再発性Clostridioides difficile感染症患者における多剤耐性菌のコロニー形成とレジストーム量に対する糞便微生物叢移植の長期有益効果

2023年9月13日 15:03

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2023年 9月 12日
クエイオスID 1CZVNS
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https://doi.org/10.32388/1CZVNS

再発性Clostridioides difficile感染症患者における多剤耐性菌のコロニー形成とレジストーム量に対する糞便微生物叢移植の長期有益効果

https://www.qeios.com/read/1CZVNS

Sam Nooij1、Karuna E.W. Vendrik1、Romy D. Zwittink1、Quinten R. Ducarmon1、Josbert J. Keller1、Ed J. Kuijper1、Elisabeth M. Terveer1

宣言
要旨
多剤耐性（MDR）菌は、特に医療施設において世界的な脅威となっている。糞便微生物叢移植（FMT）はClostridioides difficile感染症（rCDI）の再発予防に有効であり、他の微生物関連疾患にも有用である。我々は、培養法と糞便メタゲノミクスを組み合わせて、rCDI患者におけるFMTの短期（3週間）および長期（1～3年）におけるMDR菌のコロニー形成および抗生物質耐性遺伝子（ARG）に対する効果を研究している。MDR菌培養（n=87人）に基づくと、FMT後、MDR菌のコロニー形成率は減少した（FMT前20/87人＝23％、FMT3週間後10/87人＝11.5％）。メタゲノムシークエンシング（n=63患者）では、糞便中のARGの相対量が減少していることが示されたが、患者の異なる耐性遺伝子の数は健常ドナー（n=11ドナー）と比較して高いままであった。さらに、メタゲノミックデータにおけるプラスミド予測から、rCDI患者は耐性プラスミドの保有量が増加していることが示されたが、これはFMTの影響を受けていないようであった。長期（n=22患者）では、レシピエントのレジストームはよりドナーに近くなり、FMT後3週間以降も微生物叢の回復が続くことが示唆された。以上をまとめると、FMTによって腸内細菌叢は健常なドナーと同様の組成に回復し、潜在的な病原体は失われるか、あるいは非常に低い存在量にならざるを得なくなるという仮説が成り立つ。しかし、このプロセスはFMT後数日で終わるわけではない。腸内細菌叢が再びバランスのとれた状態になるには、数ヵ月かかることもある。たとえ耐性遺伝子のリザーバーが残っていても、FMTはより安定した回復力のある微生物叢組成をもたらすかもしれない。

Sam Nooij1,2、Karuna E. W. Vendrik1,2,、Romy D. Zwittink1,、Quinten R. Ducarmon1、Josbert J. Keller2,3、Ed J. Kuijper1,2、Elisabeth M. Terveer1,2、オランダ・ドナー糞便バンク研究グループを代表して
1オランダ、ライデン大学医療センター、医療微生物学部門、マイクロバイオーム解析・治療センター
2オランダ・ドナー糞便バンク、ライデン大学医療センター、ライデン、オランダ
3ハーググランデン医療センター、消化器科、ハーグ、オランダ

*現在の所属：オランダ公衆衛生環境研究所感染症管理センター（オランダ、ビルホーフェン

はじめに
抗生物質の発見は感染症の自然経過を変え、何百万人もの命を救った。抗生物質は現代医学において最も重要な開発であるかもしれないが、その使用には重要なトレードオフがある。標準的な治療法が効かない抗生物質耐性菌が出現し、感染症の効果的な予防と治療が脅かされている。抗生物質耐性は現在、公衆衛生に対する大きな脅威と考えられている[1][2]。その上、広域抗生物質療法はヒトの微生物叢を破壊し、逆説的にクロストリジオイデス・ディフィシル（Clostridioides difficile）などによる感染症への感受性を高める結果となっている [3][4][5]。

C.difficileは無症候性で腸内に存在することがあるが、抗生物質の影響を受けた微生物叢では増殖する。C.difficileは、自己限定的な軽い下痢から生命を脅かす偽膜性大腸炎まで様々な感染症（CDI）を引き起こす。腸内細菌叢の崩壊は、CDIの再発性の維持に不可欠であり、これは、糞便微生物叢移植（FMT）によって腸内細菌叢を補充すると、CDIの再発（rCDI）が速やかに消失するという観察によって裏付けられている [6][7] 。FMTは抗生物質治療後の腸内細菌叢の多様性を回復させ、C. difficile芽胞の増殖を防ぎ [8] 、おそらく他の感染症のリスクも低下させると考えられている。FMTは何年も前からrCDIの治療ガイドラインに記載されており [9] [10] [11] 、rCDIは現在FMTが定期的に行われている唯一の疾患である。

抗生物質によって乱れた腸内細菌叢は、多剤耐性（MDR）菌のコロニー形成も受けやすくなり [12] 、重症患者の感染リスクを高める [13] 。MDR菌の中でも特に問題視されているのが、β-ラクタマーゼ産生菌（ESBL）群である。ESBL産生Enterobacteralesによる感染症のほとんどは罹患率と死亡率が高く、腸内コロニー形成が先行している [14] [15] [16] 。したがって、腸管からのESBL産生Enterobacteralesの予防と除菌は、世界的な関心事である。自然脱コロナイズは合併症や菌種の種類によって異なり [17][18] 、MDR菌の脱コロナイズを促進する革新的な戦略が望まれている。今のところ、推奨される脱コロナイズ法はない [19] 。しかし、Millanらは、rCDI患者におけるFMTが、糞便中の抗菌薬耐性遺伝子の数と多様性を減少させることを見出した [20] 。この観察に続いて、ESBL産生Enterobacteralesにコロニー形成された患者がFMTで治療に成功したという様々な症例報告がなされた[21][22][23][24][25][26][27][28][29][30]。経口非吸収性抗生物質による治療とFMTによるMDR Enterobacteralesの脱コロナイズを評価するために、パワー不足のRCTが1件のみ実施されている（n=39患者）[31]。FMTの統計学的に有意な利点は認められなかったが、コロニー形成率は未治療の対照患者に比べてFMT治療患者でわずかに低かった。その後、MDR菌に対するFMTの有効性について疑問が呈され、これをさらに評価するための実験が提案された［32］。

rCDI患者におけるFMTが腸内細菌叢の抗生物質耐性に及ぼす影響をさらに検討するため、培養とメタゲノム解析の両方を用いてMDR菌のコロニー形成を評価する。特にレジストーム（存在するすべての抗生物質耐性遺伝子（ARG）のコレクション）に注目している。さらに、FMT後3年までの長期的な微生物叢への影響についても研究する。

