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アルブミン尿を伴う1型糖尿病と伴わない1型糖尿病のマルチオミクスシグネチャー

哉百名

アルブミン尿を伴う1型糖尿病と伴わない1型糖尿病のマルチオミクスシグネチャー

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9755599/

Marc Clos-Garcia, Tarunveer S. Ahluwalia, [...], and Oluf Pedersen

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関連データ
補足資料
データ利用規約
要旨
目的・仮説
アルブミン尿の有無にかかわらず、長期にわたる1型糖尿病（T1D）の新しい病態生理学的特徴を明らかにするために、T1D患者および健常対照者（HC）の腸内細菌と血中メタボロームについて調査した。また、代謝的役割に関連するマイクロバイオームの機能的基盤のマッピングを行った。

調査方法
デンマークのSteno Diabetes Center Copenhagenにて、T1D患者161名と健常対照者50名を募集した。T1D症例は、アルブミン尿のレベルに基づいて、正常アルブミン尿、中等度アルブミン尿、重度アルブミン尿増加に層別化された。便サンプルの細菌およびウイルス性マイクロバイオームのショットガンシーケンス、全参加者の血漿中の質量分析法を用いた循環代謝物および脂質プロファイリングを実施した。EggNogとKEGGデータベースを用いて、マイクロバイオームのGut Metabolic Modules（GMMs）への機能マッピングが行われた。マルチオミクスの統合はMOFAツールを用いて行われた。

結果
腸内細菌のβ多様性の測定は、アルブミン尿が中等度または高度に増加したT1DとHCの間で有意に異なっていた。細菌叢の分類学的解析により、T1DとHCで絶対量に差がある51種が同定された（高値17種、低値34種）。アルブミン尿のレベルで層別化すると、10種が中等度アルブミン尿増加群で、63種が重度アルブミン尿増加群で、25種が中等度と重度アルブミン尿増加群の両方で共通かつ差次的に豊富であった。バクテリオームの機能的特徴から、T1DとHCで異なる濃縮度を持つ23のGMMが同定され、そのほとんどが糖とアミノ酸の代謝に関与していた。アルブミン尿の層別化との関連は認められなかった。25のファージがT1DとHCの間で異なる濃度で存在した。このうち6つはアルブミン尿の状態によって変化した。血漿メタボロミクスでは、T1D患者におけるステロイド生成と糖代謝、および循環スフィンゴ脂質の違いが示された。スフィンゴ脂質濃度とバクテロイデス属菌の存在量との関連を明らかにした。MOFAにより、腸内細菌と血漿メタボロームプロファイルの相互作用は減少したが、極性代謝物、脂質、バクテリオーム組成はT1D患者のアルブミン尿レベルのばらつきに寄与していることがわかった。

結論
アルブミン尿のレベルで層別化したT1Dおよび進行性腎臓病患者は、腸内細菌叢と血中メタボロームにおいて異なるシグネチャーを示す。

キーワード：マルチオミクス、1型糖尿病、アルブミン尿、メタボロミクス、マイクロバイオーム、リピドミクス、ファージオーム
1. はじめに
慢性腎臓病（CKD）は、米国における有病率が約15％であり（1）、過去30年間にCKDによる死亡率が41.5％上昇したという記録がある（2）。アルブミン尿の上昇は、CKDの中でも末期腎不全、心血管疾患、死亡と強く関連しています(3)。糖尿病は末期腎不全の主要な原因であり、1型または2型糖尿病患者の約3分の1はCKD（糖尿病性腎症または糖尿病性腎臓病とも呼ばれる）を発症します(2)。1型糖尿病における糖尿病性腎症の進行は、アルブミン尿の増加段階（a）中等度アルブミン尿（以前は微量アルブミン尿と呼ばれていた）（尿中アルブミン30～300mg/gクレアチニン）、（b）重度のアルブミン尿（マクロアルブミン尿またはタンパク尿）（300mg/g以上）、（c）腎機能（糸球体濾過量）の低下、（d）最終的に腎代替療法が必要になることで臨床的に特徴づけることができる。

腸内細菌は常に宿主と相互作用し、ダイナミックなバランスとシナジーを構成しており、それによって代謝機能や生理機能を維持・補完する役割を担っています（4）。T1D動物モデルの研究から、腸内細菌群の変化が腸粘膜バリアの「リーキー」化、自然免疫系と適応免疫系の不均衡を引き起こし、最終的に様々な慢性非感染性疾患の引き金になるという仮説が支持されています（5, 6）。腸内細菌群の多様性が低いと代謝異常と関連し、（7）腸内細菌群異常の状態はT1D患者の代謝状態を悪化させると仮定されている（8, 9）。さらに、糖尿病性腎症におけるバランスの悪い腸内細菌叢の病態生理学的な役割も示唆されています（6）。

最近の研究では、腸内細菌叢がGタンパク質共役型受容体43（GPR43）をアップレギュレートすることにより、宿主のインスリン抵抗性やアルブミン尿の発現に影響を与えるというメカニズムが提唱されています（10）。さらに、腸内細菌叢が宿主の代謝状態に与える影響は、生物間の直接的な相互作用にとどまらず、特定の細菌の代謝産物を介したものであることもわかっています。このような観点から、細菌由来のフェニル硫酸が糖尿病の実験モデルにおいてアルブミン尿を誘導する役割が報告されていることは興味深い（11）。血漿メタボロームに関しては、我々の先行研究（12）を含め、アルブミン尿とスフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン（13）、不飽和脂肪酸およびリン脂質（13-16）との関連を報告する研究は少ない。

このような枠組みで、我々は以前、16S rRNA遺伝子マーカーのアプローチを用いて、アルブミン尿の値で層別したT1D患者の腸内細菌叢の違いを明らかにした(12)。しかし、この方法では分類群の分解能が低いため、種レベルでのバクテリオームとファージオーム、およびバクテリオームの機能的可能性についての深い洞察を得ることはできなかった。本研究では、同じ研究参加者（T1DおよびHC）（12）を対象に、高解像度ホールマイクロバイオームシーケンスとアンターゲット血漿リピドミクスおよび極性代謝物プロファイリングを組み合わせて、シングルおよびマルチオミックプロファイル、およびそれらの機能関係をさらに検討しました。したがって、本研究の目的は、以下の通りである。(1)T1Dをアルブミン尿レベルで層別し、HCにおけるメタゲノム群集の分類学的構成と機能的可能性の両方を解析すること、(2)T1Dをアルブミン尿レベルで層別し、標的としていない血漿メタボロームを特徴付けること、(3)メタボロームとメタゲノム特徴を関連づけ、長期T1Dにおける病態生理マルチコミックスサイン（アルブミン尿あり、なし）について検討することです。

