セルロースが豊富な食事は腸のホメオスタシスを破壊し、腸脳軸を通じて不安をもたらす
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記事2024年9月9日
セルロースが豊富な食事は腸のホメオスタシスを破壊し、腸脳軸を通じて不安をもたらす
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsptsci.4c00270
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伊藤 楓
細木あるか
笠井宇也
佐々木博之
原口敦
柴田英信
野崎英弘
CS薬理学・トランスレーショナルサイエンス
これを参照 CS Pharmacol. Sci.2024, XXXX, XXX, XXX-XXX
ttps://doi.org/10.1021/acsptsci.4c00270
2024年9月9日発行
2024 American Chemical Society. この出版物は本利用規約の下で利用可能です。
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要旨
健康な腸内環境は精神状態の改善に不可欠であると広く言われている。腸内環境を整える栄養素として、食物繊維が知られている。最近の研究で、食物繊維による腸内環境の維持が動物における精神疾患の症状を緩和することが示された。しかし、このような効果は、発酵性が高く短鎖脂肪酸（SCFA）の産生を促進する水溶性食物繊維でのみ報告されており、不溶性食物繊維では報告されていない。そこで我々は、セルロースなどの不溶性食物繊維が、腸内の変化を介して情動を変化させるかどうかを検証することを目的とした。マウスを2群に分け、標準食（SD：不溶性食物繊維と水溶性食物繊維の両方を含む）とセルロースリッチ食（CRD：食物繊維としてセルロースのみを含む）のいずれかを与えた。その結果、CRDを与えたマウスは不安様行動が増加した。また、RDを与えたマウスは、腸管透過性、運動障害、過敏症の増加とともに、腸内SCFAレベルの低下を示した。迷走神経切断マウスでは、CRDのこのような行動的・生理的効果は完全に消失し、腸内環境の悪化が腸脳軸を介して情動に直結していることが示された。さらに、CRDを摂取したマウスでは、扁桃体ドーパミンシグナルが変化しており、オピオイド拮抗薬は、CRD誘発不安とともに、このドーパミンシグナル変化を消失させた。以上より、食物繊維としてセルロースのみを摂取した場合、腸管の異常が誘発され、迷走神経、オピオイド系、扁桃体ドーパミンのアップレギュレーションが起こり、その結果、不安が増強される可能性が示唆された。
本出版物は、 米国化学会により個人使用の許可を得ている 。
2024 米国化学会
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近年、精神疾患だけでなく、日々のストレスや不安に悩む人が増えている。n2019年、WHOは世界で9億7000万人が精神疾患に罹患していると報告し、これは世界人口の10％以上である。1）数ある疾患の中でも、精神疾患は2019年の世界における障害とともに生きた年数（Years Lived with Disability）の2番目に多い疾患であり（2）、精神疾患が多くの人々にとって長期にわたる苦しみであることを示している。しかしながら、精神疾患の診断と治療には困難が伴う。精神疾患の診断には、リスクと障害の区別など未解決の問題があり、適切な治療を選択することを困難にしている。3）さらに、精神疾患に対する精神療法と薬物療法の奏効率はいずれも50％以下であり、有効な治療法の開発が不十分であることを示唆している。4）これらのことから、精神疾患の病態生理・病態の解明と治療法の開発が求められている。