方法
このコホート研究では、オランダ・ドナー糞便バンク（NDFB、オランダ・ライデン）から提供されたFMTを受けたrCDI患者の便サンプルを用いて、MDR菌の存在とレジストームを評価する。NDFBでは、前述[33][34]のように、ドナー糞便懸濁液の収集、スクリーニング、調製、保管、rCDI患者の治療とフォローアップに標準化された手順を用いている。つまり、患者はまずC. difficileに対する抗生物質で少なくとも4日間、FMTの24時間前まで治療される。FMTの前日、患者はマクロゴール溶液による腸洗浄を受ける[7]。FMT前の検体は、抗生物質治療中または治療後、腸洗浄の前に採取される。FMTの約3週間後に、FMT後の短期検体が要求される。2016年5月から2021年3月にかけて、rCDI患者とそれに対応するドナーのFMT前およびFMT後の短期便検体を採取した。さらに、2021年2月に53人の患者に連絡し、臨床情報を入手し、長期追跡調査（LTFU）、すなわちFMT後の長期検便を依頼した。(FMT後のCDIの再発を含む臨床データは、さらなる調査のために記録された。便検体は、メタゲノム配列決定のためのDNA抽出まで-80℃で保存するか、MDR培養検査まで終濃度10％グリセロールで保存した。入手可能性に基づき、コホートからの便検体を培養および／または配列決定の対象とした。

すべての患者およびドナーから、糞便サンプルの使用および追跡データについて書面によるインフォームドコンセントを得た。ライデン大学医療センターの地元の医療倫理委員会により、NDFBのプロトコールと実施について倫理的承認を得た（参考文献P15.145、長期追跡調査：B21.49）。

多剤耐性菌の定義
定義および検査方法は、以前に記載されたものを使用した[35]。多剤耐性（MDR）菌は、Dutch Working Group on Infection Prevention [36] の定義に従って定義した。これにはESBL産生エンテロバクター属、フルオロキナーゼとアシネトバクターの両方に耐性を持つエンテロバクター属とアシネトバクター属が含まれる。フルオロキノロン系抗菌薬とアミノグリコシド系抗菌薬の両方に耐性を示すか、カルバペネマーゼを産生する緑膿菌；カルバペネマーゼを産生するか、以下の抗生物質クラスまたは薬剤のうち少なくとも3つに耐性を示す緑膿菌：フルオロキノロン系抗菌薬、アミノグリコシド系抗菌薬、セフタジジムまたはピペラシリン、カルバペネム系抗菌薬、コトリモキサゾール耐性Stenotrophomonas maltophilia、ペニシリンおよびバンコマイシン耐性Enterococcus faecium（VRE）、またはメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）。

多剤耐性菌の培養と抗菌薬感受性試験

便中のMDR菌を同定するために、接種用ループを用いて凍結した糞便アリコート（10％グリセロール含有）から10μLの糞便を掻き出した。この糞便を15 mLのトリプシン系大豆ブロスに濃縮し、35℃で18時間培養した後、ChromID ESBL、ChromID OXA-48寒天培地、MacConkeyトブラマイシン（8 mg/L）＋シプロフロキサシン（0.5 mg/L）寒天培地、およびVRE寒天培地（bioMérieux, Marcy l'Etoile,France）にプレーティングした。MRSAの検出には、塩化ナトリウム2.5および硫酸コリスチン10 mg/Lを添加した脳心筋梗塞濃縮ブロスを使用し、MRSA-ID寒天平板に接種した。MDRが疑われるコロニーはすべて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析計（MALDI-TOF）Biotyper（Bruker Daltonik; Bremen, Germany）により同定した。抗生物質感受性は、EUCAST（European Committee of Antimicrobial Susceptibility Testing）のブレイクポイントバージョン11.0 [37]に準拠し、VITEK2（Card N199, bioMérieux）で評価した。ESBL産生はダブルディスク法で確認した。メロペネムの最小発育阻止濃度（ETEST、bioMérieux）が0.25 mg/Lを超える分離株は、カルバペネム不活化法（CIM）試験およびKPC、VIM、NDM、OXA-48およびIMP遺伝子を検出するための社内マルチプレックスPCRを用いてカルバペネマーゼ産生を調べた。VREはvanAおよびvanB遺伝子を標的とする社内PCRで、MRSAはMREJ、mecA/mecCおよびNuc遺伝子を標的とするBD MAXアッセイ（BD、米国ニュージャージー州）で確認した。NDFBドナースクリーニングの既知のMDR菌陽性6株とMDR菌陰性7株の解凍糞便アリコート（同じく10％グリセロールで保存）を陽性対照と陰性対照とした。

多剤耐性分離株の全ゲノム配列決定
MDR分離株の抗生物質耐性遺伝子型とFMT後の持続性を評価するため、培養したMDR菌30株のうち24株（FMT前の便検体から16/20株、FMT後の短期便検体から8/10株、表1）を全ゲノム配列決定に供した。2021年1月にDNAが入手可能であった分離株のみを配列決定の対象とした。DNAはQIAsymphony DSP Virus/Pathogen Midi Kit（Qiagen、Hilden、ドイツ）を用いて単離し、GenomeScan B.V.（Leiden、オランダ）に送付し、Illumina NovaSeq6000プラットフォーム（Illumina, Inc. (細菌単離株あたりのリード数 780k[258k-164M]（中央値[範囲]）。Bowtie2（バージョン2.4.2、オプション'--very-sensitive-local'）[39]とsamtools（バージョン1. 11）[40]を用いて、アダプターおよび低複雑度リードを除去し、fastp（バージョン0.20.1、パラメータ '--cut_right --cut_window_size 4 --cut_mean_quality 20 -l 50 --detect_adapter_for_pe -y'）[41]を用いてクオリティトリミングを行った。高品質のリードはSPAdes（バージョン3.15.2、オプション '--isolate'）[42]を用いてアセンブルした。ABRicate（バージョン0.8.13, https://github.com/tseemann/abricate）を用いて、CARD（2021年3月25日～）[43]とResFinder（2021年3月25日～）[44]の両データベースで抗生物質耐性遺伝子をスクリーニングし、同一性が97%以上の全長遺伝子（カバレッジ100%）のみをヒットさせた。これらのカットオフは、レジストーム解析（下記参照）と手法の一貫性を保ち、比較できるようにするために用いられた。さらに、アセンブルしたゲノムをGTDB-Tk（バージョン2.1.0）[45]を用いて分類した。これらの分類は、上述のMALDI-TOF Biotyperによる分類を検証またはさらに特定するために使用され、配列決定された分離株の種の同定として使用された。配列データはEuropean Nucleotide Archive (ENA)にプロジェクト番号PRJEB64622で寄託されている。

