微生物の相互作用がチーズの風味形成を形成する
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出版：2023年12月21日
微生物の相互作用がチーズの風味形成を形成する
https://www.nature.com/articles/s41467-023-41059-2
Chrats Melkonian, Francisco Zorrilla, ...Ahmad A. Zeidan 著者一覧を見る
ネイチャーコミュニケーションズ14巻、論文番号：8348（2023） この記事を引用する
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メトリクス詳細
要旨
チーズの発酵と風味形成は、複数の微生物の活動による複雑な生化学反応の結果である。ここでは、Streptococcus thermophilusとLactococcus株を含む市販のスターターカルチャーを用いて、1年間のチェダーチーズ製造工程における風味形成における微生物の相互作用の役割を研究した。特定の菌株をスターター培養から除外するという実験的戦略を用いることで、我々は、サーモフィラス菌がラクトコッカス菌の増殖を促進し、フレーバー化合物プロファイルを形成する上で重要な役割を担っていることを示した。ラクトコッカス属の単一菌株を系統的に除外した制御乳発酵と、ゲノム解析、ゲノムスケール代謝モデリング、メタトランスクリプトミクスを組み合わせた結果、サーモフィラス菌のタンパク質分解活性がラクトコッカス属の窒素制限を緩和し、デノボヌクレオチド生合成を促進することが示された。S.サーモフィルス菌はフレーバープロファイルに大きく寄与しているが、ラクトコッカス・クレモリス菌は、過剰になるとオフフレーバーとなるジアセチルとアセトインの生成を制限する役割も果たしている。このオフフレーバーの抑制は、L. cremorisがクエン酸をジアセチルとアセトインからα-ケトグルタル酸に代謝的に再ルーティングすることに起因すると考えられる。さらに、近縁のLactococcus lactis株はS. thermophilusと異なる相互作用パターンを示し、チーズ製造における菌株特異性の重要性を浮き彫りにした。この結果は、チーズの風味プロファイルを形成する上で、微生物の競合的および協調的相互作用が重要な役割を果たすことを浮き彫りにした。
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はじめに
微生物コンソーシアムに基づく発酵食品（チーズ、ケフィア、コンブチャなど）は、現代の食生活の大部分を占めており、多くの健康効果が報告されている1,2,3。チーズでは、安定した風味豊かな製品を保証するために、明確に定義されたスターター乳酸菌（SLAB）培養が使用される。チーズ製造中、微生物は、乳発酵中の最初のごちそうに始まり、チーズ熟成中の長い飢餓期間まで、さまざまな栄養利用可能性とさまざまなストレスを特徴とするダイナミックな条件に遭遇する。したがって、チーズ製造は、発酵食品の特性と品質を形成する微生物相互作用の役割を理解するために、よく特徴付けられた動態を持つ制御されたシステムを提供する4。
工業的チーズ製造では、SLAB培養が乳糖発酵による乳の酸性化を担っている。SLABは主に、L. lactisやL. cremorisを含む好中球性ラクトコッカス（Lactococcus）株と、好熱性ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）株から構成されている。単培養におけるこの種の生理については豊富な文献が存在し5,6,7,8、ゲノムスケールの代謝モデルも用いられている9,10,11。対照的に、3つの分類群間の相互作用は、強い相互依存性が示唆されているにもかかわらず、メカニズムの観点からはまだほとんど知られていない12,13。さらに、チーズの微生物間相互作用に関する現在の知見は、簡略化された人工乳培地の範囲に限定されており、ペアワイズ関連に関係するか、乳の酸性化中の短い時間間隔にのみ焦点を当てている。つ以上のSLAB株が関与する相互作用や、チーズの熟成段階において相互作用ネットワークがどのように進化するかについては、あまり知られていない。チーズマイクロバイオームの研究には、メタバーコーディングやメタゲノミクスアプローチも用いられている14,15,16。これらの研究は、高次の分類学を用いたチーズ製造中の群集動態に関する優れた概要を提供する一方で、種間相互作用や菌株レベルの多様性を明らかにするには限界がある。
本研究では、チーズの風味形成における微生物の相互作用と相互作用因子の役割を調べた。我々は、スターター培養から単一菌株または菌株群のいずれかを除去する菌株ドロップアウト戦略を採用した。その後、チーズ製造プロセス全体の包括的な特性評価を行った。ストレプトコッカス・サーモフィルス（ST）1株、主要なL.ラクティス2株（LLm1およびLLm2）、主要なL.クレモリス1株（LC）、およびL.クレモリスとL.ラクティスの21株の混合物（以下、ラクトコッカス・ブレンド（LB））を含む、工業的に適切なSLAB培養物を使用した。S.サーモフィラスとラクトコッカスブレンドを除いた場合の影響を、1年間のチェダー製造実験で調べた（図1a）。その後、相互作用の潜在的な役割を掘り下げるため、S.サーモフィルスよりラクトコッカスの方が増殖に有利であることを明らかにする目的で、コントロールミルク実験を行った。後者については、ゲノミクス、ゲノムスケール代謝モデリング、メタトランスクリプトミクスからメタボロミクスまで、複数の生物学的情報を組み合わせた統合システム生物学的アプローチを用いた（図1b）。
図1：実験デザインと方法の概略図。
図1
a 1年間にわたるチェダー製造実験。SLAB培養は、S. thermophilus 1株（ST）、L. lactis主要2株（LLm1 & LLm2）、L. cremoris主要1株（LC）、Lactococcus株のブレンド（LB）で構成されている。微生物の集団動態は、好熱性球菌、好中性球菌、非始動性乳酸菌（non-SLAB）を識別する生菌計数法を用いて、チーズ熟成中に定量化した。さらに、酸、糖、フレーバー関連有機化合物、ペプチドを測定するいくつかの標的分析化学的アプローチを用いて、チーズの代謝変化を測定した。 b 実験室での制御乳実験と、制御乳実験で使用した方法（1～5）の概略図。この2番目の実験では、さらに3つの主要なラクトコッカス菌株を個別に除去している。数字は、以下のように異なるタイプのデータと分析を示している： 1.メタトランスクリプトミクス、2.メタボロミクス（酸、糖、フレーバー関連有機化合物など）、3.ゲノミクス、4.系統学、5.ゲノムスケール代謝モデル（GEM）と群集シミュレーション。私たちの統合システム生物学的アプローチは、(i)SLABコミュニティのゲノムの解析、(ii)それぞれのGEMの生成とシミュレーション、(iii)異なる菌株除去条件にわたるメタトランスクリプトームの解析、(iv)主要代謝物の定量化を組み合わせた。
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結果と考察
S. thermophilusはラクトコキの増殖をサポートし、チーズ熟成中の代謝物プロファイルを形成する
SLAB培養のメンバー間の相互作用を研究するため、1年間の熟成チーズ製造実験中の集団動態を定量化することから始めた（Methods参照）。4種類のスターター培養を用いた： (すなわち、S. thermophilus（ST）、L. cremoris（LC）、L. lactis（LLm1およびLLm2）、Lactococcus blend（LB）、（ii）（i）と同じであるが、単独で調製したもの（HP）、（iii）LBを除いたもの、および（iv）STを除いたものである（図1a）。S. thermophilusを含む3つの条件では、ラクトコッ チとS. thermophilusの個体数が、9.25から始まり8 log10 CFU/gで終わる、緩やかな減少傾向が観察された（図2a-c）。S.thermophilusを除いた単一条件では、ラクトコッ チの個体数の減少はより急激で、6.5 log10 CFU/gで終 了した（図2a、b）。また、ラクト球菌数の減少は2つのバッチ間で異なる軌跡を示したが、どちらも9ヶ月と12ヶ月で収束した（図2a、b）。非SLAB菌数は、最も多い場合で0から7.5 log10 CFU/gまで増加した（図2d）。95%信頼区間推定値に基づくと、非SLAB菌集団の間に高いばらつきが観察されたが、条件間の全体的な差は認められなかった（図2d）。ラクトコッカス・ブレンドを除いたり、培養中の異なる菌株の詰め方を変えたりしても、群集動態に目に見える変化は見られなかった。したがって、種間相互作用、特にS. thermophilusが関与する種間相互作用が、全体的な個体群動態を動かしているようである。
図2: S. thermophilusはラクトコッカス群集の増殖に寄与し、チーズの最終的な風味に影響を与える。
図2