2. 研究成果
2.1. 研究参加者の特徴
本研究は、161名のT1D患者（正常アルブミン尿50名、中等度アルブミン尿増加50名、重度アルブミン尿増加61名）と50名の健常対照者（HC）により構成されている。研究の概要を図1に示す。

図1
図1
研究デザインと解析の概要。研究コホートは、健常者50名とT1D患者161名からなり、アルブミン尿レベルで層別化した：正常アルブミン尿（n=50、アルブミン尿レベル=<3.39mg/mmol）、中等度増加アルブミン尿（n=50、...である）。

研究参加者の年齢は60±11歳（平均±SD）、42％が女性であった。平均糖尿病期間は42±15年で、1型糖尿病（T1D）患者のeGFRは75±25 ml min-1（1.73 m）-2であった。各群の詳細な臨床的特徴はすでに報告されており（12）、今回も補足表1に示した。

アルブミン尿が高値のT1D患者は、降圧剤とプロトンポンプ阻害剤による治療が他より多く行われていた（補足表1 ）。HbA1c、空腹時血漿中のhs-CRPは予想通り高く、ヘモグロビン、総コレステロールとLDLコレステロールの空腹時血漿中濃度は、アルブミン尿の増加で層別化すると、T1D患者ではHCと比較して低くなった（補足表1）。

血清クレアチニンは、正常アルブミン尿のT1Dと比較して、中等度および高度アルブミン尿増加群で高く、対応するeGFR値は低値であった。Bristol stool scale scoreと推定排便回数は、各T1Dアルブミン尿群で同等であった。1日の食事性多量栄養素摂取量は、先に述べたようにアルブミン尿群間で有意に異なっていた（12）。

2.2. 腸内細菌叢のコミュニティ、分類群、機能モジュール
KEGG Orthology (KO) アノテーションを用いて、合計 9,229 個の遺伝子を腸内細菌叢にマッピングした。遺伝子の豊富さ分布（補足図1）、α（またはグループ内）多様性（補足図2）は、希薄化データ（QMP数；補足図3；補足表2）を用いた場合、Shannon index（p=0.02）を除いて4研究グループに特徴がなかった。しかし、ペアワイズ比較では、Shannon指数（pmicro= 0.015, pmacro= 0.004）、またはSimpson指数（pmicro= 0.08, pmacro= 0.02）を用いた場合、中等度および高度アルブミン尿増加群は対照群と比較して低い多様性を示した（補足図2）。

コミュニティバクテリオームの分散は、T1DとHCの間で異なっていた（padonis=0.001）。これらの違いは、主にアルブミン尿が中程度に増加したT1D患者と高度に増加したT1D患者によってもたらされた（ppermanova=0.006）。さらに、T1D個体は、対照群と比較してPCoAプロット上で不均一に分散していた（Jensen-Shannon divergence index）( 補足図4 )。これらの結果は、Wintherらによって以前に報告された16s rRNA遺伝子マーカーの結果と一致していた(12)。

ショットガンシーケンスにより、細菌分類を種レベルまで注釈することができた (Metagenomic species or MGS)。分類学的な注釈は、補足表3に記載した。

その結果、T1DとHCの間で存在量の異なる51の細菌メタゲノム種（MGS、以下種という）を同定した（図2A、B、補足表4）。T1Dでは、Veilonella rogosae (17), Faecalibacterium sp. Clostridiales sp.やLachnospiraceae細菌などの短鎖脂肪酸（SCFA）生産菌の絶対量がHCと比較して低くなっていることが観察された。T1Dでは、Eisenbergiella tayi、Hungatella hathewayi、Ruthenibacterium lactatiformansに加えて、糖分解活性で知られるC. saccharolyticumを含むClostridium属がより多く見られた（図2C、D）。T1D全体とHCの間で観察された細菌分類群（MGS）の差のいくつかは、中等度または重度のアルブミン尿を有するT1D患者とHCの間でも観察された（図2C；補足図5、6 ）。補足図7は、T1Dアルブミン尿サブグループ内のMGS絶対量と、HCと比較して中等度・重度のアルブミン尿増加群に特異的・共通的なMGSの概要を示している。

図2
図2
T1Dと健常者のメタゲノム種（MGS）レベルでの細菌量の違い。(A）T1D患者（n=161）と健常対照者（n=50）のメタゲノム種（MGS）の絶対量の差を示すVolcano plot。...

メタゲノムのショットガンシーケンスをさらに進めることで、メタゲノムの機能的代謝能と嫌気性発酵能を、入力代謝物と出力代謝物によって定義される細胞酵素プロセスを表すGut Metabolic Modules (GMMs) キュレーションの形でマッピングすることが可能になりました。Omixer Reference Pathway MapperとKEGG Orthology (RPM) (18) を用いて計算されたGMMsは、単変量解析によりT1D群ではHC群と比較して存在量に差があった（補足表6 ; 補足図8）。T1Dバクテリオームは、糖分解モジュール（リボース、フコース、トレハロースが最も多い）、アミノ酸代謝モジュール、特に非極性アミノ酸（アラニン、グリシン、イソロイシン、メチオニン、トリプトファン）、次いで酸性アミノ酸（リジン、システイン、ヒスチジン）、極性アミノ酸（スレオニン、グルタミン）に富む（PFDR < 0.10; Supplementary Figure 8; Supplementary Table 6）ことが明らかにされた。

2.3. 腸内ファージオームと1型糖尿病
我々は、被験者に502個の高濃度ファージを同定し、そのうち25個がT1DとHCの間で差次的に濃縮されていた（図3A）。興味深いことに、これらのファージのうち6種類（uvig_37554, uvig_280596, uvig_296393, uvig_436746, uvig_514207, uvig_557689）の相対量はアルブミン尿レベルの上昇とともに変化していました（図3B）。

図3
図3
T1Dと健常対照者におけるバクテリオファージの相対的な存在量の対比。(A）左図は、T1Dと健常者の相対的なファージ量を比較したボルカノプロットである。X軸はクリフデルタ効果...

さらに、CLRで正規化したファージ量は、T1D状態（25ファージ）、糖尿病期間（20ファージ）、eGFR（21ファージ）、血漿クレアチニン（7ファージ）レベルを含む複数の臨床因子（年齢、性別、食事で調整）と逆相関した（補足図9）。ヘマトクリットはヘモグロビンや一部グリコシル化ヘモグロビンと重複して17ファージと関連していることが分かった。これらの関連はすべて、T1D関連ファージと一部重複していた ( 補足図9 ) 。バクテリオーム解析とファージオーム解析から得られたサンプルの分布は、プロクラステス解析で評価したところ、類似していた（相関性＝0.67；図3C）。

2.4. 血漿中メタボロームとリピドーム
2.4.1. 血漿極性代謝物 T1DとHCの間、およびT1D内のアルブミン尿サブグループの間で、398種類の血漿極性代謝物（既知143種類、未注釈255種類）の存在量の差を、単変量および多変量のアプローチで検討した（補足表7）。
T1Dに関連する代謝物のサブセットを同定するために、データセットを70%のトレーニングサンプルと30%のバリデーションサンプルに分割して、部分最小二乗-判別分析（PLS-DA）アプローチ（多変量解析）を使用しました。5つの成分を用いて良好な分離を達成したものの、モデルの再現性には限界がありました（Q2: 25%、補足図10 ）。次に、PLS-DA解析でVIP（Variable Importance in Projection score）≧1の極性代謝物（n=132）を選択し、PCAプロットを作成したところ、T1D群とHC群を効果的に区別できましたが、アルブミン尿群の区別には至りませんでした。(図4A)。

図4
図4
T1Dと健常対照者の血漿極性代謝物および脂質のプロファイル。(A）部分最小二乗判別分析（PLS-DA）によるスコアプロットでは、極性代謝物の寄与が高い（アルブミン尿に与える影響が大きい）極性代謝物が示されました。

T1Dと健常対照者の間で代謝量が異なる58種類の極性代謝物を同定した（PFDR<10%；図4B、C；補足表8）。T1Dでは、1,5-anhydrosorbitolの血漿濃度が有意に低く、次いでコレステロール、ブチルヒドロキシトルエン、一方、lyxofuranoseやβ-D-tagatopyranoseなどのいくつかの糖由来の代謝物が高かった（図4B、補足表8）。T1D群では、アルブミン尿が中等度から高度に増加した群では、リビトール、ベンゼン酢酸、デカン酸、3-フェニルプロパン酸が有意に低く（PFDR＜10％）、高度に増加した群では2，3-ジヒドロキシブタン酸が高く（補図11 ）なっていることが明らかにされた。

2.4.2. 血漿極性代謝産物と代謝経路の機能的濃縮 血漿極性代謝産物の機能的濃縮解析（T1D vs. HC）により、ヒトの代謝経路がいくつか濃縮されていることが確認された。ステロイド生成とステロイド生合成、胆汁酸生合成、ペントースリン酸経路、フルクトース・マンノース分解やガラクトース代謝などの糖代謝経路が主な経路であった（図4C、補足表9）。
2.4.3. 血漿リピドミクス 7,470 種の血漿脂質（既知 476 種、未注釈 6,994 種、補足表 10 ）が、クラスターごとに 3 から 1,054 の範囲で強く相関した 122 の脂質クラスターに分類された（補足表 11、12）。
その結果、T1DとHCの間で差のある60の脂質クラスター（PFDR<10%）を同定した（補足表13）。T1Dのリピドームには、リゾホスホコリン（LPCs）と炭素原子数20から22の未知の脂質が豊富に含まれていた（図4D）。逆に、長鎖セラミド（炭素原子数40-44）とスフィンゴミエリン（炭素原子数30-41）を含む脂質クラスターは、T1D個体と比較してHCで非常に豊富であった。

さらに、T1D内のアルブミン尿の状態によって層別したアノテーションされたリピドームの分布を解析し、これをHCと比較した。炭素原子数の多いトリグリセリド（TG）脂質種（炭素原子数55以上）は、重度のアルブミン尿増加と正の相関を示し、比較的短いTG（炭素原子数40〜55）は、正常アルブミン尿群および中等度のアルブミン尿増加群のいずれにも逆相関していた（図4E）。

2.5. アルブミン尿量に基づくマルチオミックスファクター分析
マルチオミックスファクター解析2（MOFA2）（19）ツールにより、腸内細菌、血漿代謝物（メタボロミクスおよびリピドミクス）、臨床生化学に関するすべてのデータを統合し、因子分解のプロセスにより、どのデータタイプが個人のT1D表現型に最も寄与しているかを特定しました（アルブミン尿状態で層別化した場合）。

因数分解の結果、リピドミクスデータセットが因子構成の大部分（～50％の分散）を説明し、次いで極性代謝物、臨床生化学的変数、腸内細菌群の機能的細菌プロファイリング（GMM）（因数の分散の～30％）が説明することが確認された（図5A）。最後に、バクテリオームの分類学的組成の分析（QMP）は、要因の構成の約15％を説明した。さらに、血漿メタボロームと腸内細菌叢のデータ間の相互作用はかなり限定的で、これら2つのデータタイプを効果的に組み合わせた因子は見つかりませんでした（図5B）。その代わりに、生化学分析と極性代謝物の組み合わせ（因子2および3）は、T1DとHCの個人をよく区別しました。このように、すべてのデータを15個の因子に分割することで、T1Dの状態（および部分的にアルブミン尿レベル）が、生成された主成分に沿った個人の位置に影響を与えるという傾向が観察された（図5C）。

図5
図5
マルチオミックスファクター解析（MOFA）。複数のデータタイプ：メタゲノミクスデータ（分類学的および機能的）、血漿メタボロミクスデータ（極性代謝物およびクラスター化脂質）、生化学データ...を組み合わせた後のマルチオミクスデータ統合の結果。

Factor 2 と Factor 3 で得られた臨床データおよびメタボロミクス成分の詳細は、( 補足図 12 ) に示しています。

2.5.1. 腸内細菌と血液メタボロームの関係 メタボローム組成は他のデータタイプよりも因子組成をよく説明していたため、腸内細菌と血液メタボロームの関係を評価した（図6）。全体として、代謝物の30%はバクテリオームの分類学的プロファイリングと関連し、40%から50%は機能的プロファイリングを介してバクテリオームと関連した ( 補足図13 )
図6
図6
循環代謝産物およびマイクロバイオームの由来と機能性評価で有意に多いもの T1D対健常対照の比較において、循環代謝物および脂質データと腸内細菌叢の起源および機能性を統合したまとめ。...

T1D個体で差次的に多い極性代謝産物はすべてFaecalibacterium prausnitzii、Clostridium spp.、Lachnospiraceae spp.、Eisenbergiella tayiの細菌量に関連していた。

リピドーム組成は，バクテリオーム機能プロファイリング（GMMs）とほぼ関連していた。また、リピドーム組成は、Akkermansia muciniphilaやMethanobrevibacter smithiiなどの特定の細菌や古細菌のごく一部にしか関連しなかった。

3. 3.考察
本研究では、メタゲノム解析に基づく機能アノテーションとマルチオミクスによる因子分解により、腸内マイクロバイオーム、血漿メタボロームおよびリピドームにおいて、これまでの知見（12）と比較して、個別に、あるいは組み合わせて、T1Dに関する複数の追加の分子シグネチャーを同定した。さらに、T1Dの腸内ファージオームプロファイルを提供する。T1DとHCの間では、腸内細菌量と循環代謝物および脂質に最も有意差が認められたが、中等度および重度のアルブミン尿増加群でもHCと比較して、バクテリオームおよび血漿代謝物レベルが有意に濃縮されていることが明らかとなった。バクテリオームの機能解析では、糖、アミノ酸、短鎖脂肪酸（SCFA）の代謝種が、T1DではHCと比較して有意に濃縮されていることが確認されたが、アルブミン尿層別化ではバクテリオームの機能性に有意差は観察されなかった。後者は、腎症の発症が継続的なプロセスであり、マイクロバイオームとメタボロームの両方を一定に変化させることを示唆していると思われる。マルチオミクスにより、循環脂質がT1Dの表現型分散の大部分を説明し、次いで極性代謝物、臨床因子、機能的腸内細菌プロファイリング（GMM）が続いたことを報告した。循環代謝産物と腸内細菌群の間に限定的な相互作用が観察されたものの、循環極性代謝産物と臨床リスク因子の組み合わせが、T1DとHCを最もよく区別することができた。

メタボロームのディープショットガンシーケンスにより、細菌分類を種または株レベルまで注釈することができ（メタゲノム種、MGS）、メタゲノムの機能的代謝能と嫌気性発酵能を種-機能関係またはGut Metabolic Modules (GMM) の形でマッピングすることが容易になりました(18). T1D症例では、アルブミン尿が高度に増加した群でMGSの絶対数が相対的に多く、次いで中等度で、正常アルブミン尿群では少なかった（補足図7）。全体として、T1D群ではHC群に比べMGSの数が多く、絶対量は少なかったようである（図2B）。このことは、多くの免疫疾患が腸内細菌の多様性の喪失と一般に関連しており、特にAkkermansiaとFaecalibacteriumが宿主免疫寛容に寄与する可能性があることから、驚くべきことではないだろう（20）。また、T1D群ではHC群に比べFaecalibacteriumの絶対量が有意に少ないことも報告されている。

T1Dにおける腸内細菌叢の変化は、SCFA産生能の低下と糖質分解活性の上昇をもたらした。SCFAは、炭素原子数1〜6の脂肪族を末端に持つカルボン酸で、酢酸（C2）、プロピオン酸（C3）、酪酸（C4）があり、多糖類や食物繊維の嫌気性発酵により最も多く生産される。SCFAは主にBacteroidetes属（C2およびC3）とFirmicutes属（C4）によって生産され、有益なバクテリアの生存をさらに促進する（21, 22）。食物繊維は炭水化物代謝酵素をアップレギュレートし、腸管上皮バリア機能（特にC4）を強化し、代謝毒素および炎症分子の発現を抑えるSCFAを増加させることができる（23）。C4 SCFAはまた、C4ベースの酸素バランスを介して上皮バリアを維持し、腸内の低酸素濃度を維持する低酸素誘導性因子1（HIF1）の安定性に重要であると考えられている（21）。最近の研究では、SCFAの低下がメタボリックシンドローム(22)や炎症性腸疾患のような自己免疫疾患と関連していることも報告されている(21)。本研究では、ファーミキューテス門に属するClostridiales属の大半の絶対量がT1Dで有意に低いことが示された。多糖類投与によるSCFA産生Clostridiales属菌の増加は、2型糖尿病モデルラットにおいて、血糖値の低下、耐糖能の改善、脂質バランスの回復をもたらすことが報告されており（24）、菌量の低下、それに伴うバクテリオーム機能の低下とT1Dの関係はさらに支持されると考えられる。乳酸産生菌であるR. lactatiformans（25）の絶対量もT1Dで多く、最近T1Dで報告された血中乳酸値の上昇と部分的に一致していました（26）。さらに、糖分解能力を持つことで知られるClostridium Spp.の絶対量もT1Dグループで高かった。興味深いことに、循環タウリンレベルと正の相関があると報告されているH. hathewayiの存在量がT1Dで濃縮されていた(27)。タウリンが高血糖を抑制することを考えると（28, 29）、T1DにおけるH. hathewayiの存在は、高血糖に対する生体の代償機構を説明するものである可能性がある。

T1Dに関連する血漿中の代謝物を機能的に分類すると、ステロイド生成、胆汁酸生合成、糖代謝に富むパスウェイが示唆された。さらに、T1Dの血漿リピドームプロファイルは、循環スフィンゴ糖脂質（SL）レベル、特にセラミドの変化と関連しており、これらは腸内細菌叢、特にBacteroides sp.によって部分的に産生されていた（補足表S14）。スフィンゴ糖脂質は、特に代謝異常における二次メッセンジャーとして生理活性があることが知られている。近年、腸内細菌のスフィンゴ糖脂質が腸管上皮のバリアを通過し、宿主のスフィンゴ糖脂質代謝を変化させることが明らかになった(30)。特に、細菌のスフィンゴ脂質は、T1Dで最も変化する脂質であるセラミドを含む宿主自身のスフィンゴ脂質のプロセシングを阻害している。本研究では、脂質、特に長鎖スフィンゴ糖脂質（セラミドおよびスフィンゴミエリン）は、アルブミン尿の層別化にかかわらず、T1DではHCに比べて数倍も低いことが示された。最近の研究では、我々の知見を裏付けるように、T1Dの宿主循環長鎖セラミドと腎機能低下（13）および糖尿病性腎臓病（14、15）との関連性が観察されている。我々は最近、長鎖スフィンゴミエリンとアルブミン尿（特に正常アルブミン尿に対する重度アルブミン尿の増加）との逆相関を669人のT1D患者において報告した（13）が、これはDCCT/EDIC試験（15）でも観察されたものの、今回の研究ではサンプルサイズの制限からか結論には至らなかった。動物実験では、スフィンゴ糖脂質由来のセラミドが肝臓のインスリン抵抗性に関与することが確認されており（31）、その薬理学的阻害はグルコースホメオスタシスを改善する（32）とされている。しかし、スフィンゴ糖脂質がどのようなメカニズムでアルブミン尿の発生に影響を与えるかは不明である。細菌由来のスフィンゴ糖脂質は、腸管上皮に存在するGタンパク質共役型受容体（33）のリガンドとして作用することが報告されている（34, 35）。これらの結果は、GPR43のアップレギュレーションを介したアルブミン尿誘発性腸内細菌叢作用仮説（10）と一致する。

観察されたメタボロミクスプロファイルは、糖尿病性腎臓病（DKD）の病態生理を調べた我々の以前の研究（36）と一致した。本研究では、T1Dにおける血漿代謝物とアルブミン尿の間にいくつかの関連性を見いだした。主な関連はポリオールで、ソルビトールとリビトールの血漿濃度がアルブミン尿の高値に正比例して高いことが示された。同じ代謝物が、独立したコホートでの検証を指し示し、ヒドロキシ酪酸3,4-ジヒドロキシブタン酸にも当てはまり、これらは中等度と重度のアルブミン尿の増加と関連し、今回の研究でも再現された。最も興味深いのは、ソルビトール3,4-ジヒドロキシブタン酸とキナ酸が、細菌種の多さと強い関連性を示す3つの同定代謝物の中に含まれていたことである（図2）。しかし、T1D群における循環代謝物の機能濃縮の結果は、主にコレステロールの生合成とグルコース代謝の2つの代謝機能に関連する変化として特徴付けることができる。

コレステロールレベルの変化は、ステロイドホルモンの生合成と関連する代謝経路を特異的に濃縮する結果となった。性ホルモンレベルの変化は、生殖能力の低下や心血管疾患のリスク上昇と関連することが、T1Dで以前に報告されており（20）、今回の結果と特定のステロイド代謝の変化に関連している可能性がある。グルコース代謝については、ペントースリン酸代謝経路が我々のデータセットで非常に濃縮されていた。興味深いことに、この代謝経路は、糖尿病性腎症を含む慢性糖尿病合併症に対する保護的な役割が以前から報告されています（21, 22, 37）。

本研究では、マルチオミクスデータをさらに因子分解した結果、循環リピドームがT1Dの表現型分散のほとんど（50％）を説明でき、次いで極性循環代謝物、機能的細菌プロファイル（GMM）、最後に分類学的細菌組成（QMP）が15％説明できることが示された（図5）。しかし、アルブミン尿の程度に基づく区別はできなかった。T1D群とHC群を最もよく区別する2つの異なる相互作用を同定した。これらの因子（因子2および3、図5）は、極性代謝物および生体臨床マーカーで構成されている。興味深いことに、これらの臨床的および代謝物的特徴の中で最も重要なドライバーは、糖尿病期間と糖誘導体の組み合わせであった（補足図12）。しかし、血漿メタボロームと腸内細菌叢のデータとの間には、限られた相互作用しか認められませんでした。メタボロームの起源を調査したところ、アミノ酸代謝に富む関連GMMに反映される細菌量と関連する極性代謝物が見つかりました。同様に、リピドームも、リピドーム組成と糖分解に関与するGMMの存在量との関係を通じて、細菌の機能と関連していた。

この点、腸内細菌叢（38, 39）と血液メタボローム（40）の両方において、特にT1D患者が投薬を受けている期間（糖尿病診断から30〜45年）を考慮すると、投薬の役割を検討する必要がある。我々は、スタチンがClostridia属とRuminococcaceae属の存在量に強い影響を与えることを観察したが、残りの腸内細菌の存在量は処方された薬剤レジームによる影響をあまり受けないようであった。

最も重要な事実は、本研究が横断的研究であり、アルブミン尿の発症に対する腸内細菌群の寄与の評価に限界があることである。また、今回報告された知見は、オミックス技術を組み合わせたバイオインフォマティクス解析に基づいており、標準化されたプロトコルがない最近の研究分野であるため、再現性に支障をきたしています。メタボロミクスのデータ解析も同様で、同定された代謝物のごく一部しかアノテーションすることができませんでした。さらに、本研究におけるファージの同定は、Gut phageデータベース（19）で利用可能なアノテーションに限定されたものであった。最後に、ここで報告された知見は、ある特定のコホートに基づくものである。マイクロバイオームとメタボロームが環境因子と生物学的因子の組み合わせによって影響を受けることを考慮すると、環境条件の異なる別のコホートで検証することで、より確実な結果が得られると思われます。

腸内細菌叢の組成は、食事（41）や運動（42）などのいくつかの環境要因や、糞便微生物叢移植（FMT）によって修正可能であることが知られている。本研究は、アルブミン尿を有するT1D症例における腸内細菌叢の異常と血漿メタボローム組成の変化の関係を実証しており、我々の知見が独立した研究で再現されれば、アルブミン尿を有するT1Dにおける将来の微生物叢ベースの介入の基礎となる可能性がある。そのような介入には、食事の改善や第二世代プロバイオティクスの処方が含まれるかもしれない。

4. 材料と方法
4.1. 研究デザイン
2016～2017年に実施した横断研究では、Steno Diabetes Center Copenhagen（SDCC）の外来診療所で追跡調査を受けた1型糖尿病（T1D）患者161人と年齢・性別が一致した非糖尿病健常対照者50人を募集した(12)。参加者はすべて18歳以上であり、WHOの基準に従って1型糖尿病と診断された。今回の研究参加では、以下の条件のうち少なくとも1つを満たしていることが除外された、（a）非糖尿病性腎疾患、（b）腎不全（推定糸球体濾過量またはeGFR <15 ml min-1[1.73 m]-2）、透析。 73 m]-2）、透析または腎移植；（c）試験組み入れ前の1カ月間にレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系（RAAS）遮断治療を変更；（d）組み入れ前の3カ月間に全身性抗生物質による治療；および（e）全身性免疫抑制剤による治療を受けた者。T1D患者は、試験開始時に測定された、または過去1年以内に連続した3回の尿サンプルのうち2回で記録された尿アルブミン／クレアチニン比（UACR）の最高値（24時間尿中アルブミン量［UAER］またはUACR）に基づいて3種類のアルブミン尿群に層別化された。アルブミン尿のグループ分けは、50人が正常アルブミン尿（30mg/24時間未満またはmg/gに相当する3.39mg/mmol）、50人が中等度アルブミン尿増加（30-299mg/24時間またはmg/gに相当する3.39-33.79mg/mmol）、60人が高度アルブミン尿増加（300mg/24時間またはmg/g以上に相当する33.90mg/mmol）であった。正常アルブミン尿と判定された被験者には、アルブミン尿増加の履歴は記録されていませんでした。重度のアルブミン尿増加群では、同時にeGFR<60 ml min-1[1.73 m]-2に基づいて少なくとも30人が選択された。試験デザインは、Supplementary Section（図1、Supp Text）に記載されている。本研究はヘルシンキ宣言に則って実施され、デンマーク首都圏倫理委員会（プロトコルH-15018107）の承認を得た。参加者全員が書面によるインフォームドコンセントを行い、事後メタゲノム解析のために自己採取した糞便サンプルを提供した（図1）。

4.2. メタゲノミクス
4.2.1. 配列決定 配列決定およびメタゲノム種（MGS）生成は、既報の通り行った（43）。FASTQファイルの品質管理は、KneadData (v. 0.6.1) を用いて、以下のように低品質塩基や宿主ゲノムに由来するリードを除去して実施した。Trimmomatic (v. 0.36) を用いて、Nextera アダプター、Phred スコアが 20 未満の先頭および末尾塩基、サイズ 4 のウィンドウにおける Phred スコアが 20 未満の末尾塩基を削除してリードを品質トリムした。100塩基より短いトリミングリードは廃棄した。ヒト参照ゲノムGRCh38（Bowtie2 v.0.2.3.2、デフォルト設定）にマッピングされたリードは破棄した。両リードがフィルタリングに合格したリードペアは、HQNH（Highquality Non-Host）リードと分類して保持しました。
4.2.2. メタゲノム種の生成 参照遺伝子カタログとして、5000以上のヒト腸管深部配列から作成されたClinical Microbiomics Human Gut 22M gene catalogue (22 459 186 genes)を使用した。MGSのアバンダンスプロファイリングには、1776のリファレンスヒト腸内サンプルでアバンダンスと塩基組成が非常に一貫しているClinical Microbiomics HGMGS v.2.3 セット（44）を使用しました。
HQNHリードはBurrows-Wheeler Alignment (BWA) men (v. 0.7.16a) を用いて遺伝子カタログにマッピングし、精度を高めるオプション (-r 1 -D 0.3) を使用した。PCR/光学的重複はsamtools (v. 1.6)を用いて除去した。100塩基以上のアライメント、アライメントにおける95%以上の同一性、マッピング品質（MAPQ）≥20という基準を満たした場合、個々のリードはマッピングされたとみなされた。ただし、リードの両端が10塩基以上で遺伝子配列にアラインメントできない場合は、マッピングされていないものとした。アラインメント長と同一性の基準を満たし、MAPQの閾値を満たさないリードは、マルチマップされたとみなした。アラインメント長または同一性の基準を満たさないリードは、マッピングされていないと判断した。リードペアは、以下の3つのカテゴリーに分類された。

  1. 個々のリードが両方ともアンマップされたと考えられるリードペア。
    2）両方のリードがマルチマップされている、あるいは異なるMGSの遺伝子にマップされている、あるいは一方がマルチマップされ他方がアンマップされているリードペアは、マルチマップとみなされた。

  2. 両方のリードが同じ遺伝子にマップされたリードペア、または一方のリードが遺伝子にマップされ、他方がアンマップ、マルチマップ、または同じMGS内の別の遺伝子にマップされたリードペア（下記参照）、はマップされたと見なした。遺伝子数表は、マップされたリードペア（各遺伝子）、マップされていないリードペア、マルチマップされたリードペアの数で作成された。
    各MGSについて、そのMGSに特異的で、平均値との相関が高く、平均値からの絶対偏差が低い100遺伝子を「コア」遺伝子と定義した。各MGSの100個のコア遺伝子の総遺伝子数からMGS数表を作成した。ただし、MGSはリードペアがその100個のコア遺伝子のうち少なくとも3個にマップされた場合にのみ検出されたとみなし、この基準を満たさないMGSのカウントはゼロとした。MGS数の表は、有効遺伝子長（リード長を考慮）に従って正規化し、合計が100％になるように正規化し、各MGSの相対的存在量推定値を得た。MGS カウントテーブルの各サンプルから、置換なしのランダムサンプリングにより、ダウンサンプル（希薄化）したMGS存在量プロファイルを算出した。ダウンサンプリング後のカウント数が3未満の値は0とし、カウント数表は有効遺伝子長に従って正規化し、合計が100％になるように正規化した。

4.2.3. 定量的微生物プロファイルの算出 糞便サンプルは、フローサイトメトリーによる細菌細胞カウントに供した。0.08-0.15 gの解凍糞のアリコートを染色用緩衝液（1 mM EDTA (Sigma-Aldrich), 0.01% Tween20 (Sigma-Aldrich), pH 7.2 DPBS (Lonza BioWhittaker), 1% BSA (Sigma-Aldrich)) で 2,118 倍に薄め、糞の細胞数を測定した。糞便溶液からゴミを除去するために、サンプルを滅菌シリンジフィルター（ポアサイズ5μm（pluriSelect））を用いて濾過した。次に、170μLの細菌細胞懸濁液を20μLのDAPI（1mM in H2O、Sigma-Aldrich）で染色した。懸濁液中に存在する細菌細胞のフローサイトメトリー解析は、BD Fortessa LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences社製）を用いて実施した。測定は、あらかじめ設定した0.5μL/secの流速で行った。蛍光イベントは、440/40nm、575/26nm、および695/40nmの光検出器をそれぞれ用いてモニターした。前方散乱光および側方散乱光も収集した。BD FACSDiva™ ソフトウェアを使用して、細菌の蛍光イベントをゲートし、糞便サンプルのバックグラウンドから分離した。前方散乱チャンネル（FSC）の面積には900の閾値が、側方散乱（SSC）チャンネルの面積には200の閾値が適用された。その他のフロー設定は、Supplement Table 16に記載した。
青色蛍光（440/40 nm）対 FSC の密度プロットにより、染色された微生物細胞と装置ノイズやサンプルバックグラウンドとを区別することができた。赤色蛍光（695/40 nm）対FSCの密度プロットにより、計数ビーズと、細菌、装置ノイズまたはサンプルバックグラウンドを含む検査溶液中の他の粒子を区別することができました。測定したサンプルを直接比較できるように、固定テンプレートの形ですべてのサンプルにまったく同じゲートとゲーティング戦略を適用しました。

バクテリアの細胞数は、後に定量的微生物プロファイリング（QMP）に使用され、他の場所で説明されています（45）。簡単に言うと、データを希釈してサンプリング深度を等しくし、細胞数を用いて各MGSの総存在量を計算した。

4.2.4. 腸内代謝モジュールの計算 Emapper ソフトウェア (v. 1.0.3, HMM モード) を用いて、遺伝子カタログの各遺伝子を EggNOG (v. 4.5) orthologous groups データベース (http://eggnogdb.embl.de/) と比較し、65%の遺伝子に対してアノテーションを行った。これらの遺伝子は、MOCAT2 ルックアップテーブル (http://mocat.embl.de/) を用いて、EggNOG から Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) orthology database (http://www.genome.jp/kegg/kegg1.html) にマッピングされた。GMM のアノテーションは、Omixer-RPM (http://www.raeslab.org/software/gmms.html) を用いて R で行われた。GMMのカウントは、MGS QMPカウントに基づくGMM QMPを参照しています。その後，GMM存在量表は中心対数比（CLR）を用いて変換し，正規性を確保するとともに，組成の性質を評価した．
4.2.5. 糞便DNAの塩基配列からファージオームを算出 糞便DNAの塩基配列から得られたバルク配列リードを、BWA memを用いてGut Phageome Database (GPD) (46) に対してアライメントした。得られたファージをquality-filteredし、ファージゲノム長の75%以上にアライメントされたリードのみを保持した。ファージオーム数のデータセットを最小限のリードに希釈し、少なくとも10%のサンプルで検出されなかったファージ(n=21)を除去した。その結果、合計502個のファージが最終的なデータセットに含まれることになった。ファージオーム数は、データの構成比を評価するために、CLRアプローチで変換された。
4.2.6. 分類学的解析のために、糞便細胞数で変換した後、絶対MGS数および／または属クラスター数を使用した。年齢、性別、人種、BMI、食事のデータを調整した線形混合モデルを用いて、有意性を計算した。多重検定補正はFDR（False Discovery Rate）法を用いて計算した。観察された差の効果量は、Cliffのデルタ検定を用いて計算された。GMM 差分解析では、MGS と同じ手法を用いたが、存在量計算を用いた。
4.3. 非標的血漿中極性代謝物および脂質の解析
4.3.1. 極性代謝物 血漿サンプルは分析まで-80 ℃で保存した。極性代謝物の分析は、二次元ガスクロマトグラフィー飛行時間型質量分析計（GC×GC-TOFMS、LECO 社製消耗品不要サーマルモジュレーター搭載 LECO Pegasus 4D）を用いて行った。この方法は、以前に詳細に説明されている(36, 43, 47)。具体的には、血漿サンプル30μlにメタノール400μlと内部標準混合物（ヘプタデカン酸-d33、バリン-d8、グルタミン酸-d5、コハク酸-d4）10μlを添加した。試料をボルテックス混合し、10,000rpmで5分間遠心分離した後、上清の半分を蒸発乾固させた。続いて、まず25μlのメトキサミン（45℃、60分）、次に25μlのN-トリメチルシリル-N-メチルトリフルオロアセトアミド（45℃、60分）を加え、メトキシ化およびトリメチルシリル化による二段階誘導体化を行った。最後に、保持指標標準混合物（n-アルカン）と注入標準（4,4′ -ジブロモオクタフルオロビフェニル）（いずれも50μlヘキサン中）を添加した。キャリブレーションは、定量された各代謝物について6点から構成されました。
カラムは、フェニルメチル不活性化リテンションギャップ (1.5 m × 0.53 mm i.d.) を 10 m × 0.18 mm Rtx-5MS (相厚 0.18 μm) および 1.5 m × 0.1 mm BPX-50 (相厚 0.1 μm) に接続しました。キャリアガスにはヘリウムを用い、定圧モード(40psig)で使用した。2次元では4秒の分離時間を使用した。1次元目のカラムの温度プログラムは以下の通りであった。50℃（2分）、7℃/分で240℃まで、25℃/分で300℃（3分）。

2 次元カラムの温度は、プログラム中、対応する 1 次元カラムより 15°C 高くした。

サンプル内のデータ処理にはChromaTOF 4.72 vendor software (LECO) を、サンプル間のアライメント、正規化、ピークマッチングにはGuineu software (43) を使用した。正規化は内部標準物質による補正で行い、特定の標的代謝物は外部検量線を用いて追加定量した。化合物は、社内および NIST14 (48) のライブラリエントリとの比較によって同定されました。

全極性代謝物 398 種のうち、143 種は注釈付きで、残りの 255 種は未注釈でした。正規化および対数変換されたデータは、まず個人のeGFR（eGFR Calculator｜National Kidney Foundationでアクセス可能）に合わせて調整されました。得られたデータは、その後の解析に使用された。我々は、一変量-多変量解析を組み合わせて、T1D患者と健常対照者、およびアルブミン尿のレベルで層別した異なるT1Dサブグループの識別に関連する特徴を特定するために使用した。そのために、性、年齢、BMI、食事データを固定効果として、主成分分析（PCA）、偏最小二乗判別分析（PLS-DA）、線形混合モデルを使用した。比較した2群間の代謝物量の差は、クリフのデルタ効果量を用いて求めた。得られたすべてのp値は、10％のFDR閾値を有意とみなして、偽発見（FDR）アプローチで多重検定を調整した。

次に、Human Metabolome Database（HMDB）を使用して極性代謝物のアノテーションを行い、MetaboAnalystツール（49）による機能濃縮解析を可能にしました。そのため、HMDB でアノテーションされた極性代謝物の存在量を正規化、中心化、スケール化したデータセットをアップロードしました。その後、代謝経路に関連する代謝物セットを選択し、研究参加者において差次的に濃縮された代謝経路を計算した。

4.3.2. 血漿リピドミクス 血漿サンプルは、分析まで-80℃で保存した。サンプル調製にはFolch手順（50）を使用し、Steno Diabetes Center Copenhagen（13、51、52）で以前に発表された方法に基づいて若干の修正を加えた。簡単に言うと、血漿サンプルを無作為化し、クロロホルム：メタノール（2：1 v/v）を用いて10μLの血漿から脂質を抽出し、9種類の内部標準（安定同位体標識および非生理的脂質種）を添加した後、血漿を抽出した。サンプルは、Agilent Technologies (米国カリフォルニア州サンタクララ) の超高速液体クロマトグラフィー-四重極飛行時間型質量分析計 (UHPLC-Q-TOF-MS) を用いて、ポジティブエレクトロスプレーイオン化モードでランダムオーダーで分析されました。リピドミクスデータは、MZmine2 (53) で前処理し、ピーク面積を内部標準に正規化することで脂質を半定量化し、バッチ効果について補正した。欠損値はk-nearest neighbourアルゴリズムでインプットし、すべての値をlog-2変換して正規分布のデータにした。
リピドミクスの解析では、極性代謝物について上記で概説したのと同じアプローチを使用しました。全脂質7,470種のうち、476種がアノテーションされており、残りの6,994種はアノテーションされていない。eGFRの調整後、データの次元を減らすために、weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) を用いて、相関の強い脂質をすべてクラスター化した。7,470の脂質から、3つの脂質から1,054の脂質まで122のクラスタが得られた。脂質クラスターは、脂質含有量を考慮して注釈された。クラスタ内のすべての脂質が未注釈の場合、対応するクラスタを「不明」とし、その後に番号を付けました。これ以降、脂質のクラスター解析は極性代謝物の場合と同様の方法で行った。

個々のアノテーションされた脂質は、LipidomeR R-package を用いて、臨床グループと脂質のスペックタイプとの関連性を検討した（https://lipidomer.org/ 参照）。

4.3.3. メタボローム起源評価 メタボロームの特徴が細菌の代謝に関連するか、宿主の代謝および/または生活習慣の要因に関連するかを評価するために、Least Absolute Shrinkage and Selection Operator (LASSO) モデリングを使用した。このアプローチにより、メタボロームフィーチャー（極性代謝物、脂質および/または脂質クラスター）の存在量が、バイオクリニカルデータ、QMPまたはGMMデータおよび/またはライフスタイルによってよりよく予測されるかを識別することができました。
4.4. 本研究で用いた全データセットの薬物デコンファウンディング
本研究で使用したすべてのデータセットについて、薬物に関連する特徴を精査した。そのために、RパッケージのmetadeconfoundR（https://github.com/TillBirkner/metadeconfoundRで入手可能）（54）を、そのデフォルトパラメータで使用した。

4.5. データ統合
4.5.1. マルチオミクス因子分析 正規化したデータセットを用いて、T1Dおよびアルブミン尿で層別したそのサブグループにおける腸内細菌と血漿メタボロームプロファイルが関与する相互作用と潜在的なシグネチャーを調査した。生化学データも正規化（対数変換）後に結合した。最後に、QMP分類数、GMM CLR変換データセット、極性代謝物、リピドミクスクラスター、生化学データを統合し、統合ステップに進みました。我々は、デフォルトのパラメータでマルチオミックス因子分析（MOFA+）（24）を使用し、データの異なる層間の相互作用と、アルブミン尿のレベルが異なるT1Dの予測に有用な特徴の組み合わせを特定する可能性を検討した。
4.6. 統計解析
すべての統計解析は、Rソフトウェア（https://cran.r-project.org/）、バージョン4.1.0を実行して実施された。有意性検定の結果は、FDR（False Discovery Rate）アプローチで多重検定を補正し、有意性を10％のFDR閾値に設定した。データの可視化は、Rパッケージのggplot2を用いて行った。特定のデータの種類に関する方法論の具体的な詳細は、方法論の該当セクションに報告されています。

データの利用可能性に関する記述
本研究で提示されたデータセットは、オンラインリポジトリで見つけることができます。リポジトリ名とアクセッション番号は論文・補足資料に記載されています。

倫理に関する記述
ヒトを対象とした研究は、デンマーク首都圏倫理委員会の審査と承認を受けた（プロトコルH-15018107）。患者・参加者は、本研究への参加に際して書面によるインフォームドコンセントを提供した。

著者による貢献
コンセプト立案。OP、PR、TSA、SW。方法論。方法論：MC-G、TSA、PH、JV YF、LL、ES、MA、TH、CL-Q。調査。MC-G、TSA、SW、YF、JV、LL、ES、PH、CL-Q. 可視化。MC-G。資金獲得。PR. プロジェクト管理。PR、OP。監修 OP、PR。執筆 - 原案。原案作成：MC-G、TSA。執筆 - 査読と編集。全著者。全著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。

資金提供
本研究は、ノボ ノルディスク財団（助成番号NNF14OC0013659）PROTON Personalising treatment of diabetic kidney diseaseの支援を受けた。内部資金は、Steno Diabetes Center Copenhagen（SDCC）（Herlev、デンマーク）より提供された。TSAはノボ ノルディスク財団（助成番号NNF18OC0052457）およびSDCCから支援を受けた。

謝辞
すべての研究参加者とSDCCラボラトリースタッフの貢献に感謝する。

利益相反
PRは、本試験実施中にバイエル社から個人的な報酬を受けたことを報告する。また、AstraZeneca社およびNovo Nordisk社から研究支援および個人報酬を、Astellas Pharma、Boehringer Ingelheim、Eli Lilly、Gilead Sciences、Mundipharma、Sanofi、およびVifor Pharmaから個人報酬を受け取っている。すべての報酬はSteno Diabetes Center Copenhagenに与えられたものである。

著者MC-GはLEITAT Technological Center社に雇用されていた。著者JKVはClinical Microbiomicsに雇用されていた。

残りの著者は、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしもその関連組織のもの、あるいは出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fendo.2022.1015557/full#supplementary-material でオンライン公開されています。

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論文情報
Front Endocrinol (Lausanne). 2022; 13: 1015557.
オンライン公開 2022年12月2日. doi: 10.3389/fendo.2022.1015557.
PMCID: PMC9755599
PMID: 36531462
Marc Clos-Garcia, 1 , 2 , † Tarunveer S. Ahluwalia, 3 , 4 , † Signe A. Winther, 3 , † Peter Henriksen, 3 Mina Ali, 3 Yong Fan, 1 Evelina Stankevic, 1 Liwei Lyu, 1 Josef K. Vogt, 1 , 5 Torben Hansen, 1 Cristina Legido-Quigley, 3 Peter Rossing, 3 , 6 and Oluf Pedersencorresponding author 1 , 7 , * * * * 1
1 ノボ ノルディスク財団代謝基礎研究センター，コペンハーゲン大学健康医学部，デンマーク，コペンハーゲン
2 LEITAT Technological Center, Terrassa, Spain
3 合併症研究、ステノ糖尿病センター・コペンハーゲン、ヘルレフ、デンマーク
4 コペンハーゲン大学生物学部バイオインフォマティクスセンター、デンマーク、コペンハーゲン
5 クリニカル・マイクロバイオミクス（デンマーク、コペンハーゲン
6 デンマーク、コペンハーゲン、コペンハーゲン大学、臨床医学部
7 ゲントフテ大学病院臨床代謝研究センター（デンマーク、コペンハーゲン
corresponding authorCorresponding author.
Edited by 藤田保健衛生大学 飯塚克己
Reviewed by Sergio Polakof, l'alimentation et l'environnement (INRAE), France; Takaaki Murakami, Kyoto University, Japan
*通信員 Oluf Pedersen, kd.uk.dnus@fulo
これらの著者はこの研究に等しく貢献し，筆頭著者を共有している。
本論文は、Frontiers in Endocrinology 誌の一部門である Systems Endocrinology に投稿されたものである。
Received 2022 Aug 9; Accepted 2022 Nov 11.
Copyright © 2022 Clos-Garcia, Ahluwalia, Winther, Henriksen, Ali, Fan, Stankevic, Lyu, Vogt, Hansen, Legido-Quigley, Rossing and Pedersen.
本論文は、Creative Commons Attribution License (CC BY) の条件の下で配布されているオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用、配布、複製は許可されない。
Frontiers in Endocrinologyの記事はFrontiers Media SAの提供でここに提供されています。
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