カプセル化糞便微生物移植による腸内細菌コロニー形成と代謝物制御による潰瘍性大腸炎患者の寛解の誘導

哉百名

2023年4月25日 10:19

2023年4月24日
カプセル化糞便微生物移植による腸内細菌コロニー形成と代謝物制御による潰瘍性大腸炎患者の寛解の誘導

https://journals.asm.org/doi/10.1128/spectrum.04152-22

著者紹介 Qiongyun Chen, Yanyun Fan, Bangzhou Zhang, Changsheng Yan, Qiang Zhang, Yuhao Ke, Zhangran Chen, SHOW ALL (17 AUTHORS), Hongzhi Xu https://orcid.org/0000-0002-2725-5359 xuhongzhi@xmu.edu.cnAUTHORS INFO & AFFILIATIONs
DOI: https://doi.org/10.1128/spectrum.04152-22
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ABSTRACT
イントロダクション
結果
ディスカション
材料と方法
謝辞
補足資料
参考文献
ABSTRACT
便微生物移植（FMT）は、潰瘍性大腸炎（UC）患者の臨床的寛解を誘導することができます。浣腸、鼻十二指腸チューブ、大腸内視鏡は、FMTの最も一般的な投与経路である。しかし、潰瘍性大腸炎患者におけるカプセル化FMT治療の有効性に関する決定的なエビデンスはない。本研究では、活動性UC患者22名にカプセル化FMTを投与し、カプセル化FMTの効率性を評価するとともに、臨床的寛解への反応に関連する特定の細菌および代謝物因子を明らかにしました。その結果、カプセル化FMTの使用はUC患者の治療において成功することがわかりました。カプセル化FMTはUC患者の57.1％（21人中12人）および76.2％（21人中16人）にそれぞれ臨床的寛解および臨床的反応を誘導した。寛解を達成した患者では、FMT後に腸内細菌の豊かさが増加した。FMT後に寛解した患者では、インドール乳酸の増加とともに、アリスティペス属とオドリバクター・スプランチニクスの濃縮が見られた。寛解に至らなかった患者では、Escherichia coliとKlebsiellaが濃縮され、12,13-DiHOME (12,13-dihydroxy-9Z-octadecenoic acid) とリポ多糖の生合成レベルが上昇しました。さらに、特定の菌や代謝物と患者の寛解誘導との関係を明らかにしました。これらの知見は、UC治療におけるFMTの新たな知見を提供するとともに、FMTの効果を高めるための治療的な微生物操作に関する参考情報を提供するものと考えられる。(本研究はClinicalTrails.govに登録番号で登録されています。NCT03426683）．
重要性糞便微生物叢移植は、患者において成功裏に使用されています。最近、カプセル化されたFMTがUC患者において反応を誘導することが報告された。しかし、そのような研究に登録された患者は限られており、UC患者の寛解におけるカプセル化FMTの機能因子は報告されていない。本研究では、UC患者を前向きに募集し、カプセル化FMTを投与した。第一に、カプセル型FMTは57.1%の患者に臨床的寛解を、12週間後には76.2%の患者に臨床的反応を誘導でき、より受け入れやすいことがわかった。第二に、カプセル化FMT後の寛解患者において、日和見病原体の減少とリポポリサッカライド合成の関係を見出した。また、カプセル化FMT後の寛解導入患者において、特定の菌や代謝物と寛解導入の関連性を確認した。これらの知見は、患者が自宅でFMTを受ける可能性を提示し、FMTの効果を高めるための治療的な微生物操作に関する参考情報を提供するものである。
はじめに
炎症性腸疾患（IBD）は、主に潰瘍性大腸炎（UC）またはクローン病（CD）と定義され、様々な要因や免疫反応の異常が関与する慢性かつ再発性の腸の炎症である(1). 潰瘍性大腸炎は、大腸粘膜の持続的な炎症で、通常は直腸に発症し、徐々に大腸全体に広がっていきます。UCの発症には、腸管粘膜の異常な免疫反応による炎症が重要な役割を担っています。治療に関する選択肢としては、5-アミノサリチル酸（5-ASA）、コルチコステロイド、免疫抑制剤などがあります。これらの薬剤は、周期的な寛解をもたらし、再発を招く可能性が高い(2)。したがって、UCに対する新しい効果的な治療法を模索する必要がある。IBDにおける微生物の病態生理学的役割から、微生物叢の調節を含む代替治療法が有効である可能性があります（3、4）。
数十年前から、健康なドナーから得た糞便懸濁液を患者の消化管に投与する糞便微生物叢移植（FMT）が、Clostridioides difficile感染症（CDI）患者の細菌療法に用いられ、成功を収めている（5）。このことは、マイクロバイオームの影響を受ける可能性のある他の疾患に対する治療法としてFMTの使用を検討する研究を後押ししています。最近、IBD、特にUCの治療法としてFMTを受ける被験者が増えています。FMTは、活動性のUCに対して様々な有効性を示しています。FMTは、抗生物質、プロバイオティクス、プレバイオティクスを含む他の治療法よりも効果的であり（4）、胃腸症状の改善、下痢の減少、腸内細菌に関連する変化と関連している（6-8）。UC患者におけるFMT治療の結果は、様々な施設で非常に不均一であり、CDI患者におけるFMT治療に対する安定した反応とは異なっていた。オーストラリアで行われた大規模な多施設共同無作為化二重盲検臨床試験では、嫌気的に調製された低密度ドナーFMTを受けた参加者の32％（38人中12人）で、1週間の治療後にステロイドフリーの臨床的寛解が得られた（6）。また、UC患者を対象とした別の臨床試験では、大腸内視鏡による注入を1回行い、週5日8週間浣腸を受けた41人中18人（44％）でステロイドフリーの臨床的寛解が得られたと報告しています（9）。FMT治療の成功には、ドナー便の高品質な取り扱い、一定の基準を満たす患者、一定の輸血方法の使用が不可欠であることは間違いない。UCにおけるFMTの有効性は多くのランダム化比較試験で評価されているが、その有効性を決定的にするためには、より大規模な臨床試験が必要である。
現在、FMTの投与方法として、大腸内視鏡、経鼻十二指腸チューブ、浣腸、カプセルなど複数の方法が臨床医に提供されている(10-14)。これらのうち、侵襲的な手術は不便であり、特にFMTを頻繁に受ける人においては有害事象のリスクと医療費を増加させる。それゆえ、FMT治療が良い結果をもたらす可能性があるにもかかわらず、ほとんどの患者はFMT治療を拒否している。したがって、便利で効率的、かつ効果的なFMT法の探索は、臨床現場での応用において実用的な意義を持つ。CDI治癒率データのシステマティックレビューとメタアナリシスでは、FMTを大腸内視鏡で実施した場合、浣腸よりも優れており、経口カプセルによる治療と同等であることが示されている（15）。そのほか、UC患者におけるカプセル化FMTに関する報告もいくつかある（10、13、16）。これらの研究では、カプセル化FMTはUC患者の臨床反応を誘発し、患者のMayoスコアまたは内視鏡的に確認された粘膜治癒を改善した。しかし、これらの研究では、登録された患者数が限られていた（10人未満）。さらに、カプセル化FMTの機能的要因は、UC患者の寛解において報告されていない。カプセル化FMTの利点を探り、患者の臨床結果に与える影響を明らかにするために、より大規模な試験を実施する必要がある。
ここでは、カプセル化FMT治療後のUC患者の血清代謝物および腸内細菌叢の経時的動態を調査した。カプセル化FMTによるUC患者の治療効率を明らかにし、マルチオーム解析により臨床的寛解に関連する機能的因子を明らかにすることを目的とした。
結果
FMTの有益なアウトカム
2016年6月から2019年6月にかけて、活動的なUCの患者22名を募集し、適格性を評価した。登録された患者は、カプセル化されたFMT治療を受け、12週目に最終フォローアップを完了した。フォローアップの訪問中に、1人の患者がスクリーニングプロセスに失敗したため、除外された。臨床試験プロトコルを図1AおよびBに示す。患者のベースライン特性および疾患活動性の測定値を表1に示す。登録された患者の平均年齢は42.62歳であった。3名の患者が女性であり、ベースライン時の平均総Mayoスコアは7.62点であった。このうち、17人の患者がメサラジン（2.0g 1日2回［b.i.d.］）を投与され、4人の患者はグルココルチコイド依存症であった。
図1
図1 潰瘍性大腸炎患者における12週間寛解に対する糞便微生物移植の効果。(A）潰瘍性大腸炎患者における糞便微生物移植の試験概要、（B）本臨床試験における糞便サンプル採取（三角）、Mayoスコアリングによる臨床評価（菱形）、大腸内視鏡検査（丸）時点。FMT治療前後のUC患者の内視鏡検査とヘマトキシリン・エオジン染色（C）およびMayoスコア（D）の推移を示す。平行線は個々の患者のMayoスコアの変化を示しており、実線はFMTの値を示している。各線はベースライン（W0［円］）から始まり、エンドポイント（W12［三角］）で終了した。臨床的寛解の達成は緑で、非臨床的寛解は赤で示されている。ボックスプロット中のアスタリスクは、各群の平均メイヨースコアを示す。有意性は、ペアのウィルコクソン順位和検定で判定した。FMT、経口カプセル化糞便微生物叢移植。
表1
表1 UC患者のベースライン特性とFMTによる治療後のアウトカム
特徴UC患者（n=22）の結果b性別、数（%）女性3（13.6）男性19（86.4）年齢、年、平均（範囲）42.5（20-68）左側疾患のみ、数（%）7（31.8）総Mayoスコア 7.62（4-12）炎症マーカー、平均（範囲）CRP、 mg/L5.03 (0.15-64. 89) ESR, mm/h14.42 (0.2-30.7) WBC数, 10×9/L7.7 (3.62-18.12) 好中球数, 10×9/L4.96 (1.48-14.13) 好中球比率, % (範囲) 60.09 (38.3-75.3) Outcomes, no (%) 臨床的奏効16 (76.2) 臨床的寛解12 (57.1) 内視鏡による寛解 10 (47.6)
a
CRP、C反応性タンパク質、ESR、赤血球沈降速度、WBC数、白血球数。
b
有効性解析の対象は、試験中に通信が途絶えた1名を除いた21名である。
12週間の試験期間中、Mayoスコアの合計がベースラインと比較して有意に減少することが観察された。12週目にMayoスコアが3ポイント以上減少し、30％以上の減少を達成した患者をレスポンダー（Rps）とみなした。また、12週目にMayoスコアが2点以下になった患者を臨床的寛解（Rm）とみなした。ベースライン時、反応者（Rps）と非反応者（NRps）、寛解期（Rm）と非寛解期（NRm）の患者間で、総Mayoスコアに有意差はありませんでした。平均総Mayoスコアは、12週目のカプセル化FMT治療後に有意に（P < 0.001）減少した（図1D）。FMT治療後、腸管粘膜は修復されたように見え、潰瘍や健康な粘膜に関連する転帰は改善されました。病理組織学的検査の結果、粘膜腺は規則正しくなり、急性および慢性炎症細胞の数は、以前に観察された数と比較して著しく減少し、粘膜にクリプト炎やクリプト膿瘍は観察されなかった（図1C）。主要評価項目である臨床的寛解は、カプセル化FMT投与後のUC患者21名中12名（57.1%）で達成され、そのうち内視鏡的寛解は10名（47.6%）でした（表1）。また、UC患者の最大76.2％（16/21）で臨床効果が認められた（補足資料の図S1参照）。注目すべきは、カプセル化FMTを投与された患者の中には、4週目に臨床症状の緩和を得ることができた患者がいたことである。グルココルチコイドを投与された4名の患者は、追跡調査中に強制的に投与量を漸減させることで治療を成功させた。
試験期間中、重篤な有害事象は発生せず、FMTカプセルの治療には十分な忍容性が認められた。最も頻繁に発生した有害事象は、便通の増加（n = 2 [9.15%]）、カプセル殻を含む便（n = 1 [4.5%]）および腹痛（n = 1 [4.5%]）を含む胃腸の愁訴でした。これらの有害事象は軽度で、24時間以内に自己完結し、通常、最初のFMT治療が実施された後に発生した（表2）。カプセル化FMT治療後、感染の兆候や白血球数の変化は観察されなかった（表3）。
TABLE 2
表2 12週間の試験期間中の有害事象について
AEa登録されたUC患者（n=22）の結果b全AE、n6全SAE、n（%）0（0）FMT関連AEによる脱落、n（%）1（4.5）腹痛、n（%）2（9.1）緩い便、n（%）2（9.1）嘔吐、n（%）0（0）カプセル入り糞便、n（%）1（4.5）
a
AE、有害事象、SAEs、重篤な有害事象。
b
データはイベント数または患者数で、括弧内はパーセンテージを示す。
表3
表3 FMT治療中のUC患者の臨床検査値a
パラメータRm群NRm群ベースラインW1W4W12ベースラインW1W4W12CRP, mg/L, mean (range)6.82 (0.15-64.89)1.45 (0.3-2.86)1.02 (0.21-2.19)2.83 (0.34-17.66)3.41 (0.4-9.67)1.63 (0.37-8.4)11.56 (0.52-54.2)13.29 (0.62-38. 5）ESR、mm/h、平均（範囲）15.33 (4.2-35.0)13.49 (3.2-42.7)9.71 (1.7-21.8)7.1 (1.0-12.7)11.83 (0.2-18.3)12.69 (0. 1-21.5）15.51（0.26-48.5）12.48（0.1-23.6）WBC数、10×9/L、平均（範囲） 7.63 (3.86-12.12)5.79 (4.98-7.1)6.79 (4. 39-10.32)6.53 (4.0-9.1)7.81 (3.62-18.12)9.06 (4.7-16.74)5.64 (2.62-8.55)6.53 (4.73-7. 65)単球数, 10×9/L, 平均(範囲)0.50 (0.27-0.72)0.412 (0.2-0.66)0.43 (0.28-0.67)0.41 (0.24-0.73)0.51 (0.26-1.2)0. 72 (0.42-0.95)0.46 (0.21-0.66)0.41 (0.35-0.48)Neutrophil count, 10 × 9/L, mean (range)4.9 (1.48-8.14)3.53 (1. 36-5.75)4. 36-5.75)4.3 (2.24-6.72)4.41 (2.73-6.46)5.03 (2.24-14.13)6.85 (2.83-13.1)3.36 (1.33-6.98)3.33 (2.54-4.84)
a
Rm群：臨床的寛解期の患者、NRm群：非寛解期の患者、W1、W4、W12：それぞれ第1、4、12週、CRP：C反応性蛋白、ESR：赤血球沈降速度、WBC数：白血球数。
FMT後の腸内細菌叢の変化。
細菌αの多様性は、16S V3-V4配列に基づくリッチネス（観察値およびChao1）、シャノン多様性、ピエロの均等性を決定することで評価された。予想通り、細菌のα多様性、観察されたリッチネス（P < 0.05）、およびシャノン（P < 0.05）指数は、UC患者では健常者よりも著しく低かった（図S2A）。主成分分析（PCA）によるβ多様性の分析では、UC患者の腸内細菌群集は、健常者グループとは別に明らかに（順列多変量分散分析［PERMANOVA］；F = 4.131；P < 0.001）クラスター化していた（図 S2B）。このパターンは、UC患者においてEscherichia_Shigella、Veillonella、Enterobacter、Collinsellaの存在量が高く、AlistipesとAkkermansiaの存在量が低いことと有意に関連していた（図S2BおよびC）。
同様に、両リッチネス指数は、患者のベースライン検体よりもドナー検体で有意に高かった。UC患者からのサンプルの細菌リッチネスは、カプセル化FMT後に有意に増加し、1週目ではドナーから得たサンプルのそれと同等であったが、4週目と12週目では減少した（図2A）。シャノン多様性もカプセル化FMT後、1週目と4週目に増加した。主成分分析の結果、FMTを受けた患者の微生物群集全体が、ドナー試料で観察されたクラスターに向かって顕著なシフト（PERMANOVA; F = 1.7913; P < 0.001）を示した（図2B)。特に、FMTを受けた患者のプロファイルでは、Prevotellaceaeがファミリーレベルで優勢になることが観察された（図2C）。また、上位25属では、Prevotella_9の濃縮、BacteroidesとEscherichia_Shigellaの枯渇が観察された（Fig. S3）。ベースラインと比較して、FMT後のUC患者からのサンプルでは、Prevotella_9、Alloprevotella、Odoribacterのレベルが有意に増加し、Bacteroides、Veillonella、Enterococcusのレベルは有意に減少した（図2およびE）。FMT後の患者から得られた便サンプルにおける微生物プロファイルのシフトは、操作分類学的単位（OTU）レベルでより顕著であった（図S4）。
図2
図2 FMT後のUC患者の腸内細菌群集の変化。(A) 豊かさ（観察されたOTUとChao1）とShannonとPielouの均等性によってα多様性を推定する。破線は、線で覆われた2群間の有意な（P < 0.05）差異を示す。(B）OTU存在量のユークリッド距離の主成分分析により評価した、ベースライン時、追跡調査中の他の時点、およびドナーにおけるUC患者間の腸内細菌群集構造の差異。データはHellinger変換を行った。上位10属は、P < 0.05の有意性でPCAに適合させた。(C) FMTグループの患者から得られたサンプルにおける上位15ファミリーの相対的存在量。(D) ベースラインとFMT治療後のサンプル間で、属の相対存在量が有意に異なっていた。(E）すべての時点における属のZスコア変換相対存在量に基づき、FMTグループの異なる時点で有意差を示す属のヒートマップ。
FMT後の臨床的寛解に関連する有益な細菌の濃縮は、日和見病原体のレベルの減少を伴っていた。
臨床的寛解を達成したUC患者は、FMT後に腸内細菌叢に効率的かつ持続的な変化を示した。16S V3-V4シーケンスに基づくと、腸内細菌の豊富さは臨床的寛解（Rm）群で増加し、FMT後のフォローアップ訪問でドナーのそれと同等であった。一方、FMT後4週目と12週目のリッチネス指数は、非寛解群（NRm）グループのドナーと比較して有意（P＜0.05）に低かった。しかし、各時点でRm群とNRm群の間に有意な差は認められなかった（図3A）。FMT後のα多様性の増加傾向は、メタゲノム技術を用いて配列決定したデータセットにおいてより顕著であった（図S5）。興味深いことに、12週目の時点で、シャノン値とイーブン値はわずかに（0.05＜P＜0.1）低く、リッチさはNRm群よりもRm群で相対的に高かった。これは、一部の分類群がFMT中に効果的に移植され、Rm群でその成長の優位性を維持したことを示唆する。全体として，寛解を達成した患者から得られた便サンプルの腸内細菌群集は，FMTの1週間後にドナーから得られた便サンプルのものに近いクラスターを形成していたが，NRm患者から得られた便サンプルの細菌群集は12週目までドナーから得られた便サンプルのものに近くない（図3B；図S5）．ベースラインと比較して、細菌群集の有意な変化は、16S rRNAおよびメタゲノミックデータセットの両方において、Rm群では第1週（PERMANOVA；F = 1.7603；P = 0.0384）および第4週（PERMANOVA；F = 1.926；P = 0.034）の両方で検出したが、NRm群ではなかった（補足資料のテーブルS1参照）。さらに重要なことに、4週目にはRm群とNRm群の間に有意差があった（図3B; 表S1）。これらの結果は、FMT後4週目に寛解に関連する微生物の変化を評価することが重要である可能性を示した。
図3
図3 FMT後のRmおよびNRmに関連する腸内細菌群集の変化。(A) Rm、NRm、ドナーサンプルのα多様性を、リッチネス（観察されたOTU）とShannonとPielouの均等性によって推定した。破線は、その線で覆われた2群間の有意な（P < 0.05）差異を示した。(B）FMT後の経過観察中のベースラインと他の時点におけるRm、NRm、ドナーの腸内細菌群集構造の差異を、OTU存在量のユークリッド距離に基づくPCAで評価した。データにはヘリンジャー変換を施した。(C）細菌属の相対的な存在量は、臨床的寛解と一意的に関連していた。属の同定は、Rmのベースラインと他の時点の間で有意に異なる属をペア順位和検定で分析し、NRmのベースラインと他の時点の間で同時に有意に異なる属（W1およびW4）およびその逆を除去して右挿入（W12）を決定することによって行った。
臨床的寛解に関連する分類群を特定するため、FMT後の各時点間でRm群またはNRm群の属の違いを評価し、ベースライン値をペア順位和検定で解析した。Rm群ではFMT後1週目にButyricimonasとRuminococcacaeが排他的に増加した（NRm群では増加せず）。特に、よく知られている有益な細菌（FaecalibacterとButyricimonas）のレベルは、Rmグループのみで、4週目に独占的に強化され、日和見病原体（Escherichia_ShigellaとEnterobacter）のレベルは独占的に減少した（図3C）。Prevotella_9とAlloprevotellaは、12週目にNRmグループで特異的に増加した。これらの結果は、FMT後の臨床的寛解は、日和見病原体の根絶と有益な細菌の濃縮に関連していることを示した。さらに、Ruminococcus_gnavus_groupのメンバーの相対量は、FMT後のベースライン、1週目、4週目において、RmグループよりもNRmグループで有意に高いことがわかった（図S6）。Pedioccus、Enterococcus、Motganellaも同様の傾向を示した（Fig. S6）。これらの分類群は、FMT前の臨床転帰を予測するバイオマーカーとなりうる可能性がある。
ショットガン・メタゲノム解析により、臨床的寛解に関連するシグネチャーが確認された。
臨床的寛解に関連する腸内細菌のシグネチャーをさらに明らかにするため、0週目のRm（W0_Rm）とW4_Rm、0週目のNRm（W0_NRm）とW4_NRmのショットガン・メタゲノム解析後に得られた微生物データを、ペア・ウィルコクソンテストを用いて分析した。kraken2を用いて合計5,466種がアノテーションされ、そのうち937種の相対存在量が、特にW0_RmとW4_Rmの間で大きく変化した（表S2）。存在量の変化が見られた上位20種のうち、相対存在量の増加が見られたのは、Alistipes（Alistipes sp. 3BBH6, 5CBH24, and 5CPEGH6 and Alistipes shahii）、Odoribacter splanchnicus、Faecalibacterium prausnitziiの相対量の増加とEscherichia coli, Enterobacter hormaechei, Citrobacter freundii complex CFNIH3の相対量の減少は、FMT後に臨床的に寛解した患者の便サンプルで観察されていた（図4A）。機能的な微生物パスウェイの観点から、合計21のKEGGモジュール（表S3）および98のMetaCycパスウェイ（表S4）が臨床的寛解と特に関連することが確認された。アセト酢酸＋アセチルコエンザイムA（アセチル-CoA）（M00036）形成、フルクトース-6Pへのグルコネシス（M00003）、アデノシンリボヌクレオチドデノボ生合成（PWY-7219）、チアミン形成（PWY-7357）は4週目にRm群でユニークに増加しました。リポポリサッカライド（LPS）生合成-KDO2-脂質A（M00060）、脂質IVA生合成（NAGLIPASYN-PWY）、N-アセチルノイラミン酸分解のスーパーパスウェイ（P441-PWY）は、0週目に比べて特異的に低下した（図5BおよびC）。リポ多糖生合成経路に主に寄与する分類群にはEscherichia coliとKlebsiellaが含まれ（表S5）、これらの存在量もW4_Rm群で減少していることが観察された。
図4
図4 微生物シグネチャーは、4週目の臨床的寛解と特異的に関連している。糞便サンプルのショットガンメタゲノムプロファイリングにおいて、W0_Rm群と比較してW4_Rm群で存在量が有意に減少または特異的に増加した（すなわち、W4_NRm対W0_NRmでは有意差なし）（A）種、（B）KEGGモジュール、（C）MetaCycパスウェイを示している。有意性は、ペアのウィルコクソンテストを用いて検定した。相対的な存在量を示す各カテゴリの上位20シグネチャーを可視化した。アスタリスクは、各シグネチャーの平均値を示す。
図5
図5 メタボロームプロファイルは、FMT後のベースラインおよびタイムポイントにおける臨床的寛解と関連している。(A）時間ポイント（左パネル）および同じ時間ポイント内のサンプルのユークリッド距離（右パネル）に関して、正イオンモデルのメタボロームプロファイルのPLS_DA。データにはヘリンジャー変換を施した。文字は有意差のあるグループ分けを示す。(B) ベースラインとFMT後のサンプルで相対量が有意に異なる代謝物は、変数重要度投影（VIP）スコアが1以上であり、データベースで構造的に同定されている場合、変数重要度でフィルターをかけた。(C）臨床的寛解を達成した後、または臨床的寛解を達成しなかった後のFMT後0週目と4週目の正イオンモデルにおけるメタボロームプロファイルのPLS_DA（左パネル）、および0週目と4週目の間の患者のユークリッド距離（右パネル）．データはHellinger変換を施した。(D）W0_Rm群と比較して、W4_Rmでレベルが有意に減少または一意に増加した代謝物（すなわち、W4_NRm対W0_NRmでは有意な差はない）、VIPスコア>1を用いてフィルタリングし、データベースで構造的に同定した。(E）FMT後に経時的に変化し、さらに臨床的寛解によって層別化された部分代謝産物の相対存在量である。
寛解を達成したUC患者さんのメタボロームプロファイリング。
血清サンプルのグローバルメタボローム解析により、カプセル化FMT投与後の代謝変化と臨床的寛解に関連する代謝物が明らかになりました。部分最小二乗判別分析（PLS_DA）序列で可視化されるように、患者のメタボロームプロファイルは、正イオンモデルと負イオンモデルの両方でFMT治療後にシフトした（図5A；図S7A）。特に、Rm群とNRm群の患者のメタボロームプロファイルは、FMT後4週目にかなりの変動が見られた（図5A）。全体として、正イオンモデルまたは負イオンモデルで検出された378個の代謝物は、ベースラインと比較してFMT後に有意な変化を示した（表S6）。これらのうち、VIP（variable importance in projection）スコアが1以上である24の代謝物が、データベースで構造的に同定された。これらの代謝物には、l-トリプトファン（POS80）、12,13-DiHOME（NEG203）、PGH2-EA（POS133）などが含まれていた（図5B）。メタボロームプロファイルは、ポジティブイオン（PERMANOVA；F = 2.375；P = 0.047）モデル、ネガティブイオン（PERMANOVA；F = 2.086；P = 0.041）モデルの両方で、FMT後0週目と4週目で有意差がみられた。臨床的寛解の観点からは、Rm群の0週目から4週目までの患者のメタボローム変化は、NRm群の0週目から4週目までの変化よりも比較的広範囲であった（図5C；図S7B）。具体的には、W0_RmとW4_Rmの間で14種類の代謝物の構造同定時に有意差（P < 0.05; VIP > 1）が認められ（図5D）、これにはインドール乳酸、PGH2-EA、イソヒデオキシコール酸のレベルが上昇していた。一方、W0_NRmとW4_NRmの間では、35種類の代謝物のレベルに有意な差が見られ（P < 0.05; VIP > 1）（図S8）、l-トリプトファン、12，13-DiHOME（12，13-dihydroxy-9Z-octadecenoic acid）、オレイルエチルアミドなどが含まれていました。また、W4_Rmのメタボロームプロファイルは、W4_NRmのそれと有意に異なっていた（PERMANOVA；F = 3.171；P = 0.024）。特に、W4_RmではW4_NRmと比較してインドール乳酸の相対量が有意に高く、W4_RmとW0_Rmの差と一致した（図5E；表S7）。一方、12,13-DiHOMEの相対量は、W4_RmではW4_NRmのそれと比較して有意に低く（図5E；表S7）、W0_NRmではW4_NRmのそれと比較して（図S8）観察されました。
腸内細菌と代謝物の原子間相関。
プロクラステス解析により、腸内細菌叢とKEGGモジュール（M2 = 0.5005, P = 0.001）（図S9A）、MetaCycパスウェイ（M2 = 0.44; P = 0.001）（図S9B）、血清代謝物（M2 = 0.939; P = 0.024）（図6A）との間に強い協調的関係があることが示されました。Permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA)に基づく効果量分析を行い、腸内細菌群の各セットが代謝プロファイルにどのように影響するかを明らかにした。微生物種、MetaCycパスウェイ、KEGGモジュールの効果量は、ポジティブモデルではメタボローム分散の53.7%、22.3%、23.3%を、ネガティブモデルではメタボローム分散の62.3%, 19.9%, 17.8% をそれぞれ占めた（図6B）。臨床的寛解に関連する腸内細菌叢の変化と血清代謝の関係を明らかにするために、ピアソン相関分析を用いて、W0_RmとW4_Rmの間で有意に変化した上位20の腸内細菌種（図4A）、MetaCycパスウェイ（図4B）、KEGGモジュール（図4C）、血清代謝物（図5D）の差を探りました。ショットガンメタゲノミクスに基づく腸内微生物の特徴と代謝物の相関は、合計256個の有意な（P < 0.05）相関が同定されたが（図6C）、16S V4データセットからの属と代謝物の間には、わずか10の有意相関が同定された（図S10）。ネットワーク解析により4つの主要な相関クラスターが可視化され、そのうち1つは有益な代謝物［POS133_PGH2-EAおよびNEG151_LysoPA（18：1（9Z）/0：0）］のレベルの増加によって特徴付けられ、微生物種（Alistipes sp、 Odoribacter splanchnicusなど）、一方、代謝物（POS490_Pentacyclo [9.7.0.01,3.03,8.012,16]octadec-5-en-4-one, POS180_Phe-Asp-Trp-Asn など）、日和見菌（大腸菌、PO552株 Klebsiella sp., Salmonella entericaなど）のレベル低下で特徴づけられるものがあった。 )、機能パスウェイ(PWY-5347：l-メチオニン生合成［トランスサルファー］のスーパーパスウェイ、FASYN-INITIAL-PWY：脂肪酸生合成開始［大腸］のスーパーパスウェイ、M00348：グルタチオン輸送系、M00227：グルタミン輸送系)。Faecalibacterium prausnitzii、NEG101_イソヒオデオキシコール酸、POS329_PC[17：0/17：2（9Z，12Z）]の間の位置相関は、メタゲノムと16S V4の両方のデータセットにおいて観察された（図6C）。特に、4週目に寛解した患者（W4_Rm）では、KEGGモジュールM00060とUDP-N-アセチルグルコサミンからLPSへのKDO2-脂質A生合成経路が、ベースラインで寛解した患者（W0_Rm）に比べ、有意に減少していることが観察された。このモジュールはいくつかの遺伝子（K00677, K02536, K03269, K00748, K02560など）で構成されており、これらの遺伝子のほとんどの発現量はW0_RmおよびW4_NRmと比較してW4_Rmで著しく低下していた（図6D）。特に、Humann3によってこれらの遺伝子をコードすることが層別されたEscherichia coli、Klebsiella pneumoniae、Haemophilus parainfluenzaeなどの種の存在量は、W4_Rm群で減少した（図4Aおよび6D）。これらの結果から、FMT後に大腸菌やKlebsiellaなどの菌種を枯渇させることで、LPS産生が減少し、その結果、寛解群ではより良い治療効果が得られる可能性があると考えられた。さらに、W4_RmではW0_RmやW4_NRmに比べてインドール乳酸の濃度が高く（図6E）、これはトリプトファナーゼ遺伝子（K01167）やトリプトファンをインドール乳酸に変換する分類群Alistipes sp. 3BBH6株やOdoribacter splanchnicusが多く存在することと一致することが判明した。
図6
図6 腸内細菌と代謝産物の原子間相関。(A）腸内細菌種と血清代謝物のプロクラステス解析、（B）腸内細菌種の違いによる血清代謝物の総変動の割合、（C）W0_RmとW4_Rmで一意に有意差があった上位20の腸内細菌種、MetaCycパスウェイ、KEGGモジュール、血清代謝物のピアソン相関によるネットワーク解析。有意な相関（P < 0.05）を持つ種は保持された。(D）W4_Rmでは、LPS生合成（左パネル）およびトリプトファン代謝（右パネル）に関与する遺伝子を含む血清代謝物に関連する腸内細菌叢（種、遺伝子、パスウェイ）が濃縮および減少した。
考察
本研究では、活動性UC患者におけるカプセル化FMT治療の臨床転帰を検討した。また、腸内細菌叢と血清代謝物の一般的な解析を行い、FMT後の臨床転帰に関連する特定の分類学的、機能的、代謝物変化を特定した。カプセル化FMTは、12週目にUC患者の57.1％（21人中12人）に臨床的寛解を、76.2％（21人中16人）に臨床的反応を誘導することができました。患者から採取したサンプルの腸内細菌叢と血清代謝物は、カプセル化FMT治療後、特に4週目に有意に変化した。微生物の豊富さの改善、日和見病原体（Escherichia coli、Enterobacter hormaechei、Salmonella enterica）、LPS生合成などの経路、炎症性代謝物（12，13-DiHOME）の枯渇、有益微生物（Faucalibacterium prausnitzii and Alistipes sp. )、アセチルCoA生合成などの経路、抗炎症代謝産物(インドール乳酸)、およびそれらの相互作用がFMTの治療効果に関連することが確認されました。
本研究がこれまでのUC患者を対象としたFMTに関する研究と異なる大きな特徴は、カプセルを用いた微生物相の移植が低強度であることと、臨床的寛解が高い効率で得られることです。従来、糞便微生物移植を行うには、大腸経管や浣腸が主な方法であり、治療サイクルは比較的長かった。例えば、Paramsothyらは、まず右結腸へのFMTの単回大腸内視鏡送達を実現し、その後8週間にわたり週5日の浣腸を行った(9)。Samuelらは週2回の浣腸を行うことでFMTの有効性を示し（6）、Zhangらは中腸から1回の新鮮なFMTを用いた（17）。Paiらは、3歳から17歳の患者を対象に、ベースラインで大腸内視鏡による注入を行い、その後、週2回カプセルを6週間経口投与したことを報告している（18）。侵襲的な手術はすべてリスクが高く、患者のコスト増につながった(19)。本研究では、参加者全員が1週間以内に3回のカプセル化FMTを受け、重篤な副作用を示す者はいなかった。その結果、患者の腹痛スコア、下痢スコア、血便スコア、腸管粘膜病変、Mayo総スコアがFMT後に有意に減少した。この方法は、患者にとって大腸内視鏡検査や浣腸よりも受け入れやすいものであった。特に、臨床的寛解率（57％）は、これまでの準実験またはランダム化比較試験（RCT）研究で報告された値（37.0％；95％信頼区間[CI], [28.8～45.9] ）よりも高く、カプセルを用いた研究（20）よりも高い値であることがわかった。非盲検パイロット試験（13）では、7名の活動性UC患者にFMTカプセルを50日間毎日投与したところ、臨床症状の一時的な改善がみられた。糞便サンプルの細菌群集のα多様性には変化がなかった(13)。長期維持療法としてのカプセル化経口FMTに関する別の無作為化パイロット試験（16）では、活動性UC患者6人中2人（33.3%）が、カプセル化FMTを12週間毎日経口投与した後に臨床的寛解を達成した。一方、Arndtらは、活動性UC患者にカプセル化FMTを12週間毎日5日間連続投与したところ、10例中2例に大腸炎の悪化が認められ、8例中7例にMayoスコアの一部改善（5.8 ± 1.7 → 2.6 ± 1.1）（10）したと報告しています。このように、カプセル化FMTは、UC患者の治療において、寛解を誘導するための代替手段となり得る。しかし、家庭でのカプセルの保存に関する問題点を解決しなければならない。
一般に、FMTの4週間後に臨床症状が緩和されれば、ほとんどの患者は定常期にあると考えられる。症状の寛解に要する時間が長ければ長いほど、予後は悪くなる。病変部位（E1、E2、E3）や重症度と臨床効果の関係を明らかにしようと試みたが、カプセル型FMTの効果に有意差はなく、カプセル型FMTの影響は病変部位や重症度とは無関係であることが示された。また、FMT後4週目にRm群とNRm群の間で腸内細菌叢と代謝物の顕著かつ特異的な違いが観察されました。注目すべきは、先行研究でもFMT後4週目の微生物叢の変化を調査しており、結果は一貫した傾向を示していることである（6、9、21）。我々は、FMT後4週目に患者がFMTから利益を得られるかどうかを評価するかもしれない。もしそうでなければ、そのような患者さんにはできるだけ早く別の治療法を提供しなければならない。
また、UC患者においては、健常者と比較して微生物の豊富さが有意に減少していることが確認された。しかし、FMT後12週目に臨床的寛解を得た患者においてのみ、微生物の豊かさはドナーと同等のレベルまで改善された。FMT後の腸内細菌リッチネスの改善は、UC患者を対象としたこれまでの臨床研究でも報告されており（6、9、22）、FMTによる治療成功の重要な指標として示唆されている（6、23-25）。さらに、ドナーの腸内細菌濃度が高いことは、UC患者の寛解と関連することが報告されている（26）。全体として、細菌群集構造は、FMT後にドナーサンプルに近づくようにシフトした。特に、16S rRNA遺伝子データセットでは、Prevotella_9のレベルが顕著に増加し、FMT後に優勢属のレベルと同等になり、Bacteroidesのレベルが低下したことを伴っていた。これらの属はいずれもBacteroidalesに属するため、なぜこのような置換が起こったのかは不明であるが（27）、FMT後のPreovella_9の濃縮は、FMT処理に関する他の研究でも頻繁に報告されている（9、28）。その他、FMT後の細菌プロファイルにおける重要な変化として、日和見病原体としてよく知られているVeillonellaとEnterococcusが根絶され、人間の健康に役立つ短鎖脂肪酸（SCFA）を生成できるAlloprevotellaとOdoribacterが濃縮されました（29、30）。
臨床的寛解に関連する微生物および機能的な微生物経路を、16S rRNA遺伝子およびメタゲノム・データセットに基づいてさらに解析した。ベースラインと比較して、Faecalibacterim（F. prausnitzii）、Butyricimonas、Alistipes（Alistipes sp. 3BBH6、5CBH24、5CPEGH6株とA. shahii）、O. splanchnicus、Christensellaceae_R-7などの種の相対存在量の増加がFMT後の臨床寛解と特異的に関連していた。これらのうち、Faecalibacterim、Butyricimonas、Alistipesは、SCFA産生菌（29）としてよく知られており、IBD（31）、肥満（32）、盲腸（33）、鬱（34）において役割を果たす抗炎症性常在菌である。興味深いことに、最近発表された臨床研究では、O. splanchnicusは代謝（SCFAを産生）と粘膜免疫（制御性T細胞を誘導）の両方を促進し、潰瘍性大腸炎に対する保護効果を有する重要な菌株であると報告された（35）。CD、UC、IBSの患者では、広く生息し、ヒトの健康に関連することが報告されているChristensenellaceae科が枯渇していた(36)。また、Escherichia_Shigella（大腸菌）、Enterobacter（E. hormaechei）、Citrobacter freundiiなどの特定の分類群の減少は、もっぱら臨床的寛解と関連していた。これは、これらがIBDや下痢などの感染症を引き起こす病原菌として働くことを示した過去の報告結果と一致していた（37-39）。特に改善された微生物機能は、アセト酢酸＋アセチルCoA、フルクトース-6Pへの糖新生、チアミンの生成などであった。重要なことは、リポ多糖KDO2-脂質Aおよび脂質IVAの生合成の相対レベルおよびN-アセチルノイラミン酸分解のスーパーパスウェイの活性化の程度が、FMT後の臨床寛解中に専ら減少し、これはLPSの形成に寄与する大腸菌、クレブシエラとサルモネラ菌のレベルの変化と一致した（40および41）。腸内日和見菌由来のLPSは、宿主の自然免疫を強く刺激する主要なエンドトキシンとして、IBD、自己免疫疾患、代謝異常などに関与している（42、43）。したがって、LPSの蓄積を防ぐことは、重症の大腸炎の発症を防ぐことになる（41）。
血清代謝物プロファイルは、ベースラインとFMT後4週目の間で有意に異なっていた。これらのプロファイルのうち、インドール乳酸、PGH2-EA、イソヒデオキシコール酸の高値は良好な治療成績と関連し、12,13-DiHOMEの高値は悪い成績と関連しました。プロスタグランジンの一種であるPGH2-EAは、潰瘍性大腸炎において抗炎症作用を示した（44）。細菌のエポキシドヒドロラーゼ遺伝子が産生する12,13-diHOMEは、PPARγ（peroxisome proliferator-activated receptor γ）制御遺伝子の発現を変え、抗炎症サイトカイン分泌と制御性T細胞数を減少させ、炎症を増大させ免疫寛容を阻害しアトピー、湿疹、喘息発症に関与していた（45）。FMTによるトリプトファン生合成レベルの上昇は、治療の成功に寄与するもう一つの重要な要因であるかもしれない。臨床的寛解を得た患者では、トリプトファンは腸内細菌によってさらにインドール乳酸、インドール酢酸、インドキシル硫酸に代謝された（46）。代謝物は、腸管粘膜の自然免疫を活性化し、迅速な炎症反応を誘導するシグナルとして作用する可能性がある(47)。インドール乳酸は、AhRとヒドロキシカルボン酸受容体3の両方のアゴニストとして作用することにより、ヒトCD4+ T細胞と単球のex vivo免疫応答を用量依存的に調節した（48）。実は、微生物叢や代謝物と臨床反応との重要な関係を明確に示すために、私たちはいくつかの調査を行う努力をしました。その結果、血漿中の腫瘍壊死因子α（TNF-α）、インターロイキン17（IL-17）、IL-10、トランスフォーミング成長因子β（TGF-β）の濃度は有意に変化せず、末梢血中の免疫細胞も変化しなかった（データは示さず）。しかし、インドール乳酸は、デキストラン硫酸溶液（DSS）によって引き起こされる大腸炎において、腸の炎症を抑える可能性があることを発見しました（データは示していません）。インドール乳酸やその他の大腸炎における基礎的なメカニズムについては、さらに研究を進める必要がある。
総じて、我々は、軽度から重度のUC患者において、よく準備されたドナー便のカプセルを週3回経口投与することにより、FMTの有効性を実証した。カプセル化したFMTは、Alipipes sp.3BBH6株、Odoribacter splanchnicusなどの菌量を増やすことでトリプトファンの代謝を促進し、腸の炎症を緩和するインドール乳酸などの生産が可能になると考えられた。
材料と方法
試験デザイン
2016年6月から2019年6月にかけて、厦門大学中山病院にて活動性UC患者22名を登録し、単群パイロット臨床試験を実施しました。9人のドナーが研究に参加し、彼らの便を抽出してカプセルに充填した。微生物の多様性を高めるため、すべての患者が2人または3人のドナーからランダムにFMT注入を受けた。患者は1週間以内に3回（2日に1回）カプセル化されたFMTを実施した。12週間の追跡調査の後、臨床医はUC患者さんに対するFMTの効果を評価しました。維持療法として、5-ASA/SASP（サリチルアゾスルファピリジン）とプレドニゾンを安定量（登録前）投与し、1週間に5mg（10mg/日以上）または2.5mg（10mg/日以下）に強制的に漸減した。UC患者の便サンプルを0週目、1週目、4週目、12週目に採取してマイクロバイオーム解析を行い、血液サンプルを採取して臨床検査とメタボローム解析を行った。本研究は、厦門大学中山病院の承認を得て、ClinicalTrials.gov（登録番号：NCT03426683）に登録されました。
ドナーの管理
ドナーは厦門大学の広告で募集し、スクリーニングの過程でアンケートに答え、面接で生活習慣や病歴に関する質問に回答した。ドナー候補者は、感染症のリスクがないことを確認するため、順次、健康診断を受けた。ドナーは3ヶ月に1度健康診断を受け、健康的な食生活を送るよう指導されました。血清サンプルを用いて、以下の検査を実施した：血液検査、尿検査、肝機能、腎機能、CRP、赤血球沈降速度（ESR）、HIV、A型、B型、C型肝炎、腫瘍マーカー、TORCH（トキソプラズマ症、風疹、サイトメガロウイルス、単純ヘルペス、HIVに対する抗体）、EBウイルス（IgG、IgM）、サイトメガロウイルス（IgG、IgM）およびH．ピロリ菌（IgG）検査。便潜血検査、定期腸管病原体検査、C. difficile toxin B検査は、糞便サンプルを用いて実施した。ドナーの除外基準は、肝炎やHIVなどの感染症の個人歴、タバコや飲酒の個人歴、抗生物質やプロバイオティクスを含む前月の薬物使用、機能性胃腸障害、感染症、ポリープなどの胃腸疾患、自己免疫疾患、代謝症候群、その他の疾患であったことである。
(i)包含基準。年齢が18歳以上70歳未満で、活動性の潰瘍性大腸炎を有し、薬剤（5-アミノサリチル酸、サリチル酸スルファピリジン、プレドニゾンなど）に対する反応が悪い患者（Mayoスコア合計が4～12点）を男女別に対象とした。臨床症状（便の回数、直腸出血）、内視鏡評価、医師の評価を代表する要素である総Mayoスコアは、0から12までであった。
(ii) 除外基準消化器内視鏡検査が禁忌の患者、呼吸不全、心不全、重症免疫不全など他の重篤な疾患を有する患者、手術適応または大腸手術歴のある患者、消化器感染症の患者、登録の1ヶ月前に抗生物質またはプロバイオティクスを使用している患者、妊娠中または妊娠準備中の患者、代謝症候群や自己免疫疾患など腸内細菌叢に影響を与える他の疾患の既往がある患者を除外しました。
脱退の基準
患者さんは、いつでも試験から脱退することができた。データの信頼性を確保するため、患者には、脱退前に臨床医に連絡し、脱退の理由を説明する必要があることを伝えた。
カプセルの調製
ドナーから新鮮な便を滅菌プラスチック容器に採取した。新鮮な便サンプル（25%）を生理食塩水（60%）および医薬品グレードのグリセロール（15%）と混合し、半自動抽出装置（Treatgut TG-01; Anjiezhishan Company, China）で抽出した。器具を起動し、徐々に分離する工程を開始した。滅菌チューブを用いて抽出処理を行った後、上澄みを回収して遠心分離し、糞便微生物叢を含む沈殿物を取得した。沈殿物を十分に混合し、カプセル（DrCaps；19504907）に充填した。各カプセルには平均0.9gの糞便微生物叢の沈殿物が含まれ、直ちに-80℃で凍結された。
介入した。
本研究に参加する前に、患者からインフォームドコンセントを得た。認定された医師が、監視された臨床環境下でFMTを実施した。カプセルを経口摂取する前に、患者は一晩8時間以上絶食する必要があり、すべての患者は朝にFMTを受けた。80℃で保存したカプセルは、経口投与前に室温に戻した。患者はカプセルを温めた生理食塩水で服用した。FMT投与後6時間は，副作用の有無を確認するため，病院内で経過観察を行った。カプセル化FMTは1週間以内に3回に分けて（2日ごとに30カプセル）投与し、最長12週間まで経過観察を行った。0週目、1週目、4週目、12週目にマイクロバイオーム解析のために患者の便サンプルを採取し、検査およびメタボローム解析のために患者の血液サンプルを採取した。ベースライン（0週目、FMT前）および12週目に大腸内視鏡による評価を実施した。週次評価の時点は、W0（ベースライン、0週目）、W1（1週目）、W4（4週目）、W12（12週目）。
登録中の薬物療法
FMT中の患者には、UC維持療法が提供された。患者はメサラジン、SASP、プレドニゾンに反応不良であったため、FMT後のフォローアップ期間中は安定用量の薬剤を使用した。5-ASAまたはSASPで治療された被験者は、試験中に投与された薬剤と同じ用量の薬剤を引き続き投与された。プレドニゾンを投与された被験者は、強制的な漸減の後、投与を継続した：10mg/日超のプレドニゾンは10mg/日投与まで1週間に5mgの強制漸減があり、10mg/日以下のプレドニゾンは1週間に2.5mgの強制漸増があった。
アウトカム
12週目の臨床的奏効は、Mayoスコアの合計が3点以上減少し、ベースラインのスコアから30％以上減少したことと定義した（49、50）。臨床的寛解は、12週目のMayoスコアの合計が≦2であることと定義された。内視鏡的寛解は、粘膜の治癒とMayoスコアが≦1であること(50)とした。
糞便微生物叢の16S rRNA遺伝子とショットガンメタゲノムシーケンス。
新鮮な糞便サンプルを採取し、DNA抽出まで-80℃で凍結した。製造元のプロトコールに従い、QIAamp PowerFecal DNAキット（Qiagen）を用いて、ホモジナイズした各サンプル0.25 gから全糞便DNAを抽出した。その後、Multiskan GO分光光度計（Thermo Fisher Scientific、米国）を用いてDNAの収量と品質を確認した。細菌コミュニティを特定するために、10μL KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, USA), 2μL DNA (60 ng), および各バーコードプライマー1μL (10 μM) を含む20μL反応混合物で16S rRNA遺伝子V3-V4アンプリコンライブラリーを生成した。使用したフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ5′-CCTACGGGNBGCASCAG-3′および5′-GGACTACNVGGTWTCTAAT-3′である。PCRサイクル条件は以下の通りである： 95℃で3分間、その後、95℃で20秒間、60℃で30秒間、72℃で30秒間、最後に72℃で10分間のサイクルを30回繰り返した。AxyPrep PCR cleanup kit (Axygen, USA)のプロトコルに従い、各サンプルのPCR産物を精製し、Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, USA)を用いてその濃度を評価しました。ショットガンメタゲノム解析を行うため、各サンプルの100 ng DNAをBioruptor NGS sonicator（Diagenode社）を用いて350 bpの長さのストランドに切り出した。続いて、イルミナNEBNext Ultra II DNAライブラリープレップキットのプロトコールに従って、末端修飾、A-tail付加、シーケンスアダプター付加、精製、濃縮などのステップを経た。ライブラリーのインサートサイズは、Agilent 2100 (Agilent, USA)を用いて検出した。最後に、16S rRNA遺伝子およびメタゲノムライブラリーを、250bpペアエンドシーケンス試薬を用いたHiSeq 2500プラットフォーム（イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）および150bpペアエンドシーケンス試薬を用いたNovaseq 6000（イルミナ、インク、カリフォルニア州サンディエゴ、米国）で、それぞれXiamen Treatgut Biotechnology Co, Ltd.で配列決定した。生配列は、NCBI Sequence Read Archiveに寄託した。
微生物バイオインフォマティクス解析
生のV3-V4シーケンスリードは、FLASH（51）を用いて、-M 200や-x 0.15などのパラメータで高品質リードを生成するために組み立てられた。さらにCutadaptを用いてプライマーを除去し、生成されたリードをキメラチェックし、USEARCH（52）を用いて97%の類似性を示すOTUを生成するためにクラスタリングした。細菌の分類学的分類を行うために、OTUの代表的な配列をSilvaデータベース(53)に対してRDP Classifierを用いて信頼度50%で分類した(54)。OTUテーブルをリサンプリングし、19,295リード/サンプルを下流解析用に選択した。生のショットガンシーケンスリードをTrimmomatic (55)を用いてフィルタリングし、シーケンスアダプターや低品質・低複雑度リードを除去した。Kneaddataを使用し（https://huttenhower.sph.harvard.edu/kneaddata）、ヒト宿主からのコンタミを除去した。残りのリードは、Kraken2 (56)を用いて分類学的構成を決定し、Humann3 (57)を用いて解析し、機能アノテーションを実施した。
血清サンプルの採取とメタボロミクス
血清サンプルを採取し、代謝物抽出まで-80℃で直ちに凍結した。総代謝物含有量を各血清サンプル 0.05 g から抽出し、続いて、Q Exactive システム (Orbitrap MS; Thermo) に結合した超高性能 (UPLC) HSS T3 カラム (2.1 mm x 100 mm, 1.8 μm) を備えた超高性能液体クロマトグラフィー (UHPLC) システム (1290, Agilent Technologies) を使用して実行した液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析 (LC-MS/MS) 分析を行いました。MS生データは、以下の基準を満たした場合にフィルタリングを行った： (i) グループ内の全サンプルの50%未満に存在する代謝物は除去され、(ii) 欠損値は、データセットでデフォルトで見つかる最小値の半分で置き換えられました。ピークは、HMDB、Metlin、Monaを使用して構築した社内のMS/MSデータベースに対してアノテーションされました。最後に、各ピークの相対的な含有量をピーク面積の正規化法によって決定し、各代謝物のパーセント値を生成しました。
統計解析と可視化
リッチネス（ObservedおよびChao1）、シャノン多様性（Shannon）、およびピエルーの均等性（Evenness）を含む微生物α多様性指標は、veganパッケージ（58）を用いて計算された。微生物のβ多様性はユークリッド距離に基づいて評価し、有意性はveganパッケージのadonisを用いて、9,999回の順列を用いた順列多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて検定した。メタボロームプロファイルは、mixOmicsパッケージを用いた部分最小二乗-判別分析（PLS_DA）により解析した。群間の多様性指標、個々の分類群、代謝物の有意性は、Agricolaeパッケージ（59）を用いてノンパラメトリックのKruskal-Wallis順位和検定とBenjamini-Hochberg補正を行い、FMT前後の群間のMayoスコアの有意性はpaired Wilcoxon順位和検定により判定した。エフェクトサイズ解析は、Wangら(60)が記載した方法に従って実施した。種と代謝物、種とMetaCycパスウェイ、種とKEEGモジュール、代謝物とKEGGモジュール、代謝物とMetaCycパスウェイの間でピアソン相関を計算した。最後に、R パッケージの ggplot2 (61) または VennDiagram (62) に基づくカスタム R スクリプトを使用して、結果を視覚化した。これらの解析は、R v.3.3.2 (63)を用いて行われた。
データの入手方法
生配列のアクセッション番号は、BioProject accession no.でNCBI Sequence Read Archiveに寄託されている。PRJNA672846に寄託した。
謝辞
厦門大学中山病院消化器科の研究室メンバーおよび臨床医には、原稿に関するコメントと患者の管理に協力していただいたことに感謝します。また、原稿作成時に言語的な支援をしてくれたTopEdit（www.topeditsci.com）にも感謝する。
このプロジェクトは、福建省自然科学基金（2021J011329）および厦門市自然科学基金（3502Z20227271）の支援を受けました。また、本プロジェクトは、厦門医療衛生重点プログラム（3502Z20204007）、厦門医療衛生重点プログラム（3502Z20199172、3502Z20209026）、中央大学基礎研究基金の助成を受けた。
Q.C.、Y.F.、B.Z.、C.Y.、Q.Z.は実験、データ解析、原稿執筆を行った。Y.K.とZ.C.はドナーの管理を担当した。L.W., H.S., Y.H., Q.H., J.S., C.X., X.H., and L.Z.は患者管理を担当した。J.R.とH.X.が本試験の設計とサポートを行った。
我々は利益相反がないことを宣言する。
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