ヒトの一生を通じた腸内微生物の性差持続性に関する遺伝戦略

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出版：2023年7月14日
ヒトの一生を通じた腸内微生物の性差持続性に関する遺伝戦略

https://www.nature.com/articles/s41467-023-39931-2

キアラ・タラッキーニ
ジュリア・アレッサンドリ
...
マルコ・ヴェントゥーラ
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ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：4220（2023） この記事を引用する
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指標詳細
概要
ヒトの発育過程における腸内細菌叢の組成変化は広く研究されているが、菌株に分解された動的な変化はまだ十分に解明されていない。本研究では、健康な個人から採取した12,415の糞便マイクロバイオームのショットガンメタゲノムシーケンスデータを用いて、腸内細菌叢メンバーの株レベルでの追跡を行い、ヒトの生涯にわたって進化する腸内細菌叢の生物多様性を明らかにした。この詳細な縦断的メタアナリシスにより、ビフィドバクテリウム・ビフィダムやビフィドバクテリウム・ロンガム・サブスピーシーズ・ロンガムのような、一般的で母性に遺伝する種に属する菌株の、宿主の性別に関連した持続性が明らかになった。比較ゲノム解析と、微生物とヒト腸管細胞との密接な相互作用を含む実験から、宿主の糖鎖代謝に関連する特異的な細菌のグリコシルヒドロラーゼが、男性に比べ女性ではより効率的なコロニー形成に寄与している可能性が示された。これらの知見は、古代の性特異的な宿主と微生物の共進化が、女性における主要な微生物群の選択的な存続を促し、それが次世代に垂直的に受け継がれる可能性があることを示唆している。
はじめに
乳児の腸内微生物群集は、出生後、パターン化された発生過程を経て徐々に形成される。特に生後3年間は、新生児の急速な身体発達に伴って腸内細菌叢の組成が短期的に変化する重要な時期である1,2。この初期のダイナミックなプロセスは、やがて安定した微生物-宿主相互作用へと発展し、難消化性食物炭水化物の代謝や内因性腸管粘液産生促進、ビタミン合成、免疫系の発達と恒常性維持、病原体からの防御など、宿主の健康に有益な効果をもたらす上で最も重要なものとなる3。特に、種レベルでは、安定した腸内細菌叢の確立は、幼児期における2つの主要な食事誘導段階4,5を経て行われることが知られており、最初の段階は、生後すぐの母乳栄養開始時に行われる6,7。この段階は、一部は母親から（垂直的に）伝達され、一部は分娩中および分娩後の周辺環境との接触を通じて獲得された腸内微生物群8,9,10によって特徴付けられ、ヒトミルクオリゴ糖（HMOs）を直接的または間接的に代謝する能力により、乳児腸の最初の微生物コロニーを形成する11,12。もう一つの移行は離乳期、一般的には生後6ヶ月頃に起こり、乳児は徐々に固形でより多様な食事を摂るようになり、新たな生態学的ニッチのコロニー形成の機会を得る13,14,15。
ホールメタゲノムショットガン（WMGS）シーケンスは、複雑な微生物群集の構成を明らかにし、培養が困難な微生物種に属するゲノムを検索する強力なツールである16,17,18。そのため、最近のいくつかの縦断的研究では、乳児の腸内細菌叢の組成が調査され、種レベルでの年齢に関連した連続的な変化が強調されている19,20。例えば、乳児腸内細菌叢の主要な微生物分類群であるビフィズス菌種は、成人期を通じて低レベル（相対存在量2～14％）で存続し、その後、母親から乳児への垂直伝播によって次の宿主世代に受け継がれる可能性がある21,22。とはいえ、宿主の生物学的性別が腸内微生物群集の形成と維持に与える影響については、まだ十分に調査されていない。
本研究では、健康な乳児124人（0～3歳）の糞便メタゲノム計400個を縦断的に調査し、出生後2年間の乳児腸内細菌叢の構築の根底にある種内変異を調べた。この中で、特定の腸内細菌叢のメンバーが、おそらく世代を超えた伝播を維持するために、（男性に比べて）女性の乳児でより高い持続性を引き出すかどうかを評価した。これらの解析と、生後数日から90歳までの健常人12,415人（女性6545人、男性5870人）のショットガンメタゲノムデータの解析から、女性の消化管に優先的に存在するB. bifidum株とB. longum株の持続性に関連すると思われる2つのグリコシルヒドロラーゼ、すなわちGH101とGH136のメンバーを同定することができた。さらに、性差に関連した（ビフィズス）菌の回復力は、持続性遺伝子型を示すビフィズス菌株と非持続性遺伝子型を示すビフィズス菌株の補充を含むヒト臨床試験データにより、in vivoで検証された。
結果
生後24ヵ月以内の腸内関連微生物叢の菌株動態
ショットガン・メタゲノミクス配列決定法を、経膣分娩された正期産（妊娠37週以上）の健康な11人の新生児のマイクロバイオームに適用し、出生後1ヶ月、6ヶ月、12ヶ月、24ヶ月の縦断的サンプリングを行った（図S1、S2、補足データ1）。乳児群集状態タイプ（ICSTs）に注目した過去の科学文献23と一致して、配列決定されたリードの種レベルの分類学的分類から、離乳前の段階で最も一般的な乳児腸内構成微生物はビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）と大腸菌（Escherichia coli）であり、次いでビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（Bifidobacterium pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Bifidobacterium breve）、コリンセラ・アエロファシエンス（Collinsella aerofaciens）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）であることが明らかになった（補足データ2）。さらに、以前に報告されたように、これらの種の相対的な平均存在量は離乳後に減少し（Kruskal-Wallis検定、p値＜0.01）、同時に、Eubacterium rectale、Faecalibacterium prausnitzii、Ruthenibacterium lactatiformans、Akkermansia muciniphila、Bacteroides uniformisなどのBacteroides属のメンバーなどの成体関連細菌種によるコロニーが進行した（図S2、補足データ2）23,24。
発育途上にある乳児の腸内生態系における菌株動態を調査する目的で、上記の11の主要な腸内関連微生物種（補足データ3）に対応する合計63のメタゲノム（MAG）を、参照菌株の11の種特異的データベースを構築するために、一般に入手可能な同種のゲノム配列と結合させた（補足データ4）。完全性（90％以上）およびANIによる複製除去を評価した後、これらの11のデータベースを用いて、菌株固有の持続性および安定性、すなわち縦断的サンプルに同一の菌株が保菌されている期間を調査した（図S3）25。
収集されたデータから、E. rectaleやC. aerofaciensのような固形食の導入に関連する菌種に属する菌株は、乳児期の最初の2年間に起こる腸内ニッチの変化に脆弱なようで、不均一な菌株群に集合していることが明らかになった（図S3）。逆に、特定のB. longum subsp. longum株、B. bifidum株、B. breve株、B. pseudocatenulatum株は、それぞれ検査対象乳児の91％、72％、54.5％、45.4％において、離乳期以降も続く安定した宿主-微生物共生関係を確立しており（表S2、図S3）、評価された乳児腸内細菌叢の中で最も弾力性があり、変動がなく、安定した細菌叢を形成していた（詳細は補足テキストを参照）。具体的には、シーケンス深度を考慮した後、調整後の平均菌株数1.58株（B. longum subsp. longum）、1.44株（B. bifidum）、0.82株（B. breve）、0.80株（B. pseudocatenulatum）が、出生1年目の複数の時点間で共有されていることが判明した（Fig. S3）、したがって哺乳期の乳児腸内細菌叢の他の主要メンバーよりも有意に持続的であることが明らかになった（Kruskal-Wallis with Dunn's post-hoc test、Benjamini-Hochberg補正後のp値＜0.05；表S5；図S4）。さらに、特定のB. bifidumおよびB. longum subsp. longum株が、最後のサンプリング時期と一致する生後2年目までの乳児の腸内で検出された（補足データ5）。一貫して、これらのビフィズス菌種は、HMOやヒトムチンのような複雑な炭水化物に対する特異的な代謝活性と協力的な栄養相互作用、すなわち交差摂食作用により、乳児の腸に定着するように遺伝的に適応していることが知られている26,27,28。
解読された乳児腸内細菌叢の株分解動態は、定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）により株特異的プライマーを用いて実験的に検証され（補足データ6）、乳児腸内細菌叢の発達中に生じる変動パターンおよび／または持続的パターンが、微生物種に厳密に依存していることが確認された。
集団全体のメタゲノム研究の結果を検証し、バイオインフォマティクス的アプローチが観察された細菌の持続性パターンに偏りを与えないことを確認するために、生後1年にわたる複数の時点の糞便サンプルを含む、一般に入手可能な大規模な乳児データセットを用いて、独立した検証コホートを構築した29（補足データ1）。この特定のメタゲノミックデータセットの菌株分解微生物群集組成は、Mäklinら30. 表S7に詳述するように、検証コホートで観察された乳児の腸内細菌叢の発達の軌跡は、我々の研究集団で指摘されたことを裏付けており、非ビフィズス菌種、すなわちC. aerofaciensや大腸菌に属する菌株と比較して、ビフィズス菌菌株の長期的な持続性が強調されていた（カイ二乗事後検定、p値＜0.05）（補足データ7）。さらに、経膣分娩児では、帝王切開児と比較して、初期のB. bifidumおよびB. longumのコロニー形成株の持続性が統計的に有意に高いことが観察された（カイ二乗検定、p値＜0.05）（補足データ7）。これらの結果は、新生児期に母体由来のビフィズス菌株が乳児の腸内細菌叢に残存する能力がより高い可能性を示唆するものである。
微生物の回復力と宿主の性別との相関性
上述したように、腸内細菌叢の最初の播種は分娩時に起こると考えられており、母親から新生児への微生物系統の移行が関与している22,31。このような背景から、生態学的によく適応した腸内細菌叢メンバーの世代間伝播を維持するために、微生物株の持続性が女性においてより効果的であるかどうかを検討した。この目的のために、上記の縦断的メタゲノム乳児データセットの経膣分娩分画（女性72人、男性73人、合計145人の経膣分娩乳児）を、離乳前（0～6ヶ月）と離乳後（6ヶ月以上）のタイムポイントを含む、乳児腸内細菌叢の縦断的研究から得られた357の追加公開ショットガンサンプル（女性54人、男性59人）と統合した（図S1、補足データ1）11,32。すべての乳児は健康で、正期産で経膣分娩し、抗生物質治療は受けていない（補足データ1）。そこで、離乳の移行期を通じてビフィズス菌の持続性が高いことを考慮し、StrainGEツール（Methods参照）を用いて、B. bifidum、B. longum subsp. longum、B. breve、B. pseudocatenulatumに属する菌株群集の離乳前後の性差による安定性を評価した。