a-d チーズ熟成中の微生物群動態。(a)中好気性球菌、(c)好熱性球菌、(d)非スターター乳酸菌（非SLAB）のCFUと時間（月）との関係。平均値は線で表し、記号（丸とアスタリスク）はバッチ実験を示し、斜線部分は95％信頼区間推定値を反映する（hも同様）。 b 12ヵ月後の中好気性球菌に関する異なる条件のボックスプロット比較を示す。箱の端は四分位範囲、ひげの端は±1.5×四分位範囲、中央の線は中央値を表す（fと同様）。両側t検定のp値はnsで表示：p > 0.05、*p < = 0.05、***p < = 0.0001。S.thermophilusを除いた場合、中好気性球菌のみが有意に減少した。条件Allは25株からなる全培養株。HPは全培養の代替法（手詰め）。-LB は、L. lactis ブレンド集団を除去したもの。-e-h チーズ熟成中のメタボローム動態。 e メタボローム測定（酸、炭水化物、ペプチド）に基づく全サンプルのUMAPを用いた2次元表示。色はサンプルを採取した時刻を示し、形は4つの異なる条件を示す。f すべての条件を含む異なる時間間隔における代謝物の相対的変化、色と形はいずれも代謝物のクラスを示す。ペプチドの相対的変化が大きく、次いで2週間から3ヶ月の間の酸の相対的変化が大きい。測定された3つの糖（グルコース、ラクトース、ガラクトース）はこのパネルから除外されている。 g 4つの条件について、50の代謝物の中から最も識別性の高い6つの代謝物を選択。色は条件を示し、右側は代謝物のクラスを示す。S.thermophilusが存在しない場合、ガラクトース、ラクトース、乳酸と同様に、ペプチド濃度の大部分が有意に異なることに注意。ペプチドのアミノ酸配列は、上から順にEEEKNRLNF、VNELSKD、ELSKDIGSESTEである。 h 経時的なガラクトース濃度は、S. thermophilusが存在しない場合のガラクトースの不在を強調している。ガラクトース濃度は、チーズの熟成開始時から9ヶ月目まで安定を保ち、その後減少の兆しを示す。すべてのパネルは、n = 4の生物学的に独立したサンプルに基づいている。
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得られたチーズの表現型における微生物間の相互作用の影響を測定するために、標的メタボロミクス解析を用いた。条件全体を通して、チーズの代謝プロファイルに最も大きな変化が観察されたのは、2週間後から3ヶ月間の間であった（図2e）。これは、アミノ酸濃度の一般的な上昇に続く、ペプチド組成の変化に起因すると考えられる（図2f）。さらに、チーズのメタボロームは、3ヶ月から12ヶ月の間、ゆっくりとしたペースで変化し続け、その結果、最終的なプロファイルが異なっている。酢酸、チラミン、g-アミノ酪酸、プトレシン、カダベリンについては、3ヶ月目以降に顕著な化合物の時間依存的蓄積が観察された（図2fおよび補足図1）。S. thermophilus不使用のチーズは、他のチーズとは別のクラスターを形成した（図2e）。このパターンは、特にS. thermophilusが不在の場合、経時的に菌株除去条件によって濃度が有意に異なる化合物に起因すると考えられる。これらの化合物の大部分は、S. thermophilusを添加しなければ蓄積しなかったか、蓄積量が少なかったか、蓄積量が多かったペプチドである（補足図2）。ラクトース、ガラクトース、乳酸の濃度も、S. thermophilusを添加しない場合と添加しない場合で有意に異なることがわかった（図2g、ANOVA F(3,36) = 208 ± 334、p < 0.001、η2 = 0.86±0.08）。具体的には、S. thermophilusがいない場合、ラクトースは完全には消費されず、ガラクトースも生成されなかった（補足図3c）。この差は、チーズ熟成2週目のサンプルですでに顕著であり、チーズ製造終了まで比較的一定であった（図2h、補足図3a、c、e）。これらの結果は、乳発酵中のS. thermophilusの増殖が大きく影響していることを示唆しており、一方、例えばペプチド組成に関する経時的な分化は、チーズの長期熟成中に、増殖していないが活性のある細胞が重要な影響を及ぼすことを示している。
S. thermophilusの存在は、ラクトコッカス群集の増殖とチェダーチーズの最終代謝プロファイルの両方に有益であることがわかった。注目すべきは、2週間から3ヶ月の間、実験室での実験では法外に長いと思われるこの期間までは、成長の恩恵がはっきり見えないことである。その代わり、実験期間が1年に延びるにつれて、この効果はより明らかになる。観察された効果は、牛乳発酵中にS. thermophilusが早期に代謝産物を溢出するため、またはチーズ熟成中にほぼゼロ増殖速度で代謝が変化するためと考えられる7,17,18。いずれの場合も、交差摂食相互作用を促進する可能性がある6。S. thermophilusの溶菌によって細胞質酵素が放出され、ラクトコッカスの増殖が促進される可能性も否定できない19,20。その結果、これらの要因によって、最終的なチーズのペプチド組成が異なることが確認された。文献によると、サーモフィラス菌の存在により、乳発酵からいくつかの重要な代謝的変化が明らかになった；ラクトースの完全消費とガラクトースの生産17,18。組成と代謝のプロフィールを総合すると、ラクトコッカスの個体数とチーズの風味発現に長期的な影響を与えるには、サーモフィラス菌の初期および後期の活性が重要であると結論づけられた。
S. thermophilusはLactococcus lactis群集のメンバーと株特異的な相互作用をする。
S. thermophilusの役割を評価するため、追加菌株を除去した対照実験を行った（図1b）。牛乳発酵が指数関数期から定常期（pH 5）に移行した時点でサンプルを採取し、メタトランスクリプトミクスを用いて遺伝子発現をモニターした。SLAB培養内の微生物相互作用をさらに調べるため、培養中の個々の菌株のゲノムとそれらの系統関係も解析した（図3a）。系統学的解析の結果、L. lactisとL. cremorisという種は2つの異なるグループに分けられた。主要なラクトコッカス株のうち2株、LC株とLLm2株は、培養群内に近縁種が存在しない。3番目の主要ラクトコッカス株LLm1については、ラクトコッカスブレンドに属する2つの近縁株（LL-LB01とLL-LB02）を同定した（図3および補足表1）。ラクトコッカス・ブレンドに属する残りの菌株は、クレモリス・クレード内で明確なサブクラスターを形成していた（図3）。ラクトコッカス株の汎ゲノム解析を採用することで、培養の各メンバーについてシングルトン（すなわち、1つのゲノムにのみ見出される遺伝子）を同定した。シングルトン数が最も多かったのはLLm2株で、次いでLC株、LLm1株で、シングルトン数はそれぞれ288個、134個、79個、平均53.6±18.6個と、ラクトコッカスブレンド株と同じ範囲であった（図3a）。並行して、ラクトコッカス株の存在と活性レベル（メタトランスクリプトミクスを使用）の両方を、ゲノムあたりの転写シングルトンのパーセンタイルを計算することで評価した。その結果、主要なラクトコッカス菌株では転写されたシングルトン数が多かったが、ラクトコッカスブレンドの菌株ではこの数にかなりのばらつきがあり、これらの菌株が活性を持つかどうかに疑問が生じた（図3aおよび補足表2）。我々は、実験中の温度動態が菌株の酸性化能に影響を与える可能性があると仮定した。これを検証するため、個々のラクトコッカス菌株を異なる温度で乳発酵させ、温度ストレス耐性の代理値を算出した（37℃、40℃、43℃に対する30℃の曲線間のピアソン相関）。その結果、L. lactis株は、LL-LB01株およびLL-LB02株（PCC 0.96±0.05）を含め、試験した範囲でより高い温度ストレス耐性を示した。L.cremoris株は低温ストレス耐性（PCC 0.7±0.24）を示し、主要なLC株はこのグループの中で最もストレス耐性が高い株のひとつであった（PCC範囲0.84-0.99）（図3aおよび補足図4a、b）。
図3：異なるラクトコッカス株の除去は、S. thermophilusの遺伝子発現に明確な影響を及ぼす。
図3
a-e：異なる脱落条件下におけるラクトコッカス系統樹とS. thermophilusの転写変化の関係。 a：ラクトコッカス系統樹はL. cremoris株とL. lactis株を分けている。2つのクレードはそれぞれ透明な黄色と灰色で色分けされている。ツリーの先端の色と形は、SLAB培養に含まれる菌株を示す。オレンジの三角形はL. cremoris（LC）、濃い青と薄い青の円はL. lactis（LLm1とLLm2）、ティールの四角はLactococcus blend（LB）を表す。ツリーの空の先端は、得られたラクトコッカスのNCBI完全ゲノムに対応する。追加情報はツリーの外側の層に示されている。最初の層は、SLAB培養のゲノムに基づくユニークなk-mer含有量を示し（紫色のスケールカラー）、培養内に近縁種を持たない菌株ほど高い数を示している。第2層は、30℃と40℃の個々の酸性化曲線間のピアソン相関係数（PCC）に基づく温度ストレス耐性の代用値を示している（赤色スケール）。高い値は高い温度耐性に対応する。クレードL. cremorisは、主要なLC株を含む少数の例外を除いて、より低い温度耐性を示す（詳細は補足図5に示す）。b-eボルケーノプロットは、S. thermophilusの転写を群集全体（All）と異なるラクトコッカス脱落条件との間でそれぞれ示している。色は4つのラクトコッカス成分に対応している。S.thermophilusの転写は、LLm1に続いてLBを除いた場合に大きく変化することが観察された。LCを除いた場合は21遺伝子と少なく、LLm2を除いた場合は1遺伝子のみであった。
