糞便サンプル中のSARS-CoV-2 RNA負荷の増加は、SARS-CoV-2の生物学とCOVID-19疫学を再考するよう促すものである。

2022年11月28日 10:58

バージョン3. F1000Res.2021; 10: 370. オンライン公開 2021年7月1日 doi: 10.12688/f1000research.52540.3
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糞便サンプル中のSARS-CoV-2 RNA負荷の増加は、SARS-CoV-2の生物学とCOVID-19疫学を再考するよう促すものである。
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC8283343/
Mauro Petrillo, 概念化、データキュレーション、形式分析、方法論、監修、可視化、執筆 - 原案作成、執筆 - レビューと編集,a,1 Carlo Brogna, 概念化、形式分析、方法論、リソース、監修、執筆 - レビューと編集, 2 Simone Cristoni, 概念化、データキュレーション、形式分析、調査、方法論、リソース、検証,b,c,d,d,e,e,measurement,f,measurement,pluralization,science,upgressionalization,など。Maddalena Querci, 概念化、データキュレーション、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、執筆 - 原案作成、執筆 - レビューと編集1 Ornella Piazza, 概念化、執筆 - レビューと編集4 Guy Van den Eede, 概念化、プロジェクト管理、監督、執筆 - 原案作成、執筆 - レビューと編集1, 5
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2021年6月7日マルガリータ・アギレラバージョン1承認済み
2021年5月17日 Kourosh Honarmand Ebrahimi バージョン1が承認されました。
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要旨
背景

近年、COVID-19疾患の発症にヒトの微生物叢が関与していることを示す科学的根拠が報告されている。ヒトの糞便サンプルにおけるSARS-CoV-2 RNAの存在とCOVID-19患者の糞便におけるSARS-CoV-2活性が観察されている。

研究方法

SARS-CoV-2感染者の糞便中の微生物叢を培養し、SARS-CoV-2の存在を確認し、糞便中の細菌とウイルスの関係についてデータを収集した。

研究結果

SARS-CoV-2は細菌増殖培地において試験管内で複製されること、ウイルスの複製は細菌の増殖に追随し、特定の抗生物質の投与に影響されることが示された。SARS-CoV-2関連ペプチドを30日間培養した菌体から検出し、その特性を明らかにした。

考察

我々の観察は、SARS-CoV-2の「バクテリオファージ的」挙動と一致する。これらの結果は予想外であり、SARS-CoV-2の生物学およびCOVID-19の疫学に関する新しい仮説につながるものである。SARS-CoV-2の新たな作用機序の発見は、本疾患の予防や治療に大きな意味を持つと考えられる。

キーワード SARS-CoV-2、COVID-19、腸内細菌叢
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はじめに
最近の科学論文や総説1-3では、消化管内細菌叢とCOVID-19疾患の関係が論じられている。特に、COVID-19患者の糞便サンプルにSARS-CoV-2 RNAが長期間存在することが報告されており4、SARS-CoV-2の糞便感染の可能性については、システマティックレビュー5、6およびオープンエビデンスブリーフ7、8で検討されている。COVID-19の典型的な症状を持つ患者の糞便サンプルからSARS-CoV-2が検出されたが、口腔咽頭および鼻咽頭スワブでの複数のSARS-CoV-2リアルタイム逆転写PCR（rRT-PCR）検査に陰性であった例も報告されている9 。SARS-CoV-2 の糞便中のウイルス活性は、 COVID-19 患者の腸内細菌叢組成と関連して描かれており 10 、糞便中に複製されたウイルスが検出された 11 。一方、Wölfelら12は、便中の高いウイルスRNA濃度を観察したが、感染性ウイルスは咽頭および肺由来の試料からのみ分離されたと報告し、Yaoら13は、便中にSARS-CoV-2の生存粒子を示唆するなど、SARS-CoV-2の詳細な生物学はまだ十分に解明されていないことを示唆するものである。さらに、SARS-CoV-2と個人によって異なる微生物叢組成との間の相互作用は、病態生理学的効果および症状の重症度の差をもたらすと考えられる（Yeoh YH et al.2021, Zuo T et al.2021, Zuo T et al.2020 ）。

我々の実験は、パンデミックの理解と疾病管理に関連するデータを提供するために、COVID-19病とSARS-CoV-2感染糞便の関係をさらに調査した。しかし、この結果は、SARS-CoV-2の疫学に関する現在の考え方と一致しないため、私たちの研究成果を科学界と迅速に共有することが必要であると考えています。

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方法
実験デザインは以下の通りである。

SARS-CoV-2陽性の被験者1名と健常者の糞便サンプル（以下、それぞれサンプルA、サンプルBと呼ぶ）を、より潔癖な細菌の増殖に適した37℃のNutriSelect™ Plus栄養ブロスに植え付けること（書面での同意を得て）。
2)
Luminex技術を用いて、7日間の培養後、両検体におけるSARS-CoV-2 RNAの存在を評価し、サンプルAではSARS-CoV-2 RNAの存在を確認し、サンプルBでは非存在を確認する。
3)
サンプルBにサンプルAの遠心分離後の上清を接種し（以下、サンプルB（A+））、ペレットを再懸濁したもの（サンプルC）。
4)
全てのサンプル（A、B、B（A+）、C）をNutriSelect™ Plus栄養ブロスを用いて37℃、同条件で30日間培養し、接種日（0日目）から1、2、3、7、14、21、30日目に各サンプル中のウイルスRNA量を計測する。
5)
21日目のサンプルB（A+）由来の18アリコートについて、特定の抗生物質（以下の各々を添加することからなる。メトロニダゾール、クリンダマイシン、リンコマイシン、ピペラシリン＋タゾバクタム、バンコマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、セフィキシム、セフトリアキソン、メロペネム、リファキシミン、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン、シプロフロキサシン、コリスチン、レボフロキサシンおよびテイコプラニン）各アルコールへの、特定の抗生物質の添加から成る。SARS-CoV-2 RNA量は、抗生物質投与前と投与3日後の各アリコートについてLuminex技術により測定された。
6)
並行して、Cristoniらの方法に従い、SANIST Biotyperを用いて、全サンプルおよびサンプルB（A+）の全アリコートの細菌増殖と代謝活性を経時的に評価・監視する追加分析を行った14)。
7)
30 日目のサンプル B (A+) に存在するペプチドの精製と分析。
使用した手順とプロトコルの詳細は、実験デザインの概略図（Graphical Abstract）15 と共に、Extended Data に記載されている。

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結果
実験計画には、検証を目的とした一連の分析（すべてのサンプルA、B、B（A+）、Cで実施）が含まれている。1) SARS-CoV-2 RNA の試験管内での永続性/生存性、最終的な増殖 2) SARS-CoV-2 RNA の存在を確認した培養物における SARS-CoV-2 ペプチドの存在/合成 3) サンプル B (A+) における抗生物質の投与の効果 4) 他の代謝物の付随的存在 5) 真核細胞の存在を含む細菌サンプルの特徴づけ、などを検証することを目的とした、一連の分析が含まれていた。

SARS-CoV-2 RNAの存在
30日間にわたる検査結果から、SARS-CoV-2 RNAの体外増殖が確認された。ウイルス量は時間とともにサンプルB (A+) で非常に増加し、サンプルAでわずかに増加、サンプルCで減少したが、予想通りサンプルBは常に陰性だった( 図1).

