リモシラクトバチルス・ロイテリは、リポポリサッカライドへの出生前曝露に伴う血液脳関門機能障害および神経発達不全を正常化する

腸内細菌
第15巻 2023年 第1号
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研究論文
リモシラクトバチルス・ロイテリは、リポポリサッカライドへの出生前曝露に伴う血液脳関門機能障害および神経発達不全を正常化する
Jing Lu,Xiaobing Fan,Lei Lu,Yueyue Yu,Erica Markiewicz,Jessica C. Little, show all
論文 2178800｜Received 2022年8月11日, Accepted 2023年2月07日, Published online: 2023年2月17日
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https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2178800
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絨毛膜羊膜炎に見られるような妊娠後期の感染に由来する母体免疫活性化（MIA）は、子孫の神経発達障害のリスクを著しく増加させる。母親のプロバイオティクス補給による初期微生物叢の操作は、転帰を改善する有効な手段であることが示されているが、そのメカニズムは依然として不明である。本研究では、妊娠中のダムをリポポリサッカライド（LPS）に曝露してモデル化したMIAが、離乳前の年齢で血管の未発達、血液脳関門（BBB）の透過性の増大、アストログリオーシスを引き起こすことを明らかにした。生後早期のBBBの発達と機能障害は、後年の空間学習に障害を与えた。母親がリモシラクトバチルス・ロイテリ（L. reuteri）を出生時から補給すると、BBBの発達不全と機能不全に関連した認知機能が回復した。母体のL. reuteriが介在する微生物群集のβ多様性の変化と子孫の代謝反応は、BBBの完全性と長期的な神経発達の結果を促進するメカニズムと潜在的標的を提供する。

keywords: 母体炎症リポポリサッカライドプロバイオティクス血液脳関門
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はじめに
肥満、喘息、自己免疫疾患、うつ病、子癇前症、妊娠糖尿病に由来する母親の急性・慢性炎症状態、および心理社会的ストレス、低い社会経済状態、喫煙や汚染への曝露、微生物異常などの環境リスクは、子どもの多様な神経発達上の有害事象と関連しています。 絨毛膜羊膜炎は、胎盤や胎児膜の急性炎症を引き起こす細菌感染症として特徴づけられ、妊娠の10％までに発症し、脳室周囲白質軟化症、新生児脳症、脳性まひといった神経発達上の有害な結果と高い関連性を示します。 引用7-10 母体感染に伴う母体免疫活性化（MIA）モデルとして、グラム陰性菌の細菌細胞壁成分であるリポポリサッカライド（LPS）に妊娠後期（E17.5からE20.5まで）に母体が暴露されると、大脳皮質における神経細胞のアポトーシス、白質における低髄化、神経炎症およびミクログリオーシスを引き起こすことが証明されています。 引用11-16 さらに、MIAによって引き起こされるこれらの脳の発達の変化は、空間学習や記憶、社会的相互作用、不安、運動などの行動に長期的な影響を与え、影響の度合いはネズミの種類やLPSチャレンジの用量とタイミングに依存する（Bao et alCitation17による詳しいレビューを参照されたい）。臨床および動物研究の両方から得られた多くの証拠に基づき、MIAによる神経発達障害を減少させるアプローチが必要である。

脳の宿主発生は、幼少期の微生物叢の発達に影響されることが示されており、腸-微生物-脳軸として知られる腸内微生物叢と中枢神経系（CNS）の間のコミュニケーションを示唆するデータが蓄積されている（引用18、引用19、引用22、引用24、引用25）ため、最適な腸内微生物叢発達が最適な脳の発達につながる可能性がある。プロバイオティクスは、世界保健機関（WHO）によって「生きた微生物で、十分な量を投与されたとき、宿主に利益を与えるもの」と定義されている26 Limosilactobacillus reuteri（旧Lactobacillus reuteri, L. reuteri）は、プロバイオティクスである。reuteri）は、病原体の過繁殖を防ぐための抗菌分子の産生や、細菌のコロニー形成、粘膜バリアの完全性、粘膜IgA応答、抗炎症サイトカインの産生の調節など、腸の生理学において多くの有益な形質を示すプロバイオティクスである。 引用27,引用28 疝痛を有する母乳育児児の治療にロイテリを予防的に使用すると、泣きのエピソードの回数と時間が減少するだけでなく、胃食道逆流や便秘などの機能性胃腸障害も改善する引用31 動物試験では、母親の高脂肪食が子孫の微生物群におけるロイテリの劇的減少を引き起こし、ロイテリを子孫に投与することでL. しかし、プロバイオティクスで腸内細菌叢を操作できるにもかかわらず、新生児の免疫系が未熟なため、新生児にプロバイオティクスを直接投与することについては懸念があるCitation33、Citation34、感染症に対する感受性が高い疑いがあるCitation35、早産児における壊死に至る腸炎の発生率を減らすために予防的に投与した場合の敗血症例が報告されている。 引用36-38 これまでに、我々や他の研究者は、母親の微生物集団が子孫の行動学的転帰を変えることができることを示した引用39、炎症性侮辱の後に母親のプロバイオティクス補充が子孫の脳発達を改善できることを示した引用40 したがって、母親のプロバイオティクス補充によるマイクロバイオームと転帰の最適化は、子孫の神経学的転帰を改善する代替経路となり得る引用39。

腸内細菌叢がCNSとコミュニケーションをとるメカニズムは、まだほとんど分かっていません。これらの経路に共通する特徴は、微生物メディエーター（サイトカイン、代謝産物、活性化された免疫細胞など）が全身に放出されることである。微生物メディエーターがCNSに到達して脳機能に影響を及ぼすかどうかは、末梢血と血液脳関門（BBB）として知られる厳密に制御されたCNS関門の間の全身的なコミュニケーションに依存している。また、これらの微生物メディエーターは、CNSに到達することなく、BBBの発達や機能に直接影響を与え、それによって間接的にCNSの機能を調節しているかもしれません。BBBの機能障害は、成人のパーキンソン病やアルツハイマー病、小児の脳性麻痺、新生児脳卒中、自閉症などの神経疾患に関与しているとされている。

例えば、アストロサイトの分化とアストログリア端部による脳血管系の鞘取りが支配的になる時期は、ネズミでは生後3週間である。引用48 出生時にはBBBが完全に成熟していないことから、母親のプロバイオティクス投与は、子孫のBBBの発達と機能に対するMIAの悪影響を一部緩和することができると我々は仮定した。具体的には、授乳期（子供の生後1～21日目）にL. reuteriを早期に摂取することで、BBBを通過する代謝物を変化させ、MIAによるBBB機能障害および神経発達障害を改善することができると仮定した。ここでは、母親のLPS曝露をモデルとしたMIAが、BBBの血管系の発達不全を誘発することを報告する。このことは、子孫の血清および脳のメタボロームにおける明確なシフトと関連していた。授乳期におけるロイテリ菌の母親への投与は、MIAによるBBBの発達障害と透過性の上昇を正常化し、特定の細菌代謝物の脳への侵入を促進し、後年の空間学習を有意に改善することが示された。

研究結果
L. reuteriの授乳期における母体投与は、母体がLPSに曝露された後の子孫の空間学習を改善した。
母体LPS曝露は、絨毛膜羊膜炎および感染症関連MIAの動物モデルとして、子孫の長期転帰の研究に広く用いられている。引用17 母体LPS曝露モデルからの子孫の神経発達転帰が、授乳期の母体L. reuteri投与により改善されるかどうかを調べるために、12週齢の子孫の空間学習および記憶を評価するために、モリス水迷路が用いられた。SPF (n = 26), LPS (n = 11), Reuteri (n = 8), LPS/Reuteri (n = 7) の4つの試験群を使用した。反復測定（trial）を用いた二元配置分散分析により試験日中の逃避潜時を計算すると、試験日の主効果因子（F3, 192 = 176.8, p < .0001）および処理（F3, 192 = 14.68, p < .0001）は全群で有意であり、訓練中に隠れ台を見つける潜時が全て減少し、したがって全ての群で学習を行っていることが示された（図1a）。しかし、母親のLPS曝露群の子どもは、対照群、ロイテリ群、LPS/ロイテリ群と比較して、3日目と4日目に隠れたプラットフォームへ脱出するまでの待ち時間が長くなった（二元配置反復測定ANOVA単純効果、テューキーのポストホックテスト）。3日目の調整済み（多重比較）p値、LPS vs SPF p < .0001, LPS vs Reuteri p = .0089, LPS vs LPS/Reuteri p = .0203; 4日目、LPS vs SPF p < .0001, LPS vs Reuteri p = .0024, LPS vs LPS/Reuteri p = .0279). これらのデータは、母親のLPS曝露が対照群と比較して空間学習能力を損なったが、授乳期のL. reuteriの補充が空間学習障害を逆転させたことを示すものである。プローブ試行では、隠れたプラットフォームがあった象限での滞在時間（図1b）に4群間の差はなく、空間記憶に影響がないことが示された。

図1. 授乳期における母親のL. reuteri補給は、母親のLPS曝露によって誘発された空間学習の欠損を救済した。(a) 12週目の訓練中にSPF (n = 26), LPS (n = 11), L. reuteri (n = 8), LPS/L. reuteri (n = 7) 群間で有意差を認めた。SPF、L. reuteriおよびLPS/L. reuteriマウスは、反復測定ANOVAによりLPSよりも有意に高い学習曲線勾配を有していた。訓練3日目および4日目において、LPSマウスは他の3つの処置群のマウスと比較して、逃避プラットフォームの位置を特定するのに有意に多くの時間を要した。アスタリスクは、p値が少なくとも<0.05の有意差を示す。(b)プローブ試行中のプラットフォーム象限内の時間は、4つの処理群間で差はなかった。

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授乳期における母親のL. reuteri補給は、母親のLPSによる脳血管発達の障害および子孫のBBB過透過性を回復させた
母親のLPS曝露に伴う子孫の空間学習の変化が、早期のBBB機能障害と関連しているかどうかを調べるために、まず脳血管の発達を総合的に評価した。ネズミの脳血管の炎症による透過性亢進は、ヒトの妊娠22-40週齢に相当するP20（引用49）以前にのみ起こりうることが示されているため、本研究では、2週齢のマウスにMRI time of flight（TOF）を行い、血管内の流れを可視化し、造影剤を投与せずに、脳血管の機能解析を行った。

2週齢のマウスの体重は、治療群間で差がなかった（図2a、p＞0.05、ANOVA）。また、脳解剖のT2wイメージングに基づく脳容積（図2bの定量化、p>.05、ANOVA）にも、治療群間で統計的な差はなかった（図2f上段）。

図2. 出生時からL. reuteriを補給すると、妊娠中のLPS誘発血管発達障害および子孫のBBBの透過性亢進が逆転した。(a)体重、(b)総脳容積には影響を与えなかった。(c) 母親のLPSは生理食塩水対照群と比較して脳血管容積を有意に減少させ、授乳期のL. reuteri補充はLPSによる血管容積欠損を有意に最小化した（それぞれn = 5,8,7,6, ）。⊖のついたバーは実験群間の有意差を示す（***p < .0001, one-way ANOVA）。(d) ベースラインのT1値（秒）は、治療群間で差がなかった。(e) 母親のLPSは生理食塩水対照子孫群と比較してBBB透過性を有意に増加させ、授乳期のL. reuteri補充はLPS誘発BBB過透過性を有意に最小化させた。透過性の定量化は、ベースラインT1値と造影後（gd）T1値から導き出した。透過性はΔT1（ベースラインT1-造影後T1）/血管体積として表示した。⊖のついたバーは実験群間の有意差を示す(****p < .0001, one-way ANOVA)。(f) 脳の代表的なT2WおよびT1画像。パネルは処理群（A）SPF、（B）LPS、（C）L. reuteri、および（D）LPS/L. reuteriを表す。1段目（灰色）-T2W脳画像中央3枚；2段目-造影剤注入前のマウス脳T1マップの測定値；3段目-造影剤注入25分後のマウス脳T1マップの測定値。マップの下のカラーバーはT1マップのスケール（値）を示す。(g) TOFデータセットから得られたマウス脳血管の代表画像（赤色）をT2W画像（灰色）と重ね合わせたもの。パネルは処理群（A）SPF、（B）LPS、（C）L. reuteri、および（D）LPS/L. reuteriを表す。視覚的に確認するために、右の列に示す最大強度投影（MIP）画像をTOFデータセットから作成した。MIPは、血管の高輝度ドットを3次元的につなげたものである。

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しかしながら、生理食塩水SPF対照群と比較して、LPSへの出生前の曝露は、TOF測定に基づく総血管体積を有意に減少させた（図2g（A）及び2g（B）、図2cにおける定量化、p＜0.0001、一元配置分散分析後のテューキーのポストホックテスト）。授乳期間中のL.ロイテリ単独補充は、血管容積に影響を与えなかったが（図2g（C））、母親のLPSチャレンジ単独群と比較すると血管容積を再確立した（図2g（D）、p < .0001、一元配置分散分析後のTukeyのpost hoc test）。

BBB透過性は、造影前のT1値（図2f中段のベースラインT1）と造影剤後のT1値（図2f下段）の間のΔT1（縦緩和時間）値を計算することにより評価した。平均ベースラインT1値の間に統計的な差はなかったが（図2d）、脳内の造影剤量は対照群と比較して母体LPS挑戦群で有意に高く（図2e、p < .0001, Tukey's post hoc test after one-way ANOVA）、2週齢の母体LPS曝露子においてBBB透過率が高いことが示された。驚くべきことに、授乳期における母親のロイテリ菌の投与は、出生前のLPSによるBBB透過性亢進を修復した（図2e、p<.0001、一元配置分散分析後のTukeyのポストホックテスト）。これらのデータは、LPSによって誘発された妊娠中のMIAが子孫の血管発達とBBBの透過性を著しく損ない、出生時からL. reuteriを補充することでこれらの欠損を回復できることを初めて証明したものである。

授乳期におけるL. reuteriの母体投与は、母体がLPSに曝露された後の子孫におけるアストログリオーシスを改善した
アストログリオーシスは、BBB破壊時のアストロサイトの共通の特徴であり、CNSの傷害時に表現型アストロサイトタンパク質であるグリア線維性酸性タンパク質（GFAP）の発現上昇によって特徴付けられる。Citation51 母体のLPSによるBBBの変化がアストロサイトの活性化と関連しているかどうかを調べるために、脳血管を定義するためにGFAP（図3、緑）およびBBB特異的タイトジャンクションタンパク質のクラウジン5（図3、赤）用の免疫組織化学染色を実行した。我々は、出生前LPS刺激の有無にかかわらず、母体L. reuteri補給群または非補充群のいずれからの子孫の大脳においても、統合強度（IntDen）レベル（ImageJ（NIH）を使用）で定量化したクローディン5タンパク質レベル（図3a、SPF；図3b、LPS；図3c、Reuteri；図3d、LPS／Reuteri）の差を見出せなかった（図3e、p＞0.05、ANOVA）。母体LPS負荷は、生理食塩水と比較して（図3a）、血管周囲（クローディン-5染色、赤で識別）と脳組織（図3b）の両方でGFAP染色（緑）の著しい上昇を誘導し、定量化は図3fのクローディン-5 IntDenに対するGFAP IntDen（p = .001）として示された。 図3fではGFAP IntDen over claudin-5 IntDen（p = .0012）、図3gではDAPI IntDen（nuclei staining）over GFAP（p = .0088）としてそれぞれ示した（一元配置分散分析後のテューキーのポストホックテスト）。授乳期における母親のL. reuteri曝露はGFAP発現を変化させなかったが、母親のLPS誘発によるGFAP発現増加を有意に減少させた（図3c、d、図3fにおける定量化 p = .0247、および3g p = .0381、それぞれ、一元配置分散分析の後のTukeyのポストホックテスト）。これらのデータは、母体-LPS誘発の破壊に対するBBB感受性がアストログリア症によって補完されること、および授乳期間中の母体L. reuteriが、脳のグローバルレベルおよびBBBで特異的にアストログリア症を低減できることを実証している。

図3. 母体LPSによって誘発された2週齢の子孫のアストログリア症は、母体L. reuteriの補給によって減少した。クローディン-5（脳毛細血管の位置、赤）、GFAPアストロサイト（緑）、DAPI（核、青）の蛍光顕微鏡による代表的な画像。各群3匹のマウスにつき7～10切片を検査した。コントロールのSPF GFAP染色(a)よりも強い染色が、血管周辺と母体LPS被曝の脳内で観察された(b)。L. reuteriを母体LPSなしで（c）または母体LPSで（d）補充した母体は、コントロールグループと同様のGFAPレベルであった。ImageJ（NIH）を用いたアストロサイト活性化の定量化に基づき、（e）クラウディン-5の全体的な発現は処理によって影響を受けなかった。(f）血管近傍のGFAP発現および（g）脳内のGFAP発現は、クローディン-5レベルに対するGFAP積分密度（IntDen）レベルで表した。⊖のついたバーは実験群間の有意差を示す（すべてn = 3、少なくともp < .05）。

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授乳期におけるL. reuteriの母親投与は、母親のLPS曝露後の子孫のマイクロバイオームのβ多様性を変化させた
β多様性に基づく微生物群集組成は、他の研究において認知機能と関連していることから、我々は、L. reuteri曝露が子孫のマイクロバイオームに及ぼす影響を調査したCitation52。相対的存在量に基づく腸内細菌叢の解析では、4つの処理群間で門または科レベルの分類群に有意差は見られなかった（図4a、b、全群n = 5）。また、授乳期における母親のLPSまたはL.ロイテリ補給のいずれにおいても、生後2週間および12週間（図5a）のα多様性指数に差はなかった。一方、異なるグループ間の腸内細菌叢のβ多様性は、2週齢（図5b）および12週齢（図5c）の両方でBray-Curtis非類似度を有する主座標分析プロット（PCoA）に反映されるように差異が見られた。PERMANOVA分析により、両齢齢において処理群間でβ多様性に差異があることが明らかになった（いずれもp＝0.001）。我々のデータは、授乳期における母親のLPS曝露および／またはL.ロイテリ補給が、腸内細菌叢のβ多様性を調節することを実証している。

図4. 処理群間の細菌群集の相対的存在量。(a) 2週齢（上）および12週齢（下）の糞便サンプルの門レベルでの相対的存在量。(b) 2週齢（上）および12週齢（下）の糞便サンプルの科レベルでの相対現存量（いずれもn = 5）。

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図5 糞便微生物相のα-ダイバーシティとBray-Curtis主成分分析。Rパッケージを用いて計算した2週齢および12週齢のマウス糞便サンプルの（a）観察多様性、chao1多様性、Shannon多様性のα-多様性指標。いずれの指標においても、投与群間で有意差は認められなかった。主成分分析（PCoA）スコアは、（b）2週齢および（c）12週齢のマウス糞便サンプルの属レベルでの糞便微生物叢の相対存在量に基づいてプロットされたものである。主成分によって説明される変動の割合を軸に示している。A. SPF B. LPS C. Reuteri D. LPS/Reuteri。PERMANOVAにより、異なる処理群（すべてn = 5）間で腸内細菌叢組成（β-多様性）の有意な分離が観察された（p = 0.001）。

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授乳期におけるL. reuteriの母体投与は、母体のLPS曝露によって誘発されるメタボロームプロファイルのシフトを再形成した
本研究で観察されたβ多様性に基づく細菌組成の変化が代謝的特徴の変化と関連しているかどうかを調べるために、血清と脳の両方の試料をメタボロームプロファイリングに供した。このノンターゲットメタボローム実験の結果、11,054の特徴量が得られた。データ解釈のための情報負荷を軽減するため、GNPSオンラインプラットフォームを使って計算により推定分子IDを割り当て、ライブラリで見つかったフラグメントスペクトルと類似の一致を割り当てられる特徴のみを解析に含めました。メソッドに記載されているように、今後の特徴リストのフィルタリングの結果、推定分子IDを持つ389の高品質な特徴が得られた。全体的な代謝プロファイルが異なる治療群によって影響を受けるかどうかを判断するために、主成分分析を用いて、特徴の存在量に基づく教師なしクラスタリングを行った。

生後2週間で、血清（図6a、すべてn = 3）および脳（図6b、すべてn = 3）サンプルの代謝プロファイルは、4つの処理グループ間で別々にクラスタリングされ、脳の代謝プロファイルでは他の3グループと比較してLPSグループで最も明確な区別が観察された。生後2週間の処理による明確な組成のクラスタリングは、FDR（0.05でカットオフ）-調整されたp値（代謝物の完全なリストは表S1、ANOVA表は表S2参照）による一元配置ANOVAに基づき、図6c（77の機能が注記された血清）および図6d（80の機能が注記された脳）に示された機能の有意に異なる存在量のヒートマップでさらに実証されている（代謝物リストの全リストを見るために、表S1を参照のこと）。12週齢では、血清（図7a、すべてn = 4）および脳（図7b、すべてn = 4）のいずれの代謝プールにも分離は見られなかった。同じ方法を用いて、12週齢では、ヒートマップに示すように、血清における8つの特徴の存在量（図7c）（代謝物のリストは表S2参照）および脳におけるどの特徴も（図7d）、処置群間で有意に異なっていた。

図6. 生後2週間の血清および脳内代謝物プロファイルの主成分分析およびヒートマップ。2週齢マウスの（a）血清および（b）脳内代謝物の正規化ピーク面積をもとに主成分分析（PCoA）スコアをプロットした。サンプル間の存在量の類似性に基づいて代謝物を並べるために、階層的クラスタリングを適用した。2週齢のサンプルについて、(c)有意に異なる77の血清の特徴、(d)有意に異なる88の脳の特徴をプロットした（One-way ANOVA test with Benjamini-Hochberg method-adjusted p value <.05, all n = 3)．

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図7. 12週齢の血清および脳内代謝物プロファイルの主成分分析およびヒートマップ。12週齢マウスの（a）血清および（b）脳内代謝物の正規化ピーク面積に基づいて、主成分分析（PCoA）スコアをプロットした。12週齢のサンプルについて、ANOVAによる上位100特徴を(c)血清と(d)脳サンプルについてプロットし、*は4つの処理群間の有意差を示す（One-way ANOVA test with Benjamini-Hochberg method-adjusted p value <.05, all n = 4）。

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2週齢のマウスから得られた77の血清および80の脳の有意差特徴のうち、20は両方のプールに存在し、60は脳のプールにのみ存在し、57の特徴は血清プールにのみ存在した（図8a、表S2から全リストを参照のこと）。次に、L. reuteriによって変化したLPSに関連する特徴を具体的に同定した。両方のプールに存在する20の特徴のうち、1-パルミトイル-ホスファチジルコリン（LysoPC（16：0））と推定されるリゾホスファチジルコリンの特徴は、LPS処理群の脳で有意に減少し（p = .0016）、リウテリ曝露によって回復した（図8b、p<.0001）。脳内にのみ存在する60の特徴のうち、LysoPC（20：5）とパルミトイルカルニチンレベルと推定される2つの特徴のレベルは、母親のLPS処理グループの子孫の脳で減少したが、授乳中にL. reuteriに曝露することによって回復した。reuteriへの曝露により、SPF対照と同レベルまで回復した（図8c、LysoPC（20：5）については、SPF対LPS、p＝0.0003、LPS対LPS／reuteri、p＝0.0009、パルミトイルカルニチンについては、SPF対LPS、p＝0.0197、LPS対LPS／reuteri、p＝0.0009）。血清のみのプールでは、授乳期のL. reuteriは、1-(1Z-Hexadecenyl)-sn-glycero-3-phosphocholineとして注釈されたホスファチジルコリン機能の母親のLPS誘導低レベル（LPS対LPS/Reuteri、p = .0042）を補修し、母親LPSを減らしました。 0042）、PC（P-18:0/22:6）と推定されるホスファチジルコリンの母体LPS誘発高レベル（図8d、LPS対LPS/Reuteri、p=0.0066）を減少させた。12週間血清プールで全体的に有意に異なる存在量と同定された8つの特徴のうち、LPSに関連する特徴は、L. reuteriによって変化しなかった。

図8. 血清プールと脳プールの間で有意に異なる代謝の特徴。特徴は、仮に同定された名前を用いて表示した。(a) 血清と脳プールの間で有意に異なる代謝の特徴を示すベン図。交差点の数字は、血清と脳で共有されている有意に異なる代謝物の数を表し、交差点から外れた数字は、それぞれのプールで固有の代謝物の数を表す。 (b) 両プールで共有されている代謝物のうち、LPSグループの脳内の1-palmitoyl-phosphatidylcholineはSPFグループのそれより有意に少なかった（p = 0.0016）。ロイテリ群およびLPS/ロイテリ群の1-パルミトイル-ホスファチジルコリン量は、LPS群のそれよりも有意に多かった（それぞれp = .048およびp < .0001）。(c）ユニークブレインプールでは、LPS群の脳内のリゾPC（20：5）とパルミトイルカルニチンの両方がSPF群のそれよりも有意に少なかった（それぞれ、p = .0003およびp = .0197）。ロイテリ群およびLPS/ロイテリ群におけるこれら2つの代謝物レベルは、LPS群のそれよりも有意に高かった（リゾPC（20：5）については、それぞれp = 045およびp = 0.0009；パルミトイルカルニチンについては、それぞれp = 0.0079およびp = 0.0009；）。(d) ユニークな血清プールでは、LPS群の1-(1Z-Hexadecenyl)-sn-glycero-3-phosphocholineレベルがSPF群より有意に低く（p = .016）、PC（P-18：0/22：6）レベルが有意に高くなった。ロイテリ群およびLPS/ロイテリ群におけるこれら2つの代謝物レベルは、SPF群のそれと同様であった。すべてのデータは、Tukeyのポストホックテストを伴う一元配置分散分析によって分析され、すべてn = 3であった。母親のLPSチャレンジ時に子孫のBBBを横断した、仮に特定された名前を用いたユニークな特徴を(e)のベン図で特定し、LPSの影響下でBBBを横断するユニークな特徴が2つあることを明らかにした。(f) 8-HETEと(c) 2-アラキドノイル-リゾホスファチジルコリンのレベルは、4つの処理群間で差がなかった（one-way ANOVA）。授乳期における母親のL. reuteri曝露により子孫のBBBを通過するユニークな特徴を(g)ベン図で確認したところ、L. reuteriの影響下でBBBを通過するユニークな特徴が14個存在することが明らかとなった。

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母親のLPS曝露がBBBを横断する新たな代謝機能を誘導するかどうかを判断するために、未処置SPFでは血清のみのプールにあったが、LPS処置群の脳に特異的に出現した機能をベン図で分類した（LPSに反応して新たにBBBを横断する機能に調査を集中させるために、LPS血清プールにも存在するものを除外した、図8e）。8-ヒドロキシエイコサテトラエン酸（8-HETE）と推定されるエイコサノイドと2-アラキドノイル-リゾホスファチジルコリンの特徴は、どちらもアラキドン酸の誘導体であり、これらの基準を満たした。これらの特徴の相対的な存在量は、代謝物の血清単独（データは示さず）または脳単独のプールにおいて、治療グループ間で有意な差はなかった（図8f）。

授乳期間中のL.ロイテリ単独補給は、未処理のSPF対照と比較して、BBBを越えて脳に到達する14の新しい代謝物をもたらした（図8gおよび特徴のリストは表1を参照のこと）。推定 ID が割り当てられたこれらの代謝物の大部分は、胆汁酸またはアルコール誘導体である脂質および脂質様分子であった。興味深いことに、これら 14 種類の代謝物は、SPF および LPS 脳プールには存在しませんでした。生データを解析したところ、SPFおよびLPSマウスの脳では、これらの14の特徴が、キュレーションデータセットで選択したノイズおよびピーク形状のカットオフ値以下になったことから、L. reuteri曝露マウスの脳ではL. reuteriに関連した代謝の結果として増加していることが示唆された。

考察
腸内細菌が脳機能の調節に関与していることを示唆する証拠は数多く存在するが、その正確なメカニズムは依然として不明である。本研究は、妊娠中のMIAが生後早期（離乳前）に血管形成と透過性を乱し、アストロサイトの過剰活性化を促進し、生後の空間学習における行動変化をもたらすことを実証するものである。ヒトの腸内細菌叢の常在菌であるL. reuteriを授乳中のダムに投与すると、BBBの発達障害とその子孫の長期認知機能の障害を回復させる有効な手段であることが示された。これらの知見は、妊娠中のMIAと授乳中のL. reuteri曝露によって引き起こされる血清と脳の両方の代謝物プロファイルの早期変化（2週齢時）によってさらに裏付けられました。特に、授乳期のL. reuteri曝露に伴う脂質/胆汁酸代謝産物はBBBを通過することができ、MIA障害を改善するための有益な生物活性の可能性を持つ標的である可能性がある。注目すべきは、認知機能の差が観察される12週齢の代謝プロファイルは、MIAやL. reuteri早期暴露にほとんど影響されなかったことである。これらの知見は、プロバイオティクスによるBBBの最適化の鍵となる発達初期の窓が存在すること、そしてこの初期の最適化が後年の神経学的転帰に長期的影響を与えることを示唆している。さらに、授乳期の母親にロイテリ菌を投与するという我々のアプローチは、新生児を直接プロバイオティクスに曝露することなく、プロバイオティクスの有益な効果を得ることができることを示している。このことは、MIAや絨毛膜羊膜炎に関連する不利な条件が診断された場合に、プロバイオティクスが子供の予後を改善する治療薬となる可能性を考えると、臨床的意義があると言えるでしょう。これらの知見を総合すると、BBB血管の早期発達が長期的な認知機能にとって重要であり、腸脳軸機能の早期バイオマーカーであることが指摘される。

引用49 MIAが脳の発達とその後の認知機能に影響を及ぼすメカニズムとして、全身および局所的な炎症を介することが提案されている。引用6,引用53 例えば、妊娠中にLPSで模擬した炎症は、子孫の脳において神経細胞一酸化窒素合成酵素（NOS）およびNF-κB経路の活性化を介して脳損傷を誘発した。 引用6 これまでの研究では、妊娠中のMIAによるBBBの障害は、神経精神疾患の病因となる可能性も示唆されている。引用46,引用54 本研究では、MIA（LPS）がBBBの発達と機能の変化およびCNS機能障害の強力な誘導物質であることを証明した。ヒトの妊娠22-37週に相当する脳の発達段階であるげっ歯類生後2週齢において、BBBの透過性が上昇し、血管総量の減少によって示されるBBBの発達不全という新しい所見が観察された（Citation50）。

プロバイオティクスがBBBの健全性を調節することは以前にも示されている。引用47 常在細菌、または短鎖脂肪酸産生細菌株でコロニー化した無菌マウスは、BBB透過性を低下させ、タイトジャンクションタンパクの発現を正常化した。内皮細胞がアストログリア末端と鞘結合する過程が出生後に起こり、BBBの崩壊が反応性グリオーシスと強く関連していることを考えると、我々のデータは、出生直後の母親のL. reuteri補充が、MIAによる血管発達の欠損とBBB透過性の上昇を正常化するだけではなく、BBBとグローバルレベルの両方でアストロサイトに特化できることを示すものである。

変化したマイクロバイオームが脳に影響を与えるメカニズムを調べるために、我々はBBBの血管側と脳側の両方でMIAとL. reuteriに対する代謝反応を研究した。その結果、8-hydroxyeicosatetraenoic acid（8-HETE）と2-arachidonoyl-lysophosphatidylcholineと名付けられたエイコサノイドが母親のLPSチャレンジ後の子供のBBBを通過できることが確認された。血清と脳の両方で差次的に存在する20の代謝物のうち、母親のLPSに関連して脳内で減少したリゾホスファチジルコリン（Lysophosphatidylcholine）のレベルは、L. reuteri曝露によって回復された。脳におけるマイクロバイオーム関連代謝機能の重要性は、脳に渡るものだけでなく、BBBの発達に直接影響を与えるものである可能性がある。血清中では、代謝物が血管側からBBBに直接影響を与える可能性があるが、L. reuteriは母親のLPSによるリゾホスファチジルコリンのレベル低下とPC（P-18：0/22：6）と呼ばれる別のリゾホスファチジルコリンのレベル上昇を対照と同じレベルまで調節した。リゾホスファチジルコリンは、in vitroで酸化ストレスによる内皮細胞傷害を誘発することが示されているCitation55が、これらの2つの代謝物がBBBの内皮細胞に何らかの影響を与えるかどうかはまだ分かっていない。

L. reuteri の暴露自体によって、BBB を通過する代謝物が 14 種類追加された。これらの代謝産物は、ほとんどが脂質/胆汁酸代謝に関連するものである。胆汁酸は、宿主のグルコースおよび脂質代謝、脂肪および脂溶性ビタミンの吸収を調節する。引用56 胆汁酸とその代謝産物は、腸内細菌叢と脳の間のコミュニケーションにも関与している。CNSにおける胆汁酸の分子的役割はほとんど不明であるが、胆汁酸の副産物によってBBB機能に異なる影響を及ぼす可能性があることが示されている。胆汁酸の副産物によって、BBB機能に異なる影響を及ぼす可能性がある。循環中の主要な胆汁酸であるチェノデオキシコール酸およびデオキシコール酸は、タイトジャンクションを破壊してBBBの透過性を増加させる。 引用61げっ歯類タウリン共役型UDCAは、その脳内TGR5受容体を介して神経炎症を軽減し62、いくつかの神経変性疾患に関与している引用58したがって、L. reuteriによるBBB発達に対する保護効果および空間学習の改善は、L. reuteriによる胆汁酸関連代謝によるものではないかと提案した。

他の研究では、L. reuteriまたは無菌L. reuteri溶解物を摂取したマウスは、社会的行動、ストレス調節、および学習と記憶の神経調節因子であるオキシトシンの血漿レベルを増加させることが示されているCitation32、Citation63、Citation64 L. reuteriの正確なメカニズムは、オキシトシンを増加させることができる。しかし、L. reuteriの溶解液が生きたプロバイオティクスと同様の効果を示したことから、細菌成分、つまり潜在的に未決定の代謝物が主要な制御因子となり得ることが示唆された。オキシトシンはBBBに存在する内皮細胞のRAGE（receptor for advanced glycation end-products）によりBBBを通過することができるが65、今回観察されたMIAとL. reuteriの効果にRAGEが関与しているかどうかを今後の実験で検証することは興味深いことであろう。

本研究の限界として、各投与群におけるメタボローム解析のサンプル数が少ないことが挙げられる（2週齢時すべてn=3、12週齢時すべてn=4）。本研究の意図は、現在の腸内細菌-脳軸研究のパラダイムを転換することであった。我々の研究は、腸内マイクロバイオームと脳の間のコミュニケーションは、全身性微生物代謝産物がBBBの発達そのものに加えて、あるいはBBBを通じて脳に到達できる場合には、その影響に依存している可能性を示唆するものであった。

我々は、臨床および動物実験において、行動にはよく知られた性的二型があることを認識している。我々の主な仮説は、MIAがBBB発達不全を誘発し、ロイテリ菌がBBB発達を救済することであり、我々の研究では性別がMIAによるBBB感受性に影響を与える要因であるという仮説は立てていない。さらに、C57BL/6 Jは、行動の性差を検出するのに適した株ではないかもしれない。文献によると、C57BL/6マウスを用いたほとんどの研究では、Morris水迷路試験における空間課題の成績に性差は認められなかった。引用66-70 C57BL/6 J雌マウスは雄マウスに比べて高架式十字迷路試験で不安感が強いことが報告されているが、オープンフィールド試験における探索活動では男女差は検出されていない。 Citation71 また、3室社会性試験においてもC57BL/6 Jマウスの雌雄間に社会性や新規性の差は認められなかった。Citation72 我々の以前の論文Citation23も、C57BL/6 Jマウスにおける研究の多くと一致しており、オープンフィールド、高架式十字迷路、恐怖条件付け試験、3室社会性試験、モリス水迷路試験に性差を見出すことができなかった。そこで、本研究では雌雄両方の動物を使用した。母方のL. reuteri（妊娠後期から離乳まで）は、最近、性依存的に子孫のマイクロバイオームを形成することが示されているCitation73 母方のL. reuteriは、β多様性に基づいて雌雄両方のマウスで対照から仔のマイクロバイオーム分離が徐々に増加することを誘導した。しかし、P70で母体L. reuteri補充後のLactobacillus、Akkermansia、Lachnoclostridium、Bacteroidesの相対量は、雌マウスで有意に増加したが、雄マウスでは増加しなかった。MIAが性依存的にBBBの発達に影響を与えるという仮説は立てなかったので、今後、MIAによって誘発された男女のBBB欠損に対する母親のロイテリの効果を評価する研究が必要であろう。

結論として、MIAは、BBBの完全性の崩壊に関連した子孫の血管系形成の発達不全を誘発した。生後早期のBBB形成不全は、認知機能に対する長期的な影響と関連していた。授乳期における早期の微生物介入としてL. reuteriを導入することで、BBBの発達と認知機能を改善することができた。L. reuteriを介したMIAに対する代謝反応の制御は、BBBの血管側と脳側の両方において、BBBの完全性と長期の神経学的転帰を促進するメカニズムおよびターゲットとなる可能性を提供する。

研究方法
動物実験
動物の世話および実験手順は、米国国立衛生研究所のすべてのガイドラインに厳密に準拠し、シカゴ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認された。妊娠中のC57BL/6 Jマウスは、12時間の明暗サイクルで飼育し、餌と水を自由に摂取できるようにした。妊娠16日目（E16）に、ダムを、大腸菌O55：B5（Sigma-Aldrich、St. Louis、MO、USA）からの等量（200μL）LPSの腹腔内（i. p.)（50ug/kg body weight of dam）または生理食塩水の注入に無作為に割り付けた。ラクトバチルス・ロイテリ（ATCC PTA 6475）（L.reuteri）をMRSブロス中で37℃にて一晩嫌気性キャビネット（10％CO2、5％H2、85％N2）内で培養した。菌体を紡糸し、等量の無血清DMEM培地に懸濁した。出産直後、ビヒクルとLPSにチャレンジした両方のダムを、離乳まで、または組織収集のために仔を犠牲にするかMRIに移した離乳前の時点まで、109 L. reuteriまたはビヒクルを毎日与える（100μLの量で経口投与）ようにさらに無作為に割り付けた。仔犬の別のサブセットは、12週齢まで成長させ、行動試験に供した。その結果、4つの研究グループ：コントロール、LPS、L. reuteri、LPS/L. reuteriが得られた。

モリス水迷路
モリス水迷路は、以前に記載したように、空間学習および記憶を評価するために使用した23。動物の動きは、ANY-mazeソフトウェア（Stoelting Co.、Wood Dale、IL）で登録および処理した。各処置群の動物数は、SPF（n＝26、6匹の産駒から13匹の雌と13匹の雄）、LPS（n＝11、3匹の産駒から3匹の雌と8匹の雄）、Reuteri（n＝8、3匹の産駒から2匹の雌と6匹の雄）、及びLPS／Reuteri（n＝7、2つの産駒から3匹の雌と4匹の雄）である。簡単に説明すると、マウスは直径120cmの円形の水槽に入れられ、室温（22℃）の水が入れられた。試験の訓練段階で、マウスは水面から1cm上に露出した直径10cmの可視プラットフォームを見つけるよう訓練された。5回の試行が行われ、試行ごとにプラットフォームの位置が変更された。試験段階において、マウスは南東象限で水面下1cmに沈んだ隠れたプラットフォームを見つけるようにされた。マウスは4日間連続して試験を受けた。すべての試験日において、各マウスは5回の試行を行い、それぞれ開始位置が異なる。プラットフォームの位置を特定するのに必要な潜時（試験時間、60秒以下）を記録した。5日目にプローブ試行を行い、水槽内にプラットフォームがない状態で60秒間泳がせた。その際、水中プラットフォームがあった場所に滞在した時間を記録した。

MRI実験
プロトコル
撮像実験前に動物を麻酔し、撮像中は1.5-2.5%イソフルランで麻酔を維持した。体温、心拍数、呼吸数は、小動物用に設計されたSA Instruments社（米国ニューヨーク州ストーニーブルック）の光ファイバー検出システムで監視し、正常範囲に保った。各処置群の動物数は、SPF（n＝5、2つの産毛から2匹の雌と3匹の雄）、LPS（n＝8、4つの産毛から5匹の雌と3匹の雄）、Reuteri（n＝7、3つの産毛から4匹の雌と3匹の雄）、およびLPS／Reuteri（n＝6、2つの産毛から2人の雌と4人の雄）である。

MRIデータは、内径11.6cmのアクティブシールドグラジェントコイル（全軸最大定勾配強度230mT/m）を備えた9.4テスラ小動物スキャナー（ブルカー、エトリンゲン、ドイツ）で取得された。各マウスはアニマルホルダーに仰臥位で設置し、直径30mmの直交ボリュームコイル（Rapid MR International, Columbus, OH）に挿入した。脳全体をカバーするために、RARE（Rapid Acquisition with Relaxation Enhancement）パルスシーケンス（繰り返し時間（TR）＝4000 ms、エコー時間（TE）有効＝24 ms、視野（FOV）＝25.6 × 19.2 mm2、行列サイズ＝256 × 192、スライス厚＝0.5 mm、RARE factor＝8、励起回数（NEX）＝4）で冠状方向にマルチスライススピンエコーT2強調（T2W）撮影を実施した。T2W撮影と同じジオメトリで、flow compensated T1-weighted sequence（TR/TE = 15/3.9 ms, flip angle = 60°, FOV = 25.6 × 19.2 mm2, 256 × 192, slice thickness = 0.5 mm）でTOFアンギオ画像を取得した。Native T1測定はRARE VTR（variable TR）画像（TR = 281, 350, 500, 1000, 1500, 2000, 3000, 5000, 10000 ms, TE = 12.3 ms, RARE factor = 4, FOV = 25.6 × 19.2 mm2, matrix size = 128 × 96, thickness = 1.5 mm, slice number = 9, NEX = 1）により実施した．0.1 mmol/kgのOmniscan（ガドジアミド、GEヘルスケア、米国）をIP注入した15分後に、上記と同様のT1測定を2回繰り返した。

データ解析
MRIデータは、IDL 6.4 (Harris Geospatial Solutions, Inc. CO, USA)を用いて、社内ソフトウェアパッケージで解析した。脳領域（ROI）をT2W画像に手動でトレースし、TOF画像とT1測定画像に重ね合わせた。脳全体の体積は，各スライスの全画素の合計にスライス厚を乗じることで算出した．脳内血管の体積を求めるために、血管を表す画素のみを選択する閾値を設定した。この画素を用いて、血管の体積を算出した。

T1計算
造影剤注入前後のT1マップは、各画素のRARE VTR信号強度（STR）をTRの関数として以下のようにフィッティングすることで算出した。

�
�
�

0
⋅
1

�

�
/
�
1

ここで、P0 はプロトン密度に依存する平衡信号である。

免疫組織化学
脳は生後 2 週間のマウスから新鮮なものを入手し、OCT に包埋して凍結した。8μmの切片を氷冷メタノールで-20℃、20分間固定した。で15分間透過処理し，0.2％Triton-X PBS（PBST）中のブロッキング溶液（5％ヤギ血清）と共に室温（RT）で1時間インキュベートした．その後、脳切片をそれぞれの50μLの一次抗体溶液とともに4℃で一晩インキュベートした。PBSTで10分間4回洗浄した後、切片を、それぞれの蛍光剤結合二次抗体とともに、室温で1時間インキュベートした。核のカウンターステインにはDAPI-antifade mount mediumを使用した（Invitrogen Inc.） 画像はStellaris共焦点顕微鏡（Leica Microsystems, Inc, Buffalo Grove, IL, USA）で撮影した。画像処理および解析には ImageJ (U. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2012) 113 を使用した。

16S rRNA 配列決定
マウス糞便サンプルは、ゲノムDNA抽出とその後のIllumina MiSeqプラットフォームでの16S rRNA遺伝子配列決定のために、シカゴ大学（米国イリノイ州シカゴ）のDuchossois Family Institute（DFI）のマイクロバイオームメタジェノミクス施設に提出された。MiSeq 16S rRNAリードの処理には、デフォルトのパイプラインであるDada2（v1.18.0）を使用し、R（v4.0.3）でマイナーチェンジを行いました。具体的には、まずリードをフォワードリードでは210 bp、リバースリードでは150 bpでトリミングし、低品質なヌクレオチドを除去しました。キメラはdada2パイプラインのデフォルトのコンセンサスメソッドで検出・除去しました。その後、300 bpから360 bpの長さのASVを残し、高品質なASVとみなしました。得られたASVの分類は、RDP分類器（v2.13）を用いて、ブートストラップ信頼度スコア80以上で属レベルの分類を行いました。種レベルの分類は、blastn (v2.13.0) と refseq_rna データベース (2022-06-10 更新) を用いて行うことができます。配列データはNCBI Bioproject IDで登録されている。PRJNA866398。2週齢において、各処置群の動物数は、SPF（n＝5、2つの産毛から2匹の雌と3匹の雄）、LPS（n＝5、2つの産毛から2匹の雌と3匹の雄）、Reuteri（n＝5、2つの産毛から4匹の雌と1匹の雄）、LPS／Reuteri（n＝5、2つの産毛から2つの雌と3匹の雄）である。12週齢時の各処理群の動物数は、SPF（n＝5、2産駒の雌1匹と雄4匹）、LPS（n＝5、2産駒の雌3匹と雄2匹）、Reuteri（n＝5、2産駒の雌1匹と雄4匹）、LPS／Reuteri（n＝5、2産駒の雌3匹と雄2匹）である。

メタボローム解析
データ収集
血清および脳サンプルは、DFIのマイクロバイオーム・メタゲノミクス施設に提出され、代謝物の抽出が行われた。サンプルはThermo Fisherの液体クロマトグラフィーシステムにOrbitrap IQ-X質量分析計を接続し、ポジティブモードで分析した。Cortecs© UPLC T3 Column (1.2 µm, 2.1 × 100 mm) にサンプル3 µLを注入し、30℃でCortecs© UPLC T3 ガードを取り付けました。移動相Aは0.1%ギ酸を含む水、移動相Bは0.1%ギ酸を含む95%アセトニトリルです。0.48mL/minの流速で0.2分間、0%Bからグラジエント溶出を開始し、5分間かけて97%Bまで直線的に増加させ、この条件を1.0分間一定に保った。最後に0%Bで1.5分間再平衡化を行った。エレクトロスプレーイオン化条件は、スプレー電圧3.4 kV、気化器温度400℃、検出窓100-2000 m/zに設定した。MS2スキャンのプリカーサー選択は、150-2000 m/zに設定し、10秒以内に2回、動的排除を行った。アイソレーションウィンドウは1.5 m/z、オフセットなし、衝突エネルギーは30%に固定した。2週齢の時点で、血清サンプルについての各処置群の動物数は、SPF（n＝3、3つの産毛から雌2匹と雄1匹）、LPS（n＝3、2つの産毛から雌2匹と雄1匹）、Reuteri（n＝3、2つの産毛から雌2匹と雄1匹）およびLPS／Reuteri（n＝3、一つの産毛から雌2匹と雄1匹）である。血清サンプルの12週齢において、各処置群の動物数は、SPF（n＝4、2つの産毛から2匹の雌および2匹の雄）、LPS（n＝4、3つの産毛から2匹の雌および2匹の雄）、Reuteri（n＝4、2つの産毛から2匹の雌および2匹の雄）およびLPS／Reuteri（n＝4、2つの産毛から2人の雌および2人の雄）である。2週齢時の脳サンプルの各処理群における動物数は、SPF（n＝3、2産駒の雌1匹と雄2匹）、LPS（n＝3、2産駒の雌3匹）、Reuteri（n＝3、2産駒の雌2と雄1匹）、LPS／Reuteri（n＝3、1産駒の雌1と雄2）であった。脳サンプルの12週齢では、各処置群の動物数は、SPF（n＝4、2産駒から雌2匹および雄2匹）、LPS（n＝4、3産駒から雌2匹および雄2匹）、Reuteri（n＝4、2産駒から雌2匹および雄2匹）およびLPS/Reuteri（n＝4、2産駒から雌2匹および雄2匹）である。

データ処理
生データをオープンソースのファイル形式に変換し、MZmine2とGlobal Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) 環境のFeature-Based Molecular Networking機能を用いて、特徴の特定と公開されているライブラリスペクトルとのデータマッチング処理を行った。統計解析と可視化にはMetaboAnalystを使用しました。

MZmine
MZmine 2.53Citation74 を用いて、生データから各サンプルにおける存在量と特徴リストを作成した。使用した設定は、生データを手動で検査し、固有のノイズレベルを超えるシグナルを表す値、典型的なピーク形状、質量および保持時間（RT）の許容誤差に基づいています。まず、各データファイルの質量リストを作成するために、MS1スキャンとMS2スキャンの両方でノイズカットフィルターを使用した質量検出が行われました。Centroidの質量検出器は、MS2レベルでは6.0E3、MS1レベルでは1.0E4に設定されました。ADAPクロマトグラムビルダーアルゴリズムを使用して、MS1レベルで、最小グループサイズ3スキャン、グループ強度閾値1.0E4、最小最高強度3.0E4、m/z許容値0.015 Da または 5.0 ppmの抽出イオンクロマトグラムを作成しました。クロマトグラムのデコンボリューションは、Wavelets (ADAP) アルゴリズムを使用して、S/N 閾値 10、最小特徴高さ 5E5、係数/面積閾値 110、ピーク期間範囲 0.00-1.00, RT wavelet 範囲 0.01-0.25, m/z 中央値計算、MS2 スキャンペアリングの m/z 範囲 0.01 Da, MS2 スキャンペアリングの RT 範囲 0.1 分で実行されました。同位体ピークグルーパーモジュールは、m/z の許容範囲が 0.01 Da または 5.0 ppm、RT 0.1 min、最大電荷が 4、最小 m/z を代表同位体とするフィーチャーのグループ化に使用されました。マスターフィーチャーリストは、Join aligner モジュールを用いて、m/z の許容誤差を 0.01 Da または 5.0 ppm、RT 0.1 min、m/z と RT の重みを等しく設定して作成しました(1)。得られたフィーチャーリストをフィルタリングして重複フィーチャーを除去した後、ギャップフィリングアルゴリズムを使用して、以前のアルゴリズムで検出されなかったピークの欠測値を埋めた。ピークファインダーのギャップフィリングアルゴリズムは、強度許容差10%、m/z許容差0.02 Daまたは5.0 ppm、RT許容差0.1分で使用されました。ピーク面積が 3.0E4 未満のピークはフィルタリングにより除去されました。得られたフィーチャーリストはGNPS解析用にエクスポートされました。

グローバル天然物ソーシャルモレキュラーネットワーキング(GNPS)
Feature-Based Molecular Networking (FBMN) ワークフローCitation75 on GNPS (https://gnps.ucsd.edu)Citation76 を用いて分子ネットワークを作成した。MZmine2の結果をGNPSにエクスポートし、FBMN解析を行った。データは、プリカーサーのm/zから±17 Da以内のすべてのMS/MSフラグメントイオンを除去することによってフィルタリングされました。MS/MSスペクトルは、スペクトル全体を通して±50 Daウィンドウ内の上位6つのフラグメントイオンだけを選択してウィンドウフィルターした。プリカーサーイオンの質量公差は0.02 Daに、MS/MSフラグメントイオンの公差は0.02 Daに設定されました。次に、コサインスコアが0.7以上で、6つ以上のピークが一致するエッジをフィルターにかけ、分子ネットワークを作成しました。さらに、2つのノード間のエッジは、それぞれのノードが最も類似したトップ10ノードに登場する場合にのみ、ネットワーク内に保持されました。最後に、分子ファミリーの最大サイズを100に設定し、分子ファミリーサイズがこの閾値を下回るまで、最もスコアの低いエッジを分子ファミリーから削除した。アナログ検索モードは、プリカーサーイオン値の最大差が100.0のMS/MSスペクトルに対して検索することで使用されました。ライブラリのスペクトルは、入力データと同じ方法でフィルタリングされた。ネットワークスペクトルとライブラリスペクトルの間に保たれるすべてのマッチは、0.7以上のスコアと少なくとも6つのマッチしたピークを持つことが要求されました。このジョブは、https://gnps.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=95ff61735c414baabd25a8fc0aeb7888 でアクセスすることができます。

フィーチャーリストのフィルタリング
GNPS から出力された特徴リストに推定 ID を関連付け、Excel でブランクと品質管理注入に見られるピーク面積を用いてフィルタリングし、統計解析から低品質の特徴を除外した。ブランクピークをフィルタリングするために、まず、溶媒ブランクサンプルで見つかった1E6を超える生のピーク面積を持つすべてのフィーチャーが除去されました。次に、ピーク面積をそのサンプルのコール酸内部標準のピーク面積で割ることによって、サンプル内のフィーチャーを正規化しました。正規化されたピーク面積がメソッドブランクサンプルのピーク面積以下のサンプルに含まれるフィーチャーは削除されました。各サンプル処理グループのプールQCをランを通して注入し、各QCの3回の注入を使用して、フィーチャーの変動係数（%CV）を計算しました。3回のQC注入で正規化ピーク面積の%CVが10%を超えるフィーチャーは除外された。最後に、既知の質量分析汚染物質およびポリエーテルポリマーと GNPS が一致するフィーチャーを除去し、389 のフィーチャーをリストアップしました。

MetaboAnalyst
MetaboAnalystCitation77を使用して、GNPSからエクスポートされたフィーチャーリストを統計的に分析・可視化し、389の高品質フィーチャーにフィルタリングしました。各サブセットについて、すべてのサンプルで値が単一または一定であるフィーチャーは削除されました。数値はMetaboAnalystからエクスポートしたものです。

統計情報
16S rRNAシーケンスおよびメタボロームデータ解析は、上記のそれぞれのセクションに記載されています。他のすべてのデータは、平均値±平均値の標準誤差（SEM）として表示されています。統計解析には、GraphPad社のPrism 9 (La Jolla, CA) ソフトウェアを使用した。複数のグループ間の差異を決定するために、Tukeyの多重比較ポストホックテストを伴う一元配置分散分析が使用された。p値＜0.05を有意とした。

補足資料
補足資料
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謝辞
画像解析の技術的支援をいただいたシカゴ大学統合光顕微鏡コア施設のChristine Labno博士、16S rRNA配列解析の支援をいただいたシカゴ大学Duchossois Family研究所のNicholas Dyllaに感謝する。本研究は、NIH R01 HD105234 (E. C. Claud), NIH R21 NS121432 (J. Lu), NIDDKP30DK42086 (Center for Interdisciplinary Study of inflammatory Intestinal Disorders (C-IID)), and the SET Center and The Duchossois Family Institute of the University of Chicagoから支援を受けています。

情報開示
著者による潜在的な利益相反は報告されていない。

データの入手方法
データは、対応する著者から要請があれば入手可能である。https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA866398

補足資料
本論文の補足資料は、https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2178800 からオンラインでアクセスできます。

追加情報
資金提供
本研究は、National Institutes of Health R01 HD105234 (E. C. Claud), National Institutes of Health R21 NS121432 (J. Lu), Center for Interdisciplinary Study of Inflammatory Intestinal Disorders (C-IID) National Institutes of Health P30DK042086, The Duchossois Family Institute and The SET Center of the University of Chicagoにより一部支援されています。
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