ヒト科動物における腸内細菌叢の機能的宿主特異的適応
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公開日：2024年1月6日
ヒト科動物における腸内細菌叢の機能的宿主特異的適応
https://www.nature.com/articles/s41467-023-44636-7
M. C.リューレマン、C.バング、...A. Franke 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ15巻、論文番号：326（2024） この記事を引用する
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メトリクス詳細
概要
ヒトの腸内細菌叢の組成と機能の変化を、ヒトに最も近い近縁種と比較して詳細に知ることは、ヒトの腸内細菌叢の発生軌跡の根底にある進化過程を理解する上で極めて重要である。ヒト科動物の腸内細菌叢における分類学的および機能的変化を異なる時間スケールで推定するために、我々は、ヒトの多様な集団、および野生に生息するチンパンジー、ボノボ、ゴリラを含む200以上のサンプルから得られた糞便微生物叢の高分解能メタゲノム解析を行っている。その結果、ヒトに関連する分類群がヒト以外の類人猿では減少していることや、宿主に特異的な腸内細菌叢のパターンが見いだされ、宿主の進化的分岐に伴って新しい微生物群が広く獲得されていることが示唆された。一方、ヒト集団では、進化的に保存されたクレードを含め、高い人間開発指数（Human Development Index）と相関して、多様性が広く失われていることを示す複数の証拠が明らかになった。同様に、ヒトでは微生物と宿主の共系統のパターンが崩壊していることがわかった。宿主の系統と相関する個々の微生物分類群や機能的適応の同定とともに、これらの知見は、ヒト科動物の腸内細菌叢の分岐の軌跡に役割を果たしている特定の候補についての洞察を提供する。ヒトの腸内細菌叢の進化には、反復的な水平遺伝子移動と遺伝子消失、そして一過性の微好気的条件への適応が関与しているようである。
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はじめに
ヒト腸内細菌叢の研究は、食事、環境、生活習慣を含む多くの要因がヒト腸内細菌叢の構造に影響を及ぼし、ひいてはヒトの健康や疾病に多大な影響を及ぼすことを明らかにしてきた1,2,3。現在までのところ、これらの研究の大半は高所得国からのサンプルコレクションを対象として実施されているが、世界の多様な集団のヒトを対象とする取り組みが増えつつあり、ヒト集団間で共有されるマイクロバイオームの特性や特異的なマイクロバイオームの特性を調査・評価するための新たな切り口が提供されつつある3,4,5,6。このような努力は、腸内細菌群集の多様性パラメーターにおける従来の差異にとどまらない、宿主の地理やライフスタイルの特徴を発見する機会となった。例えば、集団の人間開発指数（HDI、平均寿命、教育、所得を包括する指標の統計的複合指標7; ）と相関する水平的遺伝子移入（HGT）の割合が高いことが明らかになり、宿主のライフスタイルの変化と連動して腸内細菌叢が常に新しい機能を獲得していることが示唆された8。しかし、腸内細菌構造の変化を宿主の行動や生態系と結びつけるメカニズムは、まだほとんど解明されていない。
ヒトの腸内細菌群集の多様性と組成のパターンを理解する上でさらに重要な洞察は、ヒト科動物の腸内細菌叢の比較調査から得ることができる。ヒト、チンパンジー、ボノボ、ゴリラの腸内細菌叢は次第に乖離しており、遠縁の種ほど乖離した群集組成を示す（系統共生9;）。同時に、個々の微生物系統の系統樹の一部は、彼ら自身の系統樹と平行している（コディバージェンス10,11;）。系統共生と共分離の両パターンは、ヒト科動物の進化が共生生物群集に長期的な影響を与えていることを示唆している12,13,14。注目すべきは、比較マーカー遺伝子解析の結果から、ヒト科動物の腸内微生物群集（原核生物とファージの両方）の共分散メンバーは、動物が自然環境を離れて飼育下に移されると失われ、ヒトの系統に置き換わることが示唆されている15,16。しかし、分類学的な解像度が低く、機能的な特徴付けが不十分であるため、このような変化を引き起こすプロセスについて深く理解することができない。
ショットガンメタゲノムデータから機能解析を行ったところ、個体の寿命期間中や種間で食餌が変化したにもかかわらず、野生の霊長類（NHP）全体で系統的シグナルが保存されていることが明らかになり、野生のNHPにおける腸内細菌叢の進化は、宿主の遺伝学と生理学によって部分的に制約されていることが示唆された17。NHPと多様なヒト集団における微生物機能の比較メタアナリシスでは、HDIの高い地域の飼育下NHPとヒト集団において、生物多様性が同程度に失われていることが観察され18、これまでの知見を裏付けている19。しかしながら、これまでの研究において、NHPの微生物叢の機能的特徴付けは、特にアフリカの類人猿とヒトにおいて、より広範な規模の機能的変化や特異的な変化を扱うことなく、選択された微生物分類群のみに限定されてきた。そのため、腸内細菌叢がヒト科動物とともにどのように進化し、ヒト腸内細菌叢の現在の構造と機能的能力（および欠損）を形成してきたかを包括的に理解するためには、強固な比較機能解析が依然として必要である。
ヒト科動物の腸内における宿主とマイクロバイオームの相互作用を進化的な観点から解明するために、2つの大陸にまたがる地理的に異なる個体群から得られた野生の非ヒト類人猿（NHA）とヒトの大規模な比較研究を紹介する。2種のゴリラ、3種のチンパンジー亜種、ボノボを含むアフリカ6カ国に生息する野生の類人猿の糞便サンプルについて、機能的ショットガンメタゲノム配列決定を行い、コンゴ共和国のゴリラとチンパンジーの公表データと組み合わせた20。さらに、コートジボワールのタイ地方（HDI2021 = 0.5507;）とコンゴ民主共和国のサロンガ国立公園近郊のバンドゥンドゥ地方（HDI2021 = 0.479;）の農村から採取したアフリカの2つの集団21のヒトの糞便サンプルと、ドイツ（HDI2021 = 0.942;）のサンプルの塩基配列を決定し、デンマーク（HDI2021 = 0.94822;）の公表データセットも加えて、さまざまな程度のHDIを組み込んだ。この広範なデータリソースを用いて、メタゲノムデータから構築した高品質の原核生物ゲノムの包括的なカタログを作成し、分類学的および機能的レベルでアノテーションを行った。その結果、ヒトの腸内微生物群集に関連する興味深いパターン、系統間の機能的適応の収束、およびこれらのパターンを駆動する潜在的なメカニズムが明らかになった。
研究結果
ヒト腸内微生物ゲノムの拡大カタログ
ヒト（Côte d'Ivoire (CIV), n = 12, Dem. Rep. of the Congo (DRC), n = 12, Denmark (DK), n = 24, and Germany (GER), n = 24)、および2つのゴリラ亜種(Gorilla gorilla gorilla, Gabon (GAB), n = 8; Gorilla beringei beringei, Uganda (UGA), n = 11, and Republic of Congo (CG), n = 28)、3つのチンパンジー亜種(Pan troglodytes verus, CIV, n = 55; P. troglodytes, GER, n = 28)を含む非ヒト類人猿の糞便サンプルからのショットガンメタゲノムデータセット(補足データ1)。 t. troglodytes, GAB, n = 11, and CG, n = 18; P.t. schweinfurthii, UGA, n = 12)、およびボノボ(Pan paniscus, DRC, n = 12)について、複数のビニングアルゴリズムと専用のキュレーション・スコアリングツール(23; Methods参照)を用いて、最大限の完全性と低コンタミネーションを確保しながら、合計7700個のメタゲノム集合ゲノム(MAGs)を再構築した。最も多くのMAG（品質スコア>50%）が、類人猿の中で最もサンプル数が多いP.t. verus（n = 2182）で再構築され、一方、サンプルあたりの平均再構築MAG数はP.t. schweinfurthii（平均=74.5）が最も多かった。ライブラリーサイズ／シーケンシングリード数は、総アセンブリーサイズと高い相関があり（ρSpearman = 0.644）、これはサンプルについて回収されたビン数と直接相関していた（ρSpearman = 0.966）。
解析のための包括的なリファレンスを確保するために、MAGのコレクションは、ヒトの糞便メタゲノム（UHGGv2、n = 4744単離株およびMAGs24;）および非ヒト霊長類の糞便メタゲノム（n = 1295 MAGs18;）から再構築された微生物リファレンス種の2つの大規模なコレクションと結合され、合計n = 13,739ゲノム配列となった；MAGはその後、厳格な基準（Suppl. 図S1aおよびS1b、補足データ2）。これらのうち、1074のSGBは2つの大規模参照セットのいずれでもカバーされておらず、ほとんどがNHAサンプルに由来していた（n = 956, 89.0%;補足図S1c）。各SGBで最も質の高いゲノム配列がその代表として選ばれた。SGB代表ゲノムの品質は全体的に高かった（品質スコアの中央値＝94.1％；補図S1d）。SGB代表ゲノムは、サンプルあたりの存在量を推定するための包括的なリファレンスとして使用された（Methods, Suppl.） 21の細菌門と2つの古細菌門を含む合計3287のSGBがデータセットに存在することがわかった（補図S1b）。このゴリラ、ボノボ、チンパンジーのSGBのキュレーションカタログは、これまでに糞便から再構築された微生物種ゲノム数を10倍以上増加させ、NHAからの糞便メタゲノムと参照ゲノムとのマッピング成功率を2〜3倍増加させた（補図S1e18）。予想通り、ヒトサンプルのSGBのうち、含まれる大規模リファレンスコレクションでカバーされていなかったのはわずかな割合で、CIV、DRC、DK、GERのサンプルで見つかったSGBのそれぞれ5.8%、2.7%、1.8%、1.7%がこのグループに該当した（補足図S1e）。NHAとヒトの両方において、これまで明らかにされていなかった多様性の最も高い割合は、バクテロイデス門とスピロカエトタ門で観察され、NHAのみでは、より低い程度ではあるが、ファーミキューテス門とファーミキューテスA門で観察された（補足図S1f）。一般に、回収されたクラスターは宿主特異性が高かった。7700のMAGは最終的なSGBのうち1787にまたがっていたが、これらのSGBのうち48のMAGだけが、単一宿主属以上のサンプルから再構築された。