近年、腸内環境と精神疾患との関係が注目されている。5）うつ病患者の腸内環境は悪化することが知られているが（6）、一方、無菌マウスはうつ病に対する抵抗性を示す（7）。7）これらの報告は、腸内環境や微生物叢を健康に保つことが気分や感情を改善する可能性を強く示唆している。うつ病患者を対象とした臨床試験では、プロバイオティクスの摂取が腸内細菌叢の改善とともに不安を緩和することが示されている(8)。8）また、プロバイオティクスの投与がGABA作動性神経系を変化させ、ナイーブマウスに抗不安作用をもたらすことも示されている。9)
プロバイオティクスは最も支持されている「腸の健康調整因子」であるが、食物繊維も腸の健康維持に重要な役割を果たしている。10）食物繊維は難消化性で、腸内細菌によって消化され、短鎖脂肪酸（SCFA）の産生を促進する。CFAsは、炎症、腸管免疫、様々な疾患の抑制など、腸の恒常性維持に重要な役割を果たすことが知られている。11)しかし、こうした有益な効果は食物繊維の種類によって大きく異なる。食物繊維は、水への溶解度によって不溶性食物繊維と水溶性食物繊維に分類される。水溶性食物繊維（難消化性デキストリン）を摂取させたマウスは、不溶性食物繊維（セルロース）を摂取させたマウスに比べて、盲腸内容物中のSCFA濃度が上昇することが、以前e. 12）水溶性食物繊維は発酵性であり、より強い整腸作用があるため、プレバイオティクスとして利用されている。13）過去のいくつかの研究から、水溶性食物繊維は腸内環境を改善することで精神疾患を緩和することが示唆されている。水溶性食物繊維の摂取による腸内環境の改善は、ネズミのうつ病、(14)統合失調症、(15)糖尿病誘発性不安症(16)の症状を緩和する。しかし、セルロースなどの不溶性食物繊維が腸内環境や情動に及ぼす影響については、これまで全く検討されてこなかった。
セルロースは植物の主成分であるため、日常的に摂取される最も一般的な食物繊維である。セルロースは水溶性食物繊維に比べて発酵しにくく、保水性が高いため、便のかさを増やし、腸を物理的に刺激して蠕動運動（腸の動き）を改善することができる(17)。18）また、高セルロース食は、脂質代謝と腸内細菌叢を調節することにより、デキストラン硫酸ナトリウム誘発性大腸炎に対する保護効果を有することが報告されており、セルロースが腸の恒常性維持に有効であることが示唆されている。19)
そこでわれわれは、不溶性食物繊維が腸内の変化を介して情動を変化させるかどうかを検証することを目的とした。その結果、セルロースリッチ食（CRD）を長期間摂取すると、不安様行動が増加することがわかった。このような情動や神経細胞の変化は、CRD曝露によるSCFAの減少に起因する腸管運動低下や知覚過敏に起因する可能性があり、迷走神経切断術やオピオイド受容体の阻害によって改善された。さらに、慢性CRD曝露により、扁桃体のドーパミンレベルが上昇することがわかった。以上の結果から、CRDによる腸管の変化が迷走神経、そしてオピオイド受容体を介して扁桃体ドーパミンシグナル伝達異常を誘発し、不安神経症状につながったことが示唆された。
結果
セルロースリッチ食の長期摂取はマウスの不安様行動を増強した。
まず、セルロースリッチ食が行動、特に不安様行動に影響を与えるかどうかを調べた。氷を2群に分け、標準食（SD：不溶性食物繊維と水溶性食物繊維をともに2.8％含む）とセルロースリッチ食（CRD：セルロースを5％含む）のいずれかを与えた。そこで、オープンフィールド試験、高架式十字迷路試験、ビー玉埋没試験を用いて不安様行動を評価した（図1およびS1）。その結果、CRDを与えたマウスは、運動量に変化を認めず（図1C,D）、ビー玉埋没試験において不安様行動の増加を認めた（図S1）。一方、オープンフィールド試験および高架式十字迷路試験では、不安様行動に有意差は認められなかった（図S1）。さらに、代表的なストレスホルモンであるコルチコステロンの濃度は、16週間CRDを摂取した動物の尿中では上昇する傾向にあったが、低値であった（図1E,F）。これらの結果は、CRDの長期摂取がマウスの不安レベルを時間依存的に亢進させることを示している。