ショットガンメタゲノムシークエンシング
2021年以前に採取されたサンプルは、以前に記載されたように保存され、配列決定のために準備された[46]。その結果、FMT前およびFMT後短期間の患者49人のメタゲノムと、8人のドナー56検体のメタゲノムが得られ、プロジェクト番号PRJEB44737でENAに寄託された。さらに22セットのFMT前、短期および長期FMT後を含む患者サンプル（うち7サンプルは以前にシーケンス済み）、および8ドナーの14ドナーサンプルのシーケンスが、Illumina NovaSeq6000プラットフォームを使用してGenomeScan B.V.（オランダ、ライデン）で行われ、サンプルあたり中央値42.6M 150bp ペアエンドリードが生成された。ヒト由来のリード（下記参照）を除いた生のリードは、プロジェクト番号PRJEB64621でENAに寄託されている。DNAは、未処理の患者およびドナーの糞便100 mgから、Quick-DNA Fecal/Soil Microbe Miniprep Kit (ZymoResearch, Irvine, California, USA)を用いて抽出し、Precellys 24 tissue homogeniser (Bertin Technologies, Montigny-le-Bretonneux, France)を用いて、5.5 m/sの速度で、短いインターバルを挟んで1分間×3回、ビーズビーティングを行った[47]。ライブラリーは、NEBNext Ultra II FS DNA kitとNEBNext Ultra II Ligation kit（New England Biolabs, Ipswich, Massachusetts, USA）を用いて構築し、約500-700 bpのDNA断片を作製した。また、DNAの単離と塩基配列決定が成功したことを確認するために、コントロールサンプルも加えた。これらには、ブランク（水）コントロールとZymoBiomics Community Standard（ZymoResearch社製）が含まれる。ネガティブコントロールはシーケンスリードを返さなかったが、ポジティブコントロールはコミュニティ内に存在するすべての生物種のリードを含んでいた。

メタゲノムリード処理
ヒト由来のリードは、bowtie2（バージョン2.4.2、オプション「--very-sensitive-local」）とsamtools（バージョン1.11）を用いて、リードをヒト参照ゲノム（GRCh38、NCBIアクセッションID GCF_000001405.26）にマッピングすることで、メタゲノム生リードから除去した。残りの非ヒトリードをfastp（バージョン0.20.1）で処理し、低品質な3'末端をトリミングし（パラメータ：'-cut_right --cut_window_size 4 --cut_mean_quality 20'）、低複雑度配列を除去し（パラメータ：'-y'）、残りのアダプター配列を除去し（パラメータ：'-detect_adapter_for_pe'）、50塩基より短いリードを除去した（パラメータ：'-l 50'）。得られた高品質なメタゲノムリードは、リードベースの分類学的プロファイリングとアセンブリーベースのARGプロファイリングに使用した。

メタゲノム中の多剤耐性分離株の定量化
培養および全ゲノム配列決定されたMDR細菌を同定および定量化するために、BWA-MEM（バージョン0.7.17）[48]を用いて、同じ便サンプル由来のメタゲノムリードをそれぞれのアセンブルされた全ゲノムにマッピングした。マッピングされたリードはカウントされ、カバレッジはsamtools coverage（バージョン1.10）を用いて定量化された。

分類学的プロファイリング
MetaPhlAn（バージョン4.0.3）[49]を用いて、分類学的微生物群プロファイルを決定した。微生物叢全体のパーセンテージとして定量化された分類学的プロファイルは、R phyloseqオブジェクトとしてインポートされ、視覚化と統計的比較が容易になった[50]。

レジストーム解析
ARGはアセンブリーベースのアプローチで検出した。クオリティトリミングしたリードをmetaSPAdes（バージョン3.15.4、デフォルトパラメータ）[51]を用いてスキャフォールドにアセンブルした。次に、ABRicate（バージョン0.8.13）を用いて、CARD（2021年3月25日～）とResFinder（2021年3月25日～）の両方のデータベースを用いて耐性遺伝子を同定し、少なくとも97%の同一性を持つ全長遺伝子（100%カバレッジ）のヒットのみを保持した。これらの基準は、高い特異性と適切な感度のバランスをとるために、BLASTヒットの目視検査に基づいて選択された。対照として、部分的な遺伝子を含めるために50%のカバレッジカットを用いて解析を繰り返したが、同等の結果が得られた。ARGは、それぞれのデータベースのアノテーションファイルを使用して、それぞれの標的抗生物質と抗生物質クラスでアノテーションされた。スキャフォールドは、BWA-MEM（バージョン0.7.17）とsamtools（バージョン1.10）を用いて、メタゲノムリードをスキャフォールドにマッピングして定量した。定量値は、各コンティグにマッピングされたリード数をコンティグの長さとアセンブルに使用された高品質リード数で除算し、1,000 * 1,000,000を乗じることで、reads per kilobase per million (RPKM)に正規化した。スキャフォールドに追加情報を付与するために、Genome Taxonomy Database Toolkit (GTDB-Tk; version 2.1.0)とContig Annotation Tool (CAT, version 5.2.3, parameters: '-r 10 -f 0. 5', [52])を用いて分類した。 5', [52] - Prodigalバージョン2.6.3 [53]; DIAMONDバージョン2.0.6 [54]; および2021年1月7日からのNCBI BLAST nrデータベース, https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/db/]を使用）、CATを一次アノテーションとして使用し、GTDB-Tkの結果を使用して分類のギャップを埋める。ARGを有するスキャフォールドのゲノム起源（染色体またはプラスミド）は、viralVerify（バージョン1.1、オプション「-p」、https://github.com/ablab/viralVerify）を用いて推定した。最後に、すべてのスキャフォールドアノテーションデータをR（バージョン4.0.2; https://www.R-project.org/）にロードし、さらなる解析を行った。これらの解析のソースコードはhttps://doi.org/10.5281/zenodo.8256351。

統計解析
患者におけるMDR菌のコロニー形成率は、FMT前とFMT後短期間、およびFMT後短期間とFMT後長期間の間で、ペアデータに対するMcNemarのカイ二乗検定を使用して比較した。メタゲノムデータにおけるMDR菌のカバー率の深さは、対数変換したカバー率の値に対する対のt検定を用いて、FMT前後で比較した。

メタゲノムおよびレジストームの分類学的構成をドナーと患者で比較するために、各ドナーについて代表的な値を1つずつ選択した。主成分分析（PCA）については、各ドナーについて、提供日に基づいて中央のサンプルを選択した（サンプル数÷2、切り上げ）。微生物叢またはレジストーム組成間の差異を表す指標としてAitchison距離を用い、レジストームでは0.001の擬似カウントを用いた。ボックスプロットを用いた多様性指標の比較では、各ドナーの中央値を選択した。PCAでは、患者における反復測定を考慮し、PERMANOVAおよびPERMDISP検定を用いてドナーと患者を比較した。多様性指標（豊かさ、総存在量、Shannon指数、Simpson均等度）は、t検定、または値が視覚的に正規分布していない場合はWilcoxon順位和検定を用いて、ドナーと患者の間で比較した。存在量の値は対数変換した。患者内では、FMT前とFMT後の短期的な測定値をすべて対のt検定を用いて比較し、FMT後の長期的なサンプルを収集した22人の患者のサブグループ内では、まず反復測定ANOVAを用いて値を比較した。p＜0.05の場合は、FMT前とFMT後、FMT後とFMT後の短期間と長期間の差を決定するために、paired t-testsをpost-hoc testとして用いた。