サンプル内の多様性は、宿主（亜）種間および配列決定深度によってかなり異なっていた（補図S1g）。また、Faithの系統的多様性（PD）は、多様性の計算にSGBの関連性を組み込んでおり、分類群の存在量から単純な多様性を推定するよりも、群集の総多様性をより適切に推定することができる。1サンプルあたり100万リードのマッピング深度を均等にした場合の系統的多様性（PD）は、アフリカのすべての類人猿宿主と比較して、ヒトでは有意に低い多様性を示した（PWilcoxon = 1.2×10-13；図1a）。個々のヒト集団とアフリカの類人猿宿主を比較すると、GERとコンゴ民主共和国のヒトはすべてのNHAグループより低い平均値を示したが（すべてのPWilcoxon < 0.05）、CIVとDKのヒトは高い分散を示し、G. g. gorillaとP.t. troglodytes（PWilcoxon>0.05）を除き、すべてのNHA宿主より有意に低い多様性を持つことがわかった（PWilcoxon < 0.05）。この2つの類人猿は、ライブラリーサイズが最も小さく、回収ゲノム数が少なく、マッピング効率が最も低いことがわかった。これらを総合すると、これらの宿主における系統多様性は、参照データベースにおける代表数が少ないために偏っている可能性があり、多様性の減少はその偶発的なものである可能性が示唆される。その結果、マップされたリード数が100万未満のサンプルは、以降の解析から除外された。その結果、G.b. beringei (n = 1)、G.g. gorilla (nGAB= 5, nCG = 1)、P.t. troglodytes (nGAB= 4)、P.t. schweinfurthii (n = 1)、およびCIVのヒト(n = 1)のグループのサンプルが解析から除外された。特筆すべきは、サンプル内系統多様性の平均値が最も低かったのはドイツ、最も高かったのはデンマークのヒトサブグループで、後者はヒトサブセット間で唯一の有意差（PWilcoxon < 0.05 vs. DRC and GER）を示し、一般的に高HDI国に見られるアルファ多様性が低いという過去の報告と矛盾していることである3,4。さらに、CIVとコンゴ民主共和国の間で観察されたPDのかなりの違いは、ヒト集団間で見られる多様性を浮き彫りにし、ヒトの腸内細菌叢の多様性をより明確にする必要性を示している。したがって、いくつかの宿主グループの多様性は、特に低存在微生物群を考慮すると、網羅的にサンプリングされていない可能性が高いが、提示された高品質メタゲノム再構築ゲノムのリファレンスコレクションは、ヒトの糞便微生物群の詳細な分類学的・機能的評価を行うための現時点での最良のリソースである可能性が高く、この分析でサンプリングされたものを含むいくつかのヒト集団が、腸内の微生物の多様性をかなり失っていることを浮き彫りにしている。
図1：ヒトおよびNHA糞便微生物群の群集レベルの特異性。
図1
c 宿主（左）とマイクロバイオーム（右）のツリーのタングルグラム（後者は重み付けなしのUniFrac距離に基づく）。行は参照宿主グループ、列は重複を共有するグループを表す。タイル内の数字は、ランダムな1000回の並べ替え（未調整、片側）に基づく、参照群における濃縮（↑）および枯渇（↓）の解析によるP値。すべての解析は、n = 211の独立したサンプル（nHuman = 71, nChimpanzee = 91, nBonobo = 12, nGorilla = 40）に基づいている。箱ひげ図は次の要素を示している：中央線：中央値、箱ひげ：上下四分位数、ひげ：1.5×四分位数間： 1.5×四分位範囲。
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ヒト科動物の系統共生は群集構造によって強く支持されている
微生物群集の分岐が宿主の分岐と並行するパターンである系統共生は、宿主と微生物叢の群集レベルの共進化の兆候である可能性があり、進化のタイムスケールにわたって維持されてきた宿主と微生物の関係を示している9。このようなパターンを調べるために、我々は6つの異なるベータ多様性の尺度を用いた。そのうち4つは系統学的または分類学的な距離指標（加重および非加重UniFrac、ならびに属レベルのAitchisonおよびJaccard距離）に基づくもので、さらに2つの指標は群集の機能的能力を考慮したものであった（KEGGオルソログ（KO）の存在量と存在／非存在パターン；Suppl. 図2）。系統共生の強いシグナルは、Jaccard距離と非加重UniFrac距離（P < 0.001、QBonferroni < 0.01）に見られ、Aitchison距離と機能的グループの存在量（それぞれP < 0.01、QBonferroni = 0.0534とQBonferroni = 0.0585、図1bとc、Suppl. 図2、Suppl. データ4）であったが、KOの有無に基づく距離（P = 0.055, QBonferroni = 0.33）および重み付きUniFrac距離（P = 1）についてはそうではなかった。これらの結果は、ヒトの微生物叢の一般的な微生物構造（Jaccardと重み付けなしのUniFracは微生物クレードの有無に基づいている）における系統共生的分岐を示唆している。このように分類群レベルの多様性に関するシグナルが減少したのは、食餌を含む環境要因の変化に応じてクレードの存在量や機能が変動した結果である可能性があり、ヒト科動物の腸内細菌叢が即時的な影響に対応して高い機能的可塑性を示す一方、微生物クレードの獲得や喪失による構造的変化は、むしろ長期的な適応から生じるのかもしれない。
宿主グループ間で共有されるSGBを、シーケンスの深さとグループサイズの違いを考慮した順列ベースの枠組みで解析した（詳細はMethodsを参照）。その結果、特にヒトに関連するSGBは、複数のNHAグループ間で強く減少していることがわかった（図1d）。一方、このようなシグナルは逆方向にはあまり見られず、ヒト腸内細菌叢において新規微生物クレードが広く獲得されていることを示している。同様のパターンはG. b. beringeiと複数のPan亜種で見られたが、G. g. gorillaでは見られなかった。G.g.ゴリラとP.t.トログロディテスは同所性の種であり、コンゴ共和国とガボンの同じ環境でサンプリングされた。これらの特定の分類群間で過剰な宿主特異的シグナルがないことは、マイクロバイオーム構造に影響を及ぼす共有環境の影響を示唆しているのかもしれない。ヨーロッパとアフリカのヒトサブグループは、それぞれCIVとDRC、DKとGERの間で強いペアワイズSGB共有を示したが、地理的地域間では見られなかったことから、マイクロバイオームが環境やライフスタイルの違いと強く関連していることが示唆された。すべてのヒトサブグループは、他のすべての宿主属とのSGB共有の強い枯渇を示し、その結果、ヒトの微生物叢は他のヒト科動物の微生物叢から明確に分離された。
進化的に保存されたコア微生物叢の喪失が顕著なヨーロッパ集団の糞便微生物叢
ヒトとNHAとの間、また、農村部や都市部、HDIが低い地域や高い地域など、環境の異なるヒトコミュニティ間の微生物群における存在量の違いは、遠い過去や最近の過去における環境変化に対する微生物が介在する適応についての洞察を与えることができる。我々は、アフリカの農村部、低HDI地域（CIVとコンゴ民主共和国）に住む個体と、ヨーロッパ内の都市部、高HDI地域（GERとDK）に住む個体を含む、NHAとヒトの腸内微生物の存在量プロファイルを解析し、比較した。以下の分類学的および機能的比較のすべてにおいて、ヒトとパン（チンパンジーとボノボ）のサンプルに限定して解析を行い、宿主が約700万～800万年前に分岐して以来の微生物叢の分岐について焦点を絞った洞察を得た25。
合計310の微生物属が解析に含まれ、そのうち173属がヒトのサブグループ間、またはヒトとNHA間の比較の少なくとも1つで存在量に差がある（QBonferroni<0.05、図2a、補足データ5）ことが判明し、その後4つのグループのいずれかに分類された。その結果、Akkermansia、Bacteroides、Alistipesなど、ヨーロッパの高HDI地域のヒトで存在量が増加している57の分類群が同定された（図2a、b）。さらに、クリプトバクテロイデス（Cryptobacteroides）、プレボテラ（Prevotella）、サクシニビブリオ（Succinivibrio）など、アフリカの2つの集団で濃縮されている39の分類群も見つかった（図2a、b）。全体として、我々が検出したヨーロッパのマイクロバイオームのマーカー分類群は、これまでの知見26,27と一致している。我々のアプローチにより、ヒト集団とは独立した、ヒトとNHAとの間で存在量の差のあるプロファイルを示す細菌分類群を同定することができた（図2b）。SIG603のようにNHAで存在量が増加する74の分類群と、ヒトで存在量が増加する50の分類群を発見したが、そのうち15はコプロコッカスやアガトバクターのようにヒトのサブグループのいずれとも関連を示さなかった。興味深いことに、アフリカ出身者と比較してヨーロッパ出身者のマイクロバイオームで減少している分類群は、NHAsのマイクロバイオームでも豊富（0.1%以上）である可能性が高く（P < 0.001；図2c）、これらの集団では進化的に保存されたクレードが失われていることを示唆している。
図2：ヒトとNHAsの微生物叢の分類学的差異。
図2
a NHA（n=143）とヒトの糞便サンプル（x軸）およびアフリカ人（n=23）とヨーロッパ人（n=48）の集団内のヒトも同様に分離したサンプル（y軸）における属の存在量の差の効果量（単変量線形回帰からのt値）。ポイントは、ヨーロッパ（濃い青）とアフリカのヒト集団（薄い青）との関連グループ、またはNHA（オレンジ）またはヒト（明るい青）での濃縮を示すように色分けされている。どのグループとも関連が認められなかった分類群（すべてQ > 0.05、両側）は灰色で示す。横線と縦線は、ボンフェローニ補正後の統計的有意性のt値閾値（｜t値｜＞4.04）を示す。 b 全グループで存在量に変化がなかった属（上）、NHA（n＝143）またはヒト（n＝71；それぞれ2行目と3行目）、あるいはアフリカ（n＝23）またはヨーロッパ（n＝48；4行目と5行目）のヒトで存在量が増加した属を選択した標本ごとの存在量と宿主グループごとの存在量。ポイントは宿主属によって色分けされている： c ヒト群集とNHAに関連する分類群の累積存在量の軌跡。NHA（n=143）、すべてのヒト（n=71）、またはヒト集団のサブグループのいずれかと関連する分類群に基づいてグループ化された、各宿主グループ内のサンプルごとの累積存在量が示されている。すべての箱ひげ図には以下の要素が示されている：中央線：中央値、箱ひげ：上下四分位数、ひげ：1.5×四分位数間： 1.5×四分位範囲。
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宿主間およびヒト群集間での糞便微生物叢機能の広範な変化
分類群特異的な変化は、宿主グループ間の広範な違いを反映している。微生物の機能を重点的に解析することで、そのような群集レベルの変化の具体的な原動力について洞察することができる。我々は、NHA（パン属）対ヒトの糞便微生物叢とヨーロッパおよびアフリカ社会のヒトにおける6,340のKEGGオルソログ（KOs28, ）の存在量の違いを解析し、それぞれ1,092（17.2 %）と881（13.9 %）のKOsに有意な存在量の違いを見出した（QBonferroni<0.05; Fig.）
図3：ヒトとNHAにおける微生物叢の機能的差異。
図3