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次に、異なる株をどの程度識別できるかを調べた。各ゲノム中のユニークなk-merの数は368から622,455であり、それらは系統学的に近縁な系統の存在に依存していることがわかった（図3a）。k-merの転写量は、3つの主要なラクトコッカス株（LC、LLm1、LLm2）と1つのS. thermophilus株の間の識別が可能であることを示したが、ラクトコッカスブレンドの株間の識別は不可能であった（補足図5）。微分発現解析を用いて、各ラクトコッカス菌株／ブレンドを培養から除外し、S. thermophilusのトランスクリプトームに対する相互作用効果を調べた。その結果、LLm1を除いた場合に最も強い反応が見られ、次いでラクトコッカスブレンド、LC、LLm2の順で、それぞれ291、182、21、1遺伝子が有意差をもって発現していた（図3b-e、補足表3および以下の各項）。LLm1とLLm2はともにL. lactis cladeに属するが、後者の株はシングルトン数が最も多く、ユニークk-mer数も2番目に多いという点で際立っている（図3）。近縁度の異なる菌株を除去することにより、異なるラクトコッカス菌株がS. thermophilusの遺伝子発現に異なる影響を与えていることが確認された。この発見は、ラクトコッカス群集内の異なる遺伝的背景と多様な系統関係に起因すると考えられ21、S. thermophilusとラクトコッカス群集間の潜在的な微生物相互作用の多様性を浮き彫りにした。
S. thermophilusのタンパク質分解活性は、窒素源を提供することでラクトコッカス群集に利益をもたらす可能性がある。
種間相互作用のメカニズムを調べるため、培養中の個々の菌株についてゲノムスケールの代謝モデルを作成し、フラックスバランス解析に基づくシミュレーションを行った。増殖培地組成の変化の影響を調べるため、ミルクを模倣した培地の関連するバリエーションにギャップ充填したモデルを作成した。補足図6aは、異なる種のモデル全体の統計量を示し、補足図6bは、モデル全体にわたり、異なる培地上でギャップ充填によって追加された特定の反応を示している（補足注1参照）。個々のモデルによるフラックスバランスシミュレーションは、発酵乳と非発酵乳の好気性と嫌気性の異なるモデルセットを用いて実施した（図4a、b、補足図6c、d）。成長が可能なシミュレーションでは、すべての種が一貫して乳糖を消費した。アミノ酸の摂取／分泌については、菌株間でいくつかの違いが観察された。分岐鎖アミノ酸であるバリンは、S. thermophilusでは1つのシミュレーション条件を除くすべてで排出されたが、LC、LLm1、LLm2ではそれぞれ4つ、6つ、3つのシミュレーション条件で消費された。その他のアミノ酸摂取/分泌予測は、補足注1に報告されている。
図4： S. thermophilusはL. lactis群集にアミノ酸の形で窒素を供給しており、これはde novoヌクレオチド生合成に必要である。
図4
a 個々のモデルとコミュニティーベースのシミュレーションを含む代謝モデリング解析の概要。 b 各代謝モデルセットのミルク培地バリエーションで実施した個々のフラックスバランス解析シミュレーションで予測された交換フラックスの選択。特に発酵産物、アミノ酸、炭素源は、種間の代謝戦略の違いを強調している。 c ミルク培地バリエーションにおけるコミュニティシミュレーションから予測された代謝交換を示す沖積図。代謝クロストークが予想されるすべてのシミュレーション条件において、アミノ酸バリンが強く予測されていることが強調されている。使用した4つの代謝モデルは、オレンジ色のL. cremoris（LC）、紺色と水色のL. lactis（LLm1とLLm2）、緑色のS. thermophilus（ST）に対応する。d-i 全菌株のSLAB培養における主要機能のAll条件と-ST条件（S. thermophilusは除外）の間のトランスクリプトーム・プロファイル。d-f分岐鎖アミノ酸（BCAA）アミノトランスフェラーゼ、BCAA輸送系2キャリアータンパク質、アンモニウムトランスポーター（T）のトランスクリプトミクス・ボックスプロットは、代謝交換の予測を裏付けている。g-j S.thermophilusを除いた場合のラクトコッカスのグルタミンおよびヌクレオチド代謝のアップレギュレーション。 g-i ボックスプロットは、全コミュニティメンバーの窒素制御タンパク質P-II、グルタミン合成酵素（glnA）および関連転写制御因子（TR）（GlnR）の活性を示す。S.thermophilusを除いた場合、ラクトコッカス株由来のすべての酵素がアップレギュレーションしていることに注意。 j メタトランスクリプトミクスは、エッシャーマップに組み込まれたラクトコッカス反応の活性の増加を表している。k S.thermophilusがラクトコッカス群集に提供する可能性のある化合物、およびS.thermophilusを除いた場合のラクトコッカス群集の転写変化を模式的にまとめたもの。矢印の色と方向は、それぞれ緑／上、赤／下で、アップとダウンの制御を表す。
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相互摂食の可能性を評価するために、SMETANAフレームワークを用いて群集シミュレーションを行った（補足注1参照）。計算されたSMETANAスコアは0から1の範囲で、予測された相互作用の信頼性の尺度として使用した（0が最も信頼性が低く、1が最も信頼性が高い）22。これらのシミュレーションから、S. thermophilusは、コミュニティメンバー間の交換が予測された3つのコミュニティシミュレーション条件（濃厚好気性ミルクでギャップ充填＆最小好気性ミルクでシミュレーション、濃厚嫌気性ミルクでギャップ充填＆最小好気性ミルクでシミュレーション、濃厚嫌気性ミルクでギャップ充填＆最小嫌気性ミルクでシミュレーション）のすべてにおいて、ラクトコッカス株にバリンを供給していることが示された（図4c）。この相互作用は一貫しているだけでなく、すべてのケースでSMETANAスコアが1であったことから、この相互作用が群集の構成と機能を維持するための重要な生態学的相互作用であることが示唆された。S. thermophilusからLLm1へのセリン交換は、3つの群集シミュレーション条件のうち2つで予測され、平均SMETANAスコアは0.38±0.01であった。グリシンとアンモニウムを含むS. thermophilusからLCへの交換は、3つのシミュレーション条件のうち1つで予測され、SMETANAスコアはそれぞれ0.3と0.29であった（図4c）。最後に、アラニンが関与するS. thermophilusからLLm2への交換は、SMETANAスコア0.42の1つのシミュレーション条件でのみ予測された。全体として、代謝シミュレーションは、S.thermophilusが主要な供与体として際立っている、群集メンバー間の相互摂食を強く示している（図4c）。
ゲノム解析と代謝モデル解析を補完するために、S. thermophilusとラクトコッカス群集のトランスクリプトームの変化を調べた。主成分分析（補足図7）は、差分トランスクリプトーム分析（図3b-e、補足注2）とパターンの一致を示した。S. thermophilusのトランスクリプトームの変化については、オリゴペプチド結合タンパク質（AmiA）およびオリゴペプチド輸送系ペルミアーゼタンパク質（OppB、OppC、OppD、OppF）としてアノテーションされた遺伝子がアップレギュレートされていることがわかった（補足注2）。ダウンレギュレートされた7つの遺伝子はトランスポーターとしてアノテーションされており、グルタミンABCトランスポーター透過酵素タンパク質(GlnP)、カドミウム、コバルト、亜鉛/H(+)-K(+)アンチポーターなどである（補足注2）。さらに、カタボリックコントロールタンパク質A（CcpA）のような転写抑制因子や、GTP感知転写多面的抑制因子（CodY）のような窒素代謝調節タンパク質が転写活性を持つことがわかった。代謝モデリングにより予測された相互作用と一致し、分岐鎖アミノ酸（BCAA）トランスアミナーゼとしてアノテーションされた遺伝子がS. thermophilusで発現していることを発見し、バリン生合成が活発であることを示唆した。さらに、BCAA transport system 2 carrier protein (BrnQ)としてアノテーションされた遺伝子も発現しており、S. thermophilusはバリンを分泌していることが示唆された。相補的なパスウェイ濃縮解析により、バリン生合成がS. thermophilusのメタトランスクリプトームで濃縮されていることがさらに支持された（図4d, e）。代謝モデリングとメタトランスクリプトーム解析を総合すると、S. thermophilusはラクトコッカスに対する分岐鎖アミノ酸供与体として働くことが示唆された。ラクトコッカスがバリンを含む多くのアミノ酸補助栄養を持つことはよく知られている1,20,23,24。加えて、SMETANAシミュレーションは、厳しい培地条件下でコミュニティメンバーが採用する可能性のある代謝戦略についての洞察を与えてくれる。
次に、S. thermophilusの存在下と非存在下におけるラクトコッカス群集の転写変化を調べた。全ての異なるラクトコッカス菌株のトランスクリプトーム・プロファイルを区別することは不可能であるため、汎ゲノム解析と汎代謝モデリングのために、これらの菌株を1つのグループに統合した。菌株間の転写変化を可能な限り調査した（補足注2参照）。S.thermophilusを除いた場合、ラクトコッカスで最も発現が上昇したOGは、窒素同化に関与する窒素制御タンパク質P-II、関連転写制御因子（GlnR）、アンモニウムトランスポーター（amtB）、グルタミン合成酵素（glnA）、グルタミン輸送ATP結合タンパク質（glnQ）であった。さらに、ラクトコッカスのGlnRが3つのオペロン、すなわちamtB、glnA、glnQを制御していることも確認した（図4f-i、補足表4、補足注2）。プリンおよびピリミジン生合成経路は協調的に発現している。特にウリジンとグアニンの合成につながる反応に関連する遺伝子の発現が上昇した（図4jと補足注2）。両経路はL-グルタミン合成酵素を介してつながっている。アミノ酸代謝における発現パターンは、アップ制御とダウン制御の両方が混在したパターンを示している（補足注2参照）。全体として、メタトランスクリプトミクス解析は、S. thermophilusがラクトコッカス菌群を相互摂食していることをさらに裏付けている。共培養研究では従来、競争的相互作用が強調されてきたが25、最近の証拠では、群集形成における相互摂食の協調的相互作用の重要性が強調されている26。ここで、確認された相互摂食相互作用を説明する一つの仮説は、S. thermophilusのタンパク質分解活性が高いため、ラクトコッカスが利用するペプチドやアミノ酸（利用可能な窒素源）が培養液中に多く供給される、というものである27,28。S. thermophilusが不在の場合、窒素の利用可能性が低くなるため、ラクトコッカスの窒素同化およびヌクレオチド合成経路がアップレギュレーションされる。化学的に定義された培地で行われた以前の研究では、S. thermophilusとL. lactis間の重要な相互作用として、タンパク質分解とアミノ酸交換も同定されている13。
チーズの風味成分はラクトコッカス菌群内の相互作用に強く影響される
チーズ風味の発現におけるSLAB菌株間の相互作用の役割を解明するため、標的メタボロミクス解析を行った。L.クレモリス（LC）を除いた場合、最も強い代謝反応が見られ、次いでLLm1、S.サーモフィルス、ラクトコッカスブレンドを除いた場合、弱く異なる反応が見られた（補足注3参照）。驚くべきことに、LLm2を除いた場合、酸性化乳の代謝プロファイルに顕著な変化は見られなかった（図5a）。ヘプタナール、ヘキサナール、2-エチルフラン、2,3-ペンタンジオン、ジアセチル、アセトインの6種類のフレーバー化合物は、有意に高い濃度で検出されるか、このL. cremorisの主要株を除去した場合にのみ生成された（図5b, cおよび補足図8）。全培養とLC欠失培養の間のメタボロームの違いを図5dにまとめた。検出された多くの追加フレーバー化合物は、菌株除去戦略によって有意に変化し（補足図9-10および補足注3）、その大部分は未知の微生物生合成経路または遺伝子クラスターを持つ二次代謝の副産物に対応した。しかし、これらのパターンを調査することで、これらの化合物がSLAB培養内でクロスフィードする可能性が数多くあることが浮き彫りになった。例えば、2,3-ペンタンジオンは、S. thermophilusが存在する場合にのみ乳汁中に検出され、LCが存在しない場合にはより多量に検出されたことから、S. thermophilusからLCにクロスフィードされた可能性がある（補足図8d）。あるいは、観察されたパターンは、2つの菌株間の基質競合の結果である可能性もある。一方、ヘキサン酸エチル、酢酸エチル、2-メチル-3-チオラノンは、LCが産生する可能性が高い（補足図10a、b、d）。
図5：チーズの風味成分は、ラクトコッカス菌群内の相互作用に強く影響される。
図5
a：主要な炭水化物、酸、チーズフレーバー化合物のPCA。最も強い反応はL. cremorisの除去で観察され、次いでLLm1、LB、S. thermophilusの協調的反応が続く。LLm2の除去は測定されたメタボロームに影響を与えなかった。矢印は、観測された変化の原因となった上位5化合物（2,3-ペンタンジオン、ヘキサナール、ジアセチル、アセトイン、酢酸エチル）を表す。 b, cは、それぞれジアセチルとアセトインのシグナル対ノイズ比（S/N）を表す。S. thermophilusが培養に含まれないと、これらの化合物の蓄積は低くなり、L. cremorisが含まれないと、これらの化合物の蓄積は高くなった。黒い横線は、酸性化前のミルクにおける2つの化合物の平均値を示す。箱の端は四分位範囲、ひげの端は±1.5×四分位範囲、中央の線は中央値を表す（fと同じ）。生物学的に独立したn = 3サンプルに基づくパネル。コミュニティ全体（All）に対して、各条件で両側t検定を行った。d SLAB培養全体と、L. cremorisを除去した場合とで変化した化合物を模式的にまとめた（詳細な箱ひげ図については補足図8と10を参照）。色は除去条件を表し、オレンジはL. cremorisの除去を、赤はSLAB培養全体を表す。上向きの矢印は、ミルク中の化合物濃度に対する化合物の増加を示す。e クエン酸からα-ケトグルタル酸へ、またピルビン酸と(S)-2-アセト乳酸を経てジアセチルへ至る代謝エッシャーマップの簡略化。代謝物と反応はそれぞれ黒と灰色で示されている。丸で囲んだものは転写の多い株を、丸で囲んでいないものは転写の少ない株を示す。丸がないのは、対応するオルソログ群遺伝子がないことを示す。クエン酸-ナトリウムシンポーターからジアセチルへの転写フラックスは、ラクトコッカス群集の全てのメンバーに存在することに注意。さらに、LC株とLLm1株は、ラクトコッカス群集の中でもアセト乳酸脱炭酸酵素に関連する遺伝子の転写が高い。ラクトコッカス群集の中でLC株だけが、ジアセチル還元酵素とブタンジオール脱水素酵素、およびα-ケトグルタル酸に対する反応において転写フラックスを示している。 f 異なるシミュレーション培地にわたる代謝モデリングに基づく予測フラックス。
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ジアセチルやアセトインなどのC4アロマ化合物は、バターのようなアロマに特徴的に寄与するクエン酸代謝の誘導体として知られている。ジアセチルの含有量が100gあたり0.05mg以下など少量であれば好ましいが、含有量が多くなるとオフフレーバーにつながる可能性がある29,30。そこで、LC除去によるジアセチルおよびアセトイン濃度の上昇が、メタトランスクリプトーム・プロファイルで説明できるかどうかを調べた。その結果、ジアセチルとアセトインの代謝に関連する遺伝子に発現パターンの違いが見られた。我々は、クエン酸からピルビン酸を経てジアセチルとアセトインに至る代謝経路と、α-ケトグルタル酸に至る代替経路の遺伝子発現レベルを調べた。ラクトコッカス株のみに存在するクエン酸ナトリウムシンポーターは高発現しており、乳汁中に存在するクエン酸をラクトコッカス株が積極的に取り込んでいることが示唆された。クエン酸から、ラクトコッカス株はピルビン酸カルボキシラーゼとアセト乳酸合成酵素反応に関連する遺伝子の発現を示したが、アセト乳酸脱炭酸酵素に関連する遺伝子が高発現したのはLC株とLLm1株だけであった。α-ケトグルタル酸に向かうもう一方の経路では、さらに、アコニテートヒドラターゼとイソクエン酸デヒドロゲナーゼに関連する遺伝子は、LCとS. thermophilusでのみ発現している（図5eと補足図11、12）。異なる培地条件下での代謝モデリングシミュレーションは、アセトインが関与する3つの反応を除いて、メタトランスクリプトミクスの結果とほぼ一致している。これらはアセト乳酸デカルボキシラーゼ（ACLDC）で、LCモデルではフラックスを持たない。また、2,3-ブタンジオールデヒドロゲナーゼ（BTDD_RR）とジアセチルレダクターゼ（ACTD）は、LLm1モデルではフラックスを持つが、LCモデルではフラックスを持たない（図5e, f）。これらを総合すると、L. cremorisの主株が培養液中に存在することで、ジアセチルやアセトインを含むいくつかの主要なフレーバー化合物の望ましくないレベルの上昇が防止される。これは、LC由来のアルコール脱水素酵素の作用などにより、ジアセチルが分解されたためと考えられる。あるいは、LCが培養中の他の菌株とクエン酸で競合し、その後、クエン酸をジアセチルやアセトイン以外の生成物、例えばエチル-ヘキサン酸、エチル-酢酸、2-メチル-3-チオラノンなどに変換している可能性もあり、これは発酵初期に酸化還元電位が急速に低下する混合培養発酵で通常起こる現象である4,31,32。その結果、ジアセチルやアセトインの生成に利用できるクエン酸の総量が減少することになる。
チェダーチーズの風味形成におけるメカニズムとしての微生物間相互作用
微生物群集における相互作用は、幅広い生態系で報告されている33,34,35,36,37。このような相互作用は、食品微生物群集においても広く報告されているが4,38,39,40,41,42、相互作用を媒介する分子因子についての洞察を提供した研究はほとんどない。その場での相互作用の解明は、関与する群集の複雑さだけでなく、牛乳のような培地の複雑さのため、特に困難である。ここでは、ゲノミクス、メタトランスクリプトミクス、メタボロミクス、代謝モデリングを組み合わせて、チェダーチーズ製造における主要な微生物間相互作用を明らかにした。注目すべきは、工業用菌株を用い、1年間という長いチーズ熟成の全サイクルを行ったことである。
S.サーモフィラスが存在する場合、ラクトコッカス菌株群に1年間の著しい増殖効果が認められ、最終的なチーズのメタボロームプロファイルが異なることが報告された。これらの知見に基づき、我々はSLAB培養内の相互摂食相互作用がチーズの風味形成に大きく寄与していると結論づけた。我々の分析では、S. thermophilusがラクトコッカス群に必要な窒素源を供給することで重要な役割を果たしていることが示された。このことは、観察されたラクトコッカス群の増殖効果についての説明を提供し、相互摂食の相互作用とチーズ風味の発現との関連性を立証した。さらに、ラクトコッカス群集内での競合的代謝相互作用を確認した。L. cremoris株は、利用可能なクエン酸をめぐってL. lactis株と競合し、その結果、最終製品中にジアセチルやアセトインなどの主要代謝物が蓄積する。このような相互作用は乳発酵の最初の5時間以内に起こり、最終的なチーズの風味に強く影響する。最後に、ラクトコッカス菌株がサーモフィラス菌の活性に異なる影響を与えることを確認した。あるL.ラクティス菌株の存在は、サーモフィラス菌の活性および最終的なチーズ風味プロファイルの発現にほとんど影響しないが、異なるL.ラクティス菌株の存在は、その両方に大きく影響する。微生物の相互作用を研究しようとする文献では、しばしば菌株の多様性が無視されている。しかし最近の研究では、菌株間相互作用の重要性が強調されており、生態進化のダイナミクスを予測する上で、菌株間相互作用が大きな役割を果たすとしている43。我々の結果は、微生物間の菌株特異的な代謝相互作用がチーズの生化学的プロフィールをどのように形成するかを示し、チーズ風味の微調整を目的とした微生物群の合理的な設計と構築に向けたターゲットを提供する。より広くは、本研究は複雑な食品微生物生態系におけるin situ相互作用を明らかにするためのブループリントを提供する。
方法
スターター乳酸菌培養
確定菌株SLAB培養から選択菌株を除去した場合の影響を調べるため、チーズ製造実験を計画した。野生株はChr. Hansen Culture Collectionから入手したもので、もともとは乳製品や培養物から分離されたものである。この菌株除去戦略を適用することで、菌株の個々の役割だけでなく、微生物群集内での相互作用についても洞察を得ることが可能になる。すなわち、S. thermophilus単株を含む1成分、L. lacticとL. cremoris44の両種に属する21株のラクトコッカス（Lactococcus）多株混合株を単一成分として接種した1成分（以下、ラクトコッカスブレンド）、L. lactis単株を含む2成分、L. cremoris単株を含む1成分である。当初の定義株SLAB培養は25株で構成され、適用した全菌種・全菌株を補足表1に示す。
菌株除去ストラテジーを適用するために、4つの定義菌株SLAB培養をデザインした。条件ALLは、工業的条件下でパックされた25菌株からなるオリジナルの定義菌株SLABに相当する。条件HPは、非工業的条件下で25株を手作業でパッキングした定義菌株SLABに相当する。条件-LBは、ラクトコッカスブレンドを除去したものに相当する。条件-STは、S. thermophilus株を除去したものに相当する。添加量は、チーズ製造工程を一定に保ちながら、チーズタンク内の同じ酸性化プロファイルを目標とするために、条件間で変化させた。熟成2週間後に測定したチーズのpHは5.35、無脂固形分の最終水分は54%±0.5%であった。条件ALL、HP、-LB用に設計された定義菌株SLABは、すべて8.1g/100Lの培養液を用いて投与されたが、条件-ST用に設計された定義菌株SLABは、S. thermophilusによる酸性化への寄与が不足するのを補うため、17.3g/100Lの濃度で投与された。各成分の割合は、成分の情報シートに記載されている、活性単位で表された使用目的に対して生産者が推奨する投与量に基づいて調整した。SLAB培養物中の各成分の最終組成を補足表14に示す。
チーズ製造
チーズはChr.Hansen A/S（デンマーク、Hørsholm）のApplication and Technology Centerで製造した。殺菌チーズミルク（オーガニックミルク、Naturmælk、デンマーク）の組成をMilkoscan™（FOSS、Hillerød、デンマーク）を用いて測定し、タンパク質／脂肪比が0.90になるように殺菌クリーム（オーガニッククリーム脂肪38％、Naturmælk、デンマーク）で脂肪レベルを調整した。チーズミルクを32℃に加熱し、各チーズバットに150kgを充填した。凝固剤（CHY-MAX® Plus、Chr. Hansen A/S）を添加する前に、乳をスターターカルチャーで40分間熟成させた。30分間の凝固後、ゲルを10×10mmの立方体にカットした。ホエーとチーズ粒を10分間撹拌した後、40分間かけて38℃に加熱し、最終的な加熱撹拌時間は45分間で、pH6.4～6.5でホエーを排出した。20分後、チーズ凝乳を12個のブロックに切り分け、pH5.35になるまで次の75分間で3回ブロックに並べ替えた。その後、ブロックを粉砕し、15分間に2回、手作業で塩を添加・混合して、チップを乾燥塩漬した（乾燥物中の塩分1.7～2.0%）。塩漬けされたチップは5分ごとに30分間混合された。成型後、チップを2バールで15分間、次いで5バールで17時間プレスした。チーズは真空パックし、0.5、3、6、9、12ヵ月後にサンプリングするまで9℃で保存した。チーズの総成分（水分、脂肪、タンパク質、全固形分）は、熟成2週間後にFoodScan™（FOSS, Hillerød, Denmark）で推定した。NaCl含量は、自動電位差終点滴定（DL50、Mettler-Toledo A/S、Glostrup、デンマーク）により塩化物濃度を分析することで推定した。 pHは、すりおろしたチーズ10gと脱イオン水10mlを木べらで混ぜて調製したペーストを電位差測定（PHC2002-8、Radiometer Analytical SAS、Lyon、フランス）した。分析はすべて二重に行った。
要約すると、1年間の熟成チーズ製造実験では、3種類のSLAB培養液を4つのミルクタンクに接種した。2つのミルクタンクに菌株一式を接種し、1つは対照として、もう1つは異なる培養の接種方法を試験した（それぞれAllとAll HP）。L.ラクティスブレンド（All-LB）およびS.サーモフィルス単一株（All-ST）のチーズ製造時の効果を試験する目的で、他の2種類の培養液を「菌株除去戦略」を用いて調製した。酸性化段階の後、1年間にわたり、5つの時点でチェダーチーズをサンプリングした。連続する2日に開始した2つのバッチ実験に従った。
微生物群集動態
すりおろしたチーズ（5.0 g）を45.0 gのオートクレーブ処理した2％クエン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5、46℃）と混合した。この混合物をStomacher® ブレンダーで4分間、ミディアム設定でホモジナイズしてチーズを溶解し、存在する細菌を懸濁させた。pH7.0の0.1%ペプトン/0.15M NaClで、必要に応じて10倍希釈液を調製した。30℃で5日間好気的に培養した後、M17寒天培地（Difco、USA）で中好気性球菌（ラクトコッカス）の総個体数を測定した。好熱性球菌（ST）の総個体数は、37℃で3日間好気培養した後、M17寒天培地上で測定した。非SLABの総個体数は、37℃で7日間培養後、Rogosa Agar（Sigma Aldrich、USA）を重層して測定した。微生物分析は各サンプリングポイントで二重に行った。
チーズ中の炭水化物および有機酸
ラクトース、グルコース、ガラクトース、乳酸、クエン酸および酢酸の含量は、アンペロメトリック検出器（Dionex, Sunnyvale, CA, USA）を備えたDionex ICS-3000 RFIC-EG™デュアルシステムを用いて定量した。分離には陰イオン交換カラム（CarboPac® PA20, 3 × 150 mm, 6.5 μm）とイオン排除カラム（IonPac® ICE-AS6, 9 × 250 mm, 8 μm）を用いた。すりおろしたチーズ（3.0 g）を、mM Na-EDTA、30 mMアラビノース、48 mM 2-ヒドロキシイソ酪酸（内部標準物質）を含む15 mlの83 mM PCAと混合し、室温で30分間回転させた。この抽出液を遠心分離し（5000×g、30分、4℃）、上清をろ過した（0.45μm）。上清は分析前に希釈（600倍）した。炭水化物の分析には25μLを注入し、26℃で流速1.3mL/minでKOH濃度を以下のように増加させながら分離を行った： 1mMのKOHで5分間、1mMから20mMのKOHで0.5分間、20mMのKOHで6.6分間保持した後、1mMのKOHで5分間再平衡化した。有機酸の分析には50μLを注入し、溶離液として5%アセトニトリル中0.4mMヘプトフルオロ酪酸を用い、30℃で1mL/分の流速で分離を行った。分析は各サンプリングポイントで二重に行った。
チーズのタンパク質分解
すりおろしたチーズ（2.0 g）を18 mlの蒸留水と混合し、25,000 rpmで2分間混合した（Ultra-Turrax model T25）。この懸濁液を全窒素（TN）、非カゼイン態窒素（NCN）、非タンパク質態窒素（NPN）の測定に使用し、標準規格NF ISO 27871（ISO, 2011）に記載されている分画手順を用いた。各画分の窒素含有量は、標準規格NF EN ISO 8968-1（ISO, 2014）に記載されているケルダール法を用いて測定した。一次蛋白分解度（NCN）と二次蛋白分解度（NPN）は、チーズに含まれるTNのパーセンテージで表した。分析は各サンプリングポイントで二重に行った。
チーズ中のペプチド
ペプチドプロファイルは、液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS/MS）で分析した。すりおろしたチーズ（3.0 g）を15 mlの尿素溶液（8 M尿素、0.01 M HCL、0.1% DTT）と混合し、室温で30分間回転させた。この抽出液を遠心分離した（5000×g、20分、4℃）。上清1mlをエッペンドルフチューブに移し、遠心した（12,000×g、5分、4℃）。上清を分析準備の整ったバイアルに移した。分離は、Agilent 1290 Infinity UHPLC（Agilent, Santa Clara, USA）を用いて行った。注入量は3μLで、逆相カラム（Waters Acquity CSH C18 peptide column (1.7 um, 2.1 × 150 mm)）を使用してペプチドを分離した。MilliQ水（0.1%ギ酸）(A)とアセトニトリル（0.1%ギ酸）(B)を混合し、50℃での2成分直線グラジエント溶出を適用した。使用したグラジエントは以下の通り： 0-0.36分96%A、8分70%A、14分54%A、16分20%A、16.5分まで20%Aを保持し、16.6分96%Aに増加し、21分まで保持した。流速は0.3mL/分であった。検出は、Agilent 6540A 四重極飛行時間型（QTOF）質量分析計（Agilent, Santa Clara, USA）を用いて行った。質量スペクトルは、質量範囲m/z 100-3000のポジティブモードでエレクトロスプレーイオン化を用いて取得した。MS/MS分析は、データ依存の取得を用いた衝突誘起フラグメンテーションを用いて行った。各MSフルスキャンにおいて、最も強度の高い2つのイオンがフラグメンテーションのために選択された。ペプチドの質量は、MassHunter Bioconfirm (ver. B.10.0, Agilent Technologies) を用いてアノテーションし、MassHunter Qualitative analysis (ver. B.09.00, Agilent Technologies) を用いて定量しました。ペプチドの質量は、Peak Studios (Bioinformatics Solutions Inc.) を用いて乳タンパク質の特定の配列に割り当てた。データベースの検索は、質量精度に50ppmの閾値、フラグメントイオンに0.3 Daの閾値を設定して行いました。消化酵素はnoneに設定し、不特定の消化パターンとした。分析は各サンプリングポイントで二重に行った。
チーズ中の遊離アミノ酸
遊離アミノ酸（アルギニンは含まず、分解産物オルニチンを含む）、γ-アミノ酪酸（GABA）、および生体アミン（フェニルエチルアミン、プトレシン、カダベリン、ヒスタミン、チラミン、スペルミジン）の含有量は、ガスクロマトグラフィー質量分析（GC-MS）（7890A & 5975C、Agilent Technologies）を用いて定量した。すりおろしたチーズ（3.0g）を15.0mlのミリQ-水と混合し、室温で30分間回転させた後、遠心分離（5000×g、30分間、4℃）し、上清をろ過した（0.45μm）。各サンプルについて、25μLを225μLのミリQ-水、内部標準として50μLの1.72%ノルバリン、200μLのメタノール/ピリジン32/8%(v/v)と混合した。その後、25μLのクロロギ酸メチルを加え、3000rpmのワールミキサーで5秒間混合した。分析には、DB-XLB 15 m × 0.25 mm × 0.25 μmカラム（Agilent Technologies）に2 μLを注入し、ヘリウムをキャリアガスとして用い、流速1.26 mL/分、110 °C（0分）から320 °C（0分）まで20 °C/分のグラジエントで分析した。分析は各サンプリングポイントで二重に行った。
チーズ中の揮発性化合物
固相マイクロ抽出（SPME）と、SPMEオートサンプラー（Gerstel社製）を装備したGC-MS（7890B & 5977A、Agilent Technologies社製）を用いて、揮発性化合物を分析した。チーズのプラグ（3.0 g）をシリンジで20 mlバイアルに移し、100 μLの内部標準物質を添加した後、バイアルをキャップで閉じた。内部標準物質は、エタノール-d6、ジメチル-d6-ジスルフィド、2-メチル-3-ヘプタノン、ピラジン-d4の10ppm溶液を1-メチル-2-ピロリドンに溶解したものであった。バイアルを60℃で10分間加熱し、20分間の抽出時間でSPMEファイバー（DVB/Car/PDMS Gray, 2 cm, Supelco）に揮発性物質を吸着させた。ファイバーをGSインレットに移し、-50 °Cに2分間保持した後、16 °C/sで150 °Cまで昇温し、12 °C/sで300 °Cまで昇温し、揮発成分を脱離させた。その後、DB-5, 30 m × 0.25 mm × 1 μm カラム（Agilent Technologies社製）で、ヘリウムをキャリアーガスとして0.085 ml/min、325 °Cで揮発性物質を分離した。揮発性成分の質量スペクトルは、m/z 29-209の質量範囲内でMSスキャンを実行して収集した。揮発性成分の同定は、化合物固有の定量イオンと所定の保持指標ウィンドウ内の2つの定性イオンを用いたマススペクトルの比較によって行った。これには、MassHunter (Version B.07.02.1938, Agilent Technologies) を使用しました。結果は、ピークの高さをベースラインノイズで割ったシグナル対ノイズ（S/N）で示されました。3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、12ヶ月のチーズを二重分析した。揮発性化合物については、非常に限定的であることが予想されるため、2週目の測定値が欠落している。最後に、酸、糖、フレーバー関連有機化合物、ペプチドの各クラスに属する30、3、28、248の特徴をそれぞれ測定することで、チーズの代謝プロファイルを定量化した。
ゲノム配列決定とアセンブリー
de novo short read whole-genome shotgun sequencing用のゲノムDNAは、QiaCubeシステム（Qiagen, Germany）のDNeasy Blood and Tissue kitを用いて、各菌株の一晩培養液（OD600 = 1でM17 Broth (Difco) supplemented with glucose）1mLからメーカーのプロトコールに従って抽出した。抽出に先立ち、細胞ペレットをTESバッファー（50 mM TRIS pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.5, 20% sucrose）で2回洗浄し、180 uLの溶解前TETバッファー（20 mM TRIS-Cl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.5, 1,2% Triton X-100, 20 mg/mL lysozyme, 2 μL of 25 U/μL mutanolysin, 4 μl of 100 mg/mL RNase A）に懸濁した。ゲノムライブラリーは、KAPA LTP Library Preparation Kit KK8230 (Roche, Switzerland)を用いて、Biomek 4000 Liquid Handler (Beckman Colter, USA)で調製した。EB buffer (Tris-Cl, pH 8.0)で希釈した500 ngのゲノムDNAの一部をBioruptor® Standard (Diagenode, USA)で12回の超音波処理（30秒ON/OFF）を行い、平均断片サイズ300 bp (CV%: 1.5)になるように機械的に断片化した。断片化したDNAは、KK8230キットの製造元のプロトコールに従って処理した。アダプターライゲーションステップの後、アダプター修飾DNA断片を8サイクルPCRで濃縮した。AMPure XP (Beckman Colter)常磁性ビーズをクリーンアップに使用し、平均サイズ450～550 bpの断片を精製した。gDNAおよび二本鎖DNAライブラリーの濃度は、それぞれQubit dsDNA Broad rangeおよびQubit 1 × dsDNA HS assay（Thermo Fisher Scientific, USA）を用いてQubit® Fluorimeterで測定した。平均 dsDNA ライブラリーサイズ分布は、Agilent HS NGS Fragment (1-6000 bp) キットを用いて、Agilent Fragment Analyzer (Agilent Technologies, USA) で測定しました。ライブラリーを正規化し、NPB溶液（10 mM Tris-Cl、pH 8.0、0.05% Tween 20）で最終濃度10 nMになるようにプールした。0.2NのNaOHで変性させた後、600μLの氷冷HT1バッファーにプールした10pMのライブラリーをMiSeq Reagent kit v3に付属のフローセルにロードし（600サイクル）、MiSeqプラットフォーム（Illumina Inc.
ショートリードの処理はすべて、CLC Genomics Workbenchバージョン9.5.3、9.5.4、または10.1.1で行った。ショートリードは、"Map reads to reference "ツールを用いて、ファージPhi × 174の参照配列にデフォルトのパラメータでマッピングした。マッピングから得られた未マッピングのリードは、PHREDスコア23を閾値として、"Trim Sequences "ツールを用いて、50塩基対未満の長さのリードを破棄するというデフォルト以外のパラメータを用いて、品質のためにトリミングされた。トリミングされたリードは、"De Novo Assembly "ツールを用いて、最小コンティグ長を600塩基対に設定する以外はデフォルトのパラメータでde novoアセンブルされた。その後、Qiagenが作成したカスタムプラグインを使用して、カバレッジ深度の低いコンティグを除去するdecontaminationステップを実行した。このステップでは、まずカバレッジ深度が15倍未満のコンティグをすべて除去し、その後、カバレッジ深度がゲノムアセンブリ全体のカバレッジ深度の中央値の25％未満のコンティグをすべて除去した。フィルターされたコンティグの遺伝子コールは、Prodigalバージョン2.6.2を用いて、デフォルトのパラメータで行われた。最後に、アノテーションされた遺伝子を含むゲノムアセンブリを、Qiagenが作成したカスタムプラグインを用いて、ローカルアノテーションデータベースに対してBLASTで機能アノテーションを行った。
比較ゲノム解析と系統解析
L.ラクティスとL.クレモリスのパンゲノムを、他の菌株の6倍以上のシングルトンを持つことが判明したLC-LB16株を除いて作成した。パンゲノム中のコア、アクセサリー、ユニーク（シングルトン）遺伝子の数は、それぞれ1247、3308、2323である。この汎ゲノムから得られたOGは、比較ゲノム解析とメタトランスクリプトーム解析、および微生物群集モデリングのためのL. lactisとL. cremorisの汎メタボリックネットワークの作成に用いられた。全菌株のゲノムから長さ31 bps (k = 31)までのすべてのk-merを同定し、各菌株のユニークなk-merをフィルタリングした。ユニークなk-merのセットについて、メタトランスクリプトームリードのマッピングを行い、その存在量を求め、7カウント以上のものだけを残した。各株で同定されたユニークk-merの数に基づいて、株ごとのカウント数の正規化を行った。54667遺伝子の総プールから15.8%は、96cd-hit以上のクラスターが3つの分類群間で混在していたため除去された。それでも84.2%は、L. cremorisとL. lactisの違いを調べるには有意な数であると考えられる。系統解析には、L. lactisとL. cremorisの107の完全ゲノムとともに、SLAB培養からの22のゲノムを使用した。CD-HIT (v4.8)をアミノ酸同一性80%の閾値で、カスタムメイドのRスクリプトとともに用いて、464のモノコアマーカー遺伝子セットを同定した45,46。樹形はPhyloPhlAn v3.047を用い、PhyloPhlAnパラメータ"-accurate "と"-diversity low "を用いて構築した。さらに、multiple sequencing alignments (msa)をmuscle (v3.8.1551)で行い、0.99の閾値以上に現れるヌクレオチドが少なくとも1つある列を削除することでトリミングを行った。最終的な最尤樹は、raxmlHPC（v8.2.12）、100ブートストラップ、GTRGAMMAIモデル48,49を用いて、連結したDNA msa上に構築した。
ゲノムスケール代謝モデルの生成とシミュレーション
代謝モデリングには、metaGEMワークフローの原核生物GEM再構成およびシミュレーションモジュールを使用した50。アセンブルしたゲノムのタンパク質配列に基づいて、CarveMe v1.4.151を用いてS. thermophilus、Lactococcus LLm1、LLm2、LCのゲノムスケール代謝モデルを作成した。まず、Prodigal v2.6.352を使用して、対応するDNA fastaファイルからopen-reading-frame注釈付きタンパク質配列ファイルを作成した。さらに、最近発表されたケフィアの乳培地を、モデル生成時のギャップフィリングに使用した42。具体的には、好気性リッチミルク、嫌気性リッチミルク、好気性枯渇ミルク、嫌気性枯渇ミルクという、生物学的に関連性のある4種類のミルク組成を調合した。前者2種の培地は乳の初期組成を表し、後者2種の培地は発酵によって枯渇した後の乳を表す。4種のミルク媒体の各バリエーションにギャップフィルを行い、4種のミルク媒体の各バージョンを生成し、またギャップフィルを行わず、合計20のモデルを生成した。すべてのモデルは、デフォルトのCarveMeユニバーサル細菌モデルテンプレートを使用して生成しました。グラム陽性菌は、グラム陽性菌に比べてサイズが小さいため、一般にペリプラズムコンパートメントをモデル化しないが、自動CarveMeツールで生成されたすべてのモデルにはペリプラズムコンパートメントが含まれていることに留意されたい。Reframed v1.2.1およびcobrapy v.0.20.0代謝モデリングパッケージ53を使用して、4種類の培地バリエーションそれぞれについて、すべてのモデルについて個別のモデルシミュレーションを実施した。ゲノムスケール代謝モデルのコミュニティシミュレーションも、SMETANA v1.2.022を用いて、異なるメディアバリエーションで実施した。結果の生成とプロットに使用したコードを含む関連データはすべて、GitHubで公開されている。
牛乳への接種
すべての牛乳発酵は、デンマークのティングレフにある有機乳業 NATURMÆLK 社の有機低脂肪（1.5%）牛乳で行った。すべての接種の出発材料は、濃縮F-DVS®（Direct Vat Set）株および直接接種用の培養物であった。すべての培養物にF-DVSを0.02%接種した。まず2.0 gのF-DVSを200 mlの冷えた牛乳に移した。混合後、4mlを200mlのあらかじめ温めた牛乳（32℃）に移し、最終発酵を行った。6つの異なる培養ブレンドの菌株と培養の割合を補足表15に示す。
牛乳の酸性化とサンプリング
SLAB培養物については、ウォーターバス内で32℃に保った牛乳をボトルに接種した後、CINACシステム55を用いてpH測定を開始し、酸性化を追跡した。59分後、温度を38℃まで上げ、183分後に温度を最終温度の35℃まで下げ、20時間培養した。pH 5に達した指数関数的成長期の約5時間の酸性化後、各発酵から1 gの発酵乳と1 gの未発酵乳をサンプリングし、200 μlの4 N H2SO4を加え、有機酸、炭水化物、揮発性物質の分析に備えた。さらにmRNA抽出用に1gをサンプリングした。個々のラクトコッカス株の温度ストレスは、4つの温度（30℃、37℃、40℃、43℃）で同じミルクを酸性化し、ミルクのpHレベルを連続的にモニターすることで評価した。
乳中の炭水化物、酸、揮発性物質
炭水化物および低分子有機酸分析に使用する発酵乳サンプルの調製には、1 gまたは1 mLのサンプルを7 mLのガラス管に入れ、200 μLの4N硫酸（H2SO4）でクエンチし、混合した後、分析まで-20 °Cで保存した。炭水化物分析のための分析物はサンプルから抽出され、タンパク質は過塩素酸（PCA）水溶液で処理することにより脱タンパクされ沈殿する。サンプルは定量のダイナミックレンジに合うようにさらに希釈される。内部標準物質としてアラビノースを加える。希釈したサンプルは、Dionex ICS-3000 システム（Thermo Fischer Scientific, Waltham (MA), USA）で分析用陰イオン交換カラムとパルスアンペロメトリック検出器を用いて分析する。定量には1点検量線を使用。濃度は、内部標準物質（アラビノース）で標準化した後、クロマトグラフィーのピーク高に基づいて計算される。低分子有機酸の分析対象物はサンプルから抽出され、タンパク質は脱タンパクされ、PCA水溶液を加えて沈殿する。サンプルはさらに希釈され、定量のダイナミックレンジに収まる。内部標準としてアジピン酸を加える。希釈したサンプルは、分析用イオン排除カラムと抑制導電率検出器を用いて、Dionex ICS-3000またはICS-5000システム（Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA）で分析する。定量には8点検量線を使用。濃度は、内部標準物質（アジピン酸）で正規化した後、クロマトグラフィーのピーク高さに基づいて計算される。
揮発性有機化合物（VOC）サンプルの調製では、各サンプル1gまたは1mLを200μLの4N H2SO4とともにヘッドスペースバイアル（20mL）に移し、テフロンライニングのアルミキャップで密閉した。その後、炎イオン化検出器付きガスクロマトグラフ（GC-FID）（Perkin Elmer, MA, USA）に接続し、HP-FFAPカラムを装備した静的ヘッドスペースサンプラーを使用して、サンプルを同定した。VOCの同定は、標準物質の保持時間との比較に基づいて行われた。インジェクターと検出器は、それぞれ180 °Cと220 °Cに保たれた。オーブンは最初に60℃に加熱し2分間保持した後、230℃に昇温し0.5分間保持した。各サンプル中の各化合物の濃度の算出は、ピーク高さをレスポンスファクターで割った値に基づいて行った。レスポンスファクターは、標準溶液を用いて、ピーク高さを既知のサンプル濃度で割った商によって設定される。標準溶液に使用した化学物質と分析対象物はすべて、ドイツ、ミュンヘンのSigma-Aldrich社から提供された。これらのアプローチにより、5種類の炭水化物、8種類の有機酸、30種類の重要なフレーバー化合物からなる合計43種類の代謝物を測定した。
RNA抽出、配列決定および解析
RNeasy Mini kit（Qiagen 74104）を用いて全RNAを抽出し、NEBNext rRNA Depletion Kit（Bacteria）を用いてrRNAを枯渇させた。その後、NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illuminaを用いてシーケンスライブラリーを調製し、EMBL Genomic C-ore FacilityでIllumina NextSeq 500システム（リード長150 bp）を用いてシーケンスした。RNA-リードは、NGLessパイプラインとsubstrimを使用して、最小品質と長さに基づいて前処理とフィルタリングが行われる。リードが与えられると、すべての塩基が少なくとも与えられた品質であるような最長の部分文字列を見つける。最小品質と最小長さのパラメーターは、それぞれ25と100に設定した。フィルターされたリードは、bbmap (v38.75)を用いてCultureに存在する全菌株のゲノムにマッピングされる。総リード数はサンプル4Bと1Bでそれぞれ4,855,868から18,812,096で、マップされたリードの割合は93-95%の範囲であった（補足表16）56。遺伝子ごとのリード数をカウントするためにhtseq-count（v0.11.2）を用いた57。得られたカウントは、汎代謝ネットワーク用に作成した汎ゲノムに基づいて、オルソロジーグループごとにグループ化した（カスタムpythonスクリプト）。正規化を行い、R58,59のDESeq2（v1.26.0）とSARTools（v1.7.2）を用いて差次的遺伝子発現を行った。遺伝子発現の差分解析では、多重検定を考慮してBH p-value調整60でWald有意性検定を行い、偽陽性率を0.01に制御した。さらなる差次的発現遺伝子、ラクトコッカス汎代謝ネットワーク情報、KEGGパスウェイはカスタム解析に基づいている35,61。系統的な技術的バイアスを補正し、サンプル間でリードカウントを比較できるようにするため、DESeq2を用いてデータを正規化した。各サンプルのスケーリングファクターの中央値を使用した。これは全遺伝子を含むデータに対して行われます。主要な機能制御の検証にはRegPreciseデータベースを使用した62。
一般的な統計解析および計算機解析
Boruta（v8.0.0）、uwot（v0.1.14）、apcluster（v1.4.10）、ggplot2（v3.4.2）、ggrepel（v0.9.3）、ggfortify（v0.4.16）、ggridges（v0.5. 4）、ggbiplot（v0.55）、ggpubr（v0.6.0）、ggalluvial（v0.12.5）、scales（v1.2.1）、tidyverse（v2.0.0）、dplyr（v1.1.2）、plyr（v1.8.8）、reshape2（v1.4.4）、cowplot（v1.1. 1）、patchwork（v1.1.2）、rstatix（v0.7.2）、viridis（v0.6.3）、grid（v4.2.2）、Biostrings（v2.64.1）、readxl（1.4. 2)を使用し、データの解析と可視化、クラスタリング、次元削減、重要度特徴ランキング解析46,63,64,65,66,67,68,69,70,71,72,73,74,75,76,77,78,79,80,81,82,83などのダウンストリーム解析を行った。具体的には、Borutaアルゴリズムはランダムフォレスト84のラッパーであり、ランダム化テストを実行する。チーズ熟成実験における識別代謝物の同定に使用される。重要度の信頼度が0.99（Borutaのデフォルト値）を超える特徴は、情報量が多いものとして扱われた。また、重要度ソースの最大実行数を10,000に増やした。この研究では、統計的分散分析（ANOVA）と、ウィルコクソン順位和検定（wilcox.test）またはスチューデントのt検定（t test）を用いた2群間の一対比較が行われた。その結果のp値は図に報告した。ラクトコッカス株の温度ストレスは、37℃、40℃、43℃での単培養と比較した30℃での単培養の酸性化曲線間のピアソン相関係数（PCC）に基づいてプロキシとして表した。代謝ネットワークはEscher web-tool (v1.5.0)85を用いて可視化した。模式図と図はそれぞれInkscapeで作成し、研磨した。
報告概要
研究デザインに関する詳しい情報は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの利用可能性
メタボロミクス、メタトランスクリプトミクスのカウントテーブルを含むソースデータは、https://github.com/Chrats-Melkonian/mi_cheese86。ゲノムおよびメタトランスクリプトミクスのデータは、バイオプロジェクトID PRJNA950467に寄託されている。SLAB培養のゲノムはBioSample accession SAMN34041181-SAMN34041202に寄託されている。メタトランスクリプトームはSRA accession SRR24029527-SRR24029544 に寄託されている。
コードの入手
結果を再現するコードはhttps://github.com/Chrats-Melkonian/mi_cheese86。
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論文
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謝辞
Mads Bennedsen氏には、Karsten Hellmuth氏、Eric Johansen氏とともに、資金獲得とプロジェクト管理に尽力していただいた。Kosai Al-Nakeeb、Anna Koza、Martin Abel-Kistrup、Jacbo Bælumには、個々の菌株のゲノム配列決定とアセンブリに多大な貢献をしていただいた。Lisandra ZepedaとIda Bærholm Schnellにはチーズのサンプリングに協力してもらった。最後に、個々の菌株の酸性化データを提供してくれたGunnar Øregaardと、有益な議論をしてくれたJannik VindeloevとAna Rute Nevesに感謝する。このプロジェクトはInnovation Fund Denmark (Grand Solution grant no. 6150-00033B; FoodTranscriptomics)およびChr. C.M.は、MiCRop Consortium（NWO/OCW助成金番号024.004.014）の一員として、Dutch Research Councilの支援を受けた。K.R.P.は、欧州連合（EU）のHorizon 2020 Research and Innovation Programの下、European Research Council（ERC）の支援を受けた（助成金契約番号866028）。
著者情報
著者および所属
バイオインフォマティクス＆モデリング、R&Dデジタルイノベーション、Chr. Hansen A/S, 2970, Hørsholm, Denmark
Chrats Melkonian, Inge Kjærbølling & Ahmad A. Zeidan
理論生物学・バイオインフォマティクス、生命科学、ユトレヒト大学、ユトレヒト、オランダ
クラッツ・メルコニアン
オランダ、ワーヘニンゲン、ワーヘニンゲン大学バイオインフォマティクスグループ
メルコニアン
医学研究評議会毒性学ユニット、ケンブリッジ大学、英国ケンブリッジ
フランシスコ・ゾリラ、ソニア・ブラスケ、キラン・R・パティル
欧州分子生物学研究所（EMBL）、マイヤーホフシュトラーセ1、69117、ハイデルベルク、ドイツ
ソニア・ブラスチェ、ダニエル・マチャド、キラン・R・パティル
ノルウェー科学技術大学バイオテクノロジー・食品科学科、トロンハイム、7491、ノルウェー
ダニエル・マチャド
菌株改良、R&D食品微生物学、Chr. Hansen A/S, 2970, Hørsholm, Denmark
メッテ・ユンゲ＆キム・イブ・ソーレンセン
グローバルアプリケーション、食品培養・酵素、Chr. Hansen A/S, 2970, Hørsholm, Denmark
レネ・トランバーグ・アンデルセン
貢献
C.M.：アイデアの整理、執筆、比較ゲノミクス、系統ゲノミクス、トランスクリプトミクス、バイオインフォマティクス解析。F.Z. ゲノムスケール代謝モデリング、群集シミュレーション、執筆。I.K.：初期トランスクリプトミクス、バイオインフォマティクス解析、ゲノムスケール代謝モデリング。M.J.とK.l.Sr.は実験を実施し、「牛乳への接種」と「牛乳の酸性化とサンプリング」に関連する部分の原稿を執筆した。S.B.はmRNA配列決定のための乳発酵サンプルのmRNA抽出を行った。D.M.はメタトランスクリプトミクスの初期データを解析し、モデル再構築と群集シミュレーションを行った。L.T.A.は研究のコンセプト立案、1年間のチェダー製造実験の設計と監督に参加。K.R.P.は研究のコンセプト立案、資金獲得、モデリングの監督、原稿の批評的修正に参加した。A.A.Z.は、研究のコンセプト立案、資金獲得、実験デザイン、データ解析、バイオインフォマティクスの監督、原稿の批評的修正に参加した。
責任著者
Chrats MelkonianまたはAhmad A. Zeidanまで。
倫理申告
競合利益
C.M.、I.K.、M.J.、K.L.Sr.、L.T.A.およびA.A.Z.は、食品発酵用微生物培養の世界的サプライヤーであるChr.Hansen A/Sの現職または前職である。しかし、本研究で示された著者らの見解は、あくまでも科学的根拠に基づくものであり、雇用主の商業的利益を反映するものではない。F.Z.、D.M.、S.B.およびK.R.P.は、競合する利害関係を申告していない。
査読
査読情報
Nature Communications誌は、Maria Kazou氏と他の匿名の査読者の方々の本研究の査読への貢献に感謝する。査読ファイルはこちら。
追加情報
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補足情報
補足情報
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転載と許可
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この記事の引用
Melkonian, C., Zorrilla, F., Kjærbølling, I. et al. 微生物の相互作用がチーズの風味形成を形成する。Nat Commun 14, 8348 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-41059-2
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受領
2023年2月24日
受理
2023年8月15日
掲載
2023年12月21日
DOI
https://doi.org/10.1038/s41467-023-41059-2
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テーマ
応用微生物学
細菌生理学
微生物群集
食品微生物学
システム生物学
この論文の引用元
チーズの風味形成を形成する微生物間相互作用
Chrats MelkonianFrancisco ZorrillaAhmad A. Zeidan
ネイチャーコミュニケーションズ (2023)
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ネイチャー・コミュニケーションズ (Nat Commun) ISSN 2041-1723 (online)
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