FMT前の抗生物質（バンコマイシン）投与期間がレジストームに影響を及ぼすかどうかを評価するため、Spearman相関を用いて、患者（n=52）のFMT前の投与期間とレジストームの豊富さ（異なるARGの数）、総存在量、シャノン多様性、シンプソン均等性を比較した。

Enterobacteralesによる患者のコロニー形成率は、MetaPhlAn4を用いて決定した。Enterobacterales目の存在量が0％を超える場合は存在、それ以外は不在とカウントした。タイムポイント間のコロニー形成率はMcNemarの検定を用いて比較した。総存在量は、反復測定ANOVAとそれに続く一対のt検定を用いて比較した。

すべての統計検定はRバージョン4.0.2で、base、rstatix、vegan、pairwiseAdonisパッケージを用いて行った。複数の検定を同時に行った場合、p値はHolmの方法で調整した。p値が0.05未満を有意とみなした。

データの利用可能性
本研究のために作成されたシーケンスリードは、European Nucleotide Archiveのプロジェクト番号PRJEB64622、PRJEB44737、PRJEB64621で入手可能である。

結果
ドナーおよび患者集団の特徴
サンプル収集期間中、NDFBは187人のrCDI患者のFMT治療208回分の糞便懸濁液を提供した。10％グリセロールに入れたFMT前後の87組の患者便サンプル（年齢中央値：73歳、四分位範囲（IQR）：64～81歳、女性56人（64％））が、培養によるMDR菌検査に利用可能であった（表1）。63組の生の凍結患者便サンプル（年齢中央値：73歳、四分位範囲（IQR）：65～81歳、女性40人（63％））が、ショットガン・メタゲノミック・ディープシーケンスに利用可能であった（表1）。42人の患者については、培養とメタゲノミクスの両方が可能であった。22人の患者がFMT後の長期サンプルを提供した（年齢中央値：73歳、IQR 64-78歳、女性14人（64％））。さらに、メタゲノミクスの配列決定には、11人の異なるドナー（年齢中央値：31歳、IQR27-42歳、女性6人（55％））から合計70検体の便が提供された（表1）。レジストーム解析は、FMT前とFMT後の短期サンプルの両方が入手可能な場合、完全なサンプルトライアドおよび長期FMT後のサンプルテトラドのみを含む。すなわち、患者のFMT前とFMT短期後、および対応するドナーの便サンプル（FMT短期後63人、FMT長期後21人、および11人のドナーからの52人のドナーサンプル）である。患者のサンプリング時間の中央値は以下の通りである： FMT前1日（IQR 1-3日）、FMT後27日（IQR 20-48日；短期）、FMT後801日（IQR 447-1114日；長期）。

サンプルソース MDR菌の培養検査を行った糞便サンプル MDR菌の全ゲノム配列決定済み／全培養済みメタゲノム配列決定に使用した糞便サンプル培養とメタゲノム両方のデータを有するサンプル
ドナー 76人（15人） 0 / 0 70人（11人） 43人（8人）
FMT前 87 16 / 20 63 42
FMT後短期（～3週間） 87 8 / 10 63 44
FMT後長期（～1～3年） 22 0 / 2 22 22
表1. サンプル数および適用技術の概要
FMT：糞便微生物叢移植、MDR：多剤耐性。

多剤耐性菌の有病率はFMT後に減少する
87例の便サンプルを選択的に培養し、MDR菌の保有率を評価した。FMT前は20/87例（23.0％）がMDR菌を保有していた（図1A、表2）。FMTの3週間後、コロニー形成率は10/87人（11.5％；p<0.0001）に減少し、このうち7人のMDR菌はFMT前の同じ患者の便サンプルからも培養された。長期的には、コロニー形成率はさらに低下し、2/22（9.1％；p＝0.0008、FMT後の短期間と比較）であった。いずれもFMT後の短期検体からも検出されたESBL産生大腸菌であったことから、長期持続性であると考えられた。長期検体を提供した患者のサブグループにおいても、FMT後のコロニー形成率およびシフトは、全87例と同様であった（図1B；FMT前5/22＝22.7％、FMT後4/22＝18.2％；p＝0.009）。

図1. 培養多剤耐性菌の有病率および存在量に対する糞便微生物叢移植の効果。再発性C. difficile感染（rCDI）患者の便サンプルを培養し、糞便微生物叢移植（FMT）前後の多剤耐性（MDR）菌の有病率を評価した。患者のサブグループについては、長期追跡サンプルを入手して検査した。培養分離株を全ゲノムシークエンシングに供し、同じ便サンプルからのメタゲノムシークエンシングデータをアセンブルされたゲノムにマッピングし、メタゲノム中の細菌を定量化した。A) 87人のrCDI患者におけるMDR菌の有病率。FMT前は20/87人がMDR菌にコロニー形成されていたが、FMT後は10/87人がコロニー形成されていた。FMT後のコロニー形成率は有意に低い（McNemarのカイ二乗、p<0.0001）。B) 長期追跡（FMT後1～3年）検体を採取した22例のコロニー形成率。5/22人はFMT前にMDR菌を保有しており、4/22人はFMT後3週間でコロニー形成され、2/22人は数年後もコロニー形成されていた。いずれの時間間隔においても、コロニー形成率は低下した（それぞれp = 0.01およびp = 0.005）。C）エッセイ感受性を比較するために、メタゲノミクスリードを、全ゲノム配列決定された培養MDR分離株のアセンブリーにマッピングした。一般に、FMT前の患者では、FMTの3週間後と比較してMDR菌の存在量が高かった（t検定、p = 0.016）。D) 種ごとのメタゲノムシークエンシングデータにおけるMDR菌のカバー範囲の広さと相対的存在量。存在量は、samtoolsのカバレッジで報告されたカバレッジの平均深さ（位置あたりのヌクレオチド）で表される。アスタリスクは統計的に有意な差を示す、: p < 0.05; : p < 0.01; : p < 0.0001.
MDR：多剤耐性、FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期追跡。
患者サンプルタイムポイント種耐性表現型 WGSに基づく遺伝子型メタゲノムで検出されたもの
P22 FMT後大腸菌アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、ampC APH(3')-Ia, APH(6)-Id, APH(3")-Ib, ANT(2")-Ia, acrD, ampC, QnrB5, emrR Yes
P30 FMT後の大腸菌アミノグリコシド系、フルオロキノロン系 acrD, emrR, emrD 有
P31 FMT前大腸菌アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、セフタジジム acdD、emrR、emrB、ampC 有
P33 FMT前 K. pneumoniae アミノグリコシド系抗生物質、フルオロキノロン系抗生物質、ESBL aadA2、 aadA16、AAC(3-Ⅱd)、TEM-1、 SHV-119、CTX-M-14 有
P33 FMT後 K. pneumoniae アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、 ESBL aadA2、aadA16、AAC(3-IID)、TEM-1、 SHV-119、CTX-M-14 有
フルオロキノロン、ESBL CTX-M-27, ermR, emrB 有
P38 FMT後大腸菌フルオロキノロン系、ESBL CTX-M-27, ermR, emrB Yes
P39 FMT前大腸菌アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、 ESBL CTX-M-15, OXA-1, acrD, AAC(3)-IIe, emrA, emrB, emrR Yes
P44 FMT前 C. freundii アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、ESBL CTX-M-15, OXA-1, AAC(3)-IIe, AAC(6')-Ib-cr, APH(6)-Id, APH(3")-Ib, QnrB6 Yes
P44 FMT後 C. freundii + 大腸菌アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、 ESBL + ESBL CTX-M-15, OXA-1, AAC(3)-IIe, AAC(6')-Ib-cr, APH(6)-Id, APH(3")-Ib, QnrB17 Yes
P44 LTFU（3年）大腸菌 ESBL NA NA NA
P51 FMT前 C. freundii ESBL CTX-M-9 あり
P58 FMT前大腸菌アミノグリコシド系、フルオロキノロン系 acrD, emrR 有
アミノグリコシド、フルオロキノロン、ESBL CTX-M-14, acrD, AAC(3)-IIe, APH(3")-Ib, APH(6)-Id, emrR Yes
P59 FMT 後の大腸菌アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、ESBL CTX-M-14, acrD, AAC(3)-IIe, APH(3")-Ib, APH(6)-Id, emrR Yes
アミノグリコシド系抗生物質、フルオロキノロン系抗生物質、 ESBL NA NA
アミノグリコシド系抗生物質、フルオロキノロン系抗生物質 AAC(6')-Ib-cr, emrA, emrB, emrR NA
P64 FMT後 E. coli アミノグリコシド系フルオロキノロン系 acrD, APH(3")-Ib, APH(6)-Id, ampC, ampH, emrA, emrB, emrR NA
アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、 ESBL ACT-27、CTX-M-15、OXA-1、TEM-1、 AAC(3)-Iye、APH(6)-Id、APH(3")-Ib、 AAC(6')-Ib-cr、QnrB6 NA
P66 FMT前 M. morganii ESBL DHA-18 NA
P67 Pre-FMT P. mirabilis ESBL CTX-M-1 NA
P68 Pre-FMT P. mirabilis_B（vulgaris/mirabilis） ESBL（なし）** NA
P69 FMT前 C. freundii* アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、 ESBL CTX-M-15, TEM-1, OXA-1, AAC(3)-IIe, APH(3")-Ib, APH(6')-Id, QnrB6 NA
P69 FMT後 C. freundii* アミノグリコシド系、フルオロキノロン系、ESBL CTX-M-15, TEM-1, OXA-1, AAC(3)-IIe, APH(3")-Ib, APH(6')-Id, QnrB17 NA
P70 FMT前の大腸菌* ESBL ampC, ampH, SHV-134 NA
P70 FMT後の大腸菌* ESBL ampC, ampH, SHV-134 NA
P71 FMT前肺炎桿菌 ESBL NA NA
P72 FMT前 P. hauseri ESBL NA NA NA
P73 Pre-FMT C. freundii ESBL NA NA
P74 Pre-FMT E. cloacae ESBL NA NA
P75 FMT前 E. cloacae* ESBL NA NA
P75 FMT後 E. cloacae* ESBL NA NA
表2. 培養した多剤耐性菌の遺伝子型と表現型の概要。
*：FMT前後で同一菌種であり、耐性遺伝子型（補足図1～3）が入手可能な場合は、耐性遺伝子型に基づいて持続性が推定される。**：ゲノム配列データからは抗生物質耐性遺伝子は検出されなかった。種名はGenome Taxonomy Database（GTDB）の通り記載し、異なる場合はNational Center for Biotechnology Information（NCBI）で知られている別名を（）内に記載した。同一の便から複数の多剤耐性菌が培養された場合、分離菌の特徴はプラス（'+'）記号で区切って記載した。
FMT： faecal microbiota transplantation、LTFU：long-term follow-up、ESBL：extended-spectrum beta-lactamase、NA： data not available（分離株および/またはメタゲノムが配列決定されていないため）。

多剤耐性菌の全ゲノム配列決定とメタゲノミクスとの比較
多剤耐性菌の培養分離株24株について、ARGとFMT後の持続性の可能性を調べるために全ゲノム配列決定を行った。その結果、1つのゲノムを除くすべてのゲノムで、耐性表現型に関連するARGを検出することができた。例えば、ESBL産生菌と分類された分離株ではESBL遺伝子が検出された（表2；補足図1〜3）。さらに、ショットガンメタゲノミクスを用いて、MDR菌を培養し、16人の患者の便検体から全DNAの塩基配列を決定した。メタゲノミクスのリードをアセンブルした分離菌ゲノムにマッピングし、エッセイ感受性を比較し、微生物叢における相対的な存在量を決定した。抗生物質による前治療を受けた患者において予想されたように、rCDI患者ではFMT後よりもFMT前の方がMDR菌の相対量が多いことがわかった（図1C；p＝0.006）。メタゲノムからは、Citrobacter freundiiの1株（43％；図1D）を除き、MDR分離株のほぼ完全なゲノムが検出された。また、WGSデータで検出された耐性遺伝子とメタゲノムデータで検出された耐性遺伝子を比較し、培養と比較したメタゲノムシーケンスの感度を推定した。その結果、培養分離株の関連するMDR菌耐性遺伝子が、それぞれのメタゲノムに戻っていることがわかった（表2）。さらに、P44のメタゲノム解析データから、FMT前のサンプルではESBL産生大腸菌の存在が示唆されたが、培養ではFMT後の糞便でのみ検出された。これらのデータから、細菌培養とメタゲノムシークエンシングを組み合わせることで、相乗的に利用でき、どちらか一方の方法単独よりも詳細な結果が得られることが示唆された。