a NHA（n=143）とヒト（n=47、x軸）およびアフリカ系（n=23）とヨーロッパ系（n=48）の集団内のヒトの糞便サンプルにおけるKEGGオルソログの存在量の差の効果量（単変量線形回帰からのt値）。ポイントは、ヨーロッパ人集団（濃い青）とアフリカ人集団（薄い青）との関連グループ、またはNHA（オレンジ）またはヒト（中青）における一般的な濃縮度に従って色分けされている。どのグループとも関連が認められなかった分類群（すべてQ > 0.05、両側）は灰色で示す。横線と縦線は、ボンフェローニ補正後の統計的有意性のためのt値閾値（｜t値｜＞4.77）を示す。 b アフリカ人とヨーロッパ人の集団間、およびNHAとヒトの関連分類群間の存在量の差に関する前回の解析からのKEGGオルソログ（KO）の効果量をそれぞれ示す。示されているKOは、グループ間で有意に存在量が異なるKOの中で濃縮（QFisher's<0.05、両側）された機能的な高次KEGGカテゴリーに並べられている。横棒は、濃縮の方向性の推定値として、KEGGカテゴリー内の全KOのt値の中央値を示す。 c 大陸間で共有される4つの細菌ファミリーの中で、アフリカまたはヨーロッパのヒトのパンゲノムに濃縮されていることが判明したKO。固定効果メタ解析のZ値を示す。KOは、アフリカとヨーロッパのパンゲノム間で有意に異なる有病率（QMeta<0.05、両側）を持つKOの中で濃縮（QFisher<0.05、両側）された機能的な高次KEGGカテゴリーにソートされている。d 4つの微生物ファミリーにまたがって、ヨーロッパ出身のヒトでより多く見つかっているクレードにおけるウロカニン酸ヒドラターゼ遺伝子（K01712）の有病率。P値（フィッシャーの正確検定、両側）： PBacteroidaceae = 4.55 × 10-7, PLachnospiraceae = 0.017, POscillospiraceae = 0.052, PRuminococcaceae = 0.030。星印は遺伝子有病率のクレードごとの差を示す（フィッシャーの正確検定、両側）： *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
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より高次のKEGGアノテーションを解析した結果、ヒトと比較してNHAに多く存在するKOのアノテーションは7つ、逆にヒトに多く存在するアノテーションは9つであった。硫黄代謝(map00920)は一般的に、両群に関連する個々の効果方向で、差異のあるKOにおいて過剰に発現していた(QBonferroni <0.05; Fig. 3b, Suppl. Data 7)。NHAに関連するカテゴリーmd:M00356、md:M00563（メタン生成）、path:map00680（メタン代謝）は、明らかにメタン生成古細菌の存在量が高いことを示している。さらに、古細菌の明確なリボソームアノテーションを含む、リボソームに関わる複数のカテゴリーを発見し、これらのKOのパンゲノム分布を利用して確認することができた（例えば、K02866 [large subunit ribosomal protein L10e]を持つSGBの92.9%がドメインArchaeaに属する）。ヒトでは、抗菌薬耐性（path:map01501, br:ko01504）、細菌移動性（path:map02030, path:map02040, br:ko02035）、バイオフィルム形成（path:map02026）、原核生物防御システム（br:ko02048）を網羅するカテゴリーに濃縮が見られ、ヒトマイクロバイオームでは、地理的条件によらず、一般的に病原性遺伝子の存在量が高いことが示唆された。さらに、有意に異なるKOのパンゲノム分布から、これらのKOは系統樹全体にわたって存在するため、特定の微生物クレードに起因するものではないことが確認された。
アフリカのヒトとヨーロッパのヒトの間で、より高次のKEGGアノテーションが充実しているのは、ヨーロッパのサブグループ（n = 16）のみであった。これらはビタミンB12/コバラミン生合成（md:M00122、M00924、M00925、path:map00860）と抗菌剤耐性遺伝子（br:ko01504、path:map01502）に関与していた。抗菌機能の増加は、ヒトの医療や広範な畜産における抗生物質の使用量の増加、および環境汚染によって説明できるかもしれない8。ヨーロッパ人の糞便中にビタミンB12を産生する微生物が増加しているのは、反芻動物の肉や乳製品を多く摂取していることが原因かもしれない。さらに、解糖/糖新生（path:map00010）、ピルビン酸代謝（path:map00620）、リン転移酵素系（path:map02060）、V/A型ATPアーゼ（md:M00159）など、酸化的炭水化物代謝への群集レベルのシフトを示唆する複数のカテゴリーが見つかった。
ヨーロッパ個体群に関連する分類群の成功は酸化的糖質代謝に関係する
しかし、このような変化は、高い頻度で存在する分類群によって過度に引き起こされている。我々はパンゲノム解析を適用し、ヨーロッパに居住するヒトの腸内において、他のヒト関連分類群と比較して、特定の微生物群に濃縮または減少している個々の遺伝子と機能を特異的に同定した。解析は、パンゲノム解析に十分な数のSGB（両群それぞれでn > =10）が回収された、バクテロイデス科、ラクノスピラ科、オシロスピラ科、ルミノコッカス科の4つの細菌科に限定した。これらの科のSGBはヒトマイクロバイオーム全体に占める割合が高く（平均53.2％）、サブグループ間に有意差はなかった（PKruskal-Wallis = 0.2）。分類学的ランクが高くなるとクレード特有の機能バイアスが増加するため、解析はファミリーレベルで行った。ファミリー間の機能的差異を考慮するため、ヨーロッパ人に関連するSGBの機能的差異を、まずフィッシャーの正確検定を用いて微生物ファミリー内で解析し、その後、共有シグナルを活用するためにZスコアを用いた重み付けなしのメタ解析にかけた。
ヨーロッパ人集団に関連するパンゲノムにおいて、167の濃縮KOと30の枯渇KOが同定された（QMeta,Bonferroni < 0.05; Suppl. Data 8 and 9）。より高次のKEGGアノテーション（モジュール、パスウェイ、BRITE階層）を用いると、これらのアノテーションのうち11個がデータセットで過剰に発現していることがわかった（QBonferroni <0.05、図3c、表1、補足データ10）。これらのうち、糖質代謝に関わる複数のグループはヨーロッパ人に関連する分類群に富んでおり、特にATP生成のための糖分子の好気的分解を指していた（クエン酸サイクル：md:M00009, path:map00020; ペントースリン酸経路：md:M00004; V/A-type ATPase, prokaryote: md:M00159）。これらのシグナルは、ヨーロッパに住むヒトの腸内における分類群の選択が、炭水化物を多く含む食事と関係していること、そして、厳密に嫌気的な発酵よりも効率的な酸化的リン酸化を栄養素からエネルギーを放出する手段として用いて、腸内環境の一時的な微好気的条件に適応している可能性を強く示唆している30。しかし、発酵の減少は短鎖脂肪酸の産生に影響を与え、ひいては宿主の腸管上皮細胞や代謝に悪影響を及ぼす可能性がある31。さらに、ヒスチジン分解に関連する経路も見つかった（md:M00045）。ヒスチジン分解の中間産物であるイミダゾールプロピオン酸が2型糖尿病患者において増加していることが、約2000人を対象とした大規模な研究で示され、この増加は微生物叢や全般的な不健康な食習慣と直接関係しているが、食事からのヒスチジン摂取量とは無関係であることが示されたためである32。酵素ウロカネートヒドラターゼ（EC:4.2.1.49; K01712）は、ヒスチジン分解経路におけるウロカネートとイミダゾールプロピオン酸の相互変換を担っている。この遺伝子は、解析した4つの細菌ファミリーのうち3つで有意に濃縮されており（P < 0.05、図3d）、オシロスピラカイ（Oscillospiracaee）でも明らかな傾向が見られた（P = 0.052）。このことは、ヨーロッパの人間社会における、微生物にコードされた代謝異常の素因を示唆している。
表1 ヨーロッパに住むヒトの腸内細菌叢で有意に濃縮（Q < 0.05、両側）されたKEGG機能群
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ヨーロッパ人で濃縮されなかった分類群では、有意に濃縮された高次のKEGGアノテーションは見つからなかった。これらの分類群のフィットネスが相対的に低いのは、ヨーロッパ人のライフスタイルに関連する単一のメカニズムによるものではなく、むしろ個々のクレードに特異的な複数の選択的力によるものである可能性がある。
宿主特異的適応の収束は、微生物ファミリーにまたがって見られる。
複数の微生物群に共通する遺伝子の増減は、特定の宿主の腸内環境に対する応答を示している可能性があり、その結果、機能が独立して複数回獲得される（そして選択される）ことになる。このような収斂適応のパターンを同定するために、ヒトとNHA間で共有されている属（n = 36）のパンゲノム解析を行った。より高いレベルのクレード効果をコントロールするため、機能レパートリー（KEGG Ontology用語）をNHA（補足データ11）とヒトのSGBパンゲノムの属レベルで比較し、その結果を属をまたいだメタ解析で統合した。合計で78のKO項がそれぞれの宿主グループへの収束的適応のシグネチャーを持つものとして同定され、これらのシグネチャーのうち57がヒトと、21がNHPと関連していた（QBonferroni<0.05; Fig.） ヒトに関連するKOの中には、シトクロムbdユビキノールオキシダーゼサブユニット（cydA、cydB）のような、呼吸鎖内で酸素を電子受容体として利用することによる酸素増加への適応や、フェリチン（ftnA）やチオレドキシン依存性ペルオキシレドキシン（BCP）を介した酸化ストレス増加への適応を示唆する複数の機能グループが再び見つかった。NHPのパンゲノムに濃縮されたKOの中には、外膜因子（TC.OMF）、主要ファシリテータースーパーファミリー（MFS）トランスポーター（lrmB）、1-エピ-バリエノール-7-リン酸キナーゼ（acbU）、ポリケチド合成酵素としてアノテーションされた2つのKO（rhiA、pksN）が見つかった。ポリケチド合成酵素が産生する産物は、抗生物質活性、病原性、共生関係のサポートなど多様な機能を持つ33。OMFとMFSは膜貫通複合体を形成し、炭水化物、金属イオン、アミノ酸などの多種多様な溶質34を輸送し、有毒化合物を輸送する35,36。これらの潜在的な適応がNHA宿主とどのように関係しているかは不明であるが、多様な食餌への適応37,38や、植物由来の異生物の代謝39を示しているのかもしれない。
図4：NHAとヒト宿主との微生物群横断的な機能的関連。
図4
a ヒト（青い菱形）とNHA（オレンジの菱形）に関連する分類群に一貫して濃縮されたKO用語。個々の属レベルのPFisher値は、門ごとに色分けして示した。P値は分類群レベルの検定では未調整、メタ解析では多重検定のためにボンフェローニ補正した。b ヒト（青）とNHA関連（オレンジ）のPrevotella SGBにおけるKO項の有病率パターン。c ヒト（青）とNHA（パン：オレンジ、ゴリラ：緑）で見つかったPrevotella SGBにおけるcydA遺伝子のツリーリコンシリエーション解析の結果は、ランダムシードによる1000回のリコンシリエーションにおいて、頻繁な転移の歴史を示している。塗りつぶされた形はcydA陽性、空の形は陰性SGBを表す。赤い矢印は、少なくとも50％の照合で見られたドナーノードからレシピエントノードへの遺伝子導入イベントを示し、頻度によって重み付けされている。赤い三角形は、ドナーノードとは独立に、50%以上の頻度で遺伝子転移のレシピエントとして同定されたノードを示す。黒丸は頻度が50%以上の種分化イベントを示す。また、プレボテラ属の中で最も頻度の高い10種の種名を示した。プレボテラ樹はパラプレボテラ・クララをアウトグループとして根付かせた（図示していない）。
