微生物による鉄の取り込みが腸の免疫寛容を促進する

哉百名


Nat Commun. 2023; 14: 2790.
オンライン公開 2023年5月15日. doi: 10.1038/s41467-023-38444-2
PMCID: PMC10185671
PMID: 37188703
微生物による鉄の取り込みが腸の免疫寛容を促進する

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10185671/

Lizhen Zhu,1,2,3,4 Geng Li,1,2,3,4 Zhixin Liang,1,2,3,4 Tuan Qi,1,2,3,4 Kui Deng,1,2,3,4 Jiancheng Yu,1,2,3,4 Yue Peng,1,2,3,4 Jusheng Zheng,1,2,3,4 Yan Song,5 and Xing Chang1,2,3,4
著者情報 論文ノート 著作権およびライセンス情報 免責事項
関連データ
補足資料
データの利用可能性に関する声明
移動します：
要旨
鉄欠乏は、炎症性腸疾患患者において最も一般的な非腸管症候群であるが、免疫寛容への影響についてはほとんど知られていない。我々は、腸内の制御性T細胞のホメオスタシスは、腸内細菌が産生する短鎖脂肪酸であるペンタン酸によって促進される、高い細胞鉄レベルに依存していたことを示すものである。主要な鉄輸送体であるTransferrin受容体1の枯渇によるTregの鉄欠乏は、腸内のTregを消失させ、致死的な自己免疫疾患をもたらす。Transferrin受容体1は、腸管Tregの主要構成要素であるc-Maf+ Tregの分化に必要である。鉄はHIF-2α mRNAの翻訳を促進し、HIF-2αがc-Mafの発現を誘導するというメカニズムである。重要なことは、微生物が産生するペンタン酸が、腸内での鉄の取り込みとTregの分化を促進することである。これにより、その後、大腸炎マウスの免疫寛容が回復し、鉄欠乏症が改善された。このように、腸における栄養素の取り込みと免疫寛容の関連性を明らかにすることができた。
主題用語 制御性T細胞、炎症性腸疾患、鉄、粘膜免疫学
このページのトップへ
はじめに
必須栄養素である鉄は、免疫系に直接影響を与える1,2。鉄欠乏症や鉄過剰症は、免疫疾患と密接な関係がある3,4。特に、炎症性腸疾患（IBD、クローン病や潰瘍性大腸炎など）5,6患者では、腸管内腔への出血の増加、腸内細菌叢の異常7、炎症反応8,9の結果として、鉄欠乏が頻繁に観察されています。さらに、IBD発症前の患者さんでは鉄欠乏が観察され10、いくつかの前向き解析では、全身の鉄分濃度がIBDのリスクと逆相関していることが示されています5,10。これらの臨床的観察から、鉄の摂取量の減少がIBDの進行に因果関係を持つことが示唆されますが、鉄のホメオスタシスが腸の免疫寛容の維持に影響を与えるかどうか、またどのように影響を与えるかは、まだ解明されていません。
鉄は、多くの酵素反応において重要な役割を果たすほか11-13、遺伝子発現を直接制御し、環境からの合図に対して細胞が迅速に反応できるようにする14-16。最もよく知られている鉄制御遺伝子は、鉄応答性エレメント（IRE）を含んでいる。IREは、鉄の恒常性に関与する遺伝子（例：トランスフェリン受容体、フェリチン軽鎖）の5'非翻訳領域（UTR）または3'UTRに見られる保存された短い幹ループのこと17. 例えば、トランスフェリン受容体は、その3'UTRに5つのIREを有している。細胞内鉄は、IREと鉄調節タンパク質（IRP1、IRP2）を含むRNA結合タンパク質との相互作用を調節し、鉄の恒常性の乱れに応答した動的な遺伝子発現を可能にする。細胞内の鉄が不足すると、IRPはIREに結合し、フェリチンやトランスフェリン受容体のような鉄の取り込みや貯蔵に関わる遺伝子の翻訳を阻害し、鉄を節約して過剰に貯蔵されるのを防ぐことができます18。逆に、鉄の量が多くなると、IRPはIREから解離し、フェリチンやトランスフェリン受容体の翻訳を可能にし、細胞が過剰な鉄を取り込んで貯蔵できるようになる。当初は鉄の恒常性維持に関与する遺伝子で同定されたが、IREは鉄の恒常性維持に直接関与しない遺伝子にも見いだされている。鉄を介した遺伝子制御が、鉄の恒常性維持以外のプロセスにおいて重要であるかは、まだ分かっていない。
制御性T細胞（Treg）は、系統転写因子Foxp319を発現するヘルパーT細胞の特殊な系統であり、腸における免疫寛容を含む自己寛容の維持に必須である20,21。従来のT細胞と同様に、制御性T細胞はさらにエフェクター細胞（エフェクターTregまたはeTreg）に分化し、その抑制機能を十分に発揮する22。この過程では、しばしば他の転写因子（例えば、T-bet、Bcl6、Gata-3、RORγt）の獲得が伴う23。これらの転写因子の多様な発現は、Tregのトランスクリプトーム、局在、およびエフェクター機能をさらに特定し、リンパ系および非リンパ系器官に存在する多様なエフェクターTregサブセットを生み出し、組織の恒常性と寛容性を維持する23。非リンパ性臓器の典型的なTregサブセットとして、腸の薄層前膜に存在するTregは、特殊な転写因子（例えば、RORγt）24-27の発現を維持するために腸内細菌叢と継続的に相互作用し、腸特有の表現型と代謝パターンを獲得して腸の恒常性を維持する28-30。マイクロバイオームが腸管Tregホメオスタシスを制御するメカニズムは、まだ十分に解明されていない。
本研究では、腸管粘膜における制御性T細胞の分化は、細胞内鉄レベルの高さに決定的に依存しており、その鉄の取り込みは、微生物叢が産生する短鎖脂肪酸（SCFA）であるペンタノエートによって促進されることを明らかにした。制御性T細胞において、Transferrin receptor I（TfR1）を特異的に枯渇させることにより、細胞内の鉄レベルが低下し、早発性の致死的自己免疫疾患を引き起こすことがわかった。非炎症条件下または急性不活性化により、TfR1欠損は腸のTreg細胞を特異的に消失させ、腸の炎症につながった。そのメカニズムは、細胞内鉄が5'-UTRに位置するIREを介して低酸素誘導因子2α（HIF-2α）の発現を促進し、HIF-2αレベルの上昇は、腸内Treg細胞の分化に重要な転写因子c-Mafの発現をさらに高める。さらに重要なことに、微生物叢が産生するペンタノエートは、腸内の鉄分調達とc-Maf+ Tregの分化を促進し、マウス大腸炎モデルにおける大腸の炎症と鉄欠乏をともに緩和した。これらの結果から、鉄代謝とTregホメオスタシスの間にこれまで知られていなかった関連性が明らかになり、栄養調達を調節することによって免疫寛容を促進する常在菌の重要性が浮き彫りになりました。
次へ
研究成果
TfR1を介したTreg細胞による鉄の取り込みは、免疫寛容の維持に重要である。
鉄欠乏が制御性T細胞や免疫寛容に与える影響を解析するため、Tfrcloxp/loxpマウス16とFoxp3YFP-IRES-Creマウス31を交配し、Treg細胞における主要鉄輸送体であるTfR1（Tfrc遺伝子によりコードされる）を特異的に枯渇させました。その結果、Tfrcfl/fl Foxp3YFP-IRES-Cre/y マウス（以降、Tfrc cKO マウスと呼ぶ）では、TfR1がTreg細胞で特異的に欠損し（図1a、補足図S1a）、誘導結合プラズマ質量分析（ICP-MS）により、細胞内総鉄量が約50％減少（8.58 ng/106細胞 vs 4.10 ng/106細胞）することがわかった（図1b）。TfR1欠損Treg細胞における細胞内鉄濃度の部分的な低下は、T細胞が非トランスフェリン結合鉄（NTBI）32,33を利用し、その取り込みがTfR1に依存しないというこれまでの研究結果と一致するものであった。
図1
Treg細胞におけるTfR1の欠損は、致死的な自己免疫の発生をもたらす。
a 3週齢のTfrc cKOマウス（Tfrcfl/fl Foxp3YFP-IRES-Cre/y mouse）とそのWT同腹子（Tfrc+/+ Foxp3YFP-IRES-Cre/y mouse）の脾臓Treg細胞（CD4+Foxp3+）におけるTfR1発現を比較する代表ヒストグラム．灰色斜線部はアイソタイプコントロール抗体による染色を表す。b 雌のTfrcfl/fl Foxp3Cre-YFP/+（Tfrc cKO Treg）またはTfrc+/+ Foxp3Cre-YFP/+（WT Treg）マウスから分離したCD25+YFP+細胞の細胞内鉄レベルをICP-MSによって決定した（WTとTfrc cKOについてそれぞれ3回の独立した実験からn = 5および3マウス） 。c Tfrc cKOマウスとWT同腹子のカプランマイヤー生存曲線。**d 3週齢のTfrc cKOマウスとそのWT同腹子の指示組織の代表的なH&E染色。データは、少なくとも3回の独立した実験の代表である。スケールバーは、100μm（皮膚および肝臓）または200μm（肺および結腸）を表す。 e CD4（上部パネル）およびCD8（下部パネル）脾臓細胞は、CD44およびCD62Lの発現を調べ、エフェクター／メモリー集団（CD44hiCD62Llo）のパーセントを示す。データは8回の独立した実験の代表である。 f 21日齢のWTマウスまたはTfrc cKOマウスからのIFNγ-、IL-17A-またはIL-4分泌CD4 T細胞のパーセンテージの要約である。(n = 5つの独立した実験から、IFNγについて7マウス；IL-17Aについて5マウス；IL-4について7マウス）。 g, h Tfrc cKOおよびWTマウスのCD4+脾臓T細胞について、6日齢（上部パネル）または21日齢（下部パネル）のいずれかで細胞内Foxp3発現を分析した。データは、少なくとも5つの独立した実験の代表（g）または要約（h）である（6日齢のマウスについてはn = 5、;21日齢のマウスについてはn = 13）。**p < 0.01, p < 0.001（両側Student's t test）。i 新生児Tfrc cKOマウスを鉄デキストランで処理した。未処理のTfrc cKOマウス、WTマウス、および鉄デキストラン処理を受けたTfrc cKOマウスのカプランマイヤー生存曲線。マンテル・コックス検定に基づく*P < 0.0001。
深遠なことに、すべてのTfrc cKOマウスは生後4週間以内に自己炎症性疾患により死亡した（図1c）。生後3週目には、Tfrc cKOマウスは、Foxp3欠損マウス（Scurfyマウスなど）34,35と同様の全身性炎症の兆候（体格の縮小、皮膚炎、細目）を示した（補足図S1b）。さらに解析を進めると、Tfrc cKOマウスでは、脾臓やリンパ節の腫大（補足図S1c）に加え、皮膚、肝臓、腸、肺への白血球の大量浸潤（図1d）が認められた。末梢臓器への浸潤白血球は主にT細胞と骨髄系細胞であり（補足図S1d）、B細胞はTfrc cKOマウスの脾臓、PBMC、骨髄、肝臓で枯渇していることが確認された。末梢におけるT細胞の蓄積は、細胞死の減少（補足図S2b）よりもむしろ、Ki-67染色（補足図S2a）によって決定される細胞増殖の増加によって主に引き起こされた。3週齢のTfrc cKOマウスでは、胸腺は重度の萎縮を示した（補足図S1e）。さらに、T細胞のエフェクター／メモリー集団（CD44hiCD62Llo）の数（図1e、補足図S1f）は、野生型（WT）同腹子に比べ、3週齢のTfrc cKOマウスでは劇的に増加した。さらに、フローサイトメトリー解析により、IL-17A、IFN-γまたはIL-4を分泌する脾臓CD4 T細胞の数がTfrc cKOマウスで著しく増加し（図1f、`図S2c）、Tfrc cKOマウスのCD8 T細胞はIFN-γレベルが上昇した（補足図S2d）。これらのデータを総合すると、Treg細胞におけるTfR1の喪失は、致命的な自己免疫炎症反応をもたらすことが実証された。
多くの重要な細胞プロセスにおいて鉄が重要であるにもかかわらず、TfR1の喪失は、免疫細胞を含むほとんどの非赤血球組織の発達を損なわない16,36,37。同様に、TfR1の欠損は、末梢におけるTreg細胞のホメオスタシスを中程度に低下させるだけであった。まだ顕著なT細胞活性化を示していない6日齢のTfrc cKOマウス（補足図S3a）では、脾臓のTreg細胞の割合が約30％減少した（10.6％から7.0％に）（図1g、h）。このような減少は、胸腺のTreg数はTfrc cKOマウスとWTマウスで同等であったため、Tregの発達障害によるものではなかった（補足図S3b、c）。3週齢のTfrc cKOマウスでは、脾臓におけるTregの割合がさらに減少しており、おそらく自己免疫疾患の進行と活性化した通常型T細胞の拡大が原因であると考えられる（図1g, h）。
TfR1は鉄結合トランスフェリンを取り込む以外にも機能する可能性があるが38、Tfrc cKOマウスの致死的な自己免疫は、選択的な鉄欠乏症のみによって引き起こされた。TfR1とは無関係に取り込まれる鉄源である鉄デキストランで処理すると、Tfrc cKOマウスは初期の致死から救済され、最大で200日間生存した（図1i）。鉄デキストランを投与したTfrc cKOマウスでは、Treg細胞（補足図S3f）および活性化/記憶T細胞（補足図S3g）の割合が、WT同腹子と同様のレベルに回復していた。これらのデータから、TfR1を介した鉄の取り込みは、生体内の制御性T細胞による免疫寛容の維持に不可欠であることが示された。
鉄はc-Maf+ eTreg細胞の分化を促進する
Tfrc cKOマウスは3週齢までに致死的な自己免疫疾患を発症したため、T細胞活性化の二次的影響の可能性を回避するために、ヘテロ接合体の雌性Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+ マウスを分析した。これらのマウスでは、X染色体のランダムな不活性化のため、TregはWT（Foxp3+Cre-YFP-）とTfrc欠損（Foxp3+Cre-YFP+）の混合細胞で構成されていました。Tfrc cKO（Tfrcfl/fl Foxp3YFP-IRES-Cre/y mice）マウスとは対照的に、成体Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+ マウスは検出できる炎症表現型を示さず、脾臓における活性化/記憶T細胞の割合が正常であった（図S3h）。これらのマウスでは、CD4 T細胞中のFoxp3+YFP+細胞の比率が、Tfrc+/+ Foxp3YFP-Cre/+ マウスの比率と比較して約30%減少し（3.04%から2.08%）（図2 a, b）、6日齢Tfrc cKOマウスのTreg減少（図1g）と同様の大きさであることがわかった。Treg細胞の部分的な喪失にもかかわらず、細胞あたりのFoxp3発現量は、TfR1欠損マウスとWT Treg細胞で同等であった（Fig. 2c）。