図2. 糞便ドナーと糞便微生物移植レシピエントにおけるEnterobacteralesの有病率と存在量。A) MetaPhlAn4によって決定されたメタゲノム中のEnterobacteralesの相対的存在量。B)FMT前日、FMT後3週間、FMT後1-3年（長期追跡、LTFU）に採取した便ドナーとFMTを受けたrCDI患者におけるEnterobacteralesの総存在量。：p＜0.05、**：p＜0.0001。
FMT：糞便微生物移植、LTFU：長期追跡。
腸内細菌叢組成および多様性に対するFMTの効果
MetaPhlAn4を用いて、FMT前後の健常人ドナーとFMTレシピエントの糞便の腸内細菌叢組成を調べた。ドナーは、ファーミキューテス、バクテロイデーテス、アクチノバクテリアに支配された安定した微生物叢を有していた（補足図4A-B）。腸内細菌はドナーの26/70便（37％）に認められた。FMTの前に抗CDI治療（バンコマイシン53 x、フィダキソマイシン6 x、メトロニダゾール1 x、メトロニダゾール+バンコマイシン1 x、不明2 x）を受けたrCDI患者では、放線菌とバクテロイデーテスの存在はかなり少なく、一方、プロテオバクテリア（主にEscherichia coliまたはKlebsiella pneumoniae）がしばしば優勢であった（31/63人=49%で50%以上の存在）。腸内細菌はFMT前のすべての患者の便に存在した。FMT後、患者の微生物叢はドナーのものと混在し、プロファイルはよりドナーに類似していた。Enterobacteralesの有病率はFMT後の数週間で低下し（58/63 = 92%; p < 0.0001; 図3A）、長期的にはさらに低下した（18/21 = 86%; o = 0.012）。Enterobacteralesの存在量もまた、FMT後まもなく減少し（p < 0.0001；図3B）、長期的には減少を続け（p = 0.025）、ドナーで見られたレベルと変わらなくなった（p = 0.09）。また、ドナーメタゲノムと患者メタゲノムの種プロファイル間のアルファ多様性とベータ多様性を比較し、違いを定量化した（図3）。菌種プロファイルのPCAでは、ドナーと患者で違いが見られた（図3A; PERMANOVA, p = 0.001; PERMDISP, p < 0.0001）。微生物叢プロファイルの違いは、FMT前のドナーとrCDI患者の間で最も顕著であった（p = 0.003）。依然として差はあるものの、FMT後の微生物叢プロファイルはわずかにドナーに類似していた（ドナーと比較した場合、短期および長期ともにp = 0.014）。分類学的プロフィールを種のランクで比較すると、豊かさとアルファ多様性（Shannon index）はrCDI患者よりもドナーの方が高く（図3B-C；p＜0.0001）、FMT後の患者では劇的に増加し（p＜0.0001）、ドナーと同じレベルまで上昇した（p＞0.1）。豊かさとシャノン指数は長期的に高いままであった。逆シンプソン指数またはシンプソン優勢としても知られるシンプソン均等性は、ドナーと患者で差がなかった（図3D；p > 0.3）。全体として、今回のデータは、rCDI患者では多様性が低く、FMTドナーでは多様性が高く、FMT後の患者では多様性が高まるという予想されたパターンを示している。

図3. 腸内細菌叢の組成と多様性の比較。健康なドナーと糞便微生物移植（FMT）レシピエントの便サンプルをショットガンメタゲノミクスを用いて配列決定した。MetaPhlAn4を用いてメタゲノムの分類学的組成を決定し、FMT前後のドナーとレシピエントの間で、またFMT後およそ1-3年の長期フォローアップの時点で、αおよびβの多様性を種のランクで比較した。A) 主成分分析（PCA）におけるAitchison距離で表したβ多様性。X軸とY軸のパーセンテージは、最初の2成分で説明される分散を表す。B-D) 種の豊かさ、シャノン指数、シンプソン均等性をそれぞれドナーとレシピエント間で比較したもの。アスタリスクは統計的に有意な差、****：p < 0.0001。
FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期追跡調査。
FMTは耐性遺伝子量を減少させるが、多様性は減少させない
それぞれの11人のドナーの便52検体のメタゲノムシークエンスデータを用いて、63人の患者のFMT前後のレジストームを決定した（補足図5-6）。次に、PCAを用いてドナーと患者のレジストーム組成の違いを定量化した（図4A）。ドナーのレジストームは類似しており、アミノグリコシド耐性、ジアミノピリミジン耐性、テトラサイクリン耐性のARGは多くの場合同じであった（補足図5）。一方、rCDI患者のレジストームは大きく異なっており（PERMANOVA, p = 0.003; PERMDISP, p < 0.0001）、β-ラクタム耐性、フルオロキノロン耐性、多剤排出ポンプのARGが異なっていた（補足図5-6）。FMT後、患者のレジストームはドナーのレジストームとは異なるものの、ドナーのような組成にシフトしていることが確認された（p = 0.003）。長期追跡調査（〜1〜3年）では、レジストームは視覚的にはドナーに似ているように見えるが、統計的にはまだ異なっていた（p = 0.012）。FMT後のレジストームの変化をより深く理解するために、抗生物質クラス別の耐性遺伝子の相対的存在量を可視化し（補足図7A）、各患者レジストームから全ドナーレジストームまでの距離を示した（補足図7B）。どちらの方法でも、FMT後、患者のレジストームはドナーのレジストームに似てくることが示唆された。

図4. 糞便ドナーと糞便微生物叢移植レシピエントのレジストームの概要。便サンプルのメタゲノム配列決定後、糞便ドナーと糞便微生物叢移植（FMT）レシピエントのレジストームを決定し、これらのグループおよびFMT前後の違いを調べた。A）Aitchison距離によるレジストームの主成分分析（PCA）。X軸とY軸のパーセンテージは、最初の2成分で説明される分散を表す。B-E) 抗生物質遺伝子のリッチネス、総存在量、シャノン指数、シンプソン均等性をそれぞれグループ間およびレシピエントタイムポイント間で比較。アスタリスクは統計的に有意な差を示し、*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001。
FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期追跡調査。
その結果、FMT前の患者の糞便メタゲノムには、ドナーよりも多くの異なる耐性遺伝子（高いレジストームリッチネス）が認められた（p<0.0001；図4B）。バンコマイシンの前治療期間はレジストームに有意な影響を及ぼさなかった（補足図8）。FMT後、患者のレジストームリッチネスは変化せず（p > 0.1）、ドナーよりも高いままであった（FMT後短期：p < 0.0001、長期：p = 0.0002）。耐性遺伝子の総存在量も、FMT前の患者ではドナーよりも高かったが（図4C；p＜0.0001）、レジストームの豊富さとは対照的に、患者ではFMT後まもなく存在量が減少した（p＝0.0003）。長期的には、存在量はさらに減少したが（p = 0.02）、ドナーよりも高い値を維持していた（p = 0.02）。シャノン指数は豊かさと存在量を組み合わせたもので、同様にrCDI患者ではドナーと比較してレジストームの多様性が高く、FMT後は減少することが示された（図4D）。シンプソン均等性（Simpson evenness）は、ドナーと患者の間に統計的な差は見られなかったが（図4E；p > 0.1）、FMT後の患者ではレジストームの多様性が減少することが示された（p = 0.017）。要約すると、FMTはARGの相対的存在量を低下させることにより、レシピエントのレジストームの多様性を変化させるようである。