具体的には、各乳幼児について、生後0～6ヵ月の時点で腸内細菌叢を支配していたビフィズス菌株と、補完的固形食導入後（12ヵ月頃）に卓越したビフィズス菌株とを比較した。種レベルでは、B. bifidumは授乳期から離乳後まで、検査した乳児258人のうち31％（女性36人、男性44人）で検出された（図1a、補足データ9）。離乳期における菌種レベルの安定性に性差は認められなかったが（Fisher検定、p値＝0.349）、0～6ヵ月齢時に検出されたB. bifidumの優勢な基準株は、女性乳児36人中24人（67％）、男性乳児44人中15人（34％）で離乳期以降も持続しており（図1a、補足データ9）、女性乳児の大腸における菌種レベルの安定性がより高いことが示唆された（Fisher検定、p値＝0.007）。同様に、全評価対象乳児の49.6％（女性67人、男性61人）が、B. longum subsp. longum種の離乳後持続性を示し、0～6ヵ月時に同定されたその優勢な参照株は、12～24ヵ月時にも女性の45％で認められ、男性乳児（21％）で観察されたものよりも有意に高かった（Fisher検定、p値＝0.005）（図1a、補足データ9）。特に、初期に移植されたB. bifidumとB. longum subsp. longumが離乳期まで高い頻度で維持されていた女性乳児と比較して、男性は（ビフィズス）菌組成の変動が大きいようである。
図1：B. bifidum、B. longum subsp.longum、B. breve、B. pseudocatenulatumの性差別持続性、および女性関連持続性ビフィズス菌種間で共有される14遺伝子。
パネル(a)では、上部の棒グラフが乳児集団におけるB. bifidum、B. longum subsp.longum、B. breve、B. pseudocatenulatumの離乳前（1-6ヶ月）から離乳後（12-24ヶ月）までの種レベルの持続性を示している。下の棒グラフは、ビフィズス菌株の12～24ヵ月間の性差による安定性を表したもので、0～6ヵ月目に同定された同じビフィズス菌株の離乳後の持続性を示す（乳児の）女性と男性の割合で表している。統計的に有意な性差は、列の上部にアスタリスクで強調表示した（フィッシャー検定、p値=0.006およびp値=0.005）。パネル(b)は、女性および男性の乳児におけるB. longum亜種longum株群集全体の検査である。棒グラフの各組は、離乳前（左）と離乳後（右）に同定された菌株数を示している。異なる色は、離乳食開始前の時期にのみ検出されたB. longum subsp.longum株（水色）、離乳食開始後の時期のみに検出されたB. longum株（水色）、離乳食開始前と離乳食開始後の時期で共有されたB. longum株（ピンク色）の数を強調している。パネル(c)は、離乳後の乳児期におけるB. longum subsp. longumの持続性株（n = 83、水色）と非持続性株（n = 171、オレンジ色）の推定相対存在量（対応するゲノム長でゲノムカバレッジを正規化して得られる）の統計的に有意な差を示す（Mann-Whitney検定、p値 = 0.001）。枠は25パーセンタイルと75パーセンタイル。ひげは1.5四分位範囲（IQR）。ボックス内の線は中央値を表し、クロスマーカー（X）は平均値を表す。パネル(d)では、左側のベン図がB. longum subsp. longumとB. bifidumが共有する14の遺伝子を強調し、右側の棒グラフが公開されている完全ゲノムB. longumとB. bifidumにおける各PDCの有病率を報告している。
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一方、B. breveとB. pseudocatenulatumは、離乳前と離乳後という時点を超えて検出されたのは、それぞれ乳児の14.3％と9.6％のみであり（図1a）、菌株の持続性に有意な性差は認められなかった（フィッシャー検定p値＞0.05）（図1a、補足データ9）。B. longum subsp. longumは乳児の腸内でより高い性差に基づく安定性／持続性を示したので、我々は上述の優勢株の解析を拡張し、異なるバイオインフォマティック・アプローチを用いて離乳期を通してB. longum subsp. この目的のために、我々は乳児縦断データセット（乳児258名、女性126名、男性132名）からメタゲノム由来のデータをアセンブルすることにより、377個の非冗長B. longum subsp. このゲノムコレクションは、一般に公開されているB. longum subsp. longum染色体配列と統合され、完全性評価と複製除去を経て、inStrainツールのゲノムデータベースとして採用された33。inStrainによって検出されたB. longum subsp.longumの離乳期を跨いだ持続性のある乳児（女性71人、男性65人）を種レベルで検討したところ、離乳前の時期に発見された少なくとも1つの菌株が、女性52人（76％）、男性31人（47％）において離乳後の段階でも維持されていることが観察された（フィッシャー検定p値＝0.003）（図1b）。
さらに、持続的なイベント（n = 83）の後、初期に移植されたB. longum株は、離乳後のB. longum亜種longum株群集全体において、平均71％±21％の相対的存在量に達した（図1c）。この数値は、乳児期の男女間で同程度であったが、持続性エピソードに関与しなかったB. longum亜sp. longum株（n = 171、平均相対存在率29％±29％、Mann-Whitney検定、p値 = 0.001）について算出した数値よりも有意に高かった（図1c）。これらの所見から、持続的な事象が発生する場合、生態学的に乳児の消化管に定着するのに有利な株が高い相対存在率で関与し、その結果、同系株集団を支配していることが示唆される。
特筆すべきことに、B. longum subsp.longum株集団全体を分析した結果、特定の菌株の持続性は、男性乳児と比較して女性乳児で統計的に有意に高い割合で発生することが示され、共存する非持続性菌株と比較して、持続性B. longum subsp.longum株のコロニー形成能力が優れていることも浮き彫りになった。
現在の科学的データに基づくと、母親の糞便菌による最初の接種後、宿主由来の糖鎖のような食事成分が、これらのアミノ糖を代謝する能力に基づいて、B. bifidumやB. longum subsp. このようなビフィズス菌は、まず乳糖、HMO、そしておそらく他の乳関連糖鎖や糖タンパク質を採食し、その後、株特異的な方法で結合部位として、また炭素源として腸管ムチン糖鎖を利用し、長期間の持続につながる35。
性特異的な微生物持続性に関連する遺伝子の同定
B. bifidum株とB. longum subsp. longum株は、乳児の離乳期を通じて性特異的な回復力を示したので、これらのビフィズス菌種を、持続的な挙動や性差を示さないか示さないB. breveやB. pseudocatenulatumと区別する潜在的な遺伝的特徴を探索するために、比較ゲノム解析を行った（図S1）。正確な概観を得るために、解析は、これらのビフィズス菌分類群に属する合計119のゲノムについて、公開リポジトリから入手可能な、完全かつ注釈付きのゲノムアセンブリーをすべて網羅した。
これらの調査から、B. bifidumとB. longum subsp. longumに特有のコア／アクセサリー遺伝子レパートリーには14のタンパク質ファミリー（PDCと呼ぶ）が同定されたが、B. breveとB. pseudocatenulatum染色体には存在しなかった（詳細は補足テキスト参照）（図1b、補足データ10）。これらのうち、宿主-微生物相互作用の調節における宿主糖鎖の重要性が知られていることを考慮して、さらに探索するために2つのGHをコードする遺伝子を選んだ。すなわち、予測される細胞外膜アンカー型ムチン分解グリコシルヒドロラーゼファミリー101（GH101）34と、細胞外ラクト-N-ビオシダーゼ36として働くと予測されるグリコシルヒドロラーゼファミリー136（GH136）である（図S5）。具体的には、GH101およびGH136酵素をコードする遺伝子は、スクリーニングされたB. bifidumゲノムの全てに見いだされたが、B. longum subsp. longumに属する染色体では、GH101およびGH136を規定する遺伝子がそれぞれ89％および38％しか存在しなかった（図1b；図S6；補足データ10）。宿主の糖鎖代謝におけるGH101およびGH136活性の関与は、in vitro条件下で培養したB. bifidum PRL2010のトランスクリプトーム調査によって検証され、グルコース（MRSベース培地）ではなくムチンを唯一の炭素源として用いた場合に、これらのGHのアップレギュレーションが示された（補足データ11）（詳細は補足テキスト参照）。これらの結果は、ムチン糖鎖コア構造に作用するGH101およびGH136酵素が、食餌性糖鎖が存在しない場合に内因性の栄養源を提供することによって、B. bifidumおよびB. longum subsp.株の宿主腸内での長期間のコロニー形成に関与していることを示唆している。
B. longumおよびB. bifidum株の出生から宿主の後期までの性特異的腸内持続性
B.bifidumおよびB. longum subsp. longum株は、ヒト（女性）の腸内において、ヒトの生涯を通じてより高いコロニー形成を達成できるという仮説を検証するために、およそ3000人の乳児（0～4歳、女性1456人、男性1541人）から得られた合計12,415の横断的メタゲノム糞便サンプル（うち女性由来が6545人（54％）、男性由来が5870人（46％））を用いた、 918人の小児（5～18歳、女性434人、男性484人）、6147人の成人（19～55歳、女性3379人、男性2768人）、および2353人の高齢者（56～90歳、女性1276人、男性1077人）から得られた株レベル解析を、同じアプローチを用い、上記のB. longum subsp. longumとB. bifidumの参照ゲノムデータベースを用いて、乳児の縦断的データを解析した（図S1）。予想通り、哺乳期の乳児はB. longum subsp. longumとB. bifidumの有病率が最も高く、それぞれ70％と40％を超えていた（図2a、補足データ10）。興味深いことに、成人の集団を調査したところ、性別がこれらのビフィズス菌の有病率に顕著な影響を与えることが観察された（PERMANOVA R2 = 0.0627および0.0558、F = 494.18および420.03、いずれもp値 = 0.0099；補足データ12）。具体的には、成人女性の41％と28％がそれぞれB. longum subsp. longumとB. bifidumを保有しており、逆に年齢をマッチさせた男性では26％と11％しか保菌していなかった（Fisher検定、p値＜0.001）（図2a、補足データ10）。対照的に、高齢者ではビフィズス菌の有病率が最も低く、B. longum subsp. longumの平均26％からB. bifidum種の平均9％で、女性でも男性でも同様の値であった（図2a、補足データ10）。B. longum subsp. longumおよびB. bifidumの有病率が成人女性と男性で異なるのは、乳製品の摂取やラクターゼの持続性などの交絡因子の可能性がある。注目すべきことに、この種の情報は公開データセットでは得られなかったため、地理的地域を代理変数として用いた（ラクターゼ持続性については南／北ヨーロッパ、乳製品食品消費についてはヨーロッパ／中国）。
図2：ヒトのライフステージにおけるB. bifidumとB. longum subsp.
パネル(a)の縦棒グラフは、ヒトのライフステージに亘るB. bifidumとB. longum subsp. 上部の棒グラフは、5～55歳の女性と男性の間で、これらのビフィズス菌種の持続性に差があることを示している。パネル(b)の横棒グラフは、B. bifidumとB. longum subsp. longumが集団間で共有する14遺伝子の有病率を示している。GH136の発現における統計的に有意な性差を赤枠で強調し、それぞれの有病率（パーセンテージ）を併記した（フィッシャー検定、p値＜0.05）。
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これらの知見は、B. bifidumとB. longum subsp. longumは、乳児期から成人期までヒトの腸内に安定的にコロニーを形成し、生殖年齢にある女性には明らかに好んでコロニーを形成し、新しい世代への微生物伝播のための潜在的なリザーバーとなり得るという興味深い概念を支持するものである。
乳幼児、小児、成人、高齢者の腸内細菌叢から検出された完全性が90％以上のB. bifidumとB. longum subsp. longumのゲノムをゲノムワイド・スクリーニングに供し、予測されるGH101とGH136酵素をコードする遺伝子の出現率を評価することで、集団全体におけるその有病率を推定した（図2b、補足データ10）。調査結果によると、B. bifidumとB. longum subsp. longumのGH101は12,415の糞便メタゲノムデータセットの88％から100％の間で検出され、これは一般的なゲノムスクリーニングから予想されるよりも多く、宿主の寿命全体にわたってヒト消化管のコロニー形成と生存に重要な役割を果たす可能性を支持した（補足データ10）。
その代わりに、GH136はメタゲノムサンプルの平均45%で見つかり、最も頻度が高かったのは成人女性（63%）で、これは年齢をマッチさせた男性（42%）で観察された頻度よりも50%高かった（フィッシャー検定、p値 < 0.05）（補足データ10）。しかし、このような性差は幼児期や高齢期には見られなかった。興味深いことに、男性に比べて女性で観察された高いコロニー形成率は、50歳を超えると消失するようで、これは閉経年齢と一致している（補足データ10）。近年、性ホルモンは腸内細菌叢レベルにおける性的二型性の強力な推進因子とみなされており、男女間の組成差や妊婦の腸内細菌叢における重大な変化と関連している37,38,39,40。ステロイド性ホルモンは、免疫系や胆汁酸分泌の調節に関与し、腸内細菌叢を制御する以外に、特定の腸内関連細菌酵素によって代謝され、微生物の代謝や増殖に直接影響を与えることが提案されている37,41,42。性差がヒトの腸内細菌叢に与える影響についてはまだほとんどわかっておらず、その基礎となるメカニズムについてはさらにわかっていないが、女性の腸管粘液には男性の粘液に比べて高いレベルのシアリル化が見られることが報告されている43。さらに、女性ホルモンのエストラジオールがヒトのムチンの発現と糖鎖付加をアップレギュレートし44,45,46、ムチンを利用する（ビフィズス）細菌に有利なように女性の腸内細菌叢を形成している可能性も論じられている。興味深いことに、エストラジオールレベルは、思春期前の段階でも男性より女性の方が高い47。実際、生殖器系の発達と制御に関与する視床下部-下垂体-性腺軸は、男性では生後6ヶ月、女性では生後2年の間に一過性の活性化を起こす48,49。この出来事は小結節、あるいは「内分泌思春期」と呼ばれ、男性ではテストステロン、女性ではエストラジオールの産生を誘導する50,51,52。
このようなホルモンによる影響に加え、大腸組織特異的遺伝子（X染色体とY染色体にある遺伝子座を除く）におけるDNAメチル化パターンの複雑なメカニズムが、腸内環境における性差や年齢差の確立に寄与している可能性があることに注意すべきである53,54。一貫して、メチル化シグネチャーのばらつきは、女性と男性を比較した場合、新生児から成人までを含む様々な年齢の被験者で観察された53,55。
これらの知見を総合すると、男性と比較して、糖鎖構造を含む女性特有の腸内環境は、B. bifidumやB. longumなどの特定の初期コロニー形成微生物種に適した環境を作りやすい構造になっている可能性が示唆される。特に、GH136酵素をコードする遺伝子が存在する場合、おそらく性特異的粘液構造に起因して、生殖年齢の女性における（ビフィズス菌）持続性の増強に一役買っている可能性がある。
母親から新生児への細菌の垂直伝播におけるGH136の役割
B.ビフィダムとB.ロンガムは、垂直伝播によって母体から受け継がれる2つの主要な菌種である56。特に、ビフィドバクテリウムのような母親の腸に関連する厳嫌気性菌種から乳児の腸へのコロニー形成は、出生時に母親の腸内細菌叢と直接接触することで起こるか、あるいは腸-乳腺経路を介することで起こると考えられており、生態学的によく適応した細菌が母乳を介して乳児に移行する可能性がある57,58,59,60。このような科学的証拠から出発し、B. longum株にGH136をコードする遺伝子が普遍的に存在することを利用して、我々は、132人の満期経膣分娩された健康な新生児とそれに対応する母親5,61から採取したメタゲノム糞便サンプルの一般公開されている検査を通して、母親から乳児への垂直伝播事象におけるGH136の関与を推定することにした（図S1）。特に、出産時の母親と1ヵ月後の新生児から採取した糞便サンプルは、B. bifidumとB. longum subsp. longumの菌株追跡解析を行い、リードをGH136遺伝子配列にマッピングした。
その結果、B. longum subsp. longumおよびB. bifidumの特定の菌株が、それぞれ36.4％および29.5％の母子分離検体中に存在することが示され、周産期の垂直伝播事象が示唆された。興味深いことに、母親から新生児への垂直感染が検出されたB. longum subsp. longum株の72.9％がGH136をコードする遺伝子を保有していたのに対し、垂直感染に関与していないと思われるB. longum subsp. longum株の28.6％だけがGH136遺伝子を保有していた（Fischer Test p-value < 0.001, Supplementary Data 14）。従って、性に関連した遺伝的およびエピジェネティックな宿主因子は、特定の微生物ゲノムの特徴と関連しており、その結果、ビフィズス菌の選択されたコンソーシアムが形成され、その菌株は出産を通じて子孫に伝達される可能性がある。
レトロスペクティブ臨床研究は、女性におけるB. longum subsp.
ヒトの腸内におけるB. longum subsp. longumのコロニー形成と持続性におけるアクセサリーGH136の役割を評価するために、我々は、健康なヒト被験者が遺伝的に異なる2つのB. longum subsp. longum株の生菌を毎日経口投与された、発表されたレトロスペクティブ臨床研究のデータを分析した62,63（図S1）。具体的には、合計21人の健常人（52％が女性）が、GH136およびGH101酵素をコードする遺伝子を保有するB. longum subsp. もう1つのグループ10人（40％が女性）は、GH101を持つがGH136遺伝子を持たないAG1と名付けられたB. longum subsp.
B. longum subsp. longum AH1206株とAG1株の持続性を評価するために、介入前（ベースライン）、21～28日の経口菌投与後（治療）、および追跡期間後（持続）に採取した便サンプルのショットガン・メタゲノミック・データを利用した（図3a）。
図3: B. longum subsp. longum AH1206株およびAG1株の補充に基づくヒトの後ろ向き臨床研究のデータの解析。
パネル(a)は、本研究で検討したヒトの後ろ向き臨床試験の実験概要を示す。パネル(b)は、菌の補充と追跡調査中のメタゲノムサンプル中のB. longum subsp. longum AG1206とAG1のマップされたリードの平均相対量を報告している。AG1206とAG1のマップされたリードの平均存在量における、フォローアップ（持続）と対応するベースラインの間の有意な差は、Box and Whisker plotのアスタリスクで示されている（**p-value < 0.01; Wilcoxon signed-rank test, p-value = 0.009）。箱は25パーセンタイルと75パーセンタイルで決定される。ひげは1.5四分位範囲（IQR）。ボックス内の線は中央値を表し、クロスマーカー（X）は平均値を表す。パネル(c)では、各サンプルについて、対応する介入研究（それぞれn=22とn=10）にわたるAG1206とAG1のマップリード（相対存在量）の傾向を示している。女性集団と男性集団（n = 21、女性11人、男性10人）間のAH1206株の持続性の違いは、ベースライン時（n = 21、女性11人、男性10人）と治療終了後（n = 21、女性11人、男性10人）に検出されたAH1206マップドリードの平均相対存在量を描いた棒グラフに詳しく示されている（**p-value < 0.01; Wilcoxon signed-rank test, p-value = 0.039）。
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各被験者の糞便メタゲノムリードを、投与されたビフィズス菌株ゲノム配列（AH1206またはAG1）に対して、99％以上の相同性のみを考慮してマッピングした。その結果、AH1206株とAG1株はともに28日間の投与期間終了時に検出可能であり、微生物補充終了後は株特異的に減少した（図3b、補足データ15）。驚くべきことに、AH1206のマップされたリードの相対量は、処理終了200日後でも、処理前のベースラインと比較して有意に高いままであった（Wilcoxon検定、p値 < 0.01）（図3b、補足データ15）。対照的に、AG1マップリードの相対的平均存在量は、摂取中断から28日後の時点では、微生物介入前の状況と比較して有意に高くなかった（Wilcoxon検定、p値＞0.05）ことから、処理1ヵ月後のAG1のレベルは、処理前のマイクロバイオームで観察されたレベルに戻っていることが示された。興味深いことに、女性ボランティアと男性ボランティアの間でAH1206の長期コロニー形成の程度を評価したところ、菌株の持続性のレベルに性差があることが確認された。実際、持続性試験の時点（追跡期間200日前後）で、AH1206に関連するマップされたリードの平均相対量は、女性のベースラインと比較して有意に高いことがわかった（Wilcoxon検定、p値＜0.01）一方、男性参加者はAH1206のこのような長期持続性を示さなかった（200日時点の平均マップされたリードとベースラインのWilcoxon検定、p値＞0.05）（図3c、補足データ15）。
全体として、これらの結果は、GH136がB. longum subsp.
トランスクリプトミクス解析による、持続性B. longum株および非持続性B. longum株とヒト腸管細胞との分子的相互作用の評価
宿主と微生物のクロストークにおけるユビキチン化されていないB. longum株コードGH136の役割を評価し、難分解性および非難分解性のB. longum亜sp. longum株と宿主細胞との分子間相互作用を調べるために、ヒト細胞株を細菌細胞と接触させるin vitroアプローチを適用した（図S1）。具体的には、Caco2/HT29-MTX細胞単層を、それぞれアクセサリーGH136をコードする遺伝子の有無に基づいて選択したB. longum subsp. その後、細菌株とヒト細胞株のトランスクリプトームをRNA-Seq実験によって調査し、各処理（PRL2022株および1898B株-Caco2/HT29-MTX接触）とそれぞれの対照条件（接触なし）の間で差次的に発現した遺伝子（DEG）を評価した。 05とした（Fig. S7, S8, Table S16, Supplementary Data 17）。
宿主細胞との接触後、PRL2022株と1898B株からそれぞれ合計334個と492個の細菌遺伝子が、対照サンプルと比較してDEGに分類された（補足データ16）。統計的に有意に発現が上昇したトランスクリプトーム（全DEGの約50％）の中に（図4a、図S6）、外多糖（EPS）産生に関与するプライミングおよびプロセッシング糖転移酵素、いくつかの糖質およびアミノ酸修飾酵素、および様々なタンパク質キナーゼをコードする遺伝子に対応する転写産物が見つかった（補足データ16）。(ビフィズス菌)宿主糖鎖および糖質代謝遺伝子に注目すると、PRL2022および1898B関連のトランスクリプトームはいずれも、対照サンプルと比較してGH101対応遺伝子(JL750_RS06690, BLSL_RS08555)の有意な高発現を示し、さらに糖質の取り込みに関与する16-19のABCトランスポーターが多数含まれると予測される遺伝子が存在することがわかった。longumとB. bifidumの間で共有されている14遺伝子のうち、上記で同定されたものを含む、糖質取り込みに関与する16-19のABCトランスポーター遺伝子を多数含んでいると予測された（図4a、b、d、e；図S7）。さらに、B. longum subsp. longum PRL2022にのみ存在するGH136遺伝子（JL750_RS09800）がアップレギュレートされていることが示された（図4b、補足データ16）。
図4：発現量の異なる細菌ムチン分解遺伝子と宿主ムチン産生遺伝子に注目。
パネル(a)では、B. longum subsp. longum PRL2022をCaco2/HT29-MTX宿主細胞と接触させて増殖させたときに、発現が上昇した遺伝子のうち、異なる遺伝子機能カテゴリーの数をグラフで強調している。パネル(b)の横棒グラフは、Caco2/HT29-MTXヒト細胞と接触培養したB. longum subsp. longum PRL2022とコントロールとの間で発現量の異なるGH101およびGH136ムチン分解遺伝子を示している。パネル(c)では、B. longum subsp. longum PRL2022をCaco2/HT29-MTXに接触させたヒト細胞と対照細胞との間で、真核宿主のトランスクリプトームにおいて発現が上昇したムチン産生遺伝子を横棒グラフで示した。パネル(d)は、Caco2/HT29-MTX宿主細胞と接触させて増殖させたB. longum subsp. longum 1898Bのアップレギュレート遺伝子のうち、異なる遺伝子機能カテゴリーの数を示している。パネル(e)は、Caco2/HT29-MTXヒト細胞と接触させて増殖させたB. longum subsp. longum 1898Bとコントロールとの間で発現量の異なるGH101ムチン分解遺伝子を示す。パネル(f)の横棒グラフは、B. longum 1898BをCaco2/HT29-MTXに暴露した真核宿主のトランスクリプトームにおいて、コントロールに対して発現が上昇したムチン産生遺伝子を示している。エラーバーは3つの独立した複製からの標準偏差を表す。行数を正規化した後、各遺伝子の差次的発現を評価するために遺伝子ごとの正確検定を計算した。多仮説に対するp値の調整は、偽発見率（FDR）法で行った。
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その結果、腸内細菌のコロニー形成は、様々な糖質修飾酵素および微生物表面成分が関与する多因子プロセスであるようである。これらのことから、宿主と微生物の相互作用と粘膜表面のコロニー形成には、（ビフィズス菌）ムチン分解酵素GH101とGH136が関与していることが裏付けられたようである。しかしながら、哺乳動物ホルモンは細菌の遺伝子発現に影響を与える可能性があるため64,65,66、我々はウシ胎児血清（FBS、ヒト細胞培養にDMEMと組み合わせて使用、「方法」のセクションを参照）に含まれる内分泌環境がGH136遺伝子の発現に影響を与えるかどうかを評価した。具体的には、FBSを添加したDMEMと無添加のDMEMでPRL2022を培養したところ、RT-qPCRによるGH136遺伝子の発現結果に有意な変化は見られなかった（t検定のp値＞0.05）。
さらに、B. longum subsp. longumと接触させたヒト細胞株のトランスクリプトームを評価し、細菌細胞が存在しない場合と比較した。注目すべきことに、PRL2022曝露群および1898B曝露群において、それぞれ1253個（874個が発現上昇）および1404個（892個が発現上昇）の宿主細胞関連遺伝子がDEGとして同定された（図S8、補足データ17）。B. longumによって発現が上昇した宿主転写産物の中には、細菌に反応するパターン認識受容体（Toll様受容体など）67,68や、免疫応答における細胞間の情報伝達を助ける細胞シグナル分子（サイトカインなど）69をコードする遺伝子が見つかった（補足データ17）。
ヒトのムチン遺伝子の発現に焦点を当て、B. longum subsp. longum PRL2022（GH136をコードする遺伝子を持つ）に暴露したCaco2/HT29-MTX細胞のトランスクリプトーム解析から、ムチン5B（粘液／ゲル形成）、ムチン3A、ムチン17（細胞表面関連）70をコードする遺伝子、およびムチンタイプの糖タンパク質上のコア2およびコア4のO-糖鎖形成を触媒するグルコサミニル（N-アセチル）転移酵素3の発現上昇が明らかになった71,72（図4c、補足データ17）。驚くべきことに、非永続性B. longum subsp. longum 1898Bに暴露した宿主由来のトランスクリプトームでは、対照サンプルと比較して、mucin3Aとmucin5Bのみが有意に高いレベルで発現していた（図4f、補足データ17）。
これらの結果から、B. longum subsp. longum株はヒト腸管細胞のトランスクリプトームに大きな影響を与え、粘液層成分の合成に関与する遺伝子の発現を調節していることが示唆される。驚くべきことに、B. longum亜sp. longum PRL2022株（GH136酵素をコード）は、GH136遺伝子を欠く1898B株と比較して、宿主のムチンおよびムチン関連遺伝子の発現をより大きく刺激する（宿主のムチン関連遺伝子のアップレギュレート数が100％増加）ことができ、これはヒト宿主（女性）の腸内での競争上の優位性と持続性の向上を示唆している。
考察
母親から乳幼児への垂直伝播は、腸内細菌叢の（特定の）メンバーが早期に定着するための極めて重要な経路であることがいくつかの研究で証明されている。このような背景から、ヒトの女性宿主にとって、後に新しい世代に母性感染する可能性のある初期コロニー形成者の持続性を維持することが特に重要である。
今回の研究では、マルチオミクスアプローチにより、B. bifidumとB. longum subsp. longumの特定の菌株が、男性に比べて女性の腸内環境で優先的に長期間にわたってコロニー形成行動を確立できることを明らかにした。特筆すべきことに、これらの菌種はビフィズス菌の中で最も垂直伝播が高いことで知られている22,73。興味深いことに、（女性の）ヒト腸内持続性に関与すると思われる遺伝的決定因子をスクリーニングした結果、すべてのB. bifidum株と特定のB. longum亜種に存在する2つのムチン分解GHファミリー、GH101とGH136が同定された。
特に、GH136遺伝子がB. longum subsp. longum分類群内に偏在していないことから、この遺伝子が母親から乳児への垂直伝播に関与していることが明らかになり、安定した雌性腸内コロニー形成のための株特異的な遺伝的重要決定因子として同定された。最近の研究では、よく知られている環境因子、年齢、食習慣、地理的起源、抗生物質37,38,39,40,42に加えて、腸内細菌叢の性依存的な軌跡における性ホルモンの重要性が検討されている。一貫して、性関連ホルモンと潜在的に複雑なエピジェネティックメカニズムによって駆動されていると思われるシアル化レベルが、男性集団の腸粘液と比較して女性の腸粘液でより高いことが以前に指摘されており43,44,45,46、性特異的な腸内環境が、持続性のあるムチン分解（ビフィド）細菌コロニー形成者を積極的に選択する格好の場所にある可能性を示唆している。
全体として、私たちの発見は、古代の（ビフィズス）菌とヒトの共進化の結果として、宿主の生理学と微生物の遺伝学との間の興味深く新規な厳密な協力関係を示唆している。
研究方法
研究対象
アストゥリアス中央大学病院（スペイン北部）で募集した、合併症のない妊娠後に生まれた経膣分娩児11名を対象とした。本研究は、アストゥリアス公衆衛生局の地域倫理委員会（Ref.N° 51/18）およびCSICの倫理委員会（Ref.136/2018）により承認された。インフォームド・コンセントは各乳幼児の親から書面で得た。糞便サンプルは、生後1ヶ月から2年後までの予定された診察時に採取された（補足データ1）。シークエンシング（下記参照）後、離乳後の各サンプル（出生後12カ月または24カ月に相当）から検出された持続性株の数を、シークエンシングの深さの違いを考慮して正規化した。具体的には、各サンプルについて、データセット全体の平均シーケンシングリード数とサンプルのシーケンシングリード数の比として正規化因子を算出した。次に、得られた正規化因子をメタゲノムサンプルで同定された難分解性株の数に適用し、調整された難分解性株の数を得た。
検証コホートは、研究コホートで観察された知見を裏付けるために、大規模で配列が深く公開されている乳児縦断的データセット29（PRJEB32631）を用いて構築した（補足データ1）。具体的には、生後21日目（離乳期前）と生後6ヵ月以降に採取された乳児の糞便サンプルを、（二次）細菌の持続性パターンの検証に適したものとして選択した（補足データ1）。この検証データセットは、最近のmGEMS法30,74,75,76とmSWEEP法30,74,75,76を組み合わせることによって解析された。事前に構築した参照配列データベースに対するk-merベースの擬似アラインメントは、Themistoソフトウェア（バージョン3.1.2）を用いて取得した。注目すべきことに、この手順は、離乳前の乳児の腸内細菌叢を特徴づける標的種に属する参照ゲノムのセットを回収するためにも採用された。詳細には、B. bifidum、B. longum subsp. longum、B. breve、B. pseudocatenulatum、および大腸菌に属する合計371のMAGが、平均完全度86.7％±10％（checkM法に基づく）で再構成に成功し、乳児研究集団の離乳期を通じて観察された宿主内菌株変異パターンを確認するための参照ゲノムとして採用された。
公開データセット
宿主の性別に関連した細菌の持続パターンを広範に調査するために、新たに配列決定した縦断的データセットを、113人の乳児を縦断的にサンプリングした2つの研究から得られた357の一般公開されているショットガンメタゲノムサンプルで補足した11,32。特に、離乳前（生後6ヶ月未満）と離乳後（生後6ヶ月以上12ヶ月未満）の健康な乳児の腸内細菌叢の解析に対応するデータセットを選択した。さらに、さまざまな年齢層をカバーする包括的な集団ベースのコホートを作成するために、生後数日から90歳までの健康な12,415人の横断便メタゲノム・サンプルを、一般にアクセス可能な146の異なる研究から検索した。特に、健常人（対照）のみとし、各個人につき1サンプルとした。サンプルとメタデータの完全なリストは補足資料（補足データ1）にある。特筆すべきは、この収集された集団データセットには、対応するメタデータから親子関係が明らかになった対象者は含まれていないが、母子二人組からのショットガンデータは別個に検討されたことである。異なるシーケンス技術によるバッチ効果は、イルミナDNAシーケンスプラットフォームで生産された生データのみを選択することでコントロールした。さらに、ライブラリーサイズの潜在的な交絡効果を克服するために、すべてのサンプルが同じライブラリーサイズになるように、各サンプルから5,000,000リードをランダムに選択し、5,000,000リードより少ないサンプルは破棄した。この手順を適用する前に、250のディープシーケンスメタゲノムサンプル（PRJEB32631）を用いて、利用可能なすべてのリード（Homo sapiensフィルタリング後の平均8,826,752 ± 1,931,731）と5,000,000リードのランダムサブサンプルを用いた株レベルプロファイリングで得られる結果を比較し、微生物群集構造に関する有効な情報が失われないことを確認した。4つの対象種の菌株プロファイルで計算したMann-Whitney U検定では、メタゲノムリードの種内変異を検出する能力が同等であることが明らかになった（補足データ8）。
民族／地理的起源や年齢など、集団構造に関連する交絡変数を、並べ替え分散分析（PERMANOVA）を用いて検定した。具体的には、年齢群で層別化し、各カテゴリカル変数について統計的有意性（p値）、説明される分散の割合（R2）、効果の大きさ（F値）を評価した。さらに、地理的地域を代理パラメータと仮定して、乳製品の摂取とラクターゼの持続性の交絡効果を検証した。具体的には、南ヨーロッパ（n = 417、男性217人、女性200人）と北ヨーロッパ（n = 413、男性186人、女性227人）のメタゲノムサンプルのサブセットを選択し、性差によるB. また、中国（n=831、男性413人、女性418人）の被験者の糞便サンプルは、乳製品の摂取を考慮してヨーロッパ（n=830、男性403人、女性427人）のものと比較した。
細菌DNA抽出
便検体は採取後直ちに氷上で保存し、凍結状態で研究室に輸送し、処理まで-20℃で保存した。DNA抽出は、QIAmp DNA Stool mini-kitを使用し、製造元の説明書に従って行った（Qiagen、ドイツ）。DNA定量はQubit蛍光光度計（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。
全ゲノム配列決定と分類学的分類
ショットガンメタゲノムシークエンシングはGenProbio srl (www.genprobio.com)が行った。DNAライブラリー調製は、Nextera XT DNAサンプル調製キット（Illumina, San Diego, CA）を用い、製造元の指示に従って行った。ライブラリー調製には、各サンプルから1ngのインプットDNAを用いた。単離されたDNAは断片化、アダプターライゲーション、精製を受けた。すぐに使えるライブラリーを等モルプールし、変性させ、シーケンス濃度が2pMになるように希釈した。シーケンシングは、NextSeq 500装置（Illumina, San Diego, CA）で、製造元の指示に従って、2 × 150 bp High Outputシーケンシングキットと1% PhiXコントロールライブラリーのスパイクインを用いて行った。上記43の乳児腸内細菌叢のホールメタゲノムショットガン（WMGS）シーケンスにより、サンプルあたり平均7,940,484±2,078,529.565のペアエンド150 bpリードが得られた。品質フィルタリング（最小平均品質スコア20、ウィンドウサイズ5 bp、最小長さ80 bp）を行い、ホモサピエンスゲノムにマップされるリードを除去した結果、サンプルあたり平均6,355,063 ± 1,425,089の微生物リードが保持された（補足データ1）。
公開されているショットガンデータセットから取得したものを含め、配列決定されたリードの分類学的プロファイリングは、METAnnotatorX2バイオインフォマティクスプラットフォーム77を用いて、National Center for Biotechnology Information（NCBI）から取得した最新のRefSeq（ゲノム）配列データベースを用いて行った（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/）。各リードの種レベルの分類は、94%以上のアラインメント同一性を用いて、Megablast78（オプション -e-value 1e-5, -qcov_hsp_perc 50）を用いて行った。複数の細菌種に対して同じ配列同一性を示したリードは破棄した。サンプル間の類似性（β多様性）は、種の存在量に基づくBray-Curtis非類似度によって計算された。β多様性のPCoA表現はORIGIN version 9.8.0.200 (https://www.originlab.com/2021)を用いて行った。
細菌ゲノムアセンブリ
それぞれのユニークな宿主幼児について、11の主要な腸管関連微生物種の代表的ゲノム（補足データ3）を、以前に報告されたように再構築した17,77。その結果、67の細菌ゲノムのde novoメタゲノム解析と分類学的分類が行われ、最小平均リードカバレッジは12倍、総ゲノムサイズは文献で報告されているものと同等であった。詳細には、品質フィルタリングとヒトゲノムマッピングに合格したショットガンメタゲノムシーケンスの生データ（fastqファイル）を、メタゲノムフラグオプション（-meta）を有効にしたデフォルトパラメータを使用して、SPAdesアセンブラv3.1279の入力として使用しました。SPAdesのパラメーターは、前述80のように、ペアエンドリード長に基づいて、最小k-merサイズを21、33、55から最大77、99、127まで組み合わせた。アセンブル後、アセンブルされた各コンティグのORFをProdigal81を用いてデフォルトパラメータで予測し、MEGAnnotatorソフトウェア82,83を用いてアノテーションを行った。
参照微生物ゲノムデータベースの構築とメタゲノム菌株レベル解析
乳幼児、成人、および高齢者の腸内細菌叢における菌株コミュニティを解明し、菌株動態を調べるために、63のMAGとNCBI RefSeqデータベースで公開されているゲノム配列（90コンティグ未満の完全およびドラフト高品質ゲノム配列）を組み合わせて、11の種特異的な参照ゲノムデータベースを構築した（補足データ4）。具体的には、オープンソースソフトウェアStrain Genome Explorer（StrainGE）（github.com/broadinstitute/strainge）を用いて、収集したゲノム（MAGsと公開ゲノム）を種ごとに処理し、Average Nucleotide Identity（ANI）値（しきい値99 % ANI値）に従って複製解除（クラスタリング）した（補足データ4）。その後、ショットガンメタゲノムシーケンスから得られたfastqをStrain Genome Search Tool（StrainGST、StrainGEツールスイートの統合コンポーネント）84を用いて解析し、入力fastqと参照ゲノムの両方をk-merize（straingst kmerize -k 23）した後、サンプルに関連するk-merセットと参照ゲノムから得られたk-merセットを反復的に比較した。その結果、StrainGEはメタゲノミックサンプル内に存在するリファレンスゲノムとより類似したリファレンスゲノムを返します（最も強いStrainGSTスコア、デフォルトの閾値は0.02、感度を最大化し、偽陽性を最小化するように最適化されています）。このアプローチを用いて、0～6カ月（離乳前）にプロファイリングされた株と12～24カ月（離乳後）に同定された株を比較することにより、乳児の縦断的な株の安定性を調査した。離乳期を通じて乳児の女性と男性のB. longum subsp.longum株コミュニティ全体を比較するために、上記のように、公開されている113の乳児メタゲノム（357の縦断的サンプル）から、さらに542のB. longum subsp.longumゲノムをメタゲノム解析でアセンブルした。このコレクションは、パブリックリポジトリから検索した404個のB. longum subsp. その後、得られた946本のB. longum subsp. longum染色体をDRep85およびcheckM86ツールで処理し、本質的に同一のゲノム（ANI値=99%）をクラスター化し、各レプリケートセットから高品質の参照ゲノムを選択した。その結果、277株のB. longum subsp. longumの冗長性のないデータベースが得られ、inStrainツールでメタゲノムfastqをデフォルトパラメータで処理するのに使用した33。ゲノムカバレッジを対応するゲノム長で正規化した値を、B. longum subsp. longumの各参照株の相対存在量の代用値とした。
qRT-PCR解析
乳児腸内細菌叢の強調された菌株動態を検証するため、経時的に優占遺伝子変異の顕著な切り替えが観察された3つの症例に焦点を当て、qRT-PCRベースのアッセイを実施した。
まず、予測された持続性株のユニークな遺伝子配列をターゲットとして、株特異的プライマーを設計した（補足データ6）。設計された各プライマー対の株特異性は、プライマーBLASTによってin silicoで評価され、in vitroでは以下の熱サイクリングプロトコルを用いて行われたエンドポイントPCR反応によって検証された： 1サイクルは94 °Cで5分間、その後94 °Cで30秒間、プライマーペアに特異的なアニーリング温度で30秒間、72 °Cで50秒間を30サイクル行い、最終サイクルは72 °Cで5分間行った。この検証ステップのために、各PCR反応は、特定の乳児から経時的に採取した糞便サンプルの各サンプルから抽出したDNAと、対象とした菌株の同じ種に属する他の分類群から抽出したDNAと一緒に行った。プライマーの株特異性が確認されると、設計したプライマーのユニークな遺伝子配列の標的を含む株の平均相対存在量が高い糞便サンプルから抽出したDNAを用いて、2回目のエンドポイントPCRを行った。得られたアンプリコンは、NucleoSpin PCR & Gel Clean Up kit（Macherey-Nagel、フランス）を用いて、メーカーのガイドラインに従って精製した。染色体DNAが入手できなかったため、精製したアンプリコンを標準曲線を作成するための標準DNAとしてqRT-PCRに使用した。具体的には、各qRT-PCR反応ミックスには、7.5μlの2x SensiFast Sybr No-Rox kit（Meridian Bioscience, USA）、10ng/μlに希釈したDNA 5μl、0.5μMのフォワードプライマーとリバースプライマー各々、および最終容量15μlになるようにヌクレオフリー水を加えた。各qRT-PCRランは、CFX96システム（BioRad, CA, USA）を用いて、以下のプロトコルで行った： 95 °Cで2分間、95 °Cで5秒間、60 °Cで30秒間のサイクルを40回行い、65 °Cから95 °Cまでの融解曲線を0.5 °C/秒ずつ変化させた。標準曲線はCFX96ソフトウェア（Biorad）を用いて作成した。
グライコバイオーム予測
メタゲノム解析により、乳児の腸内に永続的または一過的に存在すると予測されるビフィズス菌ゲノムをスクリーニングし、グリコシド結合の加水分解触媒をコードする遺伝子を探索した。グリコシルヒドロラーゼ(GH)をコードする遺伝子の予測とGHファミリーへの分類は、carbohydrate-active enzyme (CAZy)データベース87（BLASTカットオフe値1×10-10）での類似性検索により達成された。
比較ゲノム解析
B.bifidum、B.longum、B.breve、B.pseudocatenulatumの完全ゲノム配列のみをNCBIのRefSeqゲノムデータベースから検索し、Pangenome Analysis Pipeline (PGAP) v1.1 (--identity 0.5 --coverage 0.8 --cluster --method GF)を用いてコアゲノム解析を行った88。具体的には、各ビフィズス菌ゲノムの予測プロテオームについて、BLAST解析（カットオフe値＜1×10-5、両タンパク質配列の80％以上で60％の同一性）により、他の同種の菌株のプロテオームとのオルソログをスクリーニングした。得られたデータは、遺伝子ファミリー(GF)法(カットオフe値1×10-10)を用いて、MCL(グラフ理論に基づくマルコフクラスター化アルゴリズム)89により、機能的遺伝子クラスター(COG)に分類された。汎ゲノムプロファイルは、PGAPソフトウェアの一部として提供されているアルゴリズムを用いて、検討したゲノムで同定されたすべてのCOGを包含する存在／不在マトリックスに基づいて構築された。したがって、B. bifidumとB. longumの間で共有され、B. breveとB. pseudocatenulatumのゲノムには存在しないタンパク質ファミリーが収集された。
B.ビフィダムとB.ロンガムに共通する遺伝的特徴の解析と乳児、成人、高齢者集団における発現の評価
B.longumとB.bifidumが共有する14のCOGのタンパク質配列について、広範な相同性検索を行い、ドメインと局在の予測を行った。詳細には、Pfam v34.0（https://pfam.xfam.org/）、InterPro 86.0（https://www.ebi.ac.uk/interpro/）、およびSimple Modular Architecture Research Tool（SMART）（http://smart.embl-heidelberg.de/）90がタンパク質ドメインの同定に使用され、SignalP v5、Psort v3.0.3、およびTHMM v2が細胞局在予測に使用された。SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)オンラインツールは、3Dタンパク質構造モデルと比較モデリングに使用した91。コード配列の機能アノテーションのために、統合された非冗長タンパク質配列データリソース(nr)に対して、E値1e-5のBLASTPおよびtBLASTN検索を行った。また、BLASTP解析（E値カットオフ1e-5）を用いて、多個体群メタゲノムで同定されたB. bifidumおよびB. longumゲノム中のPDCホモログをスクリーニングした。さらに、同定された14のPDCのそれぞれをWGSリードとアライメントし、集団コホートにおけるそれらの有病率と存在量を決定した。簡単に説明すると、品質フィルタリング（最小平均品質スコア20；ウィンドウサイズ5bp；品質閾値25；最小長100bp）およびホモサピエンスゲノム上にマップされたリードの除去後、Bowtie293を用いて、multiple-hit mappingおよび "very-sensitive "ポリシーにより、14のPDCに対する最終的なマッピングを行った。マッピングは、最小スコア閾値関数（-score-min C, -13,0）を用いて、任意の長さのリードを2ミスマッチに制限し、少なくとも99%の全長同一性を持つマッチを保持するように行った。各PDC遺伝子に対応するリードカウントを計算するために、HTSeqソフトウェア94（ユニオンモードで実行）を採用した。
母子132組の糞便メタゲノムサンプルの解析
母親とその健康な経膣分娩の新生児から、合計164のメタゲノム糞便サンプルを公開リポジトリから取得した（PRJEB6456、PRJNA475246）。具体的には、イルミナのプラットフォームを用いたショットガンメタゲノムシーケンスから得られたDNAシーケンスデータを選択した。B. longum subsp. longum株が関与する垂直伝播事象の同定には、上述のように、分娩時の母親および出生後14～30日の新生児の糞便サンプルに対してStrainGEツールを使用した。また、Bowtie2を用いてGH136の塩基配列とメタゲノムリードを対応させ、HTseqソフトウェアを用いてリードの行数を算出した。