図1
図1. RD摂取マウスは不安レベルの上昇とコルチコステロンレベルの変化を示した。A,B) 実験の全体図。氷を2群に分け、標準食（SD）またはセルロースリッチ食（CRD）を与えた。行動検査は、給餌期間の2-4週目、6-8週目、16-18週目に、それぞれ1週間間隔で行った。動物の個体群はそれぞれ8週目と16週目に準備され、他の検査とサンプル採取に使用される。CRD に 16 週間曝露したマウスから、コルチコステロンを測定するため の臓器、糞便および尿を採取した。氷を3日間代謝ケージに収容し、3日目に糞便と尿を24時間採取した（パネルB参照）。C）CRD曝露により、ビー玉埋設試験で埋められたビー玉の数が一過性に増加した。D）ビー玉埋没の例は16週目に観察された。RD動物はSD群より多くのビー玉を埋めた。E,F）血清および尿中のコルチコステロン濃度。CRDは血清コルチコステロンを増加させる傾向があったが、尿中コルチコステロンは有意に減少した。データは、行動テストでは10-31匹/群、コルチコステロン測定では5-9匹/群の平均値±SEMで表した。統計学的有意性は、*p < 0.05で示した。
RDは腸管透過性の亢進と運動障害を含む腸内環境の悪化を引き起こす
慢性CRD暴露は不安を回復させず、むしろ悪化させたことから、慢性CRDは腸内環境も悪化させるという仮説を立てた。そこで、CRDがどのような腸内環境の変化を引き起こすかを検討した。CRDを与えた動物で最初に見られた腸内環境の変化の兆候は、盲腸pHの有意な上昇であった（図2B）。これは、CRD摂取によって著しく減少した腸内短鎖脂肪酸（SCFA）および乳酸含量をさらに測定することで説明できる（図2C,D）。これらの結果は、CRDの長期摂取が腸内でのSCFA産生の減少を引き起こし、腸内環境の悪化の特徴の一つである腸内pHの上昇につながる可能性を示唆している(11)。11)
図2
図2. RDの摂取は腸内環境の顕著な悪化を引き起こした。A) 実験の全体図。動物の個体群を準備し、それぞれ8週目と16週目にその他の試験とサンプル採取に使用した。B-D）盲腸内容物中のSCFAおよび乳酸の著しい減少（C,D）に起因すると考えられる盲腸pHの上昇（B）が、CRDを8週間または16週間摂取した動物で観察された。E) 摂取16週目にFITC-デキストランを経口投与して腸管透過性を試験した。血清FITC-デキストラン濃度はCRD動物で高く、慢性CRDが腸管バリアを破壊する可能性を示した。F,G）チャコールミール試験における腸管通過率（F）、排便回数（24時間中の糞便片数）および総便重量（G）は、CRD飼育動物における腸管運動障害を表す。H)大腸の長さはSD-CRD飼育動物間で差がなかった。aaは5-11匹/群の平均値±SEMで表した。統計的有意性は、*p < 0.05,**p< 0.01,***p< 0.005,****p< 0.001で示した。
腸管SCFAの役割として最も知られているのは、腸管バリアと運動性の維持である(20,21)。20,21)そこで、腸管の生理的変化に着目し、腸管透過性と運動性を評価した。FITC-デキストラン試験により、CRDの慢性摂取が腸管透過性亢進を誘導することが明らかになった（図2E）。また、RDの摂取は腸管運動障害を誘発し、体重と摂餌量に変化はないが、排便回数と便重量が減少した（図2F,G,S2）。しかし、慢性CRDは腸管バリア関連遺伝子の発現に有意な影響を与えなかった（図S3）。さらに、大腸短縮とサイトカイン発現により腸炎症の存在を確認した。その結果、大腸の長さ（図2H）およびサイトカインのmRNA発現（図S4）に有意差は認められなかった。重篤な分子差や炎症は観察されなかったが、これらの結果は、CRDが腸内環境の悪化、すなわち、腸内細菌叢の異常（SCFAの減少）、腸の運動異常、腸管バリアの破壊を誘発する可能性を示している。