図2
TfR1は、c-Maf+ Treg細胞の分化を促進する。
a-c Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+およびTfrc+/+Foxp3YFP-Cre/+（WT）雌マウスのCD4+脾臓細胞をゲートし、YFPおよびFoxp3発現について分析した。 a CD4+細胞にプレゲートをかけた代表的なフローサイトメトリー解析；（b）。脾臓（n＝10マウス）およびリンパ節（Tfrcfl／fl Foxp3YFP-Cre／＋ マウスについてはn＝10、WTマウスについてはn＝9）からのCD4＋T細胞におけるYFP＋ Foxp3＋細胞の頻度のまとめ；（c）。Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+またはTfrc+/+Foxp3YFP-Cre/+雌マウスのいずれかの脾臓からのゲートされたCD4+/YFP+細胞におけるFoxp3レベルを比較するヒストグラム。d-g Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+マウスの脾臓から分離したCD4+CD25+細胞のscRNA-seq解析。TfR1欠損細胞（YFP+）とWT（YFP-）細胞は、YFP-IRES-CRE転写物の検出に基づいてインシリコで分離した。 d 実験デザインの模式図。 e Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+マウスから分離したすべてのCD4＋CD25＋細胞のt-SNE投射。YFP+（クラスターA）およびYFP-（クラスターB）細胞を示す。 f, Foxp3（左）、Cre-YFP（中央）、またはMaf（右）の正規化カウントで色分けした全細胞のt-SNE投影。 g, Cre-YFP（左）およびMaf（右）の発現をクラスターAとクラスターBで比較したバイオリンプロット。h, i (a)と同様に、Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+ マウスの脾臓からのCD4+ FOXP3+YFP+ 細胞を、CD62LおよびCD44（上パネル）またはc-Maf（下パネル）の発現を分析した。エフェクターTreg細胞（CD62Llow CD44hi、上部パネル）およびc-Maf+ Treg（下部パネル）の頻度が示される。(h) 代表的なフローサイトメトリー染色；(i). c-Maf+ Treg細胞およびeTreg細胞のパーセンテージのまとめ（eTreg解析のためのn＝8マウス；3つの独立した実験に基づくc-Maf+ Treg解析のためのn＝9マウス）。Tfrc+/+Foxp3YFP-Cre/+マウスのYFP+細胞をコントロールとして含めた。 j (a)と同様に、脾臓のエフェクターTreg細胞をCD44hiCD62Low Foxp3+YFP+としてゲートし、TfR1欠損とWT eTreg細胞間でフローサイトメトリによりc-Maf発現量を比較した。b-i データは平均値±SD、***p < 0.001, ****p < 0.0001 by two-tailed Student's t test.である。
TfR1を介した鉄の取り込みに厳密に依存するTreg細胞のサブセットを調べるために、ヘテロ接合体Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+ マウスから分離した全Treg細胞（CD25+CD4+）の単一細胞RNA配列決定（scRNA-seq）分析を行った（図2d）。YFP- Treg細胞（Cre-nullおよびTfrc-undeleted、n＝6307）とYFP+ Treg（Cre-positiveおよびTfrc-deleted、n＝247）は、続いてYFP-IRES-Cre導入遺伝子の発現に基づいてシリコで分離しました。先行研究39,40と同様に、脾臓のTreg細胞は主に2つの集団、セントラルトレグ（cTreg、クラスタB）とエフェクタートレグ（eTreg、クラスタA）に分けられた。Cre-Treg細胞（別名WT）と比較して、Cre+Treg細胞（別名Tfrc欠損細胞）は、eTreg集団の頻度が減少していた（図2f）。さらに、scRNA-seqデータセットにおいて、WTとTfrc欠損Tregの間で発現が異なる上位遺伝子を分析した。特に、IL-10産生41とRORγt+Treg分化29,30に重要な転写因子であるc-Mafの発現は、Tfrc欠損Treg細胞ではWT細胞に比べて最も有意に低下していた（図2f, g）. これらのデータは、c-Maf+ Treg細胞の分化に細胞内鉄が重要であることを示唆している。
TfR1欠損Treg細胞におけるc-Maf+細胞の割合の減少は、フローサイトメトリーによってさらに検証された。雌のTfrc+/+Foxp3YFP-Cre/+マウスでは、eTreg（CD62Llow CD44hi）とc-Maf+細胞がYFP+ Tregのそれぞれ〜30％と〜15％を構成したが、Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+ マウスではYFP+細胞（別名TfR1-dficient Treg）中のそれらの比率はそれぞれ10％と1％未満に減少した（図2H、I）。また、6日齢のTfrc cKOマウスにおいても、c-Maf+ Treg細胞数の同様の減少が観察された（補足図S3d, e）。さらに、細胞単位で見ると、TfR1欠損eTreg細胞は、WTのものと比べてc-Mafのレベルが低下していたが、Foxp3は低下していなかった（図2j）ことから、鉄はTreg細胞におけるc-Mafの発現に重要であることが示された。
c-Maf+Treg細胞の分化を制御するTfR1の細胞自律的な機能は、混合骨髄キメラマウスでさらに確認された。Tfrc cKO骨髄細胞（CD45.2+）と先天性WT骨髄細胞（CD45.1+）を1：1の割合で混合したものをRag1-/-マウスに移植し、骨髄キメラマウスを構築した（補足図S4a）。このマウスにWT Treg細胞（CD45.1+）が存在すると、T細胞の活性化と自己免疫疾患の発症が防止された（補足図S4b）。ヘテロ接合体雌マウスのTfR1欠損細胞と同様に、脾臓のCD45.2+CD4+T細胞に対するFoxp3+細胞の比率は、WTのものと比較して〜50%減少した（補足図S4c、d）。重要なことは、TfR1欠損骨髄由来細胞では、eTregまたはc-Maf発現Treg細胞はほとんど観察されなかったことである（補足図S4e、f）。これらのデータから、c-Mafを発現するTreg細胞のサブセットの分化および／または維持を促進するTfR1の細胞内機能が示された。
逆に、細胞内鉄レベルの上昇は、Treg細胞におけるc-Mafの発現を促進した。WTマウスに鉄デキストランを投与したところ、Treg比率が上昇し（13.3％から17.4％、Suppl. Fig. S5a, b）、さらに重要なことに、脾臓のc-Maf+ Treg細胞が約30％増加した（26.5から39％, Fig. 3a, b）. さらに、in vitroで分化したTreg（iTreg）を硫酸鉄で刺激しても、Foxp3の誘導にはほとんど影響しなかったが（補足図S4 c, d）、c-Mafの発現は用量依存的に大幅に増強した（図3c、d）。鉄によるこのc-Mafの誘導は、同じ数の分裂を行った鉄処理細胞は、未処理細胞よりもc-Mafの発現が高かったため、細胞増殖の増加によるものではなかった（補足図S5 e, f）。最後に、鉄キレート剤（デスフェロキサミン、DFO）を用いて鉄を枯渇させると、in vitroのiTreg細胞におけるc-Mafの発現が抑制された（図3c）。これらのデータは、鉄がTreg細胞に直接作用してc-Mafの発現を促進することを示すものである。
図3
鉄はHIF-2αの発現を調節することで、Treg細胞におけるc-Mafの発現を促進する。
a, b WTマウスに鉄デキストラン（37.5mg/e.a）を5日に1回、3週間投与した。脾臓におけるc-Maf+ Treg細胞のパーセンテージをフローサイトメトリーで測定した。 a 代表的なフローサイトメトリープロット；（b）．つの独立した実験からの脾臓Treg細胞におけるc-Maf＋細胞のパーセンテージのまとめ。 c、d CD4T細胞を、iTreg分化条件（抗CD3＋抗CD28＋TGFβ1＋IL-2＋抗IFNγ＋抗IL4）で、指示濃度の硫酸第一鉄またはDFOで活性化した。c-MafとFoxp3の発現は、T細胞活性化の4日後に細胞内染色で決定した。 c 代表的なフローサイトメトリー分析；（d）。c-Maf+ Tregのパーセンテージのまとめ（モックについてはn＝7生物学的独立実験、FeSO4処理マウスについてはn＝5）。(e、f)。c）と同様に、硫酸第一鉄処理したiTreg細胞のトランスクリプトームを、RNA-seqによって処理しないiTreg細胞のトランスクリプトームと比較した。 e 差異的発現遺伝子を示すM-Aプロット；差動発現遺伝子はDESeq2によって決定し、赤または青で示す（｜LFC｜≥0.5、Waldテストでp < 0.05）。 f Metascapeを用いて、差異的発現遺伝子をGO解析。p値は累積超幾何分布に基づいて計算し、q値はBenjamini-Hochberg手順を用いて計算した。 g Tfr1fl/fl Foxp3-CreYFP/+マウス（Tfrc cKO）のYFP+Foxp3+CD4+細胞におけるHIF-1αおよびHIF-2αの発現をフローサイトメトリによって測定し、Tfrc+/+Foxp3-CreYFP/+マウスのその対応細胞（WT）におけるものと比較した。データは3つの独立した実験の代表である。 h (c)と同様に、T細胞活性化の1日後に、iTregを50μM FeSO4で24時間培養し、Foxp3+細胞におけるHIF-2αおよびHIF-1αの発現を細胞内染色により決定した。データは3回の独立した実験の代表である。 i, j (a)と同様に、iTreg細胞を50μM PT2385（HIF-2α阻害剤）ありまたはなしで、50μM硫酸第一鉄で処理した。i 代表的な結果。 j 4回の独立した実験に基づくiTreg細胞におけるc-Maf+%細胞のまとめ。 b, d, j データは平均±SD、*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 by two-tailed Student's t testを示す。
TfR1を介した鉄の取り込みは、Treg細胞のエフェクター機能に重要である。
Treg細胞におけるTfR1を介した転写プログラムについてさらに理解を深めるため、雌のTfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+ マウスから分離したTfR1欠損Treg細胞（YFP+CD25+CD4+）のRNA-seq解析を実施した。差分発現解析により、Tfrc+/+ Foxp3YFP-Cre/+マウスから分離したTfR1欠損Treg細胞と比較して、219のアップレギュレーション遺伝子と312のダウンレギュレーション遺伝子が明らかになった（補足図S6a）。発現量の異なる遺伝子（DEG）のジーンオントロジー解析により、「T細胞の活性化」と「免疫エフェクタープロセスの制御」が、Tfrc欠損によって影響を受ける最も支配的な生物学的プロセスであることが明らかになった（補足図S6b) 23. 実際、最も抑制された遺伝子の中には、CTLA-4、PD1、ICOS、IL-10、Fgl2、CD103、AhrといったTregの主要なエフェクター分子が含まれており、フローサイトメトリー解析によってさらに確認された（補足図：S6c）。エフェクターTreg細胞におけるTfR1の重要性を裏付けるように、TfR1は、ナチュラルTregまたは従来のT細胞よりもエフェクターTreg細胞において高いレベルで発現した（補足図S6 d、e）。
エフェクター分子の発現量の低下と一致して、TfR1欠損Treg細胞は、in vivoで抑制活性を失った。6日齢のTfrcfl/fl Foxp3YFP-IRES-Cre/y マウスからTfR1欠損Treg細胞（CD4+YFP+）を分離し、WTナイーブCD4 T細胞（ CD4+CD45RBhiCD25- ）とともにRag1-/-マウスに共輸送した。WTトレグの共輸送により体重減少や腸の炎症は抑制されたが、TfR1欠損トレグを受け取ったマウスは体重が減少し（補足図S6f）、重度の腸組織損傷を示した（補足図S6g）ことから、TfR1欠損細胞が抑制機能の少ないまたは全くないTreg細胞へと屈折したことがわかった。これらの結果は、Treg細胞によるエフェクター機能の獲得が、TfR1を介した鉄の取り込みレベルに依存していることを示す。
鉄はIRE依存的なHIF-2αの発現を増強することによりc-Mafの発現を誘導する
鉄がc-Mafの発現を促進するメカニズムを調べるために、鉄で刺激したiTreg細胞と未処理のiTreg細胞のトランスクリプトーム解析を偏りなく実施した。差分発現解析の結果、鉄で刺激したiTreg細胞では、655個のアップレギュレーション遺伝子と490個のダウンレギュレーション遺伝子が発見された（図3e）。DEGのジーンオントロジー解析により、Treg細胞の鉄調節遺伝子は、酸素濃度低下（低酸素）に対する細胞応答だけでなく、ストレスに対する細胞応答、白血球活性化、コレステロール生合成過程にも有意に富んでいることがわかった（図3f）。TfR1欠損Treg細胞の遺伝子セット濃縮解析（GSEA）42,43でも、低酸素反応に関連する遺伝子のレベルがWT Treg細胞と比較して低下していることが示され（補足図S7a）、鉄の部分欠損がTreg細胞の低酸素反応遺伝子の発現を損なっている可能性が示された。
低酸素応答を制御する転写プログラムは、酸素感受性α-サブユニット（HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α）と保存β-サブユニット（HIF-1β、別名アリール炭化水素受容体核移行因子、AHRN）からなる転写複合体によって調節される44。注目すべきは、雌性Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+マウスの脾臓から採取したTfR1欠損Treg細胞（YFP+CD25+）において、HIF-2αの発現が減少したがHIF-1αは減少しなかったことである（図3g）。HIF-2αタンパク質レベルが低下しているにもかかわらず、TfR1欠損Treg細胞においてHIF-2α mRNA発現は有意に低下していなかった（補足図S7b）。TfR1欠損Treg細胞におけるこれらの知見を裏付けるように、鉄処理により、iTreg細胞ではHIF-2αのタンパク質発現が増強されたが、HIF-1αのそれは増強されなかった（図3h）一方で、HIF-2αのmRNAレベルは増加しなかった（補足図S7c）。HIF-2α45の5'UTRにIREが存在することから、iTreg細胞におけるHIF-2αの5'-UTRの活性は鉄刺激によって大幅に増強されたが（補足図S7d）、ルシフェラーゼレポーターのmRNAレベルは変化していなかった。HIF-2α 5'UTRのIRE/IRP相互作用を無効にする2つの変異45,46も鉄の刺激効果を無効にした（補足図S7e）。これらのデータは、HIF-2αの翻訳が、その5-UTRのIREを介して細胞内鉄によって調節されることを示す45,46。