我々は、異なる抗生物質クラスからのARGの異なる有病率と存在量のパターンを観察した（補足図5-6）。このことをさらに調べるために、ドナーと患者の両方に遺伝子が存在するクラスを選択し、2つのグループに分けた。1つのグループ（β-ラクタマーゼ、フルオロキノロン、多剤排出ポンプ）は、ドナーではまれで、患者では一般的で豊富な遺伝子で構成されている（補足図9 A-CおよびG-I）。このグループの遺伝子の豊富さはFMT後まもなく減少し、レジストームの豊富さは長期的にのみ減少した。第2のグループ（アミノグリコシド、ジアミノピリミジン、テトラサイクリン）はドナーに多い（補足図9 D-F、J-L）。このドナーに関連するグループの遺伝子がレシピエントに移行し、その結果、FMT後にレジストームリッチネスが高くなった可能性があり、それらの存在量はFMT後も減少しなかった。これらの結果から、FMTがレジストームに及ぼす影響は、抗生物質の種類や遺伝子を保有する分類群によって異なることが明らかになった。

驚くべき耐性
レジストームデータから、ドナー糞便中にも多数のESBL遺伝子が検出された。さらに、カルバペナマーゼ遺伝子と1つのコリスチン耐性遺伝子（mrc-10_1、プラスミド上にあると予測される）は、FMT前のrCDI患者でのみ検出された。バンコマイシン遺伝子は、FMT前の患者63人中7人（11.1％）とFMT後の患者63人中11人（17.5％）でメタゲノミクスにより検出された（補足図10）。また、FMT後の短期便からは、MDROに指定されていないバンコマイシン耐性のEnterococcus faecalisが検出された。これらの耐性およびプラスミド上の耐性と予測される耐性については、補足結果および補足図10-12で詳述する。

プラスミドを介した抗生物質耐性の予測値は依然として高い
viralVerifyのプラスミド予測アルゴリズムを用いて、耐性遺伝子を持つコンティグが染色体に由来しそうなものとプラスミドに由来しそうなものを評価した。耐性遺伝子の大部分（4,567 / 6,662、68.6％）は染色体に由来すると予測され、400（6％）はプラスミドに由来すると考えられた。残りの1,695個（25.4%）のARGを持つコンティグは、プラスミドと染色体のどちらにも確実に分類できなかった。一般的なレジストームパターンに従ってFMT後に減少する染色体レジストとは異なり（図5A-C）、プラスミド由来のARGのレジストームリッチネス、存在量、多様性はrCDI患者でドナーより高く、FMT後も高いままであった（p≦0.01；図5D-F）。この効果はFMT後3年まで持続したことから、FMTはプラスミドを介した抗生物質耐性に有意な影響を与えない可能性が示唆された。

図5. 染色体耐性遺伝子とプラスミド関連耐性遺伝子のレジストーム比較。染色体上にコードされる抗生物質耐性遺伝子とプラスミドを介する耐性遺伝子との違いの可能性を評価するために、viralVerifyを用いてアセンブルされたコンティグの起源を予測した。次に、染色体上に存在すると予測される耐性遺伝子（A-C）とプラスミド由来と予測される遺伝子（D-F）について、糞便ドナーとFMTレシピエントの間で、リッチネス（耐性遺伝子数）、総存在量、Shannon indexのパラメータを別々に比較した。豊富度（A, D）はウィルコクソン順位和検定で比較し、存在度（B, E）とシャノン指数（C, F）はt検定で比較した。*: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001; ****: p < 0.0001。
FMT：糞便微生物叢移植、LTFU：長期追跡調査。
考察
本研究は、有効な培養技術、メタゲノム解析、および長期追跡調査サンプルの長所を活用し、抗生物質耐性に対するFMTの効果について、これまでで最も詳細な研究を提供するものである。FMTレシピエントはFMT後、より多様でドナーのようなレジストームと微生物叢プロフィールを有していた。1-3年間の追跡調査とプラスミド予測は、FMT後の微生物叢動態と抗生物質耐性に関する新たな知見を提供する。培養データとシークエンシングデータの間には強い相関が認められたが、それぞれに利点がある。プラスミド予測は、どの耐性菌が細菌間で移行しやすいかについての洞察を与え、潜在的に病原性のある種が存在する場合にリスクをもたらす。

我々は、MDR菌とrCDI患者のレジストームに対するFMTの効果が最長3年間持続することを見出した。FMTの効果は、ARGよりも細菌種構成に対してより顕著である。FMTの3週間後には、すでにレシピエントの分類学的組成はドナーのものと類似しているが、レジストームは長期にわたっても異なるままである。ほとんどの患者がバンコマイシンで前処置されていたため、Enterobacteralesのようなグラム陰性菌が増殖した。実際、FMT前にはEnterobacteralesの有病率と存在量が高く、FMT後には有意に減少した。Enterobacteralesはよく研究されており、このグループには多くのARGやプラスミドが報告されているため、参照データベースに偏りがある可能性がある。FMT後のEnterobacteralesの有病率の高さは、レジストームの豊富さが持続的に高いことと相関しているが、その一方で両者の存在量は減少している。このことから、抗生物質治療後のFMTは主に細菌種構成のバランスをとり、MDR菌の存在量を低下させるという仮説が提起された。しかし、これらの細菌が根絶されたわけではなく、それらのARGは低い相対量で存在したままである。その結果、C.ディフィシル菌とMDR菌の両方がFMT後に症状を引き起こさなくなる可能性があるが、それらが患者内に存在する限り、感染のリスクは依然として存在する [13][14][15] 。

健康なドナーとrCDI患者のレジストーム組成には大きな違いがあり、病歴や抗生物質の使用に関連している可能性がある [55] 。より一般的には、嫌気性腸内常在菌がアミノグリコシド耐性遺伝子やテトラサイクリン耐性遺伝子を持つことが多いことが報告されており [56] 、特定の遺伝子に違いはあるものの、ドナーや患者で共通していることがわかった。これらの嫌気性菌や常在菌はFMT中に移行し、レジストーム組成の変化を引き起こす可能性がある。その結果、FMTレシピエントのレジストームは、異なるドナーのレジストームで補完され、このことは、以前にも示されたように、異なる抗生物質クラスに対するFMTの異なる効果につながる[57]。さらに、腸内細菌叢の抗生物質耐性遺伝子のほとんどは染色体上にコードされており、プラスミドほど簡単に移行しない可能性があることがわかった。したがって、ほとんどの抗生物質耐性は宿主種に結合しているという仮説が成り立つ。しかし、FMT後に微生物叢のプロフィールは回復するものの、レシピエントのレジストームは、主に耐性遺伝子と予測されるプラスミドの残存により、異なるままであることもわかった。これは年齢や合併症と関連している可能性がある。この矛盾をさらに解明するためには、Meta-HiC [56]のようなARGと宿主生物を結びつける技術が必要である。これによって、臨床医は感染のリスクや治療法に関する追加情報を得られるはずである。