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図1.
SARS-CoV-2 RNA負荷の経時変化。
接種から30日間（0日目）、すべて同じ条件で培養したサンプルA（青棒）、B（オレンジ棒）、B（A+）（赤棒）、C（青棒）のSARS-CoV-2 RNA負荷測定（AUとして報告、拡張データ参照）。SARS-CoV-2のRNA量は、サンプルB（A+）では経時的にパワーアップする傾向があり（左上の小さな枠）、サンプルAではわずかに増加し、サンプルCでは減少していることがわかった。

結果の再現性を確認するため、同じ感染者および健常者のサンプルを用いて、全実験を独立して3回繰り返した（ただし、繰り返し実験を30日目ではなく14日目で停止した）。反復実験におけるSARS-CoV-2 RNA負荷量の測定結果を図2に示す。結果は、3回の反復実験の測定値の平均と、算出した標準偏差で示されている。その結果、サンプルAとサンプルB（A+）では、測定されたウイルスRNA量が経時的に増加する傾向が確認された。また、サンプルCでの減少、サンプルBでの検出なしも確認されましたが、図2では報告していません。

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図2.
SARS-CoV-2 RNA負荷の繰り返しによる平均的な変動。
このグラフは、図1に記載したのと同じ出発物質を用いて行った実験の3回の繰り返しの平均結果を報告している（ただし、繰り返しは30日目ではなく14日目に停止した）。測定値を正規化するために、0日目のすべての値を分母として使用した（0日目のすべての値=1）。すなわち、X日目の各サンプルについて、LuminexCountAtDayX/LuminexCountAtDay0間の比率が計算された。各バーは、サンプルA（青バー）とB（A+）（赤バー）のSARS-CoV-2 RNA負荷比の平均値と、算出された標準偏差を表している。

さらに、異なる「感染ドナー」（すなわちAの供給源）と「健康なレシピエント」（すなわちBの供給源）から3組の糞便サンプルを新たに募集し、同じ実験手順に従った。サンプルは匿名のドナーから収集され、情報（すなわち、年齢、性別、血液血清型、病気の重症度、収集時間、致死率など）は得られない。感染源（A1、A2、A3）と健常者（B1、B2、B3）のすべての組み合わせについて、同じ実験手順を実施した。一定の違いはあるものの、観察された傾向は類似しており（図3A）、A型およびB型（A+）の検体でSARS-CoV-2 RNA量が経時的に増加していることが確認された。最後に、各「レシピエント」について、SARS-CoV-2 RNA量を測定した( 図3B)。

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図3.
異なるドナーおよびレシピエントサンプルにおけるSARS-CoV-2 RNA負荷の増加。
3つの「感染ドナー」からのサンプル（A1、A2、A3）と3つの「健康なレシピエント」からのサンプル（B1、B2、B3）を組み合わせた実験の結果。A) グラフは、9つの組み合わせの結果を報告するものである。測定値を正規化するために、0日目のすべての値を分母として使用した（0日目のすべての値=1）。すなわち、各サンプルについて、X日目に、LuminexCountAtDayX/LuminexCountAtDay0間の比が計算された。各バーは、SARS-CoV-2 RNA負荷率を表す。B）各線は、3つの異なるAドナー源に感染したサンプルB1（緑線）、B2（黄線）、B3（青線）のSARS-CoV-2 RNA負荷比の平均を示す。測定値を正規化するために、0日目のすべての値をパネルA)に記載したように正規化した。

抗生物質投与の影響
異なるクラスに属する単一の異なる抗生物質の存在下で3日間培養した後に試験したサンプルB（A＋）のアリコートを分析し、それぞれにおいてSARS-CoV-2 RNAロードを測定した。SARS-CoV-2 RNA負荷は、抗生物質の存在によって異なる影響を受けることがわかった( 図4)。

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図4.
ウイルス量に対する抗生物質の効果。
以下の抗生物質（ABX）の選択で処理する前（赤）と後（3日間、破線）の18アリコートのSARS-CoV-2 RNA負荷測定（AUとして報告、補足資料参照）。メトロニダゾール（クラス：アゾール系）；クリンダマイシン、リンコマイシン、ピペラシリン＋タゾバクタム、バンコマイシン（クラス：カルボン酸および誘導体）；アモキシシリン、アンピシリン、セフィキシム、セフトリアキソン、メロペネム（クラス：ラクタム）；リファキシン（クラス：マクロラクタム）；アジチジン（クラス．アジスロマイシン、エリスロマイシン、ゲンタマイシン（クラス：有機酸素化合物）、シプロフロキサシン、コリスチン、レボフロキサシン（クラス：キノリンおよび誘導体）、テイコプラニン（半合成グリコペプチド系抗生物質）などがある。） SARS-CoV-2 RNA loadは、preABX-postABXの変動率で報告する。

SARS-CoV-2 RNA負荷は、メトロニダゾール、バンコマイシン、アモキシシリンおよびアジスロマイシンでそれぞれ処理した4つのアリコートで検出不可能なレベルまで減少した。
SARS-CoV-2 RNA量は、ピペラリシン＋タゾバクタム、アンピシリン、セフィキシム、セフトリアキソン、メロペネム、ゲンタマイシン、シプロフロキサシンおよびテイコプラニンで処理したアリコートで、20～85％低下した。例えば，cefiximeは85％，ciprofloxacinは61％，teicoplaninは56％のウイルスRNA量の減少を引き起こした．
SARS-CoV-2 RNA量は、クリンダマイシン、リンコマイシン、リファキシミン、エリスロマイシン、コリスチン、レボフロキサシンの存在によって大きな影響を受けなかった。
SARS-CoV-2ペプチドの存在
培養における細菌増殖の30日後、サンプルB（A＋）（カップル0からの）のアリコートを集め、質量分析を用いてSARS-CoV-2関連ペプチドの存在について試験した（詳細は拡張データ15に記載されている）。サンプルB（A+）からのアリコートで見つかったいくつかのペプチドは、SARS-CoV-2タンパク質に割り当てられた。表1に示すように、いくつかのペプチドの配列（NSP3にマッチするpep51とpep121；スパイクタンパク質にマッチするpep199；NS3とNにマッチするpep25とpep68、それぞれ）は、文献「重症急性呼吸症候群コロナウイルス2分離体 Wuhan-Hu-1, 完全ゲノム配列」で報告されているCDS領域の翻訳に対して、1つ以上のアミノ酸（AA）変化（赤で強調）を有する（GenBank LOCUS: NC_045512. 2). サンプルBのアリコートからは、SARS-CoV-2関連ペプチドは確認されなかった。

表1.
異なるSARS-CoV-2タンパク質（列「Match」）上にマッピングされた12個のペプチドの例（最初の列のように命名）を、ここに報告する。
赤で強調されたアミノ酸は、参照重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2分離体Wuhan-Hu-1、完全ゲノム配列（GenBank LOCUS：NC_045512.2）において報告されたCDS領域の翻訳に関する変化を表す。Pep51、pep121、およびpep230は、Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap と超高磁場分析器を用いた異なる質量分析アプローチで見出された（Brogna, personal communication）。

ペプチド
ID 長さ
(AA) フラグメントマッチ From To
pep51 27 ESDDYI KLNGPL TVGGSC LLSGHNLAK NSP3 268 294
pep121 82 L ILSVCLGSLIYSTAALGVLMSNLGMPSYCTGYREGYLNSTNVTIATYCTGSIPCSVCLSGLDSLDTYPSLETIQITISSFK 1416 1497
pep20 77 CLGSLIYSTAALGVLMSNLGMPSYCTGYREGYLNSTNVTIATYCTGSIPCSVCLSGLDSLDTYPSLETIQITISFK 1421 1497
pep230 62 WVLNNDYYRSLPGVFCGVDAVNLTNMFTPLIQPIGALDISASIVAGGIVAIVVTCLAYYFM NSP4 241 302
pep199 62 TDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQ GVNCTEVPVAIHADQLTPTWR S 573 634
pep33 69 DPQTLEILDITPCSFGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWSVYSTGSNVFQTR 578 646
pep190 74 SVASQSIIAYTM LLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLQYGSF 686 759
pep181 75 SIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLQYGSFCTQLNR 691 765
pep103 31 IQDSLSSTASALGKLQDVNQNAQALNTLVK 934 964
pep25 77 DCVLHSYFTSDYQLYSTQLSTDTGVEHVTFFIYNKIVDEPEEHVQIHTIDGSSGVVNPVMEPI CDEPTTTTSVPL NS3 199 275
pep68 13 G ISP GRMAGNGGDAALALLLLDR N 204 216
pep38 31 EAVGTNLPLQLGFSTGVNLVAVPTGYVDTPN NSP14 99 129
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同定されたAAの変化は、執筆時点でGISAID 16で利用可能なSARS-CoV-2の配列決定済み分離株で観察された変異の中に存在するか確認された。表2に示すように、pep51のNSP3:A274K以外は全てヒトで既に報告されており、その大半はサンプルの原産国（イタリア）では報告されておらず、残りのものはイタリアでシーケンスされたサンプルで観察されたが感染サンプルAの収集時期（2020年2月）以降に観察されたものであった。SARS-CoV-2のスパイクタンパク質にマッピングされた発見されたペプチドの一部を図5に示す。

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図5.
サンプルB (A+) で同定されたペプチドをSARS-CoV-2スパイクタンパク質にマッピングしたもの。
サンプルB (A+) で同定されたペプチドがSARS-CoV-2参照スパイクタンパク質 (NCBI protein LOCUS YP_009724390.1) の3つの異なる領域にマッピングされた際のローカルアラインメント。赤色でハイライトされたアミノ酸は、表1および表2に記載された変更に対応する。

表2.
表1で報告されたアミノ酸の変化は、執筆時にGISAIDで利用可能なSARS-CoV-2の配列決定済み分離株で観察された変異の中に存在するかどうかを確認したものである。
1つを除き、すべてヒトで既に報告されており、イタリアでは2つだけであった。各アミノ酸変化について、GISAID分離株での出現回数と、GISAIDに記録された最初のヒト分離株の詳細、収集日付が報告されている。pep51のAA変化NSP3:A274Kは、ヒトのSARS-CoV-2配列では報告されていないが、コウモリのβ-CoVゲノム配列では見つかっている（分離株hCoV-19/bat/Yunnan/RmYN01/2019、収集日25-06-2019）。

ペプチド
ID AA 変化観察された
in human? #発生頻度
ヒトで観察された
イタリアで観察されたか？観測された
他の
以外の
されたのか？ GISAIDに記録された最初のヒト由来株
GISAIDに記録され、収集日付が報告されている最初のヒト分離株収集日
日付
pep51 NSP3:A274K No 0 No Yes - - pep51 NSP3:K280T Yes 2 No No
pep51 NSP3:K280T Yes 2 No No hCoV-19/Finland/HEL-18-471/2021 23/01/2021
pep51 NSP3:V286L Yes 1 No Yes hCoV-19/USA/TX-HMH-MCoV-25096/2021 20/01/2021
pep121 NSP3:L1417I Yes 4 No No hCoV-19/USA/WA-UW163/2020 13/03/2020
pep199 S:D614G Yes 728,982 Yes hCoV-19/Australia/NSW2153/2020 25/01/2020
pep33 S:R634S Yes 2 No Yes hCoV-19/India/MH-NIV-815-3/2020 07/04/2020
pep190 S:S698L Yes 398 Yes No hCoV-19/USA/AZ-TG666166/2020 25/03/2020
pep25 NS3:Y264C Yes 106 No No hCoV-19/Canada/ON-S738/2020 09/04/2020
pep68 N:T205I Yes 25,665 Yes No hCoV-19/Beijing/Wuhan_IME-BJ07/2020 2019/01/2020
pep68 N:A208G Yes 514 No No hCoV-19/USA/MD-HP00076/2020 11/03/2020
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その他の代謝産物の存在
COVID-19感染者の血漿，尿，糞便から毒素様ペプチドが検出されたことは既に述べた（Cristoniら17，査読中）．サンプルB（A+）のアリコート中の毒素様ペプチドの潜在的な放出に関する評価も、同じ分析を行うことによって評価された。毒素様ペプチドが観察されたが、その存在は、メトロニダゾールおよびバンコマイシンの投与で処理されたアリコートにおいて、無視できるレベルまで完全に減少した（データは示されていない）。これらの結果は、抗菌剤の動態の違いを考慮し、慎重に解釈する必要がある。

真核細胞およびウイルス様粒子の存在
試料AおよびB（A+）には、図6に示すように、実験全体を通して特に豊富で代謝的に活発な細菌属が存在することがわかった。

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図6.
細菌属の存在
Cristoniらによって記述されたように、代謝活性を見ることによって、細菌属の存在を経時的にモニターした14。Y軸の測定値は「検出頻度」として報告されている（範囲0-10）。2つのグラフは、サンプルA、B（A+）について、0、1、7、14、21、30日目に「一般細菌腸内細菌叢」（装置で分類されていない他の細菌属を表す）とともに同定された最も代謝活性の高い属を報告しています。その他の微生物は低レベル（2個以下、7日目）で観察されたため、図では報告されていない。Mycobacterium, Actinobacteria, Bacteroidetes, Blautia, Brevibacterium, Brevundimonas, Candida (C. albicans), Collinsella, Enterococcus, Eubacterium, Klebsiella, Lactonifactor, Microbacterium, Porphyromonas, Propionibacterium, Sphingomonas, Stenotrophomonas, Streptococcus gordonii, Xanthomonas.[A]および[B]は、いずれも7日目に2個以下となった。

異なる時期に採取したサンプルA、B、B（A+）のアリコートを透過型電子顕微鏡（TEM）と走査型電子顕微鏡（SEM）の両方で分析し、真核細胞の存在を確認した。30種類以上の試料（培養30日後を含む）を観察しましたが、核を持つ細胞に似た構造を持つものはなく、バクテリアの細胞だけが見つかりました。サンプルAおよびB（A+）の画像を解析したところ、細菌細胞と相互作用するウイルス様粒子の存在が確認された。これらの粒子がSARS-CoV-2由来であることを確認するために、免疫電子顕微鏡による観察を続けている（準備中）。

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考察
我々の結果は、SARS-CoV-2ゲノムが、既知の真核細胞との相互作用に加えて、さらに人体外でも複製可能であることを示しており、「バクテリオファージ的」な作用様式の可能性を示唆するものであった。SARS-CoV-2ゲノムは、そのRNAポリメラーゼによって複製されるだけなのか（これはバクテリオファージの疑似溶原性メカニズムに相当する）、それとも細菌内で本格的なSARS-CoV-2複製粒子の生成が起こるのか（これはバクテリオファージの通常の溶原性に相当する）まだ明らかにはなっていない。いずれにせよ、我々の知る限り、これは新規の観察であり、SARS-CoV-2についてこれまで報告されたことはない。

ここで説明した実験（図1）は、同じサンプルを使ってさらに3回繰り返された（図2）。さらに、異なる出発物質を用いて、3×3デザインで独立した再現実験を行った(Figure 3)。いずれの実験でも、非常に類似した傾向が観察され、サンプルAおよびサンプルB (A+) におけるSARS-CoV-2 RNA負荷の増加が確認された。

また、異なる出発物質（すなわち、Aの供給源として異なる「感染ドナー」からの糞便サンプル、Bの供給源として「健康なレシピエント」からの糞便サンプル）を用いた複製の場合にも、同様の傾向が見られ、実験の再現性が確認された。また、SARS-CoV-2のRNA量は、ある組み合わせ（A2×B2）において特に高い値を示した。このことから、ウイルスのRNA量は、ウイルスが満たす腸内環境（eubiotic/dysbiotic）に依存することが考えられる。これは、A-Bソースの最初のカップル（図1）において、AとB（A+）のウイルスRNA量の測定値の差が顕著である理由についても、もっともな説明である。SARS-CoV-2は呼吸器系ウイルスと考えられており、上気道（URT）にはインフルエンザなどの異なるウイルスと相互作用する多くの細菌が存在する（概要はSchenk et al.、2016［MP1］を参照）。この点で、我々の観察は、最近、SARS-CoV-2感染の感受性と重症度を決定する責任として、腸内細菌叢における特定の微生物の豊富さを含む複数の作用機序によって仲介される腸-肺平衡の存在を提案したShahが立てた仮説に一致する[MP2]。

さらに、最近の報告では、URTの微生物叢とSARS-CoV-2の相互作用が示唆されている（Ebrahimi, 2020[MP3], Buddingら, 2020[MP4] ）。特にEbrahimiは、Proteobacteria門のメンバーにおいて、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体ペプチダーゼドメイン（ACE2-PD）と高い類似性を有する一連のセリンプロテアーゼTMPRSS2およびペプチジルペプチダーゼをin silicoで同定した。これらのタンパク質や類似のタンパク質が、細菌におけるSARS-CoV-2の細胞内受容体として働いている可能性は否定できない。また、SARS-CoV-2の感染に重要な役割を果たすことが知られているACE2受容体遺伝子18は、小腸を含む人体の様々な組織や臓器で発現している19 。従って、感染者の糞便から検出されるSARS-CoV-2は、ヒトの体細胞で発生した感染症である可能性が非常に高いと考えられる。このことは、消化管内では、小腸のようなヒトの細胞だけがSARS-CoV-2の標的ではないことを示唆している。ウイルスの受容体として働きやすい分類群、種、コンソーシアムを探すことは必須であり、この点に関して、SARS-CoV-2の観察された行動の標的候補となる細菌種をさらに特定することを目的として、サンプルの全ゲノムメタゲノムシーケンスを実施中である。

我々の実験デザインは細菌細胞の増殖を意図したものであるが、SARS-CoV-2 RNAの増加は、元の糞便サンプルに存在するヒト細胞の複製による可能性も考慮された。糞便サンプル中に最も多く存在するヒト細胞は、大腸上皮細胞（colonocytes）である。Loktionov 17 , は、大腸上皮からの細胞剥離現象は、通常の状態では稀であるが、（新生物のように）生理的な制御を受けない細胞が増殖し、アポトーシスによる細胞除去が適切に機能しない場合には、劇的に増加することを報告している。また、Iyengar ら 20 は、終末分化した大腸上皮細胞には増殖活性がないことを報告している。さらに最近、Nair ら 21 と Chandel ら 22 は、便から生存している大腸細胞を回収するための特異的な方法論を開発した。我々の場合、サンプル A、B ともに癌の診断を受けていない成人個人から採取されたものである。また、検体 A および B に含まれる可能性のあるヒト細胞は、以下のことが可能であるとは考えにくい。

真核細胞の維持に重要な成長因子、血清、その他の成分を含まない、通常バクテリア用に調合された培養液で成長すること。
そのような培地中で30日間生存し、SARS-CoV-2感染と同時発生すること。
特定のCO2濃度条件下でなくても増殖する。
また、SARS-CoV-2と他の真核生物（例えば寄生性線虫や真菌細胞など）が培養中に存在する可能性も検討された。

実験期間中、目視による検査では寄生性線虫は確認されなかった。さらに、サンプルBの便は独自に分析され、既知の寄生虫および微生物病原体が存在しないことが証明されました（イタリアの診断研究所Biomolecular Diagnostic Srlによる証明）。寄生性線虫は通常、宿主の外では生存できず、多くの腸管回虫（アスカリス属のものなど）は細菌の増殖を妨げる抗菌因子を放出するが23、一部の細菌属の代謝活性が高くなることが判明したのとは対照的であった。使用した培地には、（寄生性であるかどうかに関わらず）線虫に関連する化学要素（例えば、コレステロールや微量の金属）が含まれていない。

便に含まれるマイコバイオーム画分の関与の可能性が検討されました。Chinらによって強調されたように24 、腸内に存在する培養不可能な低存在量の常在および一時的な真菌種を特定するには、多面的かつ学際的なアプローチが必要であり、ヒトのマイコバイオームはまだ完全に特徴づけられていないことが確認された。したがって、使用した培養液で未知の真菌が増殖する可能性は否定できないが、微生物叢に最も多く存在するCandida albicansの顕著な代謝活性は観察されなかった。

最後に、30種類以上の調製品のTEMおよびSEMによる画像を検査した結果、真核細胞の存在は確認されなかった（準備中）。一方では、線虫や他の未知の真核細胞が培地中で増殖できる可能性を否定できないが、使用した条件からその可能性は極めて低い。いずれにせよ、SARS-CoV-2が線虫や真菌細胞と相互作用する能力はこれまで観察されたことがなく、同様に新規で驚くべき観察であろう。

上記のように、SARS-CoV-2タンパク質に一致するいくつかのペプチドが、サンプルB（A+）からのアリコート中に見いだされた。参照SARS-CoV-2ゲノムのCDS領域の翻訳と比較して、アミノ酸が変化したペプチドが同定されたことは興味深いが、細菌におけるウイルス複製のメカニズムと適合するものである。SARS-CoV-2のようなRNAウイルスは、準種と呼ばれる変異体集団として宿主に生息する。準種とは、変異事象によって遺伝的につながった異なる変異体からなるグループのことで、宿主における（ウイルス）集団全体の特徴に集合的に寄与する25 。最近の研究では、SARS-CoV-2のサンプルには宿主内ゲノム多様性があることが強調されている26, 27。バクテリオファージのような作用機序で、細菌は30日間培養されるため、観察されたアミノ酸の変化は、細菌宿主での複製イベントを通じて出現したウイルスの準種である可能性も排除できない。これに関連して、最近の研究28-30では、SARS-CoV-2ゲノムにおける超変異の発生が証明され、APOBECおよびADARデアミナーゼがこれらの現象の原因である可能性が示唆されている。APOBECファミリーは、細菌、酵母、植物のデアミナーゼに関連しており、活性部位に亜鉛を配位する高度に保存されたアミノ酸モチーフを持つ31 。最初の感染便サンプルの配列決定が行われなかったため、実験に使用した最初のSARS-CoV-2集団にSARS-CoV-2ハプロタイプが存在し、したがって観察されたアミノ酸変化が正当化される可能性は排除されない。しかし、今回見つかったアミノ酸変化は、いずれも感染検体Aの採取日（2020年2月）以降に初めて見つかったSARS-CoV-2の配列で報告されており、中には検体の原産国であるイタリアで報告されていないアミノ酸変化もある。

一方、SARS-CoV-2の超変異現象に寄与しうる多様性生成レトロエレメント（DGR）システム32の基盤にあるような他のメカニズムは、最近細菌で報告されており、したがって、見つかったAA変化の原因となる可能性がある。今後、ウイルスRNAに類似したウイルスペプチドの経時的な増加を確認するための追加実験が予定されている。

これらの結果は、SARS-CoV-2の疫学に新たな知見をもたらす可能性がある。このような関係がCOVID-19病の発症、治療、コントロールに及ぼす影響や意味を考えると、次のような疑問がすぐに湧いてくる。

SARS-CoV-2のこの「バクテリオファージ的」挙動は、一部の回復した患者で観察されるSARS-CoV-2の長期間の存在を説明できるのだろうか？33
COVID-19感染者の治療において、抗生物質やバクテリオファージを用いた治療法は有効なのか？34
微生物叢に影響を及ぼす抗生物質の投与は，本疾患の臨床経過にどのような影響を及ぼすか？35
COVID-19の疫学における細菌の関与は、COVID-19の予後不良に関連する血清CRP、プロカルシトニン、Dダイマー、フェリチンの上昇などの臨床所見の説明に役立ちうるか？36
これらの疑問は、取り組むべき多くの疑問の一例に過ぎない。この結果は，虫37が提唱するCOVID-19のパンデミックに対処する方法，すなわちOne Healthの全体論的アプローチを支持するものである．個人を単なる人間の体ではなく、「ホロビオント」、すなわち研究し、そのように扱う必要のある個別の生態系ユニットとして考えるならば、人体に生息する微生物群の役割をより深く理解することは、COVID-19病に取り組むための基本的なことなのです。

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同意事項
糞便サンプルは、CranioMed S.R.L.が、イタリアの法律で予見されるように、インフォームドコンセントに署名してこの研究に参加することに同意した匿名のドナーから収集し、扱った。個人情報（年齢、性別、血液型、病気の重症度、採取時間、致死率など）は一切収集されませんでした。

この研究は、JRC Scientific Integrity and Research Ethics（科学的誠実性と研究倫理）のガイダンスに準拠している。

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宣言文
表明された科学的成果は、欧州委員会の政策的立場を示唆するものではありません。欧州委員会および欧州委員会を代理する者は、本書の利用について一切責任を負いません。

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データの利用可能性
基礎となるデータ
ゼノード Increase of SARS-CoV-2 RNA load in faecal samples prompts for rethinking of SARS-CoV-2 biology and COVID-19 epidemiology' の基礎データ https://doi.org/10.5281/zenodo.4723549 15 .

このプロジェクトには、以下の基礎データが含まれています。

ペプチドのMass Spectrometry生データ。

NCBI Genome: Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 isolate Wuhan-Hu-1, complete genome（重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2分離株、完全ゲノム）。アクセッション番号 NC_045512.2; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_045512.2。

NCBI タンパク質表面糖タンパク質 [重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2型]。Accession number: YP_009724390.1; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/1796318598.

拡張データ
ゼノード Extended data for 'Increase of SARS-CoV-2 RNA load in faecal samples prompts for rethinking of SARS-CoV-2 biology and COVID-19 epidemiology'. https://doi.org/10.5281/zenodo.4723549 15 .

データは、クリエイティブ・コモンズ表示 4.0 国際ライセンス (CC-BY 4.0) の条件の下で利用可能です。

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謝辞
著者、臨床検体またはウイルス分離株を最初に入手したOriginating laboratories、配列データを作成しGISAIDに提出したSubmitting laboratoriesに感謝します。

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備考
[バージョン3、ピアレビュー：2件承認] 。

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資金提供
欧州委員会共同研究センターより資金提供を受けた。

研究助成機関は、研究デザイン、データ収集と分析、発表の決定、原稿の準備には一切関与していない。

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著者コメント
この研究に費やされた努力と献身は、COVID-19のために突然私たちのもとを去ったすべてのEU市民とその家族に捧げられる。

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参考文献

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バージョン3に対する査読者の反応
Kourosh Honarmand Ebrahimi、レフェリー1
1オックスフォード大学化学部、オックスフォード、英国
競合する利益競合する利益は開示されていない。
審査日：2021年7月1日。承認済み doi: 10.5256/f1000research.58157.r88861
著作権 : © 2021 ホナルマンエブラヒミ K
本書は、原著を適切に引用することを条件に、いかなる媒体でも無制限に使用、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されたオープンアクセス査読報告書です。
著者らの努力に感謝する。彼らは私の懸念に十分に答えてくれた。私はこの著作物の索引付けを推奨する。

この作品は明確かつ正確に表現され、最新の文献を引用しているか？

部分的に

統計解析とその解釈は適切か？

可

再現性を確保するために、結果の基礎となるすべての元データが利用可能か？

はい

研究デザインは適切で、技術的に問題がないか？

はい

導き出された結論は、結果によって十分に裏付けられているか？

部分的に

他の研究者が再現できるような方法と分析の詳細が十分に提供されているか？

部分的に

査読者の専門分野

ウイルス学と免疫学、生物無機化学

私は、この提出書類を読み、それが許容できる科学的水準であることを確認するために、適切なレベルの専門知識を有していると考えていることを確認します。

バージョン2に対する査読者の回答
Kourosh Honarmand Ebrahimi、レフェリー1
1英国オックスフォード大学化学部
競合する利益競合する利益は開示されていない。
レビュー日：2021年6月25日ステータス予約の上承認された。
著作権 : © 2021 ホナルマンエブラヒミ K
これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されたオープンアクセス査読レポートで、原著を適切に引用することを条件に、いかなる媒体でも無制限の使用、配布、複製を許可するものです。
著者は、私の当初の懸念に十分に応えてくれました。彼らの仮説は非常に興味深いものでしたが、ACE2受容体は小腸のような他の組織でも発現しており、彼らが観察したことは、消化管組織でのウイルスの複製によるものかもしれないと、論文のどこかで言及しています（Hanら（2020 1 ））。

研究内容が明確かつ正確に示されているか、また、最新の文献を引用しているか。

部分的に

該当する場合、統計解析とその解釈は適切か？

あり

再現性を確保するために、結果の基礎となるすべての元データが利用可能か？

はい

研究デザインは適切で、技術的に問題がないか？

はい

導き出された結論は、結果によって十分に裏付けられているか？

部分的に

他の研究者が再現できるような方法と分析の詳細が十分に提供されているか？

部分的に

査読者の専門分野

ウイルス学と免疫学、生物無機化学

私は、本申請書を読み、それが許容できる科学的水準であることを確認するための適切なレベルの専門知識を有していることを確認しますが、上記のとおり重大な留保を有しています。

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参考文献

: 2019-nCoV受容体ACE2の各組織における発現解析とその意義の検討. Ann Transl Med .2020;8(17) : 10.21037/atm-20-4281 1077 10.21037/atm-20-4281 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
マウロ・ペトリロ
Mauro Petrillo、欧州委員会共同研究センター（JRC）、イスプラ、イタリア。
競合する利益競合する利益は開示されていない。
Kourosh Honarmand Ebrahimi博士へ。

コメントありがとうございます。

ご指摘は適切であり、それに応じて「考察」のセクションを修正しました。

さらに、最近の報告では、URTの微生物叢とSARS-CoV-2の相互作用が示唆されています（Ebrahimi, 2020, Buddingら, 2020）。特に、Ebrahimiは、Proteobacteria門のメンバーにおいて、アンジオテンシン変換酵素2（ACE2）受容体ペプチダーゼドメイン（ACE2-PD）と高い類似性を有する一連のセリンプロテアーゼTMPRSS2およびペプチジルペプチダーゼをin silicoで同定している。これらのタンパク質や類似のタンパク質が、細菌におけるSARS-CoV-2の細胞内受容体として働いている可能性は否定できない。同時に、SARS-CoV-2の感染に重要であることが知られているACE2受容体遺伝子は、そのタンパク質が小腸を含む人体の様々な組織や器官で発現している[Yan 2020]。したがって、感染者の糞便サンプルから見つかったSARS-CoV-2は、ヒトの体細胞で起こった感染に由来する可能性が非常に高いと考えられる。我々の観察はこれとは対照的であり、消化管において、小腸のようなヒトの細胞が唯一のSARS-CoV-2の標的ではないことを示唆している。

コメントにより、原稿の質が向上し、掲載に適しているとお考えいただければ幸いです。

よろしくお願いします。

Mauro Petrillo、著者を代表して。

バージョン2に対する査読者の回答
マルガリータ・アギレラ（Margarita Aguilera）レフェリー1
1グラナダ大学カルトゥハ校薬学部微生物学科、グラナダ、スペイン
競合する利益競合する利益は開示されていない。
審査日：2021年6月25日ステータス承認済み doi: 10.5256/f1000research.57680.r88113
著作権 : © 2021 アギレラ M
本論文は、Creative Commons Attribution Licenceの条件の下で配布されたオープンアクセス査読レポートで、原著を適切に引用することを条件に、いかなる媒体においても無制限の使用、配布、複製を許可するものです。
著者らは、提案されたすべての提案に従って原稿を完全に改善した。これ以上の処置は必要ない．

論文は明確かつ正確に表現され、最新の文献を引用しているか。

はい

統計解析とその解釈は適切か？

はい

再現性を確保するために、結果の基礎となるすべての元データが利用可能であるか？

部分的に

研究デザインは適切で、技術的に問題がないか？

はい

導き出された結論は、結果によって十分に裏付けられているか？

はい

他の研究者が再現できるような方法と分析の詳細が十分に提供されているか？

部分的に

査読者の専門分野

微生物叢、プロバイオティクス、分類学、微生物学、分子生物学、バイオテクノロジー。

私は、この投稿を読み、それが許容できる科学的水準であることを確認するために、適切なレベルの専門知識を有していると考えていることを確認します。

マウロ・ペトリロ
Mauro Petrillo、欧州委員会、共同研究センター（JRC）、イスプラ、イタリア。
競合する利益競合する利益は開示されていない。
Aguilera教授へ。

貴重なコメントとご提案をいただき、ありがとうございました。原稿の質を向上させることができました。

よろしくお願いします。

Mauro Petrillo、著者を代表して。

第 1 版の査読者の反応
Margarita Aguilera、レフェリー1
1グラナダ大学カルトゥハ校薬学部微生物学科、グラナダ、スペイン
競合する利益競合する利益は開示されていない。
審査日：2021年6月7日ステータス承認済み。doi: 10.5256/f1000research.55836.r85802
著作権 : © 2021 アギレラ M
これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されたオープンアクセス査読レポートで、原著を適切に引用することを条件に、いかなる媒体でも無制限に使用、配布、複製することを許可しています。
糞便中のSARS-CoV-2 RNA量の増加は、SARS-CoV-2の生物学とCOVID-19疫学を再考させる」と題する研究は、よく設計され、健全に実施されている。

COVID-19に対応するための臨床研究への投資が急務となった今、新たな問いを投げかけるべきであり、本研究は革新的な試みであった。この仮説は、SARS-CoV-2患者の健康状態により、宿主の反応が異なるため、患者間で大きな差が生じることに関連している。著者らは、SARS-CoV-2の長期生存、増殖、ウイルスと腸内細菌叢の相互作用の可能性を評価することにより、SARS-CoV-2がバクテリオファージ活性を持っていることを示す実験データを示している。Luminex技術によるウイルスRNA、抗生物質治療の影響、培養微生物叢の優勢な分類群に対するBiotyper、真核細胞、ペプチド、その他の代謝物の分子配列など、複数の方法論と実験データが結果と結論を適切に裏付けています。

したがって、Petrilloらは優れた全体論的アプローチを行ったと考えられるので、若干の修正・説明の後、出版することを提案します。

本書では、腸内細菌叢の代わりに腸内細菌叢という用語を使用してください。
このパラグラフの最後に下線部を追加してください。一方、Wölfelら12は、便中の高いウイルスRNA濃度を観察したが、感染性ウイルスは咽頭および肺由来の試料からのみ分離されたと報告しており、またYaoらは便中にSARS-CoV-2の生存粒子を示唆していることから、SARS-CoV-2の詳細な生物学はまだ十分に解明されていないことが示唆された。また、SARS-CoV-2と個人によって異なる微生物叢の構成との相互作用により、病態生理学的効果や症状の重さが異なることが予想されます。
微生物の接種と培養に使用する培地NutriSelect™Plus nutrientが、培養される特定の分類群や測定される代謝物に影響を与える可能性があるかどうかを説明してください。他の培地を試したことがありますか？
すべての培養実験データで好気性条件のみを使用している場合は、その説明をお願いします。
実験時に添加した抗生物質の濃度を具体的に教えてください。
図1：この図に示されたデータについて、もっともらしい説明をお願いします。健康な人の微生物叢には、SARS-CoV-2の増殖をよりよくするような真性分類群が含まれているということでしょうか？
図3：3つの図に見られる違いを教えてください。サンプル受容体の微生物叢組成が影響しているようです。もっともらしい説明をお願いします。
この結果から、ウイルスの受容体として働きやすい分類群、種、コンソーシアムを探すことが今後の研究課題です。それについてコメントをお願いします。
研究内容が明確かつ正確に表現されているか、また、最新の文献を引用しているか。

はい

統計解析とその解釈は適切か？

はい

再現性を確保するために、結果の基礎となるすべての元データが利用可能か？

部分的に

研究デザインは適切で、技術的に問題がないか？

はい

導き出された結論は、結果によって十分に裏付けられているか？

はい

他の研究者が再現できるような方法と分析の詳細が十分に提供されているか？

部分的に

査読者の専門分野

微生物叢、プロバイオティクス、分類学、微生物学、分子生物学、バイオテクノロジー。

この度は、貴重なご意見・ご感想をお寄せいただき、誠にありがとうございました。

それらのすべてに対応し、改訂版の原稿を提供する予定です。

よろしくお願いします。

マウロ・ペトリロ、著者を代表して。

マウロ・ペトリロ（Mauro Petrillo
Mauro Petrillo、欧州委員会、共同研究センター（JRC）、イスプラ、イタリア。
競合する利益競合する利益は開示されていない。
Aguilera博士へ。

本報告書に貴重なコメントと示唆をいただき、誠にありがとうございます。

予想通り、ご指摘のすべてに対応し、新バージョンの原稿を提供しました。

本書では、腸内細菌叢の代わりに腸内細菌叢という用語を使用してください。
回答回答：了解しました、ありがとうございます。
このパラグラフの最後に下線部のフレーズを追加してください。同時に、Wölfelら12は、便サンプルに高いウイルスRNA濃度を観察したが、感染性ウイルスは喉と肺由来のサンプルからのみ分離されたと報告し、Yaoらは、便サンプルに生存SARS-CoV-2粒子を示唆したことから、SARS-CoV-2の詳しい生態がまだ完全に解明されていないことが示された。さらに、SARS-CoV-2と個人によって異なる微生物叢の構成との間の相互作用は、病態生理学的効果および症状の重篤度の違いを引き起こす可能性がある。
回答非常に適切な指摘である。参考文献とともに追記しました。
微生物の接種と培養に使用する培地NutriSelect™Plus nutrientが、培養される特定の分類群や測定される代謝物に影響を与える可能性があるかどうかを説明してください。他の培地を試したことがありますか？
すべての培養実験データで好気性条件のみを使用している場合は、その説明をお願いします。
実験時に添加した抗生物質の濃度を具体的に教えてください。
回答回答：これらの点については、補足資料の1,3,8)に情報を追加しました。補足資料を入手するための新しいリンクは、https://doi.org/10.5281/zenodo.4723549 です。

図1：この図に示されたデータについて、もっともらしい説明をお願いします。健康な人の微生物叢には、SARS-CoV-2の増殖をよりよくするような真正性の分類群が含まれているということでしょうか？
図3：3つの図に見られる違いを教えてください。サンプル受容体の微生物叢組成が影響しているようです。もっともらしい説明をお願いします。
この結果から、ウイルスの受容体として働きやすい分類群、種、コンソーシアムを探すことが今後の研究課題です。それについてコメントをお願いします。
回答ご指摘の点は適切であり、それに応じて「考察」の部分を修正しました。SARS-CoV-2 の RNA 量は、ある組み合わせ（A2×B2）で特に多くなっている。したがって、ウイルスのRNA量は、ウイルスが満たす腸内環境（eubiotic/dysbiotic）に依存すると考えるのが妥当であろう。これは、A-Bソースの最初のカップル（図1）において、AとB（A+）のウイルスRNA負荷測定値の差が顕著である理由のもっともらしい説明でもある。SARS-CoV-2は呼吸器ウイルスとみなされ、上気道（URT）にはインフルエンザなどの異なるウイルスと相互作用する多くのバクテリアが存在する（概要はSchenkら、2016を参照されたい）。この点で、我々の観察は、最近、SARS-CoV-2感染の感受性と重症度を決定する責任として、腸内細菌叢における特定の微生物の豊富さを含む複数の作用機序によって仲介される腸-肺平衡の存在を提案したShahが立てた仮説に一致する。さらに、最近の報告では、URTの微生物叢とSARS-CoV-2の相互作用が示唆されている（Ebrahimi, 2020, Buddingら, 2020）。特に、Ebrahimiは、Proteobacteria門のメンバーにおいて、ACE2ペプチダーゼドメイン（ACE2-PD）と高い類似性を有する一連のセリンプロテアーゼTMPRSS2およびペプチジルペプチダーゼをin silicoで同定している。これらのタンパク質や類似のタンパク質が、細菌におけるSARS-CoV-2の細胞内受容体として働いている可能性は否定できない。ウイルスの受容体として働きやすい分類群、種、コンソーシアムを探すことは必須であり、この点について、SARS-CoV-2の観察された行動の標的候補となる細菌種をさらに特定することを目的として、サンプルの全ゲノムメタゲノムシーケンスが進められている'。

皆様のコメントにより、原稿の質はかなり向上したと思います。

よろしくお願いします。

Mauro Petrillo、著者を代表して。

バージョン1に対する査読者の回答
Kourosh Honarmand Ebrahimi、レフェリー1
1英国オックスフォード大学化学科
競合する利益競合する利益は開示されていない。
査読日：2021年5月17日ステータス留保付きで承認。doi: 10.5256/f1000research.55836.r85393
著作権 : © 2021 ホナルマンエブラヒミ K
本論文は、原著を適切に引用することを条件に、いかなる媒体でも無制限に使用、配布、複製を許可するクリエイティブ・コモンズ表示ライセンスの条件の下で配布されたオープンアクセス査読報告書である。
Petrilloらは、SARS-CoV-2が糞便サンプルにおいてバクテリオファージ活性を持つ可能性があることを報告している。彼らは、Luminex技術を用いてウイルスRNAの存在を測定し、質量分析法を用いてウイルスタンパク質の存在を測定している。実験デザインは健全で、彼らの発見は刺激的であり、この研究の出版を支持するものである。しかし、出版前に解決しなければならないいくつかの懸念がある。従って、若干の修正を加えた上で出版することを推奨する。

SARS-CoV-2は、呼吸器系のウイルスである。上気道（URT）には多くの細菌が存在し、インフルエンザのような異なるウイルスと相互作用しています（Schenk et al.）さらに、最近の報告では、URTの微生物叢とSARS-CoV-2の相互作用が示唆されている（例えば、（Ebrahimi, 2020 2 ）、（Budding et al, 2020 3 ））。著者らはこれらの文献を引用し、URTにおけるSARS-CoV-2の同様のバクテリオファージの挙動に関して、その知見を議論する必要がある。
図3のドナーA2のグラフで、B2(A2+)サンプルのRNA量が他のサンプルと大きく異なるのはなぜか？著者らは説明する必要がある。
著者らは、SARS-CoV-2ペプチドの存在が、細菌におけるウイルス複製のメカニズムと適合することを示唆している。もしこれが本当なら、著者らはウイルスRNAと同様のウイルスペプチドの増加を観察すべきではないだろうか？
この研究は明確かつ正確に提示されているか、また最新の文献を引用しているか？

部分的に

統計解析とその解釈は適切か？

可

再現性を確保するために、結果の基礎となるすべてのソースデータが利用可能であるか？

はい

研究デザインは適切で、技術的に問題がないか？

はい

導き出された結論は、結果によって十分に裏付けられているか？

部分的に

他の研究者が再現できるような方法と分析の詳細が十分に提供されているか？

部分的に

査読者の専門分野

ウイルス学、免疫学

私は、本申請書を読み、それが許容できる科学的水準であることを確認するために適切なレベルの専門知識を有していることを確認しますが、上記のとおり重大な留保があります。

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参考文献
1.上気道微生物叢の組成と免疫学的意義. FEBS Lett .2016;590(21) : 10.1002/1873-3468.12455 3705-3720 10.1002/1873-3468.12455 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar].
2. : 上気道細菌が発現するSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合タンパク質はウイルスの重症化を防ぐ可能性がある. FEBS Lett .594(11) : 10.1002/1873-3468.13845 1651-1660 10.1002/1873-3468.13845 [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar] 3.上気道細菌が発現するSARS-CoV-2スパイク糖タンパク質結合タンパク質は、重症ウイルス感染を予防する可能性がある。
3. : SARS-CoV-2感染に関連する年齢依存的な咽頭微生物叢シグネチャー. SSRN Electronic Journal .2020; 10.2139/ssrn.3582780 10.2139/ssrn.3582780 [CrossRef] [Google Scholar] 3.
マウロ・ペトリロ（Mauro Petrillo
Mauro Petrillo、欧州委員会、共同研究センター(JRC)、イスプラ、イタリア。
競合する利益競合する利益は開示されていない。
Kourosh Honarmand Ebrahimi博士へ。

この度は、貴重なご意見・ご感想をお寄せいただき、誠にありがとうございました。

私たちは、そのすべてに対応し、他の査読者のコメントも待って、完全改訂版の原稿を提供します。

よろしくお願いします。

Mauro Petrillo、著者を代表して。

マウロ・ペトリロ（Mauro Petrillo
Mauro Petrillo、欧州委員会、共同研究センター（JRC）、イスプラ、イタリア。
競合する利益競合する利益は開示されていない。
Kourosh Honarmand Ebrahimi博士へ。

本報告書に貴重なコメントと示唆をいただき、誠にありがとうございます。

予想通り、ご指摘のすべてに対応し、新バージョンの原稿を提供しました。

SARS-CoV-2は呼吸器系ウイルスである。上気道（URT）には多くの細菌が存在し、インフルエンザなどの異なるウイルスと相互作用します（Schenk et al.、2016）。さらに、最近の報告では、URTの微生物叢とSARS-CoV-2の相互作用が示唆されている（例えば、（Ebrahimi, 2020）；（Budding et al, 2020）。著者らは、これらの文献を引用し、URTにおけるSARS-CoV-2の同様のバクテリオファージの挙動に関して、その知見を議論すべきである。
回答ご指摘は適切であり、それに応じてDiscussionセクションを修正しました。「SARS-CoV-2は呼吸器系ウイルスと考えられており、上気道（URT）には多くの細菌が存在し、インフルエンザなどの異なるウイルスと相互作用します（概要についてはSchenk et al.、2016参照）。この点で、我々の観察は、最近、SARS-CoV-2感染の感受性と重症度を決定する責任として、腸内細菌叢における特定の微生物の豊富さを含む複数の作用機序によって仲介される腸-肺平衡の存在を提案したShahが立てた仮説に一致する。さらに、最近の報告では、URTの微生物叢とSARS-CoV-2の相互作用が示唆されている（Ebrahimi, 2020, Buddingら, 2020）。特に、Ebrahimiは、Proteobacteria門のメンバーにおいて、ACE2ペプチダーゼドメイン（ACE2-PD）と高い類似性を有する一連のセリンプロテアーゼTMPRSS2およびペプチジルペプチダーゼをin silicoで同定している。これらのタンパク質や類似のタンパク質が、細菌におけるSARS-CoV-2の細胞内受容体として働いている可能性は否定できない。ウイルスの受容体として働きやすい分類群、種、コンソーシアムを探すことは必須であり、この点に関して、SARS-CoV-2の観察された行動の標的候補となる細菌種をさらに特定することを目的として、サンプルの全ゲノムメタゲノムシーケンスが進められている"。

図3、ドナーA2のグラフ：なぜB2(A2+)サンプルでは、RNAの量が他のサンプルと大きく異なっているのか？著者は説明する必要がある。
回答図3にパネルを追加し、修正しました。また、それに伴い、「考察」の項も修正しました。関連性という点では、SARS-CoV-2 の RNA 量は、ある組み合わせ（A2×B2）で特に高いことに気付いた。したがって、ウイルスRNA量は、ウイルスが満たす腸内環境（eubiotic/dysbiotic）に依存すると考えるのが妥当であろう。これは、A-Bソースの最初のカップル（図1）において、AとB（A+）のウイルスRNA量の測定値の差が顕著である理由についても、もっともな説明である'。

著者らは、SARS-CoV-2ペプチドの存在が、細菌におけるウイルス複製のメカニズムと適合することを示唆している。もしこれが本当なら、著者らは、ウイルスRNAと同様のウイルスペプチドの増加を観察すべきではないのか？
回答ご指摘の通りですので、「考察」の項を適宜修正しました。ウイルスRNAに類似したウイルスペプチドの経時的な増加を確認することを目的とした追加実験が計画されている」。
ご指摘のおかげで原稿の質が向上し、出版にふさわしいとお考えいただければ幸いです。

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