さらに重要なことに、HIF-2αは、Treg細胞における鉄を介したc-Mafの発現誘導に必要であることが示された。HIF-2αは、c-Maf低Treg細胞よりも、in vivoのc-Maf高Treg細胞でより高いレベルで発現した（補足図S7f）。iTreg細胞をHIF-2α転写活性47を阻害するPT2385で処理すると、鉄によるc-Maf発現誘導能は完全に消失した（図3i、j）。さらに、レトロウイルスで導入したshRNAによるHIF-2αのノックダウンは、鉄によるc-Maf発現の誘導をブロックした（補足図S7 g, h, i）。最後に、以前に発表されたChIP-Seq結果48の再解析により、HIF-2αとHIF-1β（AHRN）がc-Mafプロモーター領域に直接関連することが明らかになり（補足図S7j）、c-MafがHIF-2αの直接標的であることを示唆した。これらのデータから、Treg細胞におけるc-Mafの発現はHIF-2αによって制御され、その翻訳はIREを介して細胞内鉄によって促進されることが示された。
腸内Treg細胞の蓄積にはTfR1を介した鉄の取り込みが必要である
c-Mafを発現するTreg細胞は、腸の固有層に多く存在し、RORγtを発現し、腸の免疫寛容の維持に極めて重要な役割を担っている28-30. Treg細胞における鉄を促進するc-Mafの発現の知見と一致して、TfR1を介した鉄の取り込みは、腸におけるTreg細胞のホメオスタシスにとって重要であることが示されました。まず、腸（結腸と小腸を含む）のTreg細胞は、脾臓と肺の対応する細胞よりも高レベルのTfR1を発現し、より不安定な鉄を含んでいた（補足図S8a）。また、HIF-2αは、脾臓や肺のTregよりも大腸のTregの方が高いレベルで発現していた。重要なことは、脾臓のTreg細胞の数にはわずかな影響しか及ぼさなかったにもかかわらず、細胞鉄レベルの低下は、腸のTreg細胞を完全に消失させたことである。雌のTfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+マウスの分析では、ほとんどYFP+Foxp3+（すなわち、 一方、肺と脾臓のYFP+Foxp3+細胞の比率は、WTマウス（Tfrc+/+ Foxp3YFP-Cre/+マウスのYFP+Foxp3+細胞）と比較して30％程度しか減少していなかった（図4a、b）。腸におけるTfR1欠損Treg細胞のこのような選択的な不在は、Tfrc cKO骨髄由来Treg細胞（CD4+CD45.2+Foxp3+）が小腸および結腸にほぼ存在しないことから、混合骨髄キメラマウスにおいても観察された（補足図S4c、d）。これらのデータは、腸の薄層前膜のTreg細胞は、その分化とホメオスタシスに高レベルの細胞内鉄に厳格に依存していることを総称して示している。
図4
腸管Treg細胞のホメオスタシスには、継続的な鉄の取り込みが必要である。
a, b 6〜8週齢の雌性Tfrcfl/fl Foxp3YFP-Cre/+およびTfrc+/+Foxp3YFP-Cre/+マウスについて、組織常在Treg細胞について分析した。肺、大腸（L.I.）および小腸（S.I.）の層状固有層からCD4+ T細胞を分離し、細胞内染色によりYFPおよびFoxp3発現について分析した。a CD4+CD45+集団におけるYFP+Foxp3+（赤ゲート）およびYFP-Foxp3+（青ゲート）細胞の頻度を示す代表的なフローサイトメトリー解析；b 示した組織からの全CD4 T細胞におけるYFP+Foxp3+細胞のパーセンテージの要約。(結腸、n＝4；S.I.、n＝5；肺、n＝3マウスを3回の独立した実験にわたって調べた）。 c Treg細胞における急性TfR1不活性化の概略図。 d、e 最初のタモキシフェン処置から14日後に、指示した組織におけるCD4 T細胞に対するTreg細胞の比率をFoxp3の細胞内染色により分析した。 d フローサイトメトリ分析の典型。 e 指示した組織からのFoxp3+ CD45+ T細胞の比率を要約する。データは、少なくとも3つの独立した実験の代表（d）または要約（e）である（S.I.）、 n＝13；結腸、n＝21；脾臓、n＝27；LN、n＝27；肺、WTまたはTfrc iKOマウスそれぞれについてn＝9、n＝10；肝臓、WTまたはTfrc iKOマウスそれぞれについてn＝8、n＝7）。 f 脾臓のTreg細胞をFoxp3＋CD4＋としてゲートし、エフェクターTreg細胞（CD44hiCD62Llow）比率を決定した。データは3つの独立した実験の代表である。 g 脾臓のCD4+Foxp3+細胞における示された転写因子のレベルは、細胞内染色によって決定した。h-j TfR1の急性不活性化は、タモキシフェン処理したFoxp3eGFP-creERT2Tfrc fl/flマウスにおいて、より遅い体重増加および結腸短縮として現れる大腸炎をもたらした。 h タモキシフェン処理後の体重変化のまとめ（2回の独立した実験にわたって調べた1群あたりn = 9マウス）***p < 0.0001 by a two-tailed t test. データは平均±SEMである；i 結腸の長さを示す代表写真。j 結腸の長さのまとめ（2つの独立した実験からn = 3マウス）。b、e、j データは平均±SD、*p < 0.05, **p < 0.01,***p < 0.001,****p < 0.0001 による両側スチューデントtテストによって示した。
さらに、他の組織に存在するTreg細胞ではなく、腸管Treg細胞のみがTfR1を介した鉄の取り込みを継続的に必要としていることが明らかになった。成体Foxp3eGFP-creERT2Tfrcfl/flマウス（以下、Tfrc iKOと呼ぶ）にタモキシフェンを注射し、成熟Treg細胞のTfrcを急性的に欠損させた。これらのマウスにおいて、タモキシフェンはFoxp3プロモーターの制御下でERT2-Cre融合タンパク質を活性化し、Treg細胞におけるTfR1の特異的かつ急性的な消失を可能にした（図4c、補遺図S8b）。その結果、Treg細胞における細胞内鉄のレベルは、タモキシフェン処理後に減少した（補足図S8b）。最初のタモキシフェン投与から3週間後、Tfrc iKOマウスの脾臓では、T細胞（補足図S8c、d）とTreg細胞（図4d、e）の比率は変化しなかったが、eTreg集団（図4f）とc-MafおよびHIF-2αの発現が低下したことから、これらの転写因子の発現がTreg細胞の鉄レベル（図4g）によって活発に調節されており、eTreg細胞発生に必須であることが確かめられた。脾臓のものとは対照的に、結腸および小腸（S.I）のTreg細胞の割合は、タモキシフェン投与後に50％以上減少した（結腸 39.6%→14.4%；S.I. 17.5%→11.1%）（Fig.4d, e）．このような減少は腸のTreg細胞に特有のものであり、肺や肝臓を含む他の非リンパ系臓器ではTregの比率は変化しなかった（図4e）。腸の薄層前膜のTreg細胞は13週間にわたって減衰と交換を繰り返すことを考えると49、タモキシフェン投与3週間後のTreg細胞数の減少は、TfR1依存性の鉄取り込みが生体内の腸内Treg細胞の維持に選択的に必要であることを示していた。
さらに重要なことは、TfR1依存性Treg細胞は、腸における免疫寛容の維持に不可欠であったことである。最初のタモキシフェン投与から3週間後という早い段階で、Tfrc iKOマウスは、炎症性細胞の浸潤（補足図S8g）、体重増加の遅れ（図4h）、結腸の短縮（図4 i, j）などの大腸炎の兆候を示したが、他の器官（例えば、肺、肝臓、腎臓、補足図S8g）では明らかな炎症が観察されなかった。これらの結果から、腸における免疫寛容の維持には、TfR1依存性のTreg細胞が重要であることが併せて示された。
微生物叢が産生するペンタン酸は鉄の取り込みを促進し、c-Maf+ Tregの分化を促進する
より高いレベルの不安定な鉄と、TfR1を介した鉄の取り込みの選択的依存性から、腸のTreg細胞は独自のソースで鉄を調達している可能性があることがわかった。無菌マウス50やラット51の腸管上皮細胞に関するこれまでの知見と同様に、腸内細菌叢がTreg細胞による鉄の取り込みを促進することを見出した。無菌マウスの大腸または脾臓から採取したTreg細胞は、特定の病原体を持たない（SPF）マウスのTreg細胞と比較して、不安定な鉄をあまり含まない（図5a）。細胞内鉄レベルの代用マーカー52であるフェリチンの発現も、無菌マウスの大腸Treg細胞で減少していた（図S9a）。さらに重要なことに、無菌マウスの大腸のTreg細胞数はSPFマウスの大腸のものと比べて減少していたが、報告されているように53、鉄デキストランで処理すると細胞内の鉄レベルが上昇し、その後、無菌マウスの大腸Treg細胞比率が回復した（図5b、c）。
図5
微生物が産生するペンタノエートは、鉄の取り込みと腸管Tregの分化を促進する。
a 特定病原体フリーマウス（SPF）、無菌マウス（GF）、鉄デキストラン処理した無菌マウスから大腸（左）および脾臓（右）のTreg細胞を分離した。可溶性鉄レベルは、細胞内の可溶性鉄レベルと逆相関するカルセイン-AMによる染色で測定した。大腸、SPF、GF、GF+鉄デキストラン群についてそれぞれn = 4,4, 3匹、脾臓、SPF、GF、GF+鉄デキストランについてそれぞれn = 8, 83匹。 b, c 無菌マウスを鉄デキストランで処理し、大腸のTregをFoxp3細胞内染色により評価した。PBS処理した無胚葉マウスおよびSPFマウスを対照として含めた。 b 結腸からのプレゲーションCD4+CD45+細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイル；（c）示された器官におけるFoxp3+細胞の割合の要約（結腸、SPF、GF、GF＋鉄デキストラングループについてそれぞれn＝8，9，3マウス；S．脾臓、n = 11,11,5（SPF, GF, GF+iron dextranグループ）。 d SPF（モック）マウスおよび抗生物質処理SPF（ABX）マウスのカイカからの代謝物をガスクロマトグラフ質量分析（GC-MS）により分析した。e, f SPFマウスを汎用の抗生物質で処理し（ABX）、21日間飲料水を介してペンタン酸ナトリウムを投与した（ABX+pentanoate）。FACSにより、大腸トレグにおける不安定鉄、c-MafおよびHIF-2αの濃度を測定した。未処理のSPFマウス（モック）および抗生物質で処理したSPFマウス（ABX）をコントロールとして含めた。つの独立した実験からの、不安定鉄（カルセイン-AM染色）、c-Maf及びHIF-2αの代表的な（e）又は要約した（f）レベルを示す（カルセイン-AM染色、n＝6マウス；c-Maf染色、n＝9マウス；HIF-2α染色、n＝12マウス）。 g、h 細胞内染色によって大腸Treg細胞の比率を決定した；g 代表的フローサイトメーター分析；（h）．4回の独立した実験のまとめ（SPF、ABX、ABX+pentanoateについて、それぞれn = 22, 20, 22 mice）。 a, c, f, h 統計的有意性は両側t検定で決定した。*p < 0.05, **p < 0.01,***p < 0.001, ****p < 0.0001. データは平均値±SDで示した。
微生物叢が促進する腸内トレッグの鉄分取り込みの重要性は、微生物叢を枯渇させたSPFマウスでさらに検証された。パン抗生物質（ABX）処置は、腸内微生物叢を枯渇させ、大腸Treg細胞における不安定鉄のレベルを低下させた（補足図S9b）。報告されているように、抗生物質処理は結腸のTreg細胞を減少させた53-56が、鉄デキストラン処理は細胞の鉄レベルを高め、その後、これらのマウスの結腸Treg細胞の頻度を回復させた（補足図S9 c,d）. これらのデータは、常在細菌がTreg細胞の鉄吸収を促進し、その後、大腸Treg細胞の拡大を促進することを示すものである。
常在細菌叢が産生する代謝産物は、粘膜免疫系を形成することができる57,58。Treg細胞の鉄吸収を促進する可能性のある腸内細菌叢が産生する固有の代謝物を同定するため、メタノール-クロロホルム-水抽出法を用いて盲腸の糞便内容物を抽出し、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）59を用いてSPFマウスとパン抗生物質処理マウスの無機相の組成を比較しました。ペンタン酸および酪酸という2つのSCFAのレベルは、抗生物質投与マウスで最も広範囲に減少していた（図5d）。酪酸60と同様に、ペンタン酸は無菌マウスの大腸に存在せず、微生物由来であることがさらに確認された（図S9e）。
さらに解析を進めると、ペンタン酸は鉄の調達を促進し、その後Treg細胞においてHIF-2αとc-Mafの発現を誘導することがわかった。酪酸60とペンタノエートは共にin vitroでiTregの分化を促進したが（補足図S9f）、ペンタノエートのみが細胞内鉄のレベルを上昇させ（補足図S9g）、HIF-2α 5'-UTR活性（補足図S9h）、iTreg細胞のHIF-2α（補足図S9g）とc-Maf（補足図S9i、j）の発現を促進した。このようなペンタノエートの活性は、鉄キレーターであるDFOによって阻害されたことから、ペンタノエートは鉄の取り込みを促進することで機能することが確認された（補足図S9 i, j. これらのin vitroの結果と同様に、ペンタノエートは鉄の取り込みを促進し、細胞内の鉄レベルを上昇させた（Fig. 5e, f左パネル）、微生物欠乏マウスの大腸Treg細胞におけるc-Maf（図5e, f中央パネル）およびHIF-2α（図5e, f右パネル）の発現を増加させた。その結果、抗生物質投与マウスの大腸Treg細胞の比率は、ペンタノエート処理後に部分的に回復した（図5g、h）。
以上のことから、微生物が産生するペンタノエートは、鉄の取り込みを促進し、その後、Treg細胞におけるc-MafとHIF-2αの発現を高めることによって、腸のTreg細胞の恒常性を促進することがわかった。
ペンタノエートはDSS誘発大腸炎における鉄欠乏と腸の炎症の両方を緩和する
IBD患者では、鉄欠乏とそれに起因する貧血の管理が不十分なのが現状である61。鉄の取り込みと大腸Tregの恒常性を促進するペンタノエートの能力は、大腸炎患者の鉄欠乏性貧血だけでなく腸の炎症も緩和する戦略を提供する可能性があります。デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）で誘発した急性大腸炎のマウスモデル（図6a）では、DSS投与後7日目という早い段階で赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット値が著しく低下していた（図6b）。一方、DSS処理前にペンタノエートをマウスに投与した場合、これらのマウスは、モック処理した動物（図6b）と比較して、血清鉄レベルの増加（図6c）、赤血球数の増加、およびヘモグロビンおよびヘマトクリット値の向上を示し、鉄欠乏および結果として生じる貧血は大幅に緩和された。また、大腸の短縮（図6d、e）や腸の炎症（図6f、g）など、大腸炎の多くの兆候は、ペンタノイン酸処理によって著しく緩和されました。
図6
ペンタノエートは、大腸炎に伴う貧血と腸の炎症を予防する。
a DSS誘発大腸炎におけるペンタン酸ナトリウムの評価に用いた実験の模式図である。簡単に説明すると、6週齢のC57BL/6マウスにペンタン酸ナトリウム（200 mM）を飲料水経由で3週間投与し、さらにDSS（4%）を7日間投与した。 b DSS投与7日後に、血液学分析装置（ProCyteDx）で赤血球数、ヘマトクリットとヘモグロビン値などの赤血球パラメータを測定した。統計的有意性は、一元配置分散分析により決定した（*p < 0.05, ****p < 0.0001, n = 26 mouse examined over three independent experiments）。データは平均値±SEMで示した。 c (b)と同様に、血清鉄レベルはICP-MS（iCAP RQ, Thermo Fisher）により決定した。ICP-MSの検出については、2回の独立した実験にわたって調べたn＝6マウス。 d〜g DSSチャレンジ後7日目と15日目の大腸の長さd、eおよびヘマトキシリン・エオジン染色f、gを示した。スケールバーは200μmを表す。データは3つの独立した実験から得られたものである（e、モックおよびペンタノエート処理後の7日間についてそれぞれn＝14および13マウス；モックおよびペンタノエート処理後の15日間についてそれぞれn＝9および10マウス；g、1群につきn＝4マウス）。 c、e、g 統計的有意性は両側スチューデントt検定によって決定した。*p < 0.05, **p < 0.01,***p < 0.001, ****p < 0.0001. 示したデータは平均±SDである。
さらに重要なことに、ペンタノエートは、活動性大腸炎が確立したマウスにおいても、腸の炎症と鉄欠乏を緩和した。慢性大腸炎のマウスモデルは、デキストラン硫酸ナトリウム（DSS）の反復投与によって誘導された（図7a）。このような大腸炎が進行中のマウスにおいて、ペンタン酸塩を投与すると、赤血球数が増加し、ヘモグロビンやヘマトクリット値が模擬投与した動物に比べ向上するなど、鉄欠乏とそれに伴う貧血が大きく緩和されました（図7b）。また、短縮結腸（図7c、d）および腸の炎症（図7e、f）もペンタノイン酸処理後に有意に改善した。これらのデータは、ペンタノエートが大腸炎患者の鉄欠乏と大腸の炎症の両方を緩和する理想的な薬剤である可能性を示唆している。
図7
ペンタノエートは、大腸炎に伴う貧血と腸の炎症を改善する。
a 発症後の慢性大腸炎でペンタノエートを評価する実験の模式図である。簡単に説明すると、WTマウスに2%DSSを5日間投与し、その後水または1%DSSを7日間投与することを3サイクル繰り返した。20日後、飲料水に200mMペンタン酸ナトリウムまたはビヒクルを添加し、ペンタン酸処理から17日後にマウスを分析した。 b （a）と同様に、血液を採取し、赤血球を含む赤血球パラメータ（モックおよびペンタン酸処理群については0日、n＝15および16マウス；37日、n＝15マウス）、HGBおよびヘマトクリット（モックおよびペンタン酸処理群はそれぞれn＝15および16）については3回の独立実験にわたり測定した。エラーバーは平均の標準誤差を表し、****p < 0.0001 in one-way ANOVA Test. c-f (a) と同様に、結腸の長さとH&E染色を測定した。 e スケールバーは200μmを表す。データは2つの独立した実験の代表（c、e）または要約（d、f）である。d n = 各条件で17匹のマウス、f n = 5匹のマウス。統計的有意性は両側Student's t testによって決定された。***p < 0.001. g, h クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）患者および対照者（正常）の便サンプル中のペンタン酸レベルを、LC-MSで測定した。データは、以前に発表されたHPM2（g n = 146、n = 265、n = 135、UC、CDまたはIBDを持たない個人）またはPRISM（h、n = 88、n = 76、n = 56、CD、UCまたはIBDを持たない個人）研究62,63に基づいてZスコア変換しています。箱ひげ図は中央値および四分位範囲（IQR）を示している。上下のひげは、上四分位以上と下四分位以下からのIQRの1.5倍を示す。*p < 0.05; ns, 線形回帰分析に基づく統計的に有意ではない。 i gと同様に、便サンプル中のペンタン酸レベルは、細胞内鉄レベルの代替である腸内のFTH1発現（FPKM）とRNA-secで決定した正の相関があった。データはHPM2 studie63に基づきZスコア変換したもの。ピアソン係数分析（両側）に基づきp = 0.02。エラーバンドは、95%信頼区間を持つ線形回帰線を表す。
鉄のホメオスタシスと腸の炎症におけるペンタン酸の重要性をさらに裏付けるように、HPM2とPRISMの両方のコホートにおいて、便サンプル中のペンタン酸のレベルは、対照の人と比較して、活動性のクローン病（CD）または潰瘍性大腸炎（UC）のいずれかで減少した62、63（図7g、h、補足データ1、2）。細胞内鉄量52の代用マーカーである細胞性フェリチン重鎖（FTH1）の発現は、CDまたはUC患者で減少し（補足図S9i）、さらに重要なことに、HPM2コホートではペンタン酸のレベルと正の相関があった（図7i）。
に移動する：
考察
本研究では、腸管Treg細胞の分化は、細胞内の鉄のレベルが高いことに強く依存しており、HIF-2αとc-Mafの発現を促進し、腸における免疫寛容の維持に重要であることを実証した。重要なことは、腸内Treg細胞における細胞内鉄レベルの増加は、微生物叢が産生するペンタノエートに依存しており、鉄またはペンタノエートが微生物叢欠乏マウスの腸内Treg細胞の欠損を救済することであった。このように、微生物叢が栄養素の調達を調節することによって、腸内Treg細胞のホメオスタシスを促進するメカニズムが明らかになった。
この結果は、ペンタノエートがIBD患者の鉄欠乏と免疫寛容を同時に回復させる治療薬として機能する可能性を示しています。現在、IBDに伴う貧血を緩和するために鉄の直接補給が行われているが、世界的な鉄過剰はしばしば鉄を介した酸化ストレスや腸内の病原性細菌の過剰繁殖につながる64。DSS誘発大腸炎モデルで実証されたように、鉄の調達とTregの恒常性を促進するペンタノエートのユニークな能力は、鉄欠乏と腸の炎症の両方を緩和した。ペンタノエートは、Megasphaera massiliensis65などの腸内常在菌によって生産されるため、ペンタノエートを直接補給するか、Megasphaera messiliensisを調節すれば、IBD患者の腸内環境と非腸内環境の両方を改善するのに役立つと考えられる。IBDは異質な疾患であり、マウスのDSS誘発大腸炎がヒトのIBDのすべての特徴を再現しているわけではないことは、注目に値すると思います。
鉄の吸収を改善するペンタノエートのユニークな能力には、いくつかのメカニズムが寄与していると考えられます。SCFAとして、ペンタノエートは、大腸における鉄の溶解度と利用可能性を高めると考えられる66,67。あるいは、ペンタン酸はSCFA受容体FFAR2（GPR43）を介して機能し、鉄のホメオスタシスに関連する遺伝子（例：TfR1）の発現を調節する可能性もある。最後に、強力なHDAC阻害剤65として、ペンタン酸は鉄の吸収に関わる遺伝子の発現を刺激する可能性もあり、鉄のホメオスタシスにおける役割をさらに裏付けています。鉄の調達を促進する活性に加えて、ペンタノエートはin vitroでT細胞およびB細胞におけるIL-10の発現を促進した60。IL-10は様々な免疫細胞においてc-Mafのターゲットとして確立されていることから41,60,68-70、ペンタノエートがTreg細胞以外のリンパ球においてHIF-2α-c-Maf軸を介してIL-10を促進するかどうかは、さらなる研究が必要であると思われる。
腸内細菌叢は、栄養の調達だけでなく、免疫寛容の維持にも重要である。当初提唱された、シデロフォアを分泌して鉄を奪い合う微生物叢と宿主の「鉄の綱引き」71に加え、腸内微生物叢は、鉄のバイオアベイラビリティを高める、鉄の取り込みに関わる遺伝子の発現を調節する7、鉄輸送を促進する補因子を分泌する72など、腸内において宿主が取り込む鉄分を調節する28。注目すべきは、鉄分充足状態とは対照的に、鉄欠乏状態7では、乳酸菌が産生する2,3-ジアミノプロピオン酸（DAP）とロイテリンを介して、微生物が鉄吸収を阻害することがある73。このように、微生物に依存した鉄のホメオスタシスは、異なる生理的環境下での栄養調達と免疫寛容の相互作用において極めて重要な役割を担っていると考えられる。
腸管Treg細胞の分化に加え、細胞内の鉄はTreg細胞のエフェクター機能に不可欠である。特に、HIF-2αとc-Mafの両方がTreg細胞のエフェクタープログラムと抑制機能に必須であることが最近明らかになったが、TfR1 cKOマウスにおける自己免疫疾患の重症度は、c-Maf欠損マウス29、30またはHIF-2α欠損Tregs74のいずれかを持つマウスに比べてはるかに高かった。鉄の機能は、HIF-2α-c-Mafの発現促進以外にも、Tfrc cKOマウスにおけるTregのエフェクター活性の欠陥と致死的な自己免疫に寄与していると考えられる。従来のT細胞増殖における鉄の重要性75と同様に、TfR1欠損による部分的な鉄欠乏によって、Treg細胞の増殖と活性化が損なわれた。さらに、ミトコンドリア活性における鉄の重要な役割75およびTregエフェクター機能におけるミトコンドリアの役割76,77を考えると、TfR1欠損Treg細胞におけるミトコンドリア機能の欠陥が、TfR1 cKOマウスに見られるTreg抑制活性の喪失および致死的自己免疫の一因であると考えられる。Tregの鉄依存性エフェクター機能を解明するために、さらなる研究が必要である。
鉄を介したシグナル伝達は、多くの生物学的プロセスの制御において複雑かつ多面的な役割を担っていることは、注目に値する。IREを介した転写後制御における役割に加え、鉄は遺伝子発現に関与する酵素（JmjC脱メチル化酵素15、プロリル水酸化酵素ドメイン酵素78など）に結合し、特定の転写因子79に直接結合してその活性を調節できる。今後、免疫系における鉄を介したシグナルの役割に関する研究が進めば、免疫機能不全に関連する疾患の治療にさらなる可能性が生まれるかもしれません。
このページのトップへ
方法
マウス
Tfrcfl/flマウスは、National Resource Center of Model Mice (Nanjing, China)から入手し、10世代以上にわたってC57BL/6バックグラウンドに戻し交配させた。Foxp3YFP-IRES-Cre、Foxp3eGFP-creERT2、Rag1-/-、C57BL/6 SJL (CD45.1) マウスは、Jackson laboratory (Bar Harbor, ME) から入手した。すべてのマウスは、特に指定がない限り、標準的なマウスチャウ（JXT、Jiangsu Xietong）および滅菌水に自由にアクセスできる特定の病原体のない条件下で維持された。マウスは、12時間の明暗サークルと21.1〜22.2℃の温度範囲で制御された環境下に収容された。湿度は40%〜60%に維持された。
無菌マウスは、National Resource Center of Model Mice (Nanjing, China)から入手し、無菌アイソレーターに収容した。Treg細胞のTfR1を急性的に枯渇させるために、Foxp3eGFP-creERT2マウスに320mgタモキシフェン／kg（体重）を4日ごとに計4回、経口ガベージで投与した。すべての動物実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに準拠して行われ、ウエストレイク大学の機関バイオメディカル研究倫理委員会によって承認された。研究デザインにおいて性別は考慮されていない。
抗生物質の投与
6週齢のC57BL/6マウスに、最初に混合抗生物質（5mgメトロニダゾール、2.5mgバンコマイシン、5mgアンピシリン、5mgネオマイシン）を5日間毎日経口ガバージで投与した。さらに3週間、抗生物質カクテル（1 mg/mL metronidazole, 0.5 mg/mL vancomycin, 1 mg/mL ampicillin, and 1 mg/mL neomycin）を飲料水に補充した。
鉄デキストラン処理
新生児マウスについては、まず鉄デキストラン（Sigma）を生後3日目（5mg/e.a.）および9日目（7.5mg/e.a.）に腹腔内注射した。その後、生後44日目まで週1回、鉄デキストラン（12.5mg /e.a.）でマウスを連続投与した。無菌マウスには、鉄デキストランを5日おきに3週間腹腔内注射（37.5mg/e.a.)した。
DSS誘発大腸炎モデルにおけるペンタノエートの活性の解析
6週齢のC57BL/6マウスに、大腸炎誘発の3週間前に、飲料水に200mMのペンタン酸ナトリウムを添加した。4%(w/v)のDSS（分子量36-50kDa；MP Biomedicals）を飲料水に7日間添加し、大腸炎を誘発した。DSS処理後0日目と7日目に、EDTA抗凝固剤を含むBD Microtainerチューブを用いて採血し、赤血球パラメータをHematology Analyzer（ProCyteDx）を用いて測定した。大腸炎の重症度を判定するため、大腸サンプルを10%中性緩衝ホルマリンで一晩固定し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。組織学的評価は、陰窩構造の損傷、粘膜下層の浮腫、炎症細胞の浸潤という3つのパラメータに基づいて、二重盲検法で評価されました。
確立された大腸炎モデルにおけるペンタノエートの活性の解析
飲料水に2％（w/v）のDSS（分子量36 KD-50 KD；MP Biomedicals）を5日間投与し、その後7日間、水または1％DSSを3サイクル投与することにより慢性大腸炎を誘発した。20日間経過後、200mMのペンタン酸ナトリウムを投与し、ペンタン酸ナトリウムまたはビヒクル投与後17日目に、ヘマトロジーアナライザー（ProCyteDx）を用いて赤血球パラメータを測定した。
ガスクロマトグラフィー質量分析法による代謝物の分析
マウス盲腸内容物の代謝物は、メタノール-クロロホルム-水抽出法を用いて有機相と水相の両方で抽出した。簡単に説明すると、あらかじめ冷却したメタノール/クロロホルム（2：1、v/v）（Sigma）3mLを、あらかじめ秤量した新鮮なサンプルを含むチューブに添加した。超音波プロセッサーでホモジナイズした後、サンプルを8000gで10分間、4℃で遠心分離し、上清を2mLの氷冷水を含むチューブに回収した。激しくボルテックスした後、サンプルチューブを18,000g、4℃で10分間遠心分離し、相分離を得た。界面を乱すことなく上相を回収し、Speedvac（Eppendorf Vacufuge）を用いて乾燥させ、代謝物ペレットを取得した。
糞便内容物から抽出した代謝物を脱イオン水に溶かし、50μLのHClと200μLのエーテルを含む抽出液でホモジナイズした。激しく振盪した後、サンプルを1,000gで10分間遠心分離し、上層のエーテル層を回収した。エーテル抽出物80μLを16μLのN-tert-butyldimethylsilyl-N-methyltrifluoroacetamide（MTBSTFA）と混合し、80℃で20分間加熱した後、室温で一晩放置して誘導体化した。誘導体化したサンプルを、HP-5MSカラム（0.25 mm × 30 m × 0.25 μm）を備えたガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）（5977B GC/MSD, Agilent Technologies）に通した。キャリアガスには純ヘリウム（99.9999%）を用い、流速は1.2mL/minとした。ヘッド圧力は5psi、スプリット比は100:1に設定した。入口温度と移送ライン温度はそれぞれ250℃と300℃であった。以下の温度プログラムを使用した： 60 ℃（3分）、60-120 ℃（5℃/分）、120-300 ℃（20℃/分）。有機酸はNIST MS Search 2.3を使って同定した。
リンパ球の染色とフローサイトメトリー
細胞表面の染色には、細胞をFACSバッファー（1mM EDTAを含むPBS中の2％FBS）で洗浄し、CD16/32に対する抗体（2.4G2、BD Pharmingen）でブロックし、氷上で30分間指示した表面抗体とインキュベートした。その後、細胞をFACSバッファーでさらに2回洗浄し、PBS中の1％パラホルムアルデヒドで固定した後、CytoFLEXマシン（Beckman）で分析した。細胞内サイトカイン染色については、ゴルジストップ（BD Bioscience）の存在下、フォルボール12-ミリスチン酸13-アセテート（PMA、Sigma）（50ng／ml）＋イオノマイシン（Sigma）（500ng／ml）で細胞を3時間刺激した。その後、細胞を表面染色し、Cytofix/Cytopermキット（BD Bioscience）で固定/透過処理し、表示サイトカインに対する抗体で染色した。細胞内Foxp3およびc-Mafの染色は、製造元の指示に従い実施した（Ebioscience）。Foxp3とYFPの共染色は、細胞を3.7％ホルムアルデヒド（Sigma）で固定し、0.2％Triton X-100で透過させ、FACSバッファー中で90分間、指示した抗体で染色を行った。
本研究では、以下のFACS抗体を使用した： TfR1-APC（1：200、R17217、Invitrogen、17071182）、CD44-APC（1：200、IM7、Biolegend、103012）、CD44-FITC（1：200、IM7、Biolegend、103005）、CD62L-PE／Cy7（1：200、MEL-14、Invitrogen、25062182）、Foxp3-PE（1：100、FJK-16s、Invitrogen、12577382）、CD4-PerCP／Cy5. 5（1:200、GK1. 5、Biolegend、100434）、Foxp3-Pacific Blue（1：100、FJK-16s、Invitrogen、48577382）、CD25-APC（1：200、PC61、Biolegend、102012）、c-Maf-APC（1． 200、sym0F1、Invitrogen、50985582）、HIF-2α-APC（1：100、ep190b、Invitrogen、MA5-16021）、HIF-1α-APC（1：100、Mgc3、Invitrogen、17-7528-82）、抗CD16／32（1：400、2． 4G2、BD Pharmingen™、553142）、IL4-PE／Cy7（1：200、11B11、Biolegend、504117）、IL-17A-APC（1：200、TC11-18H10． 1, Biolegend, 506911）、INF-γ-APC（1:200, XMG1.2, Biolegend, 505810）、CD4-FITC（1:200, GK1.5, BD Pharmingen™, 557307）、 CD11b-PerCP/Cy5. 5 (1:200, M1/70, Biolegend,101228), CD19-PE/Cy7 (1:200, 6D5, Biolegend,115520), CD8-APC (1:200, 53-6.7, Biolegend, 100724), CD4-Pacific Blue (1:200, GK1. 5, Biolegend,100428), CD44-PE (1:200, IM7, Biolegend,103024), OX-40-PE/Cy7 (1:200, OX-86, Biolegend,119415), GITR-APC (1:200, DTA-1, Biolegend, 126312), PD-1-APC (1： 200、J43、eBioscience™、17998582）、Ki-67-APC（1：200、16A8、Biolegend、652406）、CD152-PE/Cy7（1：200、UC10-4B9、Biolegend、106314）、ヘリオスピー／Cy7（1：200、22F6、Biolegend、137236）、ICOS-APC（1：200、7E． 17 G9、Invitrogen、17994282）、CD103- PE／Cy7（1：200、2E7、Biolegend、121425）、Ahr-PE（1：100、4MEJJ、Invitrogen、12-5925-82）。
有責鉄を検出するために、単核細胞をPBSで2回洗浄し、続いて1mMのカルセイン-AM（Invitrogen）で37℃、10分間処理した。この後、前述のようにフローサイトメトリー抗体で細胞を標識した。
腸管前膜細胞の単離
腸を採取し、消化前バッファー（1 mM DTT、10 mM EDTA、10 mM HEPES in PBS）中で37℃、30分間インキュベートして上皮細胞を除去した。残った組織は、1mg/mLのコラゲナーゼD（Worthington）、20μg/mLのDNase I（Roche）、および10％のFBS（Hyclone）を含む消化バッファー中で37℃、30分間、常に撹拌しながら解離した。その後、40-70% Percoll gradient (GE Healthcare)の界面で単核球を回収した。
細胞の精製と培養
ナイーブCD4 T細胞を精製するために、脾臓細胞およびリンパ節細胞を、マウスナイーブCD4+T細胞分離キット（Stem cell）を用いて、製造元の指示に従い精製した。細胞の純度は、日常的に95%以上であった。精製したナイーブCD4 T細胞を、T細胞培地（IMDM、10％FBS、1x抗生物質、2mM L-グルタミン及び50μM β-メルカプトエタノール）中、抗CD3（3μg／mL；2C11）及び抗CD28（2μg／mL；37N）により刺激した。iTreg分化を誘導するために、以下のブロッキング抗体および組換えサイトカインを培養に加えた：抗IL4（5μg/mL）、抗IFNγ（5μg/mL；R46A2）、rhIL2（100U/mL、Peprotech）および5 ng/mL rhTGF-β（RDシステム）。指示された場合、iTreg細胞は、50μM FeSO4（Sigma）、0.1mM 酪酸ナトリウム（Sigma）、1mM ペンタン酸ナトリウム（Macklin）、または50μM PT2385（Selleck）で刺激した。
細胞増殖を解析するために、CD4 T細胞を精製し、CellTrace Violet試薬（Life Tech）で標識し、iTreg条件下で刺激した。
ICP-MS分析
TfR1 cKOマウスおよびWTマウスのTreg細胞中の鉄を測定するために、Tfrcfl/fl Foxp3 YFP-Cre/+またはTfrc+/+ Foxp3 YFP-Cre/+雌マウスのCD25+YFP+ Treg細胞を鉄フリーチューブで選別し、超純HNO3（サーモ）で95℃、1時間溶解させた。溶解液をさらに純水で希釈し、ICP-MS（iCAP RQ, Thermo fisher）による金属分析に供した。
PBMCの鉄分析には、血清を0.1% Triton X 100と0.1% HNO3を含むDI水で20倍に希釈し、ICP-MSで分析した。
Tregのルシフェラーゼアッセイ
HIF-2α 5'-UTR IREのルシフェラーゼ構築物は、以前に報告されている（Mayka Sanchez et al.、2007）。ナイーブCD4 T細胞を精製し、iTreg分化条件下で培養した。分化の72時間後、250万個の細胞を、マウス初代T細胞ヌクレオフェクションキット（Lonza AG）を用いて、9μg pGL3 (HIF-2α-5'UTR)-Luc および 0.5μg renilla luciferase reporter で一過性にトランスフェクトした。12時間静止後、50μM FeSO4、1mM ペンタン酸ナトリウムまたはPBSのいずれかを含む750μL Treg分化培地でさらに12時間培養し、細胞溶解液を調製し、ホタルルシフェラーゼ（FL）とレニラルシフェラーゼ（RL）の活性をデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ（プロメガ）で測定し、FL活性をRL活性で正規化した。
RNA抽出、cDNA合成、定量的Real-Time PCR
Total RNAはRNeasy plus kit (Qiagen, CA)を用いて単離し、cDNAはPrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKara, Japan) を用いて合成した。定量的PCRは、SYBR Premix Ex Taq（TaKara、Japan）を用いて、StepOnePlus real-time PCR system（Life Tech、USA）で実施した。遺伝子発現は、ΔΔCt法を用いて18 S rRNAまたはβ-アクチンに正規化した。プライマー配列は、補足データ3に記載した。
RNA seq解析
Tfrcfl/fl Foxp3 YFP-Cre/+又はTfrc+/+ Foxp3 YFP-Cre/+雌マウスのCD4 T細胞をまず分離し、CD4（BioLegend、GK1.5）、CD25（BioLegend、PC61）に対する抗体で染色し、CD25+YFP+ Treg細胞をフローサイトメトリー（BC MoFlo Astrios、Beckman）により選別してから細胞を溶解してRNAを抽出した。mRNAライブラリーは、NEBNext® Single Cell/Low Input RNA Library Prep Kit (E6420, NEB)を用いて調製した。DNAライブラリーは、Hiseq 2000プラットフォームまたはHiseq X-10プラットフォームで配列決定した。鉄補給によるトランスクリプトーム変化を分析するために、WT Treg細胞をFeSO4（50μM）またはPBSで4日間処理した。解析には、2つの独立した実験からの2組のサンプルを含めた。RNA seqのリードはまずSTAR80でmm9にマッピングし、Deseqで遺伝子発現の差分（RPKM）解析を実施した。ヒートマップはCluster3とJava Treeview81で作成し、遺伝子とサンプルは階層的クラスタリングでクラスタリングした。ジーンオントロジー解析はMetascapeを用いて行った。GSEA解析は、サンプル発現データセット（FPKMマトリックス）と全遺伝子セット（v7.5）を入力として用いた。FDRが10%未満の遺伝子セットが表示用に選択され、正規化濃縮スコア(NES)が報告された。
シングルセルRNA seq
液滴ベースのscRNA-seqデータセットは、Chromiumシステム（10x Genomics）を用いて作成した（10xと称する）。6週齢のTfrcfl／fl Foxp3 YFP-Cre／＋雌マウスからのTreg細胞（CD4＋CD25＋）を上記のように選別し、手動でカウントし、10000個の細胞を捕捉できるようにその濃度を調整し、10x Single Cell 3′ Reagent Kit（V2 chemistry）の標準プロトコルに従った。ライブラリーはNovaSeq 6000プラットフォームで配列決定した。
骨髄移植
6日齢のTfrc flox/flox Foxp3 Cre-IRES-YFPまたはTfrc +/+ Foxp3 Cre-IRES-YFPマウスから骨髄細胞を精製し、抗CD4抗体および抗CD8抗体と磁気ビーズ（Stem Cell）を使用して浸潤T細胞を枯渇させた。その後、骨髄細胞とコンジェニックWT骨髄細胞（CD45.1+）を混合し、移植前日に亜致死放射線（400rad）を照射したRag1-/-マウスに500万細胞を静脈内注入した。キメラマウスは移植8週後に解析された。
養子縁組移植
野生型C57BL/6マウスからCD45.1+CD4+CD45RBhighCD25-(Teff)をフローサイトメトリーでソートした。6日齢のTfrc flox/flox Foxp3 Cre-IRES-YFPマウスまたはTfrc +/+ Foxp3 Cre-IRES-YFPマウスからCD45.2+CD4+YFP+（Treg）細胞をソーティングした。400,000個のTeff細胞と100,000個のTreg細胞マウスを混合して、Rag-1欠損マウスに注射した。レシピエントマウスは、注射時および週3回、12週間またはマウスが最初の体重の20％を失うまで体重を測定した。
レトロウイルス感染
レトロウイルスは、Plat-E細胞に表示されたプラスミドをトランスフェクトすることにより作製した。トランスフェクションの2日後に新鮮なウイルス上清を回収し、ポリブレン（8μg／mL）の存在下で活性化の18時間後および40時間後のTreg細胞の感染に使用した。900gで1.5時間スピン感染させた後、Treg細胞を37℃でさらに2時間培養してから、指示したTreg分化培地に再懸濁した。
統計学と再現性
統計検定はGraphPad Prismバージョン9.0を用いて行い、すべての統計パラメータは図の説明文に報告されている。2つ以上のグループ間の差は、Student's t-testまたはANOVAにTukeyのポストホックテストを加えたもので、適宜、分析した。サンプルサイズは、統計的手法によって予め決定されたものではなく、分析から除外されたデータはなかった。
大腸炎の重症度を評価するため、H&E 染色結果を盲検化した病理医が採点した。その他の実験および結果評価において、治験責任医師はグループ分けについて盲検化されていなかった。確立された大腸炎を用いた実験では、マウスを治療群と対照群に無作為に割り付けた。その他の実験では、無作為に割り付けなかった。
HPM2およびPRISMデータの再解析
2つの公開IBDデータセット（PRISMおよびHMP2）を解析し、クローン病（CD）、潰瘍性大腸炎（UC）患者および非IBD対照者の便サンプルにおけるペンタン酸の存在量を決定しました。本研究では、PRISMデータセットからCD（n = 88）、UC（n = 76）、非IBD（n = 56）と診断された患者220名を選択しました。HMP2データセットには、CD（n = 265）、UC（n = 146）およびIBDでない対照者（n = 135）の546人が含まれていました。便サンプルは、4つのLC-MS法を組み合わせたメタボロームプロファイリングで分析されました。CDまたはUCに分類された参加者は、コントロール（IBDでない）個体と比較されました。具体的には、HMP2コホートにおいて、年齢を連続共変量、4種類の薬剤（抗生物質、免疫抑制剤、化学療法、プロバイオティクス）を二次共変量として、線形混合効果モデルを適用し、ペンタノイン酸レベルを決定しました。PRISMコホートにおけるペンタノエートレベルは、線形回帰モデルに従って評価し、試験同意時の年齢を連続共変量として、投薬（抗生物質、メサラミン、免疫抑制剤、ステロイド）を2値共変量として含めた。さらに、90人（CD、n = 43; UC、n = 25; IBDなし、n = 22）の254のHTXサンプルに基づいて、HMP2からの追加のホストトランスクリプトーム（HTX）を使用して、ペンタノエート存在量に関連付けた。初期正規化は、Rのlimmaパッケージで実装されたvoom法を用いて、サンプルごとの生のHTXカウントデータに対して行われました。正規化されたカウントは、年齢、性別、生検場所をコントロールしながら、遺伝子発現の差を検出するための線形混合効果モデリングの基礎として使用された。スピアマン相関は、HTXの発現とペンタノエートの状態との関連付けに使用された。すべての統計検定は、GraphPad Prismバージョン9.0を用いて実施し、統計パラメータは図の説明文に報告した。
報告書の要約
研究デザインに関する詳細な情報は、この記事にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryに掲載されています。
にアクセスしてください：
補足情報
補足情報(4.0M, pdf)
ピアレビューファイル(1.1M, pdf)
追加補足ファイルの説明(18K, pdf)
補足データ1(31K, xlsx)
補足データ2(3.3M, xlsx)
補足資料3(9.4K, xlsx)
報告書サマリー(313K, pdf)
このページのトップへ
謝辞
Zongyi Zhang、Chao Zhang、Youhui Yangには、施設サポート、技術支援、議論に感謝します。また、蕭長春博士、蕭宜春博士、王志璋博士には、重要な試薬の共有と示唆をいただきました。施設支援と技術支援をいただいたWestlake Universityのadvanced biomedical technology core facility、supercomputing center、Instrumentation and Service Center for Molecular Sciences、laboratory animal resource centerに感謝します。本研究は、浙江省重点研究開発プログラム（2022SDXHDX0002）（XC）、中国国家重点研究開発プログラム（2022YFA0807300、2018YFA0107500、2018YFA0801400）、中国国家自然科学基金（32025016、31870927、81671552 & 81830078）の支援を受けています。このプロジェクトは、Westlake Education FoundationとTencent Foundationから一部支援を受けています。
ソースデータ
ソースデータ(61K, xlsx)
移動します：
著者の貢献
L.Z.が実験を行い、データを分析し、原稿を執筆した。G.L.、Z.L.、T.Q、K.D.、J.Y.、Y.P.、J.Z.、Y.S.が試薬準備、データ分析、原稿作成を支援した。X.C.は、プロジェクトのコンセプト立案、研究の設計と監督、原稿執筆を行った。
に行く：
査読
このページのトップへ
査読情報
Nature Communicationsは、Yatrik Shahおよび他の匿名査読者の本著作物の査読への貢献に感謝します。査読ファイルはこちらです。
こちらへ
データの利用可能性
本論文で作成したハイスループットシーケンスデータは、GEOにアクセッション番号GSE195607 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE195604)で寄託されています。HMP2メタボローム（MBX）およびホストトランスクリプトーム（HTX）の分類学的および機能的プロファイルは、2020年7月にhttp://ibdmdb.org からダウンロードされた。PRISMのマススペクトルデータは、メタボロミクスワークベンチ研究ST000923からダウンロードしたものです。ソースデータはSource Dataファイルとして論文とともに提供されます。ソースデータは本論文に付属しています。
に移動します：
競合する利益
L.ZとX.C.は、Westlake Universityが出願した、TfR1と鉄代謝をターゲットにしてTreg細胞の分化を調節する方法と試薬に関する特許出願の共同発明者です。他の著者は、本研究に関連する競合利益はないことを宣言している。
移動する：
脚注
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属における管轄権の主張に関して中立を保っています。
次へ
補足情報
オンライン版には、10.1038/s41467-023-38444-2で入手できる補足資料が含まれています。
をご覧ください：
参考文献

  1. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to tango: regulation of Mammalian iron metabolism. Cell. 2010;142:24-38. doi: 10.1016/j.cell.2010.06.028. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  2. Ganz T, Nemeth E. 宿主防御と炎症における鉄のホメオスタシス. Nat. Rev. Immunol. 2015;15:500-510. doi: 10.1038/nri3863. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  3. Andrews NC. 鉄代謝：鉄欠乏症と鉄過剰症。Annu. Rev.ゲノミクスHum. Genet. 2000;1:75-98. doi: 10.1146/annurev.genom.1.1.75. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  4. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Targeting iron metabolism in drug discovery and delivery. Nat. Rev. Drug Discov. 2017;16:400-423. doi: 10.1038/nrd.2016.248. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  5. Stein J, Hartmann F, Dignass AU. IBD患者における鉄欠乏性貧血の診断と管理。Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2010;7:599-610. doi: 10.1038/nrgastro.2010.151. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  6. Goldberg ND. 炎症性腸疾患患者における鉄欠乏性貧血。Clin. Exp. Gastroenterol. 2013;6:61-70. doi: 10.2147/CEG.S43493. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  7. Das NK, et al. Microbial Metabolite Signaling Is Required for Systemic Iron Homeostasis. Cell Metab. 2020;31:115-130.e116. doi: 10.1016/j.cmet.2019.10.005. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  8. Laftah AH, et al. Tumour necrosis factor alpha causes hypoferraemia and reduced intestinal iron absorption in mice. Biochem. J. 2006;397:61-67. doi: 10.1042/BJ20060215. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  9. Nemeth E, et al. IL-6 mediates hypoferremia of inflammation by inducing the synthesis of the iron regulation hormone hepcidin. J. Clin. Invest. 2004;113:1271-1276. doi: 10.1172/JCI200420945. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  10. Widbom L, Ekblom K, Karling P, Hultdin J. 炎症性腸疾患を発症した患者は、診断の数年前に鉄欠乏と血漿フェリチンの低下が見られる：ネステッドケースコントロール研究。Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2020;32:1147-1153. doi: 10.1097/MEG.000000001816. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  11. Sheftel AD, Mason AB, Ponka P. The long history of iron in the Universe and in health and disease. Biochim. Biophys. Acta. 2012;1820:161-187. doi: 10.1016/j.bbagen.2011.08.002. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  12. 鉄とその健康への重要性についてのレビュー。J. Res. Med. Sci. 2014;19:164-174. [PMC free article] [PubMed] [Google Scholar].

  13. Lieu PT, Heiskala M, Peterson PA, Yang Y. 健康や病気における鉄の役割。Mol. Aspects Med. 2001;22:1-87. doi: 10.1016/S0098-2997(00)00006-6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  14. Muller S, et al. CD44は鉄のエンドサイトーシスを媒介することでエピジェネティックな可塑性を制御している。Nat. Chem. 2020;12:929-938. doi: 10.1038/s41557-020-0513-5. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  15. Jiang Y, et al. 鉄依存性ヒストン3リジン9脱メチル化はB細胞増殖と体液性免疫応答を制御する. Nat Commun. 2019;10:2935. doi: 10.1038/s41467-019-11002-5. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  16. Wang ZZ, et al. 鉄は、RNA結合タンパク質PCBP1-Mediated Proinflammatory Cytokine Productionを促進することにより、Tヘルパー細胞の病原性を駆動する。Immunity. 2018;49:80-+92.e7. doi: 10.1016/j.immuni.2018.05.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  17. Pantopoulos K. Iron metabolism and the IRE/IRP regulatory system: an update. Ann. N Y Acad. Sci.2004;1012:1-13。doi: 10.1196/annals.1306.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  18. Eisenstein RS, Blemings KP. 鉄調節タンパク質、鉄応答性要素および鉄ホメオスタシス。J. Nutr. 1998;128:2295-2298. doi: 10.1093/jn/128.12.2295. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  19. 転写因子Foxp3による制御性T細胞の発生制御．Science. 2003;299:1057-1061. doi: 10.1126/science.1079490. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  20. 坂口 聡．制御性T細胞：歴史と展望。Methods Mol. Biol.2011;707:3-17.doi: 10.1007/978-1-61737-979-6_1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  21. Josefowicz SZ, Lu LF, Rudensky AY. 制御性T細胞：分化と機能のメカニズム。Annu. Rev. Immunol. 2012;30:531–564. doi: 10.1146/annurev.immunol.25.022106.141623. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  22. Panduro M, Benoist C, Mathis D. Tissue Tregs. Annu. Rev. Immunol. 2016;34:609-633. doi: 10.1146/annurev-immunol-032712-095948. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  23. Cretney E, Kallies A, Nutt SL. Foxp3(+)エフェクター制御性T細胞の分化と機能。Trends Immunol. 2013;34:74-80. doi: 10.1016/j.it.2012.11.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  24. ROR(gammat)(+)細胞によって媒介される腸内細菌叢に対する寛容性．Trends Immunol. 2016;37:477-486. doi: 10.1016/j.it.2016.05.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  25. Yang BH, et al. RORgammatを発現するFoxp3(+)T細胞は、腸の炎症時に抑制能力を高める安定した制御性T細胞エフェクター系譜を表す。Mucosal. Immunol. 2016;9:444-457. doi: 10.1038/mi.2015.74. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  26. Sefik E, et al. MUCOSAL IMMUNOLOGY. 個々の腸内共生生物は、RORγ(+)制御性T細胞の異なる集団を誘導する。Science. 2015;349:993-997. doi: 10.1126/science.aaa9420. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  27. Ohnmacht C, et al. MUCOSAL IMMUNOLOGY. 微生物叢はRORgammat(+)T細胞を通じて2型免疫を制御する。Science. 2015;349:989-993. doi: 10.1126/science.aac4263. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  28. 田之上哲也、阿多羅志、本田耕一郎：腸管制御性T細胞の発生と維持．Nat. Rev. Immunol. 2016;16:295-309. doi: 10.1038/nri.2016.36. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  29. Neumann C, et al. c-Maf依存的なTreg細胞の腸内TH17細胞およびIgAの制御は、宿主-微生物叢のホメオスタシスを確立する。Nat. Immunol. 2019;20:471-481. doi: 10.1038/s41590-019-0316-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  30. Xu M, et al. c-MAF依存性制御性T細胞は、腸のパソビオントに対する免疫寛容を媒介する。Nature. 2018;554:373-377. doi: 10.1038/nature25500. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  31. Rubtsov YP, et al. Regulatory T cell-derived interleukin-10 limits inflammation at environmental interface. Immunity. 2008;28:546-558. doi: 10.1016/j.immuni.2008.02.017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  32. Pinto JP, et al. Tリンパ球によるNTBIの取り込みの生理的意味. Front Pharmacol. 2014;5:24. doi: 10.3389/fphar.2014.00024. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  33. Arezes J, et al. Tリンパ球による非トランスフェリン結合鉄（NTBI）の取り込み：オリゴマーのクエン酸第二鉄種を選択的に獲得する証拠. PLoS One. 2013;8:e79870. doi: 10.1371/journal.pone.0079870. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  34. Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY. Foxp3は、CD4+CD25+制御性T細胞の発生と機能をプログラムする。Nat. Immunol. 2003;4:330-336. doi: 10.1038/ni904. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  35. 免疫異常、内分泌異常、腸疾患、X 連鎖症候群（IPEX）は、FOXP3 の変異によって引き起こされる。Nat. Genet. 2001;27:20-21. doi: 10.1038/83713. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  36. Scara5はフェリチン受容体であり、非トランスフェリン鉄輸送を媒介する。Dev. Cell. 2009;16:35-46. doi: 10.1016/j.devcel.2008.12.002. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  37. Muckenthaler MU, Rivella S, Hentze MW, Galy B. A Red Carpet for Iron Metabolism. Cell. 2017;168:344-361. doi: 10.1016/j.cell.2016.12.034. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  38. Jian JL, Yang Q, Huang X. Src Regulates Tyr(20) Phosphorylation of Transferrin Receptor - 1 and Potentiates Breast Cancer Cell Survival. J. Biol. Chem. 2011;286:35708-35715. doi: 10.1074/jbc.M111.271585. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  39. Miragaia RJ, et al. Regulatory T Cells の Single-Cell Transcriptomics Reveals Trajectories of Tissue Adaptation. Immunity. 2019;50:493-504.e497. doi: 10.1016/j.immuni.2019.01.001. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  40. Zemmour D, et al. Single-cell gene expression reveals a landscape of regulatory T cell phenotypes shaped by the TCR. Nat. Immunol. 2018;19:291-301. doi: 10.1038/s41590-018-0051-0. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  41. Imbratta C, Hussein H, Andris F, Verdeil G. c-MAF, a Swiss Army Knife for Tolerance in Lymphocytes. Front. Immunol. 2020;11:206. doi: 10.3389/fimmu.2020.00206. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  42. Subramanian A, et al. Gene set enrichment analysis： ゲノムワイドな発現プロファイルを解釈するための知識ベースのアプローチ。P. Natl. Acad. Sci.2005;102:15545-15550.doi: 10.1073/pnas.0506580102. [PMC無料記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  43. (株)エヌ・ティ・ティ・ドコモ(株) Cell Syst. 2015;1:417-425. doi: 10.1016/j.cels.2015.12.004. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  44. Lee P, Chandel NS, Simon MC. 低酸素誘導因子とそれ以外による低酸素への細胞適応。Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2020;21:268-283. doi: 10.1038/s41580-020-0227-y. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  45. Sanchez M, Galy B, Muckenthaler MU, Hentze MW. 鉄調節タンパク質は、鉄欠乏症における低酸素誘導性因子-2αの発現を制限する。Nat. Struct. Mol. 2007;14:420-426.doi:10.1038/nsmb1222.Biol.2007;14:420-426. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  46. HIF-2aの翻訳を阻害する低分子化合物は、その5'UTR鉄応答性エレメントを酸素センシングに関連付ける。Mol. Cell. 2008;32:838-848. doi: 10.1016/j.molcel.2008.12.004. [PMC無料記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  47. 前治療歴のある進行性透明細胞腎細胞癌患者に対するファーストインクラスの低酸素誘導性因子-2α拮抗薬であるPT2385の第I相用量漸増試験。J. Clin. Oncol. 2018;36:867-874. doi: 10.1200/JCO.2017.74.2627. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  48. Schodel J, et al. 11q13.3腎臓がん感受性遺伝子座の共通遺伝子変異は、サイクリンD1発現のエンハンサーへのHIFの結合に影響を与える。Nature Genetics. 2012;44:420-U229.DOI：10.1038/NG.2204. [PMC無料記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  49. Luo CT, Liao W, Dadi S, Toure A, Li MO. Treg細胞における段階的なFoxo1活性は、腫瘍免疫と自然発生的な自己免疫とを区別している。Nature. 2016;529:532-536. doi: 10.1038/nature16486. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  50. Deschemin JC, et al. 微生物は腸内細胞の鉄センシングをシフトする。FASEB J. 2016;30:252-261. doi: 10.1096/fj.15-276840. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  51. Reddy BS, Pleasants JR, Wostmann BS. ラットにおける鉄および亜鉛の代謝、ならびに金属酵素の活性に及ぼす腸内細菌叢の影響。J. Nutr. 1972;102:101-107. doi: 10.1093/jn/102.1.101. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  52. Munro HN. フェリチン遺伝子発現の鉄調節。J. Cell Biochem. 1990;44:107-115. doi: 10.1002/jcb.240440205. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  53. 大腸制御性T細胞の誘導とその効果．Science. 2011;331:337-341. doi: 10.1126/science.1198469. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  54. ヒトの微生物叢から合理的に選択されたクロストリジウム菌株の混合物によるT-reg誘導。Nature. 2013;500:232-+6. doi: 10.1038/nature12331. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  55. Round JL, Mazmanian SK. 腸内細菌叢の常在菌による誘導性Foxp(3+)制御性T細胞発生。P Natl. Acad. Sci.2010;107:12204-12209.doi: 10.1073/pnas.0909122107. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  56. Geuking MB, et al. Intestinal Bacterial Colonization Induces Mutualistic Regulatory T Cell Responses. Immunity. 2011;34:794-806. doi: 10.1016/j.immuni.2011.03.021. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  57. Arpaia N, Rudensky AY. 微生物代謝物が腸の炎症反応を制御する。P Natl.Acad. Sci. 2014;111:2058-2059. doi: 10.1073/pnas.1323183111. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  58. Zeng H, Chi HB. 制御性T細胞の発達と機能の代謝的制御。Trends Immunol. 2015;36:3-12. doi: 10.1016/j.it.2014.08.003. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  59. Lotti C, et al. Development of a fast and cost-effective gas chromatography-mass spectrometry method for the quantification of short-chain and medium-chain fatty acids in human biofluids. Anal. Bioanal. Chem. 2017;409:5555-5567. doi: 10.1007/s00216-017-0493-5. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  60. Luu M, et al. 短鎖脂肪酸ペンタノエートは、リンパ球の代謝-エピジェネティッククロストークを調節することにより、自己免疫を抑制する。Nat. Commun. 2019;10:760. doi: 10.1038/s41467-019-08711-2. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  61. Wade F, Odufalu FD, Grosch G, Chambers M, Schroeder K. Primary Care and Gastroenterology Physicians in the Management of Iron Deficiency Anemia in Inflammatory Bowel Diseaseの実践パターン。Gastroenterology. 2020;158:S87-S88. doi: 10.1053/j.gastro.2019.11.219. [CrossRef] [Google Scholar].

  62. Franzosa EA, et al. Gut microbiome structure and metabolic activity in inflammatory bowel disease. Nat. Microbiol. 2019;4:293-305. doi: 10.1038/s41564-018-0306-4. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  63. Lloyd-Price J, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases. Nature. 2019;569:655-662. doi: 10.1038/s41586-019-1237-9. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  64. Gargallo-Puyuelo CJ, Alfambra E, Garcia-Erce JA, Gomollon F. Iron Treatment May Be Difficult in Inflammatory Diseases： 炎症性疾患における鉄の治療は困難である：パラダイムとしての炎症性腸疾患。Nutrients. 2018;10:1959. doi: 10.3390/nu10121959. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  65. ユイルS、ライヒャルトN、パンダS、ダンバーH、マルダーIE. 酪酸と吉草酸の産生によるin vitroでの強力なクラスIヒストンデアセチラーゼ阻害剤としてのヒト腸内細菌。Plos One. 2018;13:e0201073. doi: 10.1371/journal.pone.0201073. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  66. Yilmaz B, Li H. 腸内細菌叢と鉄：健康と病気における重要なアクター(The Crucial Actors in Health and Disease). Pharmaceuticals (Basel) 2018;11:98. doi: 10.3390/ph11040098. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  67. Salovaara S, Sandberg AS, Andlid T. Combined impact of pH and organic acids on iron uptake by Caco-2 cells. J. Agric Food Chem. 2003;51:7820-7824. doi: 10.1021/jf030177n. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  68. ILC2によるIL-10産生にはBlimp-1とcMafが必要であり、細胞代謝を調節し、気道過敏性を改善する。J Allergy Clin Immunol. 2021;147:1281-1295.e1285. doi: 10.1016/j.j.jaci.2020.08.024. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  69. Gabrysova L, et al. c-Mafは、疾患特異的な遺伝子ネットワークを制御し、CD4(+)T細胞のIL-2を抑制することによって免疫応答を制御する。Nat Immunol. 2018;19:497-507. doi: 10.1038/s41590-018-0083-5. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  70. Aschenbrenner D, et al. An immunoregulatory and tissue-residency program modulated by c-MAF in human TH17セル. Nat .Immunol. 2018;19:1126-1136. doi: 10.1038/s41590-018-0200-5. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  71. ワインバーグED. 栄養免疫。宿主が微生物の侵入から鉄を遠ざけようとする。JAMA. 1975;231:39-41. doi: 10.1001/jama.1975.03240130021018. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  72. Qi B, Han M. Microbial Siderophore Enterobactin Promotes Mitochondrial Iron Uptake and Development of the Host via Interaction with ATP Synthase. Cell. 2018;175:571-582.e511. doi: 10.1016/j.cell.2018.07.032. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  73. チェレイユBJ. 鉄のホメオスタシスと腸の炎症とのクロストーク。Gut Microbes. 2010;1:65-69. doi: 10.4161/gmic.1.1.10863. [PMC無料記事] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  74. Hsu TS, et al. HIF-2alpha は制御性 T 細胞の機能に不可欠である。Nat. Commun. 2020;11:5005. doi: 10.1038/s41467-020-18731-y. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  75. Yarosz EL, et al. Cutting Edge: Activation-Induced Iron Flux Controls CD4 T Cell Proliferation by Promoting Proper IL-2R Signaling and Mitochondrial Function. J. Immunol. 2020;204:1708-1713. doi: 10.4049/jimmunol.1901399. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  76. Das M, Alzaid F, Bayry J. Regulatory T Cells under the Mercy of Mitochondria. Cell Metab. 2019;29:243-245. doi: 10.1016/j.cmet.2019.01.012. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  77. Weinberg SE, et al. Mitochondrial complex III is essential for suppressive function of regulatory T cell. Nature. 2019;565:495-499. doi: 10.1038/s41586-018-0846-z. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  78. Fong GH, Takeda K. Role and regulation of prolyl hydroxylase domain proteins. Cell Death Differ. 2008;15:635-641. doi: 10.1038/cdd.2008.10. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  79. フライシュハッカーAS、カイリーPJ. 鉄を含む転写因子とそのセンサーとしての役割。Curr. Opin. Chem. 2011;15:335-341.doi:10.1016/j.cbpa.2011.01.006.Biol. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  80. Dobin A, et al. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 2013;29:15-21. doi: 10.1093/bioinformatics/bts635. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].

  81. Saldanha AJJava. マイクロアレイデータのTreeview-拡張可能な可視化。バイオインフォマティクス。2004;20:3246-3248. doi: 10.1093/bioinformatics/bth349. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
    Nature Communicationsの記事は、Nature Publishing Groupの提供でここに提供されます。
    ama apa mla nlm
    NCBIをフォローする
    NLMとつながる

国立医学図書館
8600 Rockville Pike
ベセスダ、MD 20894
ウェブポリシー
FOIA
HHS 脆弱性の開示
ヘルプ
アクセシビリティ
採用情報
NLM
NIH
米国保健省
USA.gov

この記事が気に入ったらサポートをしてみませんか？