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プレボテラ属は、データセット中で最大の属レベルのクレード（n = 212、全SGBの3.7％）を占めた。この属はすべての宿主種で見つかったが、ヨーロッパ人ではその存在量と有病率が大きく減少している。我々は、観察されたパターンを駆動する潜在的な機能的メカニズムを解明するために、さらなる解析のためにこの属を選択した。エンリッチメント解析の結果、126のKOが明瞭な有病パターンを示した（Q < 0.05；図4b）。最も顕著な違いは、シトクロムbdユビキノール酸化酵素サブユニット1および2（cydAおよびcydB）に見られ、これらはヒト関連プレボテラSGB（UHGGv2ゲノムを含む）114株中101株で見つかったが、NHA由来のSGB72株中2株でしか存在しなかった。このような有病率の差は、単一の宿主に限定された分布域を持つプレボテラ属内の単一系統によるものではないことに注意することが重要である。その代わりに、この分類群の系統樹全体にまたがる複数の兄弟クレードにまたがって観察される（図4c）。シトクロムbdオキシダーゼはストレス応答に関与し、特に一過性の微好気性環境において顕著である40。プレボテラ（Prevotella）種の系統樹（データセットから回収された全てのSGB代表（n = 184）を用いて再構築）とcydA遺伝子の系統樹を比較すると、両者の樹上トポロジーの間に広範な不整合が見られた（図4c）。Prevotella系統とcydA系統の間で重複-転移-損失（DTL41;）モデルを用いた樹形復元を行ったところ、Prevotella系統の枝（離れた枝も含む）間で遺伝子転移が頻繁に起こること（ \bar{T}*** = 44.6）と、NHA関連クレードでそれに続いて損失が起こること（ \bar{L}*** = 23.2）が明らかになった。遺伝子有病率で標準化すると、これらの値はPrevotella属で見つかった単一コピー遺伝子の転移と消失のそれぞれ71番目と61番目のパーセンタイルである（Suppl. Data 13）。興味深いことに、NHAで見つかった2つのcydAを持つSGBは系統学的に離れているが、それらのcydA遺伝子は非常に類似しており、一方から他方への転移の結果である可能性が高い。遺伝子転移イベントとマッピングは、異なる開始シードを用いた1000回の照合においても頑健であり、全イベントの89.2%、全マッピングの67.6%が100%の一貫性をもって見つかった。これらの結果は、NHAと比較してヒトで観察されたシトクロムbdユビキノール酸化酵素の濃縮は、ヒトの腸内におけるプレボテラクレード間の遺伝子消失と水平遺伝子移動の複数回繰り返されたイベントの結果であることを示唆している。
同系統は微生物形質の濃縮と関連しており、ヒトでは破壊されている。
宿主と微生物間の同系統のパターンは、密接な相互作用、あるいは極端な場合には相互依存、そして共進化の軌跡による一致した代謝経路から生じる可能性がある。厳しい選択基準を用いて、SGB系統樹の209サブツリーを共系統解析にかけた（Methods参照）。サブツリーは、UHGGv2カタログの77のSGBに加えて、データセットに存在する46ファミリー、945（28.8％）のSGBにまたがる。共系統シグナルを検出するために、Mantel-testベースのフレームワークと並べ替えを使用した42, （詳細はMethodsを参照）。すべての並べ替えで平均P値＜0.05に基づいて同系統候補を定義したところ、209サブツリー中56サブツリー（26.8%）が同系統パターンを示すと認定された（Suppl. Data 14）。これらのサブツリーは、解析に含まれる1051個のSGBのうち312個（30.7％）をカバーし、5345個のヒト科SGBのうち5.84％をカバーしている（ManaraらのSGBを除く）。すべての結果とサブツリーはオンラインで検査できる(https://mruehlemann.shinyapps.io/great_apes_shiny_app)。共系統シグナルを持つサブツリーを視覚的に検査することで、例えばクリプトバクテロイデス属のサブグループ（図5a）のように、宿主系統に従わない微生物系統の候補が多数見つかる。このようなシグナルは、同じ属の宿主姉妹（亜）種が利用できないヒト由来配列のトポロジー的不一致にもかかわらず、ゴリラとパンのクレード内の共系統形成が統計的に有意なマンテル検定をもたらす可能性があることを示唆している。
図5：ヒトと非ヒトアフリカ類人猿の系統樹。
図5
a マンテル検定に基づく共系統解析で有意な結果が得られたグループのサブツリー系統樹。先端の色と形は宿主のサブグループに対応する。樹木は関連ファミリーからランダムに選択したアウトグループ（図示せず）に根付かせた。 b 解析で少なくとも10個のSGBを用いた微生物ファミリー全体での共系統パターンの濃縮と枯渇。バーは図1の色に対応する門ごとに色分けされている。塗りつぶしたバーは、有意な（QFisher<0.05、両側）濃縮と枯渇を示す。破線はすべてのSGBにわたる平均的な同系統比率を示す。 c 宿主サブグループ間で同系統パターンを持つSGBのサンプルごとの比率を宿主サブグループごとに色分けした。d コフィロジーのシグナルと関連してインシリコで推定された43の微生物形質、ゲノムサイズ、遺伝子数の濃縮（青）と枯渇（赤）。SGBの系統的関連性を考慮した混合効果ロジスティック回帰による効果量とP値。横線は有意なボンフェローニ調整P値のしきい値を示す（両側）。 e 9つの系統におけるSGBレベルの遺伝子数を、同系統シグナルの有無（青）と有無（赤）でグループ分けした。門内差は両側ウィルコクソン順位和検定で評価した。 f SGBによる推定D-キシロース利用の有病率を系統間で比較し、同系統シグナルの有無（青）と有無（赤）でグループ分けした。有病率の門内差は両側フィッシャー検定を用いて評価した。同系統シグナルが陰性および陽性の系統内のSGBのグループサイズは、x軸のラベルに示されている（n = neg/pos）。 g 120個のGTDBマーカー遺伝子（左）とgyrB配列（右）に基づくビフィズス菌の最尤系統樹のタンングルグラム。先端の色と形は宿主サブグループに対応する。すべてのパネルにおいて、星印は有意水準を示す： * p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001。正確なP値は補足データ14-16から得ることができる。すべての箱ひげ図は以下の要素を示している：中央線：中央値、箱ひげ：上下四分位数、ひげ：1.5×四分位数間： 1.5×四分位範囲。
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テストしたサブツリーのうち149個（71.3%）にヒト由来ゲノムが見つかり、そのうち38個（25.5%）が同系統候補であった。同様に、ヒト由来の代表ゲノムを持たないテストされたサブツリー60個のうち18個（30％）が、例えばW0P29-013属のように、同系統シグナルを示した（図5a）。全体として、ヒト由来SGBの21.8%（n = 377個中82個）が共系統サブツリーで見つかったが、これはNHA由来SGBの35.7%（n = 647個中231個）に比べて有意に少なかった（PFisher = 2 × 10-6）。共系統シグナルは、共系統パターンを示す木のSGBと解析に含まれるファミリーの全SGBの比率に基づいて定義され、強く異なっていた。6ファミリーは過剰な共系統シグナルを示し、9ファミリーは有意な枯渇を示した（QFisher、FDR < 0.05；図5b、Suppl. Data 15）。最も高い共系統比を示したのはDialisteraceaeで（Cophylo-Ratio = 100%, Q = 4.61 × 10-7）、この解析ではDialister属の14個のSGBがすべてを代表していた。Dialisterは腸内細菌叢の中でよく見られるが、どちらかというと無視されてきたメンバーであり、様々なヒトの疾患によって増加43,44したり減少45したりすることが分かっている。しかし、Dialister invisusの1種は、大規模なメタアナリシス46において、ヒトの母子間や家庭内で中程度に感染することが判明した。最も強い減少が見られたのはLachnospiraceae科とTreponemataceae科などで、前者はこのクレードに関する以前の結果を裏付けるものであった13。後者のTreponemataceae、特にTreponema D属は、ヨーロッパに住むヒトで枯渇が見られ、嫌気性堆積物47に生息し、ヒトやNHPへの感染の（中間的な）リザーバーとなっている。
宿主グループを比較すると、すべてのヒトサブグループにおいて、NHA宿主と比較して、同系統シグナルを持つSGBの割合が有意に減少している（すべてQWilcoxon < 0.05；図5c）。さらに、ドイツとデンマークのヒトは、アフリカの2つのヒト集団と比較して（QWilcoxon <0.05）、同系統のSGBの割合がさらに低かったが、互いにそうではなかった（PWilcoxon = 0.68）。アフリカのヒトのサブグループは、その同系統比率に違いはなかった（PWilcoxon = 0.096）。これらの結果は、ヒトの腸内細菌叢において、地理的起源とは無関係に野生の類人猿に関連するクレードが消失していること、また環境やライフスタイルの変化に伴って新しい微生物パートナーが導入されていることを示唆しており、これまでの解析で得られた知見を再度確認するものである。
共分岐のシグナルは、宿主との強い関連と適応の可能性を示唆しており、ゲノムサイズと遺伝子含量の減少は、このプロセスに関連する予想されるパターンである48。このようなプロセスが我々のデータセットで検出できるかどうかを調べるために、ゲノムサイズと遺伝子数、およびゲノムレベルのアノテーションから推定される43の微生物形質について、系統的関連性をコントロールしながら、ロジスティック回帰を用いて共系統との関連シグナルを解析した（Methods; Suppl. Data 16を参照）。解析した45形質のうち、ゲノムサイズ、遺伝子数、複数の単糖を利用する能力、胆汁感受性を含む13形質が、同系統シグナルを示すクレードで有意に減少していた（QBonferroni <0.05；図5d；Suppl. Data 17）。門レベルの解析では、特に放線菌門、ファーミキューテスA門、ファーミキューテスC門、疣贅菌門でこの全体的な傾向が確認され（PWilcoxon <0.05）、一方、プロテオバクテリアは逆のシグナルを示した（図5d）。この逆シグナルは、例えば大腸菌に見られる宿主特異的な遺伝子の獲得によって説明できるかもしれない49。同系統のシグナルがないクレードで胆汁に対する感受性が高いことは、胆汁耐性がヒト科宿主の腸内環境への適応であることを明確に示唆している。食餌性単糖（形質： D-キシロース（図5f）、D-マンノース、マルトース、グルコース発酵物、スクロース、トレハロース、L-アラビノース；すべてQ < 0.05）。同系統のクレードにおける単純食糖の利用の枯渇は、宿主由来の複合糖質または宿主の文脈における他のエネルギー源への適応を示唆しているのかもしれない。
アルギニン・ジヒドロラーゼ経路（アルギニン・デイミナーゼ経路（ADI）とも呼ばれる）の1つの形質のみが、同系統シグナルに富んでいた。アルギニン代謝は宿主と微生物の相互作用の文脈で広く議論されており50、ADIは特に宿主との相互作用において細菌を酸ストレスから保護することが示された51が、宿主の免疫力を調節することも示され52、また哺乳類のコロニー形成の過程でサッカリバクテリアによって特異的に獲得されることも示され53、ヒト科動物の同系統と関連する可能性が確認された。これまでの解析では、胞子形成菌群は腸管外で生存する能力があるため、宿主間での分散が容易であり、同系統パターンを示す可能性は低いことが示唆されていた10,13,54,55。しかし、この形質のアノテーションは2つの系統（ファーミキューテス類とファーミキューテスA類）のみに限定され、またこれらの系統内でもまれで、データセット全体で54のSGBにしか見られなかった。従って、これらの結果がこれまでの知見と矛盾するかどうかは、今回の分析では結論づけられず、今後焦点を絞った分析が必要である。
バクテロイデス科の157のSGBのうち67が、同系統シグナルを持つサブツリー内に見つかった（Co-pylogeny-Ratio = 43.5%）。しかし、ビフィズス菌科では厳密な同系統の証拠は見いだされず（解析ではnSGB=10、同系統シグナルを持つものはなし）、同じ報告13からの知見と矛盾している。メタゲノム由来のgyrB配列の系統樹とビフィドバクテリウム属のGTDBマーカー遺伝子の系統樹を比較すると、両アプローチの間に明らかな矛盾があり（図5g）、これが今回の解析とこれまでの知見の違いを説明していると考えられる。
考察
ここで我々は、アフリカの野生類人猿とヒト集団由来の糞便メタゲノムデータセットとしては最大規模のキュレーションを行った。そのために、ゴリラ（Gorilla gorilla; Gorilla beringei beringei）、チンパンジー（Pan troglodytes verus; P.t. troglodytes; P.t. schweinfurthii）、ボノボ（Pan paniscus）、およびアフリカとヨーロッパのヒト集団など、野生のヒト以外の類人猿の糞便から高品質な微生物ゲノムを調査し、再構築した。その結果、微生物群集と宿主種との進化的関係が保存されていることが示された。さらに、比較アプローチを採用することで、NHAとヒトの腸内細菌叢における微生物の分類学的および機能的存在量の広範な変化を見出した。これまでの研究では、ヒトの腸内細菌叢に影響を与える重要な因子として「欧米型」ライフスタイルが指摘されてきた。今回のヒトのサンプル集団の中で、我々はヨーロッパのヒト集団に関連する原核生物のシグナルに差があることを確認することができた。重要なことは、類人猿の比較データセットを用いて、アフリカのヒト集団と比較してヨーロッパ人で失われた微生物群が、野生の類人猿集団でも見られることを示したことである。したがって、これらの分類群の消失は、ヒト科動物に関連する腸内細菌叢の進化的に保存されたメンバーの大量絶滅に至る、最後の共有祖先以来の自然な分岐の軌跡からの逸脱とみなすことができるかもしれない。このような変化を（先行研究が行ってきたように）工業化と関連付けたくなるが、これらのヒト集団間には多くの違いがあり（例えば、ゲノムの多様性、食事、運動、日光への暴露、抗生物質への暴露、集団ボトルネック）、今回のサンプリング体制では、今回サンプリングしたヒト集団間で観察された変異の原因となっている特定の要因を特定することは不可能であった。ロジスティック上の制約から、対象とした宿主および宿主サブグループの糞便サンプルの保存方法は異なっている。これらはマイクロバイオームの構成に影響を及ぼすと予想されるが、これまでの研究では、保存方法とは無関係に個々のシグネチャーが保持されることが示されている56。このような注意点があるにもかかわらず、ヒト集団間でかなりのばらつきが存在するという事実は注目に値し、ヒト関連微生物の多様性をより高解像度でサンプリングする必要性を浮き彫りにしている。同様に、我々の解析は、野生ヒト以外の類人猿の個体群間で発見されるべき未記載の微生物多様性がさらに存在することを示唆している。
異なるヒト集団に関連する分類群のゲノムにおいて、濃縮または枯渇している個々の遺伝子や機能を同定するためのパンゲノム解析において、我々は解析対象のヨーロッパ集団に関連する好気呼吸に関与する数多くの機能形質を同定した。我々は、ドイツとデンマークのヒトの糞便サンプルに濃縮されている分類群には、腸管内の好気性条件下で生き残る、あるいは好気性条件を利用する、クレードに依存しない能力によって、選択的優位性があるのではないかという仮説を立てた。より具体的には、これらの分類群は高濃度の酸素に耐えられるように収斂適応を遂げたと考えられる。このような好気性耐性は、微生物の体力を向上させ、細菌が高酸素濃度に耐えて粘液層を代謝し、エネルギーを得ることができる57。しかし、細菌によってこの粘液が枯渇すると、微生物の攻撃から宿主を守る重要な物理的・免疫学的バリアが減少し、宿主の上皮細胞と微生物叢が直接相互作用できるようになるため、（自己）免疫プロセスが引き起こされる可能性がある58,59。注目すべきは、工業化に伴う新規微生物の導入が、ヨーロッパの集団における糞便微生物叢の群集組成に大きな差異をもたらしたことである。従って、腸の炎症に対する感受性は、この集団に見られる特定の分類群によって増強される可能性がある。その結果、アッカーマンシア（Akkermansia）属やバクテロイデス（Bacteroides）属を含む、よく特徴付けられたムチン分解性分類群の存在量がヨーロッパ人集団で増加していることが判明した。これらの知見は、工業的な食品システムに直接アクセスできるヒト集団では、腸内細菌叢による粘液分解が増加していることを示唆する過去の報告と一致しており、先進国で観察される炎症性腸疾患の罹患率の高さと関連している可能性がある6。
比較的、いくつかの経路だけが逆方向に保存された濃縮を示し、ある種の人間社会でそれらが失われるクレード特異的なメカニズムが示唆された。特に、プレボテラ（Prevotella）という分類群は、ドイツとデンマークのサンプルでは減少しているが、ヒト科全体では保存されていることがわかった。プレボテラは、糞便微生物群集を定義するために用いられる概念であるヒト腸内細菌型のひとつを決定する主要な分類群である60。ヒトの腸内細菌叢が、このような個別のカテゴリーを用いて分類するのが最適なのか、それともむしろ動的で連続的な勾配に沿って分類するのが最適なのかについては、依然として議論の余地がある（Cheng 2019, Knight 2014）。とはいえ、これまでの報告では、工業化された食品システムにアクセスする（すなわち、いわゆる「西洋化」した食事を摂取する）個体は、一般的にバクテロイデス優位の腸内細菌型を示すことが示されている。バクテロイデス腸内細菌型は、多くの腸疾患61や腸管外炎症性疾患62と関連している。逆に、農村部や伝統的な自給自足戦略（すなわち、植物が豊富な食事を摂取する）に頼る人々は、Prevotella優位の腸内細菌型を示す傾向がある3。この腸内細菌型は、欧米社会に住む人の約20％にもみられる63。興味深いことに、プレボテラと宿主の健康に関しては、相反する報告がある。プレボテラ菌が糖代謝を改善する可能性が示されている一方で64、プレボテラ菌の多さが自己免疫疾患や腸の炎症と関連しているという報告もある65。モデル系から得られた結果から、プレボテラが自己免疫に関与している可能性が示唆されているが、これらの研究は主に無菌動物の単コロニー化に依存しているため、微生物の相互作用相手の欠如や宿主の異常な生理機能のために偏っている可能性がある65。ヒトを対象とした研究では、プレボテラ属細菌の増加と炎症性腸疾患との間に説得力のある関連性はまだ示されていない65。
ここでは、進化的な情報に基づいた枠組みを用いて腸内細菌型の概念を拡張し、進化の時間スケールにおけるヒト腸内細菌叢の構築に関与する機能的動態を解明した。このような洞察は、腸内細菌叢の変化がヒトの健康にどのような影響を及ぼすかについて、より的確な情報を与える可能性がある。我々は、プレボテラ（Prevotella）という分類群が、サンプリングされたヒト科動物の間で保存されていることを発見した。さらに、プレボテラ属の多様性はすべてのヒト科動物群に共通しており、この微生物群の進化的保存と宿主との長年にわたる相互作用を明らかに示唆している。言い換えれば、プレボテラクレードはすべてのヒト科動物の腸内微生物群集に不可欠なメンバーであることがわかった。したがって、プレボテラ腸内細菌型は、ヒトの腸内細菌叢の進化的祖先的なコミュニティー状態を表していると考えられる。プレボテラの存在量と多様性の減少は、個別の腸内細菌型というよりもむしろ、疾病リスク66や微生物叢不全症候群67の重要なバイオマーカーと見なされる可能性がある。宿主の健康と炎症におけるプレボテラの役割に関して、この多様な分類群を詳細に分析・評価するためには、さらなる研究と大規模な菌株コレクションが必要である。そのような研究は、プレボテラ属を相互作用する微生物の複雑なコンソーシアムのメンバーとして、また慢性炎症性疾患におけるプレバイオティクスやプロバイオティクスの介入の潜在的な標的として考慮する必要がある。
最後に、ヒトの糞便サンプルから得られた高品質のメタゲノム集合体のカタログと既存のデータを活用し、サンプリングされた宿主間の共系統パターンを調査した。全体として、共系統はクレード特異的な濃縮と枯渇を示した。加えて、ヒト由来のMAGは、NHA由来のMAGに比べて、共系統群の中で有意に少ない頻度で検出された。我々はグローバルな参照データセット24からヒト由来データを含めたので、この効果はヒトマイクロバイオームメンバーを網羅的にカバーしていないことによるアーチファクトとは考えにくい。共分岐遺伝学的パターンを持つ細菌の間で、いくつかの微生物形質が減少していることがわかった。その中には、予想通り、ゲノムサイズと遺伝子数の減少、胆汁に対する感受性、複数の単純炭水化物の利用があった。これらの減少は、ヒトの腸に住み着き、宿主由来の複雑な炭水化物を利用する微生物の特殊性を反映している、というのが我々の仮説である。
我々の研究には限界がある。共系統解析はショットガン・メタゲノミック・シーケンス（MAGs）から回収したゲノム配列に大きく依存しているが、これは汚染されている可能性があり、不完全であるため、ツリー構造、ひいては共系統推定値に偏りが生じる可能性がある。MAGの潜在的な欠点に対処するため、我々は厳格なデータ処理パイプラインと品質管理を実施し、高品質のMAGと、潜在的なゲノムギャップを減らすために代表的な種ごとに複数のMAGからの情報を組み込んだ宿主特異的な汎ゲノムベースの機能アノテーションフレームワークを実現した（Methods参照）。さらに、解析に含まれるヒト科宿主の分岐時期について、一般的に用いられている推定値では、共有祖先からの分岐時期を800万～1900万年前としている25,68。細菌の種分化は1,000万年から1億年、あるいはそれ以上の時間枠で起こる69,70,71。従って、ヒト科動物の同系統は微生物種内、あるいは場合によっては属内で観察されると予想される。今回のデータセットでは、宿主属間のMAGの種レベルでの共有は低かった（1.68％；1,787個の再構築されたSGBのうちn＝30、ManaraらとUHGGv2は含まず）。SGBは95％平均ヌクレオチド同一性で定義され、一般的に適切とされる尺度であるが72、それでもクレード特有のバイアスがかかりやすく、宿主のライフスタイルの（進化的な）変化に伴う種分化ダイナミクスの変化73、すなわち個々のマイクロバイオーム内での遺伝子の水平移動（HGT）の増加が以前に実証されていることにさらに影響される可能性がある8。このような潜在的なバイアスを考慮し、共系統検定に含めるサブグループの属レベルのアノテーションを共有する閾値を緩和し、一方、厳格な包含基準を定義することで検定するサブ系統の数を最小限に抑えた（Methodsを参照）。このような考慮にもかかわらず、ホミニッド間の同系統のシグナルが観察されたことは、ロバストな統計的枠組みによって裏付けられている。
さらに、ヒトとアフリカの類人猿に焦点を当てたことに起因する限界もある。これらの宿主クレード間の比較は、（進化的に）むしろ最近の適応と宿主間の分岐を詳細に調査するための枠組みを提供する一方で、以前報告されたヒトの腸内細菌叢がネコ科動物の腸内細菌叢に収斂していること17のような、より広範な規模の調査によって明らかにされる可能性のあることを無視する可能性がある。しかしながら、我々の解析は、パンとホモの腸内細菌叢が最後の共通祖先以来歩んできたユニークな軌跡の影響を示している。
これにより研究者たちは、近縁的な影響と進化的な影響の両方を考慮した視点から、微生物に関連した炎症性疾患を評価することができるようになる。今後の研究では、霊長類の宿主内、あるいは宿主間で起こる水平的遺伝子転移の詳細な解析を検討し、微生物の種を超えた動態や移行にさらに光を当てる必要がある。しかし、このような解析には、微生物の単離ゲノムか、少なくとも検出事象の信頼性を高めるためのロングリード配列決定データが必要である。さらに、同じ生息環境を共有する宿主グループ、例えばG. g. gorillaとP. t. troglodytesの時系列データは、単一時点のデータでは適切に解明できない、種を超えた共有動態に関するさらなる洞察を与える可能性がある。
まとめると、我々はヒトとアフリカの類人猿の腸内における、約1000万年にわたる進化と宿主-マイクロバイオーム相互作用にまたがる、ヒト科動物に関連する糞便群集の詳細な分類学的・機能的記述と分析を行った。西洋的なライフスタイル、より正確には工業化に伴うヒトの腸内細菌叢の変化が、マイクロバイオーム不全症候群の原動力であることが以前に示唆されている。この症候群では、迅速に適応する微生物叢とゆっくりと進化する宿主遺伝子との不適合が、メタボリックシンドローム、2型糖尿病、炎症性腸疾患などの慢性炎症性疾患を引き起こす6,74。したがって、本明細書で示すような進化の力を考慮したヒトとNHA腸内細菌叢の比較解析は、ヒトに関連する微生物叢の理解を進め、慢性炎症性疾患を予防・治療するための個別化された標的介入の開発を導く強力な基盤となる。
研究方法
倫理と包括声明
ヒト試料を用いた研究に関する倫理的承認は、ドイツ・キール地方倫理委員会（参照番号A156/03）、イボリアの倫理委員会（Comité national d'éthique et de la recherche [CNER]、許可番号101 10/MSHP/CNER/P）、およびコンゴの倫理委員会（Comité d'Éthique, Ministère de l'Enseignement Supérieur et Universiaire、許可番号ESO/CE/018/11）から得た。ヒトが参加する研究で行われたすべての手順は、機関および／または国の研究委員会の倫理基準、および1975年のヘルシンキ宣言とその後の改正、または同等の倫理基準に従っていた。
アフリカの野生に生息する類人猿のサンプリングは、以下の組織から許可を得て実施した。ブウィンディ・インペネトレイブル・フォレスト国立公園、ウガンダ（ゴリラ・ベリンゲイ・ベリンゲイのサンプリングのため）： マウンテン・ゴリラの調査は、ウガンダ野生生物局、コンゴ自然保護研究所、ルワンダ開発委員会、国際ゴリラ保護計画、マックス・プランク進化人類学研究所、公衆衛生を通じた保全、マウンテン・ゴリラ獣医プロジェクト、熱帯林保全研究所、ダイアン・フォッシー・ゴリラ基金によって実施され、ウガンダ国立科学技術評議会およびウガンダ野生生物局の規定と許可を遵守して実施された。
ウガンダ、ブドンゴ森林保護区（Pan troglodytes schweinfurthii のサンプリング）：ウガンダ国家科学技術評議会およびウガンダ野生生物局。
ココロポリ・ボノボ保護区（Pan paniscusのサンプリング）、コンゴ民主共和国：Ministere de Recherche Scientifique et Technologie（コンゴ民主共和国科学技術省）；
ロアンゴ国立公園、ガボン（ゴリラ・ゴリラおよびパン・トログロディテス・トログロディテスのサンプリング）：ガボン国立公園局、国立科学技術研究センター（Centre National de la Recherche Scientifique et Technique of Gabon
コートジボワール、タイ国立公園（Pan troglodytes verusのサンプリング）：コートジボワール高等教育・科学研究省、コートジボワール湖沼省、Office Ivoirien des Parcs et Réserves。作業は、Centre Suisse de Recherches Scientifiques en Côte d'IvoireとTaï Chimpanzee Projectのスタッフの支援を受け、マックス・プランク協会の倫理評議会の承認を得た（2014.4.08）。
研究の実施に貢献し、著者資格を満たすCIVとコンゴ民主共和国の研究者が共著者として含まれた。アフリカのサイトでの研究は、謝辞のセクションに記載されているように、現地のパートナーとの協力のもと、現地の当局の許可を得て、現地の方針に同意して実施された。野生に生息し、慣れ親しんだ動物の糞は、排便後に動物に干渉することなく採取した。類人猿の生息地での調査は、類人猿の疾病リスクを最小化するため、IUCNのガイドラインに従って行われることが多くなった。分析においては、性差や性別の影響を考慮した層別化や補正は行わなかった。我々の解析は、異なるヒト科動物種間、あるいはヒトの発育指数に差がある集団から得られたヒトサブグループ間の腸内メタゲノムの比較に焦点を当てている。この文脈では、性別や性差の影響は無視できると予想されるため、今回の解析ではこれらの要因については調査していない。
糞便サンプリング、DNA抽出、データ作成
アフリカの野生に生息する類人猿とヒトのサンプリングは、以下の場所で行われた： ブウィンディ・インペネトレイブル・フォレスト国立公園、ウガンダ（ゴリラ・ベリンゲイ・ベリンギ、パン・トログロディテス・シュヴァインフルティ）、ココロポリ・ボノボ保護区とサロンガ・スド国立公園に隣接する村々、コンゴ民主共和国（パン・パニスカス、ヒト）、ロアンゴ国立公園、ガボン（ゴリラ・ゴリラ、パン・トログロディテス・トログロディテス）、タイ国立公園と隣接する村々、コートジボワール（パン・トログロディテス・ヴェルス、ヒト）。ヒト（n = 48）および野生霊長類（n = 109）から糞便を採取する手順については、以前に記述されている15。簡単に説明すると、糞便サンプルは排便直後に採取し、地域のインフラに応じて、RNAlaterに保存して-20℃で凍結するか、クライオチューブに保存してフィールドラボに戻るまで魔法瓶で冷却し、その後液体窒素でスナップ凍結した。野生の霊長類を対象とした研究を実施するための適切な政府許可と許可を、関係当局から得た（サイトごとの詳細は謝辞を参照）。コンゴ民主共和国のヒト糞便サンプル（n = 12）はRNAlaterで保存し、-20℃で凍結した。コートジボワールのヒト糞便サンプル（n = 12）はクライオチューブに保存し、フィールドラボに戻るまで魔法瓶で冷却し、その後液体窒素でスナップ凍結した。ドイツのヒト糞便サンプルは、参加者が自宅で標準的な糞便採取チューブに採取し、研究センターに郵送し、-80℃で保存した。糞便サンプルからのDNA抽出は、200 mgの便を0.70 mmガーネットビーズチューブ（Qiagen）に移し、1.1 mLのASL緩衝液を加え、その後SpeedMill PLUS（Analytik Jena AG）で50 Hz、45秒間ビーズビートを行った。サンプルを95℃で5分間加熱し、遠心分離して上清を200μl残し、QIAcubeシステム（Qiagen）で自動化されたQIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen）を用いて、製造元のプロトコールに従ってDNA抽出を行った。DNA品質はQubitおよびGenomic DNA ScreenTape（Agilent）で評価した。イルミナNextera DNA Library Preparation Kitを使用してショットガンメタゲノムライブラリーを構築し、その後、HiSeq 2500プラットフォームで2×125 bpリード、またはNovaSeq 4000マシン（イルミナ）で2×150 bpリードでシーケンスした。
データ処理、アセンブリー、メタゲノムビニング
生のシーケンスFastQファイルは、BBMapソフトウェアスイート75を用いて品質管理および前処理を行った。ホストリードはbbmap.shを用いて除去した。ヒト参照データベース76をマスクし、95%同一性という緩やかなマッピングしきい値を用いて、パンおよびゴリラ宿主からの宿主コンタミネーションも捕捉し、より広い宿主範囲を考慮した。メタゲノミックコンティグをmetaSPAdesでアセンブルし、2000 bp以上のコンティグを保持した77。リードはMinimap278を用いて各サンプルのコンティグにマッピングし、Samtools79を用いてBAMファイルに変換し、MetaBAT2 binning tool80のjgi_summarize_bam_contig__depthsバイナリを用いてコンティグごとのマッピング深さを推定した。個々のサンプルのコンティグビニングは、MetaBAT280、MaxBin281、CONCOCT82を用いて行った。さらに、VAMBビニングツール83を、各宿主グループ内の全サンプルからのマージされたコンティグのクロスマッピングカタログに使用した。個々のビニング結果は、MAGScoT23を使用して精緻化し、各サンプルについて高品質のメタゲノム集合ゲノム（MAG）を取得した。MAGの種レベルのゲノムビン（SGB）へのクラスタリングは、MAGの低品質によるSGBの膨張を制御するために、多段階アプローチでdRep84を用いて実施した。まず、MAGを各宿主グループ内で97％の類似度まで非複製化し、最も高いスコア（完全性とコンタミネーションに基づいてMAGScoTで計算）を持つMAGをクラスター代表として選択した。次に、UHGG v2からの代表配列とともに、すべての宿主グループからの高品質および良質な代表配列（スコア> =0.7）を、dRepを使用して95%のSGBにクラスタリングし、再び最高品質のMAGを代表として選択した。前のクラスタリングステップからの中品質（スコア0.5～0.7）の97%代表を、次にfastANI72を用いてSGB代表と比較し、高い類似性（>=95%）を持つMAGをそれぞれのSGBに割り当てた。高品質のSGBライブラリにヒットしない中品質の97%代表は、次に95%SGBにクラスタリングされ、クラスタ内の少なくとも2つのゲノムの場合にカタログに追加され、シングルトンクラスタは破棄された。SGB代表の最終カタログは、メタゲノムモード85のSalmonを使用して、全サンプルのコンティグアバンダンスを定量するために使用された。分類学的アノテーションは、GTDBtk (v2.1)とGTDBリリース207v286,87を用いて行った。属および/または種レベルの割り当てがないSGBについては、SGB IDを分類学的ラベルとして使用した。GTDBtkのマーカー遺伝子のアラインメントは、GTDBtkのそれぞれの "infer "機能を使用して、すべてのSGB代表の系統樹を作成するために使用した。全てのデータ処理スクリプトはオンラインで入手可能。https://github.com/mruehlemann/greatapes_mgx_scripts
Pangenomeカタログの作成、アノテーション、解析
全てのMAGはprodigal (v2.6.3)88を用いてコーディング配列のコールを受けた。タンパク質配列はMMseqs89,90を用いて95%の類似性に基づいてクラスタ化され、eggNOG-mapper v291アノテーションツールのemapper.pyスクリプトを用いてeggNOG 5.0参照データベース92を用いてアノテーションされた。KEGGオルソログアノテーションに基づくMAGレベルの機能プロファイルは、各宿主属（ホモ、ゴリラ、パン）のSGBレベルのパンゲノムに折りたたまれた。ある宿主属からSGBのMAGが回収されなかった場合、メタゲノムデータから回収されたMAGを持つそれぞれのSGBの全ての宿主特異的パンゲノムに機能が存在する場合、その機能は存在するとみなすことで、推論されたアクセサリーゲノム／機能における宿主特異性を考慮し、他の宿主グループにわたるMAGから機能プロファイルを推論した。
微生物クレードおよび機能量の計算
下流のデータ処理と統計計算はすべてR v4.293でtidyverseライブラリ94を用いて行った。SGBの存在量を推定するために、SalmonからのSGB代表のサンプルごとのコンティグ存在量を使用した。Salmonの出力には、コンティグあたりの総マッピングリードと、ライブラリーのサイズと総シーケンス深度で調整したマッピングリードが、トランスクリプトミクス分野の指標であるTPM（transcripts per million）として含まれており、メタゲノムライブラリーに直接転送することができます。個々のコンティグカバレッジは、マッピングリード数とSalmonマッピング出力の有効長から計算し、カバレッジ10%以上のコンティグを存在するとみなした。SGBは、その全長の少なくとも20%が「存在」とマークされたコンティグに含まれ、少なくとも1,000リードと250TPMがマップされた場合に存在するとみなされた。最終的なSGBの存在量は、それぞれのサンプルに存在するSGBにマッピングされたリードから計算されたTPMとして計算された。SGBの存在量と分類学的割り当てを組み合わせ、ドメインレベルから種レベルの存在量を、それぞれの分類学的ビン内の累積TPM存在量として計算した。レアファクションは、100k、250k、500k、1M、2.5M、5M、10Mのコンティグレベルのマップされたリードの5倍反復サブサンプリングに基づいて計算され、その後、上記のようにTPM計算が行われた。TPMを行わず、リードをレア化することで、特にライブラリーサイズが小さいサンプルに影響するSGBの低カバレッジや低存在によって生じるサンプリング効果をリアルにシミュレートした。コミュニティレベルの機能プロファイルは、SGBのTPMアバンダンスとそれぞれのSGBの宿主-属特異的機能プロファイル（KEGGオルソログ[KOs]の存在）を掛け合わせ、SGBごとの値を機能注釈のサンプルレベルのアバンダンスに要約することで計算した。最終的に、個々のKOの機能アバンダンスは、それぞれのKOを持つSGBの累積TPMアバンダンスを表す。
アルファ多様性とベータ多様性
R96用picanteパッケージのpd()関数を用いて、GTDBtkマーカー遺伝子に基づく系統樹から計算した。これまで検出されていなかったSGBによる属レベルのPD増加は、これらのSGBがそれぞれの属としてアノテーションされているPDとされていないPDの差から計算した。サンプルレベルのPDはSGBの有無パターンから計算した。β多様性は、R98およびSGBの存在量とGTDBtkマーカー遺伝子に基づく系統樹を入力として、phyloseqパッケージのUniFrac()関数を用いて、重み付けなしUniFrac距離97および重み付けUniFrac距離97として評価した。Aitchison距離99は、R100用のcompositionsパッケージのclr()関数から得られたCLR変換された属レベルのTPM存在量から計算し、すべての存在量に1の擬似カウントを加え、ゼロ以下のCLR変換された存在量をすべてゼロとした。Jaccard距離101は、R102のveganパッケージのvegdist()関数を用いて、属レベルの存在/不在パターンについても計算した。SGBは宿主特異性が高いため、単純に宿主排他的なSGBのために高いβ多様性を導くであろうし、属レベルでのグループ化はこれを防ぎ、UniFrac距離はSGB間の系統的関係を使用するため、属レベルの存在量がAitchisonとJaccard距離のために選ばれた。機能的存在量のβ多様性は、対数変換したKO存在量のユークリッド距離から計算し、不定値を避けるために仮数1を加えた。KOの存在-非存在値は上記と同様に扱い、Jaccard距離を使って一対の距離を推測した。
クロスホストシェアリング解析
宿主グループ間のSGBの過剰共有と減少共有の置換ベースの解析は、SGBの豊富さとグループごとのサンプルサイズに影響を与えるライブラリーの深さの違いを考慮するために、1Mのマッピングされたリードの5つのレアファクションの平均SGB存在量に基づいて行われた。各宿主グループについて、このグループから5サンプルの100倍サンプリングが抽出され、宿主で見つかったSGBは、他の宿主グループの各5サンプルのランダムなサンプルでの存在について分析され、Relshared = nSGB,shared / nSGB,hostとして共有SGBの相対量を計算した。全100サンプリングの平均値を、両方向の全宿主対の相対共有係数として用いた。過剰共有と減少共有は、宿主グループの違いを考慮した5つの無作為サンプルを1000回抽出して、すべての宿主グループとの相対共有について上記の計算を繰り返すことによって分析した。P値は、無作為サンプリングが真の共有係数を上回った／下回った割合から計算した。
系統共生分析
Phylosymbiosisは、コミュニティレベルの多様性、加重なしUniFrac、加重ありUniFrac、属レベルのAitchison、およびJaccard距離、ならびにKEGGオーソログ（KO）存在量ベースのAitchison距離の5つの尺度を用い、Brooksら（2016）に記載されたアプローチに従って評価した。簡単に説明すると、宿主グループの違いは、UPGMAクラスタリングによってマイクロバイオームのデンドログラムを推論するために使用された。ブランチサポートは1000倍ジャックナイフサンプリングから算出した。R103のphangornパッケージのRF.dist()関数を用いて、マイクロバイオーム樹と宿主の系統樹間のRobinson-Foulds距離を算出した。宿主系統樹と100,000本のランダム樹を用い、マイクロバイオーム樹の比較として系統共生の有意性を評価した。R104のggtreeパッケージとcowplotパッケージでタングルグラムを作成した。
グループ間の存在量の違いの評価
ヒトとNHA間、および工業化システムの外部と内部で生活するヒト間の分類学的存在量の差は、マイクロバイオームデータの組成性を考慮するためにCLR変換した存在量に基づいている105。宿主群の少なくとも1つにおいて、有病率が20%を超え、相対存在量（CLR変換前）が0.1%を超えるすべての属と、宿主群の少なくとも1つにおいて、有病率が20%を超え、CLR変換後の存在量が1を超えるすべてのKO存在量が計算に含まれた。
KOの存在量はそれに応じてフィルターにかけられ、その後、歪みの少ない分布を得るために（log+1）変換された。対数変換が選択されたのは、CLR変換がデータの組成性を仮定しているためで、これは分類学的存在量の場合とは異なり、機能的存在量では満たされない。存在量の差は、各分類群（または機能）について、従属変数として存在量、説明変数としてヒト／NHAおよびヨーロッ パ／アフリカの2分法を用いたR93の線形回帰で評価し、すべてのグループとの関連を一度に評価した（モデルはlm(abundance ~ Human + European)と定義）。P値は、summary.lm()関数を用いて、得られたモデルのt値から計算した。対数倍差はグループ平均存在量と0.01の仮数を用いて計算した。P値はBonferroni補正を用いて多重検定用に調整した。NHAと有意に(Q < 0.05)正の関連を持つ特徴は "NHA associated "としてグループ化された。地理的差異（ヨーロッパ/アフリカ）に関連する特徴は、正に関連するそれぞれのグループに分類した。ヒトとNHAとの間に有意な差があるが、特定のサブグループとは差がない残りの属は「ヒト関連」としてグループ分けした。これらの比較のいずれにおいても存在量に差のない属は、「不変」または「その他」としてグループ分けした。
グループ間の機能的パンゲノムの違い
ヒトに関連するSGBのパンゲノムカタログを、地理との強い関連性とは無関係に、他のヒトに関連する分類群と比較してヨーロッパのコミュニティで豊富であることが見出された分類群のSGB間で微生物ファミリーの中で比較した。KEGG Ontology（KO）の用語アノテーションを機能グループとして使用し、グループ間の有病率の差をフィッシャーの正確検定を用いて評価した。KOのファミリーごとの効果量（Zスコア）はPFisher値から計算し、効果の方向は2つのグループの有病率の比のlog2と0.01の擬似カウントを用いて評価した。Zスコアの合計を加算し、それぞれのKOが発見されたファミリーの総数の平方根で割って、各KO項のZMetaを求め、PMetaの計算に使用した。PMeta値はホルム補正を用いて多重検定のために調整した。Q < 0.05のKO項が、解析対象の微生物ファミリーのうち少なくとも2つに存在する場合、有病率の差のある機能とみなした。NHPとヒトに関連するSGB間の機能的差異を評価するために同様のアプローチが採用されたが、この場合、SGBパンゲノムの差異は属レベルで比較され、メタ解析はすべての属からのシグナルを組み合わせて、特に特定の系統内の属間で行われた。
ツリー照合解析
emapper/eggNOGアノテーションで "Prevotella"（シトクロムbdオキシダーゼサブユニット1）というアノテーションが付けられたPrevotella属の代表的なSGBからタンパク質をunclustered protein sequence catalogから抽出した。アウトグループとして含まれるParaprevotella claraについても同様の手順で行った。不完全なcydA配列は200の長さの閾値を使って取り除いた。タンパク質配列はClustal Omega106を用いてアライメントした。IQTREE2107と自動モデル選択の結果、ベイズ情報量基準（BIC）に従ってLG + F + R8モデルが最良適合モデルとして選択された。分岐支持値はUFBoot108を使用して計算し、SH-aLRT検定109を実施した。Prevotella SGBsとParaprevotella claraのGTDBtkマーカータンパク質配列のアラインメントは、cydA配列について上述したのと同じ方法でゲノムレベルの種系統を再構築するために使用した（BIC best-fit: LG + I + I + R5）。RANGER-DTL2.0ソフトウェア110のOptResolutions補助プログラムを用いて、cydA系統樹の確信度の低い枝（ブートストラップサポート30%未満）を種樹とともに解決し、デフォルト値（重複：2、損失：1、転移：3）を用いて重複-転移-損失コストを最適化した495本の等確率樹を得た。無作為に選ばれた出力樹は、頑健性を評価するため、RANGER-DTL 2.0の種樹と、デフォルト値と1000個のランダムな開始種を用いて、並行して照合分析に用いられた111。サンプリング結果はRANGER-DTL 2.0ソフトウェアパッケージのAggregateRangerツールを使ってまとめた。損失および転移イベントのグローバルな比較のために、全てのPrevotella遺伝子を、(1) 'PreferredName'アノテーションを持ち、(2) Prevotella SGBの少なくとも20%で見つかり、(3) ゲノムあたりシングルコピーのみで、751遺伝子を選択した。損失および転移事象は遺伝子の有病率に影響されるため、平均損失および転移頻度は、それらが見出されたSGBの総数で割ることによって標準化した。
微生物の表現型と同系統シグナルとの相関
SGBの代表ゲノム配列をTraitarツール113を用いて解析し、最大67の微生物形質を推定した。同系統解析に含まれる1017個のSGBのうち、50個以上および1017-50＝967個未満に存在する43個の推定形質について、同系統シグナルとの関連を解析した。Rパッケージlme4qtl114を用いて、各形質について、1017個のSGBについて、共分類のシグナル（二値形質）を従属変数とし、形質をバイネレイ固定効果説明変数とする混合ロジスティック回帰モデルをフィッティングし、モデルにランダム効果として関連性行列と門レベルカテゴリーを含め、リンクとしてプロビットを用いたバイノーマル関数を用いることにより、SGB間の系統学的・分類学的関連性を考慮した。関係行列は、SGBの系統樹からコフェネティック距離行列を用い、その最大距離で割ることにより0から1の間の値にスケーリングして算出した。したがって、ゲノムサイズ（メガベース）と遺伝子数（プロディガル出力中の遺伝子数）は、固定効果連続形質として含まれた。個々のモデルのエフェクトサイズとP値はRのsummary()関数から得た。D-キシロース利用率および遺伝子数における、共分岐シグナルを持つSGBと持たないSGBの間の例示的な門レベルの差は、それぞれノンパラメトリックなフィッシャーの正確検定およびウィルコクソンの順位和検定を使用して算出した。
統計と再現性
すべての統計計算はR v4.293でtidyverseライブラリ94を用いて行った。使用した統計検定はそれぞれのサブセクションに示す。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。種レベルの微生物代表のライブラリーへのマッピング率が低い（1,000,000リード以下）サンプルを解析から除外した。P値＜0.05は統計的に有意とみなし、解析に応じて調整または未調整のいずれかとした。実験は無作為化されていない。治験責任医師は、実験中および結果評価中の割り付けについて盲検化されていなかった。
報告の要約
研究デザインに関する詳細は、本論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
すべてのメタゲノムシーケンスデータはNCBI BioProject accession ID PRJNA692042, PRJNA539933, PRJNA491335から入手できる。7700のメタゲノム集合ゲノムのコレクションは、European Nucleotide Archive, Accessionに寄託されている： PRJEB68160。ソースデータは本論文で提供している。
コードの利用可能性
発表された結果と原稿の図を生成するためにシーケンスファイルを処理するコードはすべて、https://github.com/mruehlemann/greatapes_mgx_scripts。
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謝辞
IKMBマイクロバイオーム研究室およびNGS研究室の優れた技術サポートに感謝する。Sébastien Calvignac-SpencerとGrit Schubertには、解析と原稿への貴重な貢献に感謝する。本研究はDeutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) Collaborative Research Center 1182 "Origin and Function of Metaorganisms"（https://www.metaorganism-research.com、プロジェクト番号：261376515、プロジェクトA2とZ2；AFとJFB）の成果であり、DFG Excellence Cluster 2167 "Precision Medicine in Chronic Inflammation"（PMI、プロジェクト番号：390884018；AF）から基盤的支援を受けた。JFGはDFG助成金「霊長類ファージオームの生態と進化」（GO 3443/1-1：プロジェクト番号453352748）およびDFG研究グループ「霊長類の社会性と健康」（FOR2136; CA 1108/3-1：プロジェクト番号244372499）の支援を受けた。ココロポリでの研究は、マックス・プランク協会とハーバード大学の支援を受けた。オズーガとタイ国立公園での調査はマックス・プランク協会の助成を受けた。ロアンゴでの調査はUS Fish and Wildlife Service、Tusk Trust、Berggorilla Regenwald Direkthilfe、マックス・プランク協会の支援を受けた。ブウィンディでの調査はマックス・プランク協会の支援を受けた。ブウィンディ・マウンテンゴリラの調査は、国際ゴリラ保護計画の連合メンバーから資金提供を受け、Wildlife Conservation Societyから追加資金を得た。サンプル採集のため、これらのフィールドでの作業を促進してくれた組織に非常に感謝している： ブウィンディ - マウンテン・ゴリラの調査は、ウガンダ野生生物局、コンゴ自然保護研究所、ルワンダ開発局、国際ゴリラ保護プログラム、マックス・プランク進化人類学研究所、公衆衛生を通じた自然保護、マウンテン・ゴリラ獣医学プロジェクト、熱帯林保護研究所、ディアン・フォッシー・ゴリラ基金によって実施された； ココロポリ-Vie Sauvage、ボノボ保護イニシアティブ、ロアンゴ-Agence Nationale des Parcs Nationaux、Centre National de la Recherche Scientifique et Technique of Gabon、タイ国立公園-Centre Suisse de Recherches Scientifiques en Côte d'Ivoire、タイ・チンパンジー・プロジェクトのスタッフ。原稿執筆をサポートしてくれたテイラー・エルメスに感謝する。
資金提供
Projekt DEALによるオープンアクセス資金提供。
著者情報
著者および所属
キール大学臨床分子生物学研究所（ドイツ、キール
M. C.リューレマン、C.バング、M.グルーシン＆A. フランケ
ハノーバー医科大学医療微生物学・病院疫学研究所（ドイツ・ハノーバー
M. C.リューレマン
応用動物学・自然保護学、グライフスヴァルト大学、ドイツ・グライフスヴァルト
J. F. ゴーガルテン
ヘルムホルツ感染研究所（ドイツ、グライフスヴァルト
J. F.ゴガルテン、M.ウルリッヒ、F.H.レーンダルツ
高病原性微生物疫学、ロベルト・コッホ研究所、ベルリン、ドイツ
J. F.ゴガルテン、M.ウルリッヒ、F.H.レーンダルツ
ウイルス進化、ロバート・コッホ研究所、ドイツ、ベルリン
J. F.ゴガルテン
進化ゲノム学、マックス・プランク進化生物学研究所、ドイツ、プレーン
B. M・ヘルメス、J・F・ベインズ
キール大学実験医学研究所（ドイツ・キール
B. M.ヘルメス、M.ポイエ、J.F.ベインズ
ドイツ・キール大学人間栄養・食品科学研究所ニュートリインフォマティクス研究グループ
S. ワシナ
アラサン・ワタラ大学／ブアケ大学教育病院、医学研修・研究ユニット、コートジボワール、ブアケ
C. アクア＝コフィ
オスナブリュック大学認知科学研究所、比較生体認知（ドイツ、オスナブリュック
T. デシュナー
コンゴ民主共和国、キンシャサ、国立公衆衛生研究所、国立生物医学研究所
J. J.ムヤンベ・タムフム
ドイツ、ライプチヒ、マックス・プランク進化人類学研究所、霊長類行動進化学部門
M. M・ロビンス
米国マサチューセッツ州ケンブリッジ、ハーバード大学人類進化生物学部
M. スルベック
ドイツ、ライプチヒ、マックス・プランク進化人類学研究所
M. サーベック
認知科学研究所、CNRS UMR5229 リヨン第1大学、ブロンセデックス、フランス
R. M. ヴィティグ
タイ・チンパンジー・プロジェクト、CSRS、コートジボワール、アビジャン
R. M.ヴィティッヒ
スイス、ヌーシャテル、ヌーシャテル大学生物学研究所
K. ツーバービューラー
セント・アンドリュース大学心理学・神経科学学部（英国、スコットランド、セント・アンドリュース
K. ツーバービューラー
貢献
J.F.B.、F.H.L.およびA.F.は研究プロジェクトを立案し、C.A.-K.、C.B.、T.D.、J.-J.M.-T.、M.M.R.、M.S.、R.M.W.、K.Z.、A.F.およびF.H.L.は研究基盤の構築と維持、野外調査の実施、資料の提供を行った。M.R.、C.B.、J.F.G.、M.G.、S.W.、M.P.、J.F.B.、F.H.L.、A.F.はデータの分析を行った。原稿はM.R.、B.M.H.、C.B.、J.F.G.、M.G.、M.P.、M.U.、J.F.B.、F.H.L.、A.F.が執筆した。著者全員が提出された原稿を読み、編集し、承認した。
著者
M. C. RühlemannまたはA. Frankeまで。
倫理申告
競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Communications誌は、Katherine Amato氏、および本研究の査読に貢献した他の匿名の査読者に感謝する。査読ファイルはこちら。
追加情報
出版社からの注記 スプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
補足情報
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Rühlemann, M.C., Bang, C., Gogarten, J.F. et al. ヒト科動物における腸内細菌叢の機能的宿主特異的適応. Nat Commun 15, 326 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-023-44636-7
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受領
2023年04月05日
受理
2023年12月20日
出版
2024年01月06日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-44636-7
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