我々のコホートでは、FMT後にMDR菌の感染を報告した患者はおらず、FMTを行わない対照群も含まれていない。したがって、FMT後のMDR菌感染のリスクに関するデータはない。他の患者群では、FMTが感染リスクを低下させることが判明している[58][59]。さらに、患者の腸内がMDR菌で脱コロナイズされていなくても、FMTはMDR菌による感染数を減少させる可能性がある［60］。そのメカニズムとしては、FMTによって腸内細菌叢がMDR菌に強いバランスのとれた状態に回復するという仮説がある［58］。このような状況は、感染感受性の低下または感染抵抗性と表現されるかもしれない。我々のデータは、これに関与する微生物叢プロセスの新たな詳細を示している。

MDR菌の管理のための微生物叢療法は、まだ実験段階にある。可能性のあるベネフィットをよりよく評価するためには、ARGを細菌分類群や宿主の腸内生態系に結びつけることができる古典的な微生物学的手法と組み合わせた、より大規模な（無作為化対照）試験やマルチオミクス研究が必要である。さらに、FMTの国際的な登録の利用は、異なる患者集団における感染リスクを評価するための長期的なデータ収集に役立つ。そして最後に、レジストームの違いを説明し、より一般化可能な結果を得るためには、対照患者やより多様な患者を対象とした研究が必要である。そうすれば、感染症にかかりやすい患者の抗生物質耐性を制御するためのFMTの実行可能性を評価することができる。

謝辞
MDR菌を培養してくれたLUMCのExperimental BacteriologyグループのEric K.L. BerssenbruggeとIngrid M.G.J. Sandersに感謝の意を表したい。オランダ・ドナー糞バンクのHein W. Verspaget教授には、継続的な支援と監督をいただいた。また、DNA塩基配列決定を提供してくれたGenomeScan B.V.にも感謝する。最後に、LUMCのExperimental BacteriologyグループとCenter for Microbiome Analyses and Therapeutics、特にWiep Klaas Smits博士には、有意義なディスカッションを提供していただいた。

著者の貢献
SN、KEWV、RDZ、EJK、EMTが本試験のコンセプト立案とデザインを行った。QRD、EJK、JJK、EMTが研究を監督した。KEWV、JJK、EJK、EMTが患者の治療を監督した。KEWVは臨床データおよび微生物学的データの収集と解析を行った。SNはゲノム解析、メタゲノム解析、統計解析を行い、原稿を作成した。すべての著者が原稿を確認・編集し、最終版を承認した。

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ゲノムアセンブリー GRCh38 [] ^Langmead B, Salzberg SL: Bowtie 2 による高速ギャップドリードアライメント。Nat Methods 2012, 9(4):357-359。
このような研究成果には、ゲノム配列のアライメント、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析、アライメント結果の解析が含まれる。Bioinformatics 2009, 25(16):2078-2079.
また、そのような配列に対応するために、FASTQプリプロセッサーを開発した。Bioinformatics 2018, 34(17):i884-i890.
このような研究成果を、バイオインフォマティクス（Bioinformatics）誌に発表した。
このような研究は、バイオインフォマティクスの分野では非常に重要である。
このような研究成果は、生物多様性保全の観点から、生物多様性保全に貢献するものである。Nucleic Acids Res 2017, 45(D1):D566-D573.
このデータベースは、抗菌薬耐性菌の同定を目的としたものである：後天性抗菌薬耐性遺伝子の同定。J Antimicrob Chemother 2012, 67(11):2640-2644.
また、そのような遺伝子発現は、遺伝子発現を制御するために必要な情報である。このデータベースは、ゲノム分類データベースを利用したメモリフレンドリーな分類を実現するものである。
このような背景の下で、日本では、「日本人の腸内細菌叢移植は、腸内細菌叢の発がん性大腸菌に影響を与える」とする研究結果が発表された。Gastroenterology 2021, 161(4):1218-1228 e1215.
Ducarmon QR, Hornung BVH, Geelen AR, Kuijper EJ, Zwittink RD: Toward Standards in Clinical Microbiota Studies： mSystems 2020, 5(1).
李浩：BWA-MEMによる配列リード、クローン配列、アセンブリーコンティグのアライメント。arXiv:13033997[q-bioGN]に掲載。2013.
このような研究開発には、研究者、技術者、研究者間の協力が不可欠である。Nat Biotechnol 2023.
また、そのようなメタゲノム解析は、微生物学的な分類学に基づくメタゲノム分類学的プロファイリングと、微生物学的な分類学的プロファイリングに基づくメタゲノム分類学的プロファイリングに大別される。この論文では、微生物学的な背景を明らかにすることを目的とした。
また、このような解析は、微生物学的な研究者にとっても、非常に重要である。Genome Res 2017, 27(5):824-834.
^von Meijenfeldt FAB, Arkhipova K, Cambuy DD, Coutinho FH, Dutilh BE: Robust taxonomic classification of uncharted microbial sequences and bins with CAT and BAT. Genome Biol 2019, 20(1):217.
ハイアットD、チェンGL、ロカシオPF、ランドML、ラリマーFW、ハウザーLJ： Prodigal: 原核生物の遺伝子認識と翻訳開始部位の同定。BMC Bioinformatics 2010, 11:119.
また、そのような遺伝子配列は、遺伝子発現に影響を与える可能性があるため、遺伝子発現に影響を与える可能性のある遺伝子は、遺伝子発現に影響を与える可能性がある。Nat Methods 2021, 18(4):366-368.
このような研究により、ヒトの腸内細菌叢におけるレジストームの拡大が明らかになった。Microbiome 2023, 11(1):166.
a, bMcCallum GE, Rossiter AE, Quraishi MN, Iqbal TH, Kuehne SA, Schaik Wv：メタゲノム染色体確認キャプチャーにおけるノイズ低減戦略による抗生物質耐性遺伝子と微生物宿主の関連付け bioRxiv 2022:2022.2011.2005.514866.
このような背景のもとで、日本では、抗菌薬耐性菌の腸内コロニー形成を抑制するための微生物叢の回復を目的とした非盲検試験「PUNCH CD試験」が実施され、その結果、抗菌薬耐性菌の腸内コロニー形成が抑制された。Genome Med 2021, 13(1):28.
a, bGhani R, Mullish BH, Davies FJ, Marchesi JR: How to adapt an intestinal microbiota transplantation programme to reduce the risk of invasive multidrug-resistant infection. Clin Microbiol Infect 2022, 28(4):502-512.
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