ムチン上でのB. bifidum PRL2010の増殖とRNA-Seq解析
B. bifidum PRL2010細胞は、0.05%(wt/vol)のl-システイン塩酸塩を添加したDe Man-Rogosa-Sharpe (MRS) broth (Sharlau Chemie, Barcelona, Spain)中、嫌気条件下（2.99% H2, 17.01% CO2, 80% N2）（Concept400;Ruskin）で37℃で増殖させた。0.5%ムチンを添加したグルコース無添加の改良MRS（mMRS）30mlに、生細胞を接種した。細胞はOD600nmが0.1になるように接種した。接種後、増殖をモニターし、OD600nmが0.6～0.8の間（指数期）になった時点で、6000rpm、5分間の遠心分離により細胞を回収した。増殖アッセイは3連で行った。B. bifidum PRL2010培養物の全RNAは、既述の方法で単離した27。RNA の品質は Tape station 2200 (Agilent Technologies, USA) を用いて確認した。RNA の濃度と純度は、分光光度計（Eppendorf, Germany）を用いて評価した。RNA シークエンシング（RNA-Seq）のために、抽出した RNA の 100 ng から 1 µg を、QIAseq FastSelect - 5 S/16 S/23 S を用いて、製造元の説明書に従って rRNA を除去する処理を行った（Qiagen, Germany）。rRNA 除去の収量は、Tape station 2200（Agilent Technologies、米国）を用いて確認した。その後、TruSeq Standard mRNA Sample preparation kit（Illumina, San Diego, USA）を用いて全トランスクリプトームライブラリーを構築した。サンプルはテクニカルサポートガイドに従ってNextSeq highoutput v2.5 kit（150サイクル、シングルエンド）（イルミナ）にロードした。デマルチプレックスしたリードを品質フィルター（overall qualityフィルターおよびlengthフィルターを使用）し、BWA95を通してB. bifidum PRL2010リファレンスゲノムにアライメントした。ORFにオーバーラップするリードのカウントは、HTSeqソフトウェア94を用いて行った。RPKM値の解析および偽発見率補正（カットオフ0.01）は、DESeq296および式RPKM = numReads/（geneLength/1000 × totalNumReads/1,000,000）を用いて行った97。実験は3連で行った。
ヒト細胞株試験
ヒト男性ドナーの大腸腺がん由来Caco-2細胞（ATCCから購入）および女性ドナーのヒト結腸がん由来ムチン分泌性杯細胞株HT29-MTX（Prof. Antonietta Baldiの好意により提供された。Antonietta Baldi, University of Milan)を、高グルコース(4.5 g/L)と10 mMのピルビン酸ナトリウムを添加した最小必須培地(MEM)とダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)で培養した。両培地とも、10%ウシ胎児血清（FBS）、2mMグルタミン、100μg/mlストレプトマイシン、100U/mlペニシリンを添加した。培養は10cmディッシュで37℃、5％CO2加湿雰囲気で行い、週に3回継代した。その後、Caco-2細胞とHT29-MTX細胞の混合懸濁液を、DMEM＋FBS中に≈105細胞/cm2の密度で、ファルコン24ウェルマルチトレイ（Becton, Dickinson & Company, Franklin Lakes, NJ, USA）用のメンブレンフィルター（孔径0.4μm）付き細胞培養インサートに播種した。細胞は、3日ごとに培地を交換しながら、タイトな単層が形成されるまで（TEER > 600 Ω cm2）、21日間培養した。
ヒト細胞単層とビフィズス菌の共培養
播種から21日後、24ウェルプレートの培地を抗生物質を含まない新鮮なDMEMに交換した。その後、最終濃度≈108 cells/mlのビフィズス菌をCaco-2/HT29-MTX細胞単層に接種した。その後、24ウェルプレートを5% CO2、37℃でインキュベートした。培養4時間後、細菌細胞は後でRNAに回収され、処理するまで-80℃で保存された。
これらの実験のために、B. longum subsp. longum PRL2022（GH136-エンコード遺伝子を保有）およびB. longum subsp. longum 1898B（GH136-エンコード遺伝子を欠失）をMRSブロス中で37℃の嫌気条件下で培養した。指数関数的増殖期（0.6 <OD600nm < 0.8）に達した時点で、Thoma細胞計数チャンバー（Herka社製）を用いてビフィズス菌細胞を計数し、最終濃度が108個/mlになるように希釈し、PBSで洗浄した後、抗生物質を含まないDMEM400μlに再懸濁し、Caco-2/HT29-MTX細胞単層に播種した。さらに、DMEMに懸濁し、ヒト細胞株と接触させずに24ウェルプレートと同じ培養条件で維持したビフィズス菌株をサンプルコントロールとして用いた。実験はすべて3連で行った。
さらに、血清サプリメントであるFBSのホルモン画分がGH136遺伝子の発現に影響を与えるかどうかを調べるために、B. longum subsp. longum PRL2022を、上記と同じプロトコールに従って、FBSを添加したDMEMと無添加のDMEMで培養した。その後、得られたRNAを用いてqRT-PCR実験を行い、検討した2つの条件（DMEM＋FBSまたはFBSなしのDMEM）間でのGH136の発現の違いを評価した。具体的には、iScript Select cDNA synthesis kit (Bio-Rad Laboratories, USA)を用いて、以下の熱サイクルでcDNAへの逆転写を行った： 25℃で5分、46℃で20分、95℃で1分。mRNAの発現レベルは、Bio-Rad CFX96システムでPower Up SYBR Green Mastermix（ThermoFisher Scientific、USA）を用い、メーカーの指示に従ってqRT-PCRのSYBR greenテクノロジーを用いて評価した。この目的のために、rpoB-fw（CACGATGGTGCTGCGACCTTCCC）、rpoB-rv（GACCTGACGGATACGACGGTTGCC）、atpD-fw（CGTATGCCTTCCGCCGTGGGTTAC）、atpD-rv（ACGTAGATGGCTTGCAGCGAGGTG）、ldh-fw（GTGATGGGCAGCATGGCGACTC）、 ldh-rv（GGAGGCGAAGCGGTCTTGGTTGTC）を、ハウスキーピング遺伝子rpoB、atpD、およびldhの増幅のためのプライマーとして用い、プライマー対GH136-fw（AGCGTCTCGAAGCACATCAA）およびGH136-rv（AGATCATCAGCGAGGCGAAG）を、GH136遺伝子の発現を定量するために用いた。PCRは以下のサイクルに従って行った：初期ホールドは95℃。
真核生物RNA-Seqデータ解析
RNeasy Mini Kit（Qiagen）を用いてヒト細胞単層から全RNAを抽出した。すべてのサンプルはRNAインテグリティナンバー（RIN）≧8であった。RNAシーケンス（RNA-Seq）には、TruSeq Standard mRNA Sample preparation kit（Illumina、米国サンディエゴ）を用い、製造元の指示に従って、各サンプルから抽出したRNA 0.1μg～4μgからポリdT濃縮した鎖状cDNAライブラリーを調製した。各cDNAサンプルの質と量は、Tape station 2200 (Agilent Technologies, USA)とQubit Fluorometer (Thermofisher)で評価した。その後、cDNAライブラリーは、テクニカルサポートガイドに従って、Illumina NextSeq 500 high-output v2.5 kit（150サイクル、シングルエンド）（Illumina）を用いて塩基配列を決定した。RNA-Seqの生データ（fastq）を品質スコアとアダプター配列の有無に基づいてトリミングするためにfastq-MCFプログラムを使用した。高品質なfastqは、スプライスアウェアSTARアルゴリズム（バージョン2.7.10a）100を用いてヒト参照ゲノム配列（GRCh38.p13）にアライメントし、アライメントの品質はPicardソフトウェアツール（バージョン2.26.11）を用いて評価した（https://broadinstitute.github.io/picard/）。その後、個々の遺伝子転写産物にマッピングされたリードの定量は、HTSeqソフトウェアのhtseq-countsスクリプトを "union "モードで実行した94。生カウントは、低カウント（CPM < 1）の遺伝子をフィルタリングするためにCPM（Counts per million mapped reads）、および統計的にロバストな遺伝子発現差解析のためにTMM（Trimmed Mean of M-Values）を用いてEdgeRパッケージ101で正規化した。発現差は、比較したグループ（共培養Caco-2/HT29-MTX/B. longum subsp. longum 1898BとCaco-2/HT29-MTX/B. longum subsp. longum PRL2022）の各サンプルペアにおける平均発現のlog2 fold change (logFC)として評価した。さらに、各比較についてVolcano plotを作成し、発現変化（log fold change）とその統計的有意性（p値）を同時に可視化した。
B. longum subsp. longum RNA-Seqデータ解析
B. longum subsp. longum株からの全RNAの抽出、RNA配列決定、および生のfastq処理は、B. bifidum RNA配列決定実験について上述したように行った。生カウントの生成とDEGの同定は、真核生物RNA-seqデータ解析について上記したように行った。
ヒトのレトロスペクティブ臨床研究
糞便サンプルのショットガンメタゲノムデータセットは、女性および男性の被験者がB. longum subsp. longum株を含む微生物製剤（PRJNA324129、PRJEB28097）を毎日摂取した、一般に公開されているヒト臨床試験から取得した。選択された研究で使用された菌株（ANI値98.5％）の染色体を手作業で検査し、GH136遺伝子の有無を評価した結果、2つの異なる処理パターンが得られた。健康なボランティア21人（女性11人、男性10人）のグループには、GH136遺伝子を保有していることが判明したB. longum subsp. この後者のコホートでは、ベースライン期間、投与28日後、および摂取中止から約200日後に糞便サンプルが採取された。第二の健常人グループ（n=10、女性4人、男性6人）は、GH136遺伝子を持たないB. longum subsp. longum（AG1株と命名）を含むプロバイオティクスサプリメント（5×109 CFUを隔日投与、4週間）を摂取した。対応する糞便サンプルは、ベースライン時、微生物介入21日目、および追跡調査28日後に分析された。AH1206株のゲノム配列はNCBIデータベースから取得し、AG1株の染色体はSpades v3.15（メタゲノミックモード）を用い、デフォルトのパラメータで、使用したプロバイオティクスサプリメントの一般公開されているメタゲノム配列リードから回収した。アセンブルされたコンティグの分類学的分類は、METAnnotatorX2パイプラインと手動でキュレートしたゲノムデータベースを用いて行った。再構成されたB. longum subsp. longum AG1の染色体の完全性とコンタミネーションは、CheckM解析によって検証された86。B. longum subsp. longumの存続性の検証は、上述のようにBowtie2によるリードマッピングで行った。簡単に説明すると、メタゲノミックリードは、低品質（スコア20以下）、tRNA、rRNA配列を除去するためにフィルターされた。さらに、Homo sapiensゲノムにマッピングされた配列も除去した。フィルターされたリードはBowtie2（--very-sensitiveオプション、全長同一性99%以上）の入力として使用された。各参照ゲノムに対応するリードカウントを計算するために、HTSeqソフトウェア（ユニオンモードで実行）を使用した94。各メタゲノミックサンプルについて、マッピングされたリードの相対的な存在量を、シーケンスされたリードの総数で生のリード数を正規化することにより推定した。
統計と再現性
入力データの高分解能と一貫性を保証するため、イルミナシーケンスプラットフォームに基づくショットガンメタゲノミクスデータセットのみを選択した。さらに、腸の罹患が報告されている人のサンプルは事前に除外した。サンプルサイズは主にリソースの利用可能性によって決定された。したがって、サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。実験は無作為化されていない。無作為化を用いない観察研究であるため、実験中および結果評価中の割り付けについて研究者は盲検化されていない。統計データ解析およびグラフ作成には、SPSS バージョン 25、および ORIGIN バージョン 9.8.0.200（www.ibm.com/software/it/analytics/spss/）（https://www.originlab.com/） を使用した。PERMANOVAはvegan Rパッケージのadonis2関数を用いて計算した。種レベルの存在量データのBray-Curtis測定に基づくPERMANOVA解析は、PCoA解析で比較したグループ間の観察された差のp値を推定するために、1000回の並べ替えを用いて実施した。遺伝子発現の差分解析では、EdgeRパッケージを用いて、FDR（False Discovery Rate）としてfold change間の差の統計的有意性を推定した。
報告概要
研究デザインの詳細については、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
本研究で作成されたヒト腸管細胞、B. longum subsp. longum PRL2022および1898Bの乳児ショットガンメタゲノムシーケンスおよびRNA-seqデータは、アクセッションコードPRJNA833139でSequence Read Archive (SRA)に寄託されている。本研究の結果を裏付ける他のすべての一般公開メタゲノムデータセットは、Supplementary Dataで報告されているアクセッションコードから入手できる。本研究で使用したヒト参照ゲノム配列（GRCh38.p13）は、https://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Index?db=core。B. longum subsp. longum 1898BおよびPRL2022のゲノム配列は、それぞれhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_002075875.1およびhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_016759745.1。糖鎖活性酵素(CAZy)データベースはhttp://www.cazy.org/。
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謝辞
GenProbio Srlのプロバイオゲノミクス研究室の資金援助に感謝する。本研究の一部は、パルマ大学のHPC（High-Performance Computing）施設を利用している。本研究は、パルマ大学のプログラム "FIL-Quota Incentivante "の財政的支援を受け、カリパルマ財団と共催している。D.v.S.は、アイルランド政府の国家開発計画（助成金番号：SFI/12/RC/2273-P1およびSFI/12/RC/2273-P2）を通じてアイルランド科学財団（SFI）から資金援助を受けているAPCマイクロバイオーム・アイルランドのメンバーである。G.T.は、"Parma Microbiota "と題するプロジェクトの枠組みで、"Fondazione Cariparma "の支援を受けている。LMVは、イタリア大学研究省の「Programma Operativo Nazionale 2014-2020」の支援を受けている。また、プロジェクトAGL2017-83653R（スペイン "Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCIU)"、"Agencia Estatal de Investigación (AEI) "およびFEDER）からの資金提供についても謝意を表する。
著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Christian Milani、Marco Ventura。
著者および所属
イタリア・パルマ大学化学・生命科学・環境持続可能学部プロバイオゲノミクス研究室
Chiara Tarracchini、Giulia Alessandri、Federico Fontana、Sonia Mirjam Rizzo、Gabriele Andrea Lugli、Giulia Longhi、Chiara Argentini、Laura Maria Vergna、Francesca Turroni、Christian Milani & Marco Ventura
イタリア、パルマ、GenProbio srl
フェデリコ・フォンタナ、ロザリア・アンツァローネ、アリス・ヴィアッピアーニ
イタリア、パルマ、パルマ大学医学・外科学教室
マッシミリアーノ・ジョバンニ・ビアンキ、レオナルド・マンカベッリ、ジュゼッペ・タウリーノ、マルティナ・チウ、オヴィディオ・ブッソラーティ
イタリア、パルマ、パルマ大学、部門間研究センター「マイクロバイオーム研究ハブ
マッシミリアーノ・ジョバンニ・ビアンキ、レオナルド・マンカベッリ、フランチェスカ・トゥローニ、ジュゼッペ・タウリーノ、オヴィディオ・ブッソラーティ、クリスチャン・ミラーニ、マルコ・ヴェントゥーラ
スペイン、ビジャビシオサ、33300、CSIC、アストゥリアス製品研究所、乳製品微生物学・生化学部門
シルビア・アルボレヤ＆ミゲル・グイモンデ
APCマイクロバイオーム研究所・微生物学部、アイルランド国立大学バイオサイエンス研究所、T12YT20、コーク、アイルランド
ドウ・ヴァン・シンデレン
貢献
RNAseqおよび細菌DNAシーケンス実験：G.A.、G.L.、R.A.、A.V. コレクションデータおよびゲノム、メタゲノム、トランスクリプトームデータの処理と解析：C.T、 G.A.、S.M.R.、M.B.、C.A.、L.M.V.、S.A.、G.T.、M.C.、M.G.による計算フレームワークの開発、実装、および計算解析の補助：F.F.、G.A.L.、L.M.による原稿執筆：C.T.、G.A.、C.M.による原稿の批評的修正および承認：全著者。
著者
Christian MilaniまたはMarco Venturaまで。
倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Communications誌は、本研究の査読に貢献いただいた匿名査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。
追加情報
出版社からの注記 Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
補足情報
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査読ファイル
追加補足ファイルの説明
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報告書サマリー
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タラッキーニ、C.、アレッサンドリ、G.、フォンタナ、F.ら、ヒトの一生を通じた腸内微生物の性差持続性に関する遺伝戦略。Nat Commun 14, 4220 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39931-2
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2023年1月25日受領
2023年6月30日受理
2023年7月14日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-39931-2
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細菌の宿主応答
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ネイチャー・コミュニケーションズ（Nat Commun） ISSN 2041-1723（オンライン）
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