RDはTRPA1のアップレギュレーションにより腸管知覚過敏を引き起こす
次に、CRDを投与したマウスの生化学的・生理学的変化の影響を調べるため、有害刺激に対する腸の反応性を評価した。その結果、アリルイソチオシアネート（AITC）およびカプサイシン（図3B）による侵害刺激に対して、CRD飼育マウスは明らかな知覚過敏を示した。さらに、CRD投与群では、腸管の一過性受容体ポテンシャルアンキリン1（TRPA1）（図3C）とナトリウムグルコース共輸送体1（SGLT1）の発現が上昇した（図3D）が、TRPバニロイド1（TRPV1）の発現には変化がなかった（図S5）。ITCはTRPA1の活性化因子であり、SGLT1はTRPA1およびTRPV1とともに迷走神経を発火させることが知られている(22)。22)したがって、CRDの摂取はTRPA1およびSGLT1の発現を上昇させ、有害刺激に対する反応性を亢進させ、その結果、腸管知覚過敏を引き起こし、さらに迷走神経を発火させる可能性が示唆された。
図3
図3. 慢性CRD曝露は、おそらくTRPA1の増加を介して腸管知覚過敏を誘発した。A,B) 摂食期間16週目に直腸投与したAITC（A）とカプサイシン（B）による腸刺激で過敏性を調べた。腹部を蹴ったり、下腹部を床に押し付けたりすることを疼痛関連行動スコアとした。RD投与動物は両試験で知覚過敏の増加を示した。C,D)TRPA1(C)およびSGLT1(D)のmRNA発現レベルは、CRD曝露8週後のマウスの腸組織ですでに増加していた。aaは5-11匹/群の平均値±SEMで表した。統計学的有意性は、*p < 0.05、**p < 0.01で示される。二元配置分散分析（Uncorrected Fisher's LSD、Sidakの多重比較検定、unpairedt検定、Mann-Whitney検定による）。
agalシグナルはCRD誘発不安を媒介する
慢性CRDが不安様症状と腸内環境の両方を悪化させることがわかった。従って、次の問題は、CRDが直接あるいは間接的に脳を調節して不安誘発効果をもたらすかどうかである。迷走神経を介した腸から脳への伝達が不安を調節することが示唆されていることから(23)、迷走神経切断術、すなわち肝迷走神経枝の切断を行った（図4A）。迷走神経切断によりCRD誘発不安が減少したことから、CRDは不安に関連する脳機能を直接調節するのではなく、おそらく腸-脳軸を介して間接的に調節していることが示された。その後、迷走神経切断動物はCRD誘発不安の徴候を示さず（図4B）、運動能力にも変化はなかった（図4C）。重要なことは、不安の改善を示した迷走神経切断CRDマウスは、盲腸pHの有意な上昇も示したことである。
図4
図4. 迷走神経切断によりRD誘発不安が抑制された。A) 迷走神経切断の全体的な実験スキーム。手術後、少なくとも4週間の回復時間をとった。henマウスに標準食（SD）またはセルロースリッチ食（CRD）をさらに8週間与え、行動テストを行い、犠牲にして組織を採取した。B,C)CRDによって誘発されたビー玉埋没テストにおける不安様行動は迷走神経切断によって抑制され（B）、運動活性には影響を及ぼさなかった（C）。データは7-8匹/群の平均値±SEMで表した。統計的有意性は、*p < 0.05、**p < 0.01で示した。
これらの結果は、迷走神経からなる腸脳軸がCRDによる不安様行動の増強に必須であることを示している。また、CRDの不安惹起作用は、脳に直接作用するのではなく、腸内環境の変化によって生じることも示された。
RD誘発性腸管過敏症は、オピオイド作動性システムを介して不安と扁桃体を増強する可能性がある。
最近の研究で、腸から脳への迷走神経伝達が脳の内因性オピオイド作動性システムを活性化することが示された(24,25)。24,25）また、有害刺激や慢性的な過敏症は、エンケファリンなどの内因性オピオイドの緊張性放出によってオピオイド作動性システムを活性化することも知られている。26)したがって、我々は、慢性CRDによって誘発される腸管過敏症もまた、オピオイド作動性システムの活性化を引き起こし、脳機能の改変につながる可能性があると仮定した。オピオイド受容体の寄与を明らかにするため、オピオイド受容体拮抗薬ナロキソンをマウスに注射し、オピオイドシグナル伝達の遮断がCRD誘発不安を抑制できるかどうかを調べた。予想通り、ナロキソンの注射はCRD誘発不安を抑制したが（図5B）、運動活性には影響を与えなかった（図5C）。これらの結果は、CRDの摂取が迷走神経の過剰な発火に対する腸の過敏性を誘発し、それがオピオイド作動性システムを活性化し、不安の増強につながる可能性を示唆している。
図5
図5. nオピオイド受容体拮抗薬はCRD誘発不安を抑制した。A）実験の全体図。B,C）不安様行動（B）および運動活性（C）に対するオピオイド受容体阻害の効果を、SDまたはCRDに16週間曝露した動物で評価した。不安様行動はビー玉埋没試験で測定した。運動活性は、ビー玉埋没試験の直後にオープンフィールド試験によって評価した。ナロキソン（1 mg kg-1）の投与はCRD誘発不安を抑制したが、運動活性には影響を与えなかった。データは5匹/群の平均値±SEMで表した。統計的有意性は、シダックの多重比較検定を用いた二元配置分散分析により、***p < 0.005で示した。
RDは扁桃体のドーパミン系を変化させるが、これは膣切開によって回復する。
CRDによって誘発される不安の根底にどのような分子メカニズムがあるのかを理解するために、不安の制御と発現に関与することが知られている様々な脳領域におけるモノアミンレベルを測定した。その結果、16週間のCRD曝露により、扁桃体のドーパミンレベルが有意に上昇した（図6B）が、他の脳領域や他のモノアミンでは有意差は認められなかった（図6AおよびS7A,B）。次に、扁桃体におけるドーパミン受容体とトランスポーターのmRNA発現量を測定した。興味深いことに、CRDを摂取したマウスはSDを摂取したマウスに比べて、摂取8週目にドーパミンD2受容体（D2R）のmRNA発現量が有意に低下した（図6C）が、16週目には有意差は認められなかった（図6D）。特に、迷走神経切断によりCRD誘発性のD2R発現低下が逆転したことから（図6E）、迷走神経シグナル伝達が扁桃体ドーパミン作動性システムの変化に関与していることが示唆された。しかしながら、迷走神経切断術はCRD誘発による扁桃体ドーパミン濃度の上昇には有意な影響を及ぼさなかった（図6F）。
図6
図6. 慢性CRDは扁桃体におけるドーパミンシグナル伝達を変化させた。A,B）扁桃体におけるドーパミン（DA）、ノルアドレナリン（NE）、およびセロトニン（5-HT）レベルをHPLCで測定し、摂食期間8週（A）および16週（B）のSD-およびCRD摂食マウス間で比較した。C,D）ドパミン受容体（D1RおよびD2R）およびドパミントランスポーター（DAT）の扁桃体mRNA発現量を、SDまたはCRD曝露後8週目（C）および16週目（D）に測定した。E）扁桃体ドーパミンレベルに膣切開は有意な影響を与えなかった。F）CRD動物における扁桃体D2R mRNA発現レベルの減少は、迷走神経切断によって回復した。aaは5-10匹/群の平均値±SEMで表した。統計学的有意性は、*p < 0.05、**p < 0.01で示され、一元配置分散分析（one-way ANOVA with Uncorrected Fisher's LSD）、ペアのないt検定、またはマン・ホイットニー検定による。
最近の研究では、神経炎症が情動変化に関与している可能性も示唆されていることから(27)、扁桃体の炎症にも注目した。炎症を評価するため、扁桃体における炎症性サイトカインと抗炎症性サイトカインのmRNA発現量を測定した。驚いたことに、扁桃体のTNