィルターを行った(26, 27)。高品質な配列はDADA2を用いてノイズ除去され、固有のAmplicon Sequence Variant (ASV)が得られた(28)。Qiime2（バージョン2020.2）パイプラインと推奨パラメーターを用いて解析を行った。ASVの分類学的割り当ては、Qiime2に実装されているBlastコンセンサス分類法、SILVA 16S rRNAデータベース（v138）、UNITE v8データベースを用いて行った(29)。細菌および真菌の群集組成データは、Majorbio Cloud Platformを用いて解析した。糞便微生物叢のα多様性は、観察されたリッチネス（Sobs）、チャオ（Chao）、存在量に基づくカバレッジ推定量（ACE）、シャノン（Shannon）およびシンプソン（Simpson）指数を用いて評価した。さらに、β多様性は主座標分析（PCoA）とBray-Curtis距離および重み付きUniFrac指標を用いて測定した。ウィルコクソン順位和検定は、異なるグループ間の相対的存在量の分類群の違いを分析するために利用した。

統計的手法
本研究では、SPSS 22.0（SPSS Inc.） 連続変数は中央値および四分位範囲（IQR）で表した。統計学的検定の選択の指針として正規性検定を行った。測定データは、t検定、ノンパラメトリックMann-Whitney U検定、Kruskal-Wallis H検定、Friedman検定を用いて比較した。さらに、カテゴリーデータはカイ二乗検定を用いて比較した。p値はすべてFDRで補正し、特に断りのない場合は0.05未満を統計的に有意とみなした。

結果
ASD児の特徴
本研究では、ASDの重要な包含基準を満たした38人の子どもと、別の家庭の健常児30人を対象とした。ASD児は12週間連続してFMT治療を受け、さらに8週間経過を観察した。健常児は全試験期間中、いかなる治療も受けなかった（図1）。試験開始時に、参加者全員の性別、年齢分布、体格指数（BMI）などの人口統計学的特徴を比較した（表1）。さらに、ASD児の自閉症とGI症状の重症度を評価した。食事評価では、ASD児の47.4％（38人中18人）が、さまざまな程度で食事摂取のバランスが崩れていることが明らかになった。

表1
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表1. 自閉症スペクトラム障害（ASD）児と健常対照（HC）児の人口統計学的特徴。

FMTに対する臨床的反応
追跡調査段階で、FMT後の参加者の消化器症状全般をGSRSを用いて測定したところ、消化不良、便秘、下痢などの症状に有意な改善が認められた。GSRSの平均スコアは、FMT治療中止後に51％低下したが、治療中止8週間後に逆転（ベースラインから32％低下）し（図2A）、FMT後に消化器症状が明らかに改善したことが示された。また、FMT治療後、ASDと睡眠に関する症状の改善も観察された。FMT治療中止後、ABCスコアは20％低下し、治療中止8週間後も低下したまま（ベースラインから23％低下）であった（図2B）。追跡期間終了時、CARSの得点は10％減少し（図2C）、SRSの得点は6％減少した（図2D）。治療中止8週後には、睡眠症状を評価するSDSCの得点が10％減少した（図2E）。FMT治療前後の各スケール得点の変化を測定した（表2）。試験中に脱落者はなかった。また、経過観察中に観察された短期的な有害事象は、嘔吐と発熱2名であったが、これらは24時間以内に消失する自己限定的なものであり、長期的な有害事象は観察されなかったことから、FMT療法は一般的に安全であることが示された。したがって、今回のデータは、経口凍結乾燥FMTが重篤な有害事象を引き起こすことなく、消化器症状、ASD関連症状、睡眠症状を改善する可能性を示唆している。

図2
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図2. FMT後のGI、ASD関連症状、睡眠症状の変化。すべてのASD児が12週間のFMT治療を受け、治療終了後8週間の観察期間があった。GI症状、ASD関連症状、睡眠症状は、ベースライン（0週目）、治療後（12週目）、評価期間の最終時点（20週目）の3つの異なる時点で尺度によって評価された。(A）GSRSスコア（n = 31）。(B）ABCスコア（n = 38）。(C）CARSスコア（n = 38）。(D）SRSの総得点（n = 38）。(E）SDSCスコア（n = 38）。有意性の判定にはフリードマン検定を用いた。*p＜0.05、***p＜0.01、***p＜0.001、***p＜0.0001。

表2
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表2. ASD児の消化器症状、ASD関連症状、睡眠症状に対するFMT治療の効果。

ASD児における腸内細菌叢の変化とFMT後の変化
α多様性の評価を行ったところ、初回評価時にHC群とASD群の間でα多様性に顕著な変化が観察された（図3A）。両群の腸内細菌叢の非類似性を調べるため、β多様性を計算したところ、両群間でβ多様性に有意な格差が検出された（図3B）。門および属レベルで微生物叢の組成を調べたところ、ASD患者の微生物叢とHCの微生物叢の間に非類似性があることがわかった（図4A、図3C）。LEfSe分析を用いて、ベースライン（LDAスコアが4.0以上）においてASD群とHC群の間で存在量に有意差を示した2属を同定した。ASD群では、科レベルではLachnospiraceaeが、属レベルではBlautiaが相対的に多く、HC群では、科レベルではEnterobacteriaceaeが、属レベルではEscherichia-Shigellaが相対的に多かった（図4B）。

図3
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図3. ASD児における腸内細菌叢の変化とFMT後の変化。FMT治療はASD児の腸内細菌叢の組成を変化させる。(A）ASVに基づくチャオ指数とシャノン指数で測定したα多様性（HC、n＝30；FMT前［week0］のASD、n＝38；FMT後［week12］のASD、n＝33；FMT後8週間［week20］のASD、n＝32）。有意性はKruskal-Wallis H-検定を用いて決定した。(B）Bray-Curtis距離のPCoAで解析したβ多様性（HC、n＝30；week0、n＝38；week12、n＝33；week20、n＝32）。(C)各群における代表的属の相対的存在量を示す棒グラフ。(D) 有意差のある細菌属の存在量。有意性はKruskal-Wallis H-検定を用いて決定した。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。

図4
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図4. ASD児における腸内細菌叢の変化。ASD児の腸内細菌叢の組成はHC児のそれとは異なっている。(A）2つのグループの最も一般的な細菌門の相対的存在量を示す棒グラフ。(B）LEfSeは、2群間で細菌の存在量に最も有意差のある分類群を検出した。LDAスコアが4以上の細菌がグラフ化された。(C)2つのグループにおける最も一般的な真菌門の相対的存在量を示す棒グラフ。(D) LEfSeは、2群間で真菌の存在量に最も有意差のある分類群を検出した。LDAスコアが4以上の真菌をグラフ化した。

12週間のFMT治療後、ASD児のαおよびβ多様性にはFMT治療前後で有意差は認められなかったが（図3A,B）、FMT治療によりASD患者のサンプル中の様々な細菌属の相対存在量に変化が認められた。具体的には、Eubacterium_hallii_group、Anaerostipes、Fusicatenibacter、Collinsella、Ruminococcus_torques_group、Doreaの存在量が増加し、Blautia、Prevotella、Sellimonasの存在量が減少した（図3C,D）。ASD児の腸内細菌叢について、GI症状の有無とFMT後の変化も解析したところ、GI症状のない個体が有意に少ない可能性があり、HC群と比較してαおよびβの多様性に統計学的に有意な差はないことがわかった（補足図S1A,B）。しかし、特定の細菌属の存在量にはまだ差がある（補足図S1C,D）。

FMT後の糞便真菌叢の変化
真菌のITS領域のアンプリコンベースの塩基配列決定を通して、我々は研究コホートの腸内真菌叢を分析した。その結果、ASD患者38人中31人、HC患者30人中5人に質の高い真菌の配列が認められた。真菌のα多様性は、ASD患者とHC患者で有意な差が認められた（図5A）。PCoAを用いたβ多様性の解析から、ASD患者の腸内真菌叢はHC患者のそれとは有意に異なることが示された（図5B）。門レベルでも属レベルでも、ASD患者とHCの間で真菌叢組成の違いが観察された（図4C、図5C）。ベースラインでは、LEfSe分析を利用して、ASDとHCの間で存在量に有意差（LDAスコアが4.0以上）を示した7属を同定した。科レベルの存在量では、ASD群の子どもたちは、アスペルギルス科、サッカロミコプシダ科、スポリジオボラ科、クラドスポリ科で比較的高いレベルを示した。属レベルでは、ASD児はAspergillus、Saccharomycopsis、Rhodotorula、Cladosporiumのレベルが比較的高かった。対照的に、HC群では属レベルでAscomycotaとSaccharomycesのレベルが比較的高かった（図4D）。

図5
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図5. ASD児における腸内真菌叢の変化とFMT後の変化。FMT治療はASD児の腸内真菌叢の組成を変化させる。(A）ASVに基づくChao指数とShannon指数で測定したα多様性（HC、n＝5；FMT前のASD［week0］、n＝31；FMT後4週［week12］、n＝27；FMT後12週［week20］、n＝23）。有意性はKruskal-Wallis H-検定を用いて決定した。(B）Bray-Curtis距離のPCoAで解析したβ多様性（HC、n＝5；week0、n＝31；week12、n＝27；week20、n＝23）。(C) 各グループにおける代表的な属の相対的な存在量を示す棒グラフ。(D）有意差のある真菌属の存在量。有意性はKruskal-Wallis H-検定を用いて決定した。*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001。

12週間のFMT治療後、ASD児のベースラインと治療後のサンプル間でαおよびβ多様性に有意差は観察されなかったが（図5A,B）、FMT治療はASD患者のサンプルにおけるいくつかの真菌属の相対存在量に変化を引き起こした。特に、アスペルギルス科の存在量の増加と、Saccharomycopsis、Cystobasidium、Chaetomiumの存在量の減少が観察された（図5C,D）。この解析では、GI症状の有無にかかわらずASD児の腸内真菌細菌叢、およびFMT後の変化も対象とした。GI症状のない個体数が有意に少なかったため、HC群と比較してαおよびβの多様性に統計学的に有意な差は観察されなかった（補足図S2A,B）。それにもかかわらず、特定の真菌属の存在量には明らかな差が認められた（補足図S2C,D）。

ASD関連腸内細菌、真菌と臨床症状との共分散
ASD患者における腸内細菌、真菌の変化と臨床的中核症状との関連をスピアマンの順位相関係数を用いて解析した。Intestinibacter、Terrisporobacter、Turicibacterは、社会的コミュニケーションや認知障害の症状を含むSRSスコアと正の相関を示した。Ruminococcus_torques_groupは、感覚、関連、身体と物の使用、言語、社会性、自助の5領域を含むABCスコアと正の相関があった。一方、FusicatenibacterとErysipelotrichaceae_UCG-003の存在量の増加は、ASD中核症状のスコアと負の相関があった（図6A）。ASD患者におけるCladosporiumやAuriculariaのような特定の真菌属の存在量の増加は、中核症状のスコアと正の相関があった。逆に、Saccharomyces、Rhodotorula、Cutaneotrichosporon、Zygosaccharomycesの存在量の増加は、ASD中核症状のスコアと負の相関があった（図6B）。

図6
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図6. ASD関連腸内細菌、真菌と臨床症状との間の共分散。FMT前後のASD患者における細菌、真菌属の存在量と中核症状の潜在的相関。(A）有意に異なる上位30腸内細菌属とASDの中核症状との間のスピアマンの相関分析。(B）スピアマンの相関分析により、腸内細菌属とASDの中核症状から構築された相関行列。正の相関を赤、負の相関を青で示す。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。

考察
ASD患者に対するFMTの治療効果を検討した先行研究はほとんどない。小規模の非盲検臨床試験において、中等度から重度の消化器症状を有する18人のASD児が、2週間の抗生物質投与と腸内洗浄を受けた後、経口投与または直腸投与のいずれかに無作為に割り付けられ、初回投与量を多くして開始し、その後7～8週間低用量で維持するFMT治療を受けた。治療終了8週間後に追跡評価を行った。治療の結果、GSRSスコアによる消化器症状は80％改善し、CARSスコアは治療中に22％低下し、その後8週間無治療で24％低下した。シークエンシング解析の結果、ビフィズス菌、プレボレラ菌、デホスホコッカス菌の存在量と総細菌多様性は、治療8週間後に増加し、安定したままであった(19)。8人のASD児は、2年間のFMT治療後、消化器症状とASD症状の両方に改善を示した。さらに、微生物の多様性が増加し、ビフィズス菌とプレボテラ菌の割合が高くなるなど、腸内細菌叢に顕著な変化が見られた(30)。上記の臨床試験には、中等度から重度の消化器症状を有する少数のASD児が参加した。FMTの治療方法はさまざまで、治療期間中は毎日経口または直腸投与が必要であった。本研究では、より多くのASD児を対象とし、経口投与に凍結乾燥粉末カプセルを利用することで、投与回数を減らした。このアプローチは、多くのASD児と親の不安に対する薬物療法の課題を軽減するのに役立つ。

別の臨床試験では、40人のASD児と16人の健常児が4週間のFMT治療を受け、その後8週間の経過観察を受けた。その結果、経口および直腸FMTはいずれも有効であり、FMTはドナー微生物叢の生着も促進することが示された。Eubacterium coprostanoligenesの存在量とGSRSスコアの高さには正の相関があったが、FMT治療によりその存在量が減少し、ASD症状の改善に寄与したと考えられる(20)。上記の研究に含まれるASD児はすべて消化器症状を有していた。GI症状のないASD児に対する治療効果は不明であり、治療期間も比較的短かった。この結果から、特定の微生物介入をターゲットにすることで、FMTの有効性が高まる可能性が示唆されたが、さらなる詳細な研究が必要である。これにより、治療戦略を最適化するための貴重な知見が得られる可能性がある。本研究では、消化器症状のないASD児を対象とし、治療前後の腸内細菌および真菌組成の変化と、社会性障害などのASD中核症状の改善との相関分析を行った。これらの知見から、FMTは腸内細菌叢を調節することによりASD症状を改善する安全かつ効果的な長期的治療選択肢となり得ることが示唆された。

ASDの病因は依然として不明であるが、腸内細菌群集とASDには一定の相関関係がある。ASD児の微生物叢は比較的停滞した発達を示し、徐々に正常な軌道から外れていく。また、初期の微生物叢は不安定で未発達であり、一般細菌がコロニー形成を確立するのは困難であった。ASD児では3歳以前にマイクロバイオームの関係が著しく変化しており、これは行動障害が起こる年齢と一致している(31)。複数の研究により、ASD患者の腸内細菌群集は一貫して健常児とは異なることが示されている(32)。健常児と比較すると、ASD児は動物門レベルでVerrucomicrobiaの存在量の減少を示した(33)。クラスレベルではβプロテオバクテリアが増加し、目レベルではClostridialesが増加し、BacteroidalesとSelenomonadalesが減少した(34)。科レベルでは、ErysipelotrichaceaeとRuminococcaceaeが高く、Prevotellaceae、Actinomycetaceae、Coriobacteriaceae、Streptococcaceae、BifidobacteriaceaeとOscillospiraがASD児で低かった(35)。クロストリジウム属、アルカリフレクサス属、デスルホビブリオ属、アセタネロバクテリウム属、パラバクテロイデス属、ラクトバチルス属、スッテレラ属、オドリバクター属、ブチリシモナス属、プレボテラ属、ドレア属、コリンセラ属、ラクノクロストリジウム属、ビフィドバクテリウム属、コプロバチルス属はASD児で上昇したが、ワイセラ属、ヘルココッカス属、アルカリフィルス属、アルカリフィルス属、オシロスピラ属はASD児で上昇した、 Alkaliphilus, Anaerofilum, Pseudoramibacter, Streptococcus, Anaerovorax, Lactococcus, Leuconostoc, Ethanoligenens, Veillonella, Flavonifractor, Haemophilus, Eisenbergiella, Akkermansia, Faecalibacterium, Parasutterella, Paraprevotellaは属レベルで減少した(8, 36, 37)。各研究における微生物叢の変化に関するこれらの所見は、サンプルサイズや母集団の違いにより異なる可能性がある。われわれの研究では、ASD児ではHCに比べてBlautiaとSellimonasが属レベルで増加し、Doreaは減少していた。しかし、FMT治療後、BlautiaとSellimonasは減少し、Doreaは増加した。さらに、FusicatenibacterとErysipelotrichaceae_UCG-003の増加量はASD中核症状のスコアと負の相関を示した。

ASDと腸内真菌の関係を調べた研究はいくつかある。これらの研究の中には、腸内真菌のディスバイオーシスがASDの発症に影響することを発見したものもある。カンジダは、ヒトの腸内真菌叢に広く分布している属である(38)。ASD患者の腸内では、カンジダ・アルビカンスが有意に増加している。ASD患者の腸内真菌叢におけるカンジダの増加は、腸内真菌集団の変化につながり、サイトカイン調節異常を通じてGI異常に悪影響を及ぼす可能性がある(39)。別の研究では、ASD患者におけるGIイーストの高い有病率が明らかにされ、簡単な培養に基づく方法では、ASD群の57.5%でカンジダが検出されたが、対照群では検出されなかった。さらに、光学顕微鏡下でカンジダの攻撃的な形態（偽性菌糸を呈する）が同定されたことから、これらの酵母は腸粘膜に付着しやすいことが示唆された(40)。我々の知る限り、腸内真菌叢の変化とASDに対するFMT療法を関連付けた研究は今のところない。われわれの研究では、ASD児ではHCに比べてSaccharomycopsisとCystobasidiumが属レベルで増加していた。しかし、FMT治療後、SaccharomycopsisとCystobasidiumは減少した。ASD児はHC児と比較してカンジダ属の存在量は増加しなかったが、FMT治療後にカンジダ属の存在量は減少した。さらに、Saccharomyces、Rhodotorula、CutaneotrichosporonおよびZygosaccharomycesの存在量の増加は、ASD中核症状のスコアと負の相関を示した。

本研究にはいくつかの限界がある。非盲検試験デザイン、プラセボ群の不在、リクルートバイアス、そして菌株特異的解析のための16S rRNA配列決定の限界は、研究結果を解釈する際に重要な考慮点である。第一に、本研究は小規模の単一施設介入研究であった。観察されたASDおよび消化器症状への影響は、プラセボ効果に影響されている可能性がある。ASD児におけるFMTの有効性をさらに検討するためには、より大規模なランダム化比較試験が必要である。第二に、われわれはFMTに対する臨床的反応を2ヵ月間のみ評価した。症状が再発する可能性があるため、患者の長期追跡を行うことが重要である。第三に、登録時に消化器症状がなかった参加者の数は限られており、ASD児によくみられる限られた食事パターンが腸内細菌叢の構成に影響を及ぼす可能性がある。最後に、ASD児の腸内細菌叢の解析は、短期的には糞便中の細菌と真菌に限られていた。FMTがASD児の腸内細菌叢にどのような影響を与えるかについてより深く理解するためには、消化管のさまざまな部分の細菌叢に焦点を当てた長期的な研究を実施する必要がある。

結論
要約すると、凍結乾燥FMTの経口投与は、ASD児に対する有効かつ安全な治療法であることが明らかになった。FMTは、ASD児の消化器症状、ASD関連症状、睡眠障害を改善し、腸内細菌叢および真菌叢の組成を変化させる可能性がある。

データの利用可能性
生シーケンスデータはNCBI Sequence Read Archiveデータベースに研究アクセッション番号PRJNA1047541で登録されている。

倫理声明
ヒトを対象とした研究は、上海交通大学上海小児病院の倫理審査委員会の承認を得た（承認番号：2021R117-F02）。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。本研究への参加については、参加者の法的保護者／近親者から書面によるインフォームド・コンセントを得た。

著者貢献
YL：原案執筆、方法論、調査、形式分析、データ管理。PX：執筆-原案、方法論、調査。RC：執筆-原案、方法論、調査。JL：執筆（原案）、方法論。QX: 原案執筆、方法論。FX： 執筆-原案、方法論。LY: 原稿執筆、方法論。XW：執筆-原案、方法論。YW：執筆-校閲・編集、監督、プロジェクト管理。TZ：執筆-校閲・編集、監督、プロジェクト管理、資金獲得、構想。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および/または出版のために金銭的支援を受けたことを表明する。

本研究は、上海市科学技術委員会の医療イノベーション研究プロジェクト（助成金番号：22Y11903700）の支援を受けた。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fped.2024.1369823/full#supplementary-material。

補足図S1消化器症状の有無にかかわらずASD児における腸内細菌叢の変化とFMT後の変化。GI症状のあるASD児とないASD児の腸内細菌叢の比較。(A）ASVに基づいてChao指数とShannon指数で測定した腸内細菌叢のα多様性（HC、n＝30；GI症状のあるASD、n＝31；GI症状のないASD、n＝7）。(B）Bray-Curtis距離のPCoAで解析したβ多様性。(C)および(D)有意差のある細菌属数。有意性はKruskal-Wallis H-検定を用いて決定した。P < 0.05、***P < 0.01、***P < 0.001。補足図S2消化器症状の有無にかかわらずASD児における腸内真菌叢の変化とFMT後の変化。GI症状のあるASD児とないASD児の腸内真菌叢の比較。(A）ASVに基づいてChao指数とShannon指数で測定した腸内真菌叢のα多様性（HC, n = 5; GI症状のあるASD, n = 26; GI症状のないASD, n = 5）。(B）Bray-Curtis距離のPCoAで解析したβ多様性（GI症状のあるASD、n＝26；GI症状のないASD、n＝5）。(C)および(D)有意差のある真菌属数。有意性はKruskal-Wallis H-検定を用いて決定した。*P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001。
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キーワード：自閉症スペクトラム障害、糞便微生物叢移植、腸内細菌叢、治療、小児

引用 自閉症スペクトラム障害児に対する経口凍結乾燥糞便微生物叢移植後の効果と微生物叢の変化。Front. doi: 10.3389/fped.2024.1369823.

受理された： 2024年1月13日；受理：2024年4月23日；
発行：2024年5月9日

編集：Stefano Bibbò

ステファノ・ビッボ、サクロ・クオーレ・カトリカ大学、イタリア
査読者

Giulia Catassi, ウンベルト1世病院, イタリア
Qinrui Li、北京大学人民病院、中国
© 2024 Li, Xiao, Cao, Le, Xu, Xiao, Ye, Wang, Wang and Zhang. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 Yizhong Wang wangyz@shchildren.com.cn、
張廷 zhangt@shchildren.com.cn

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまで著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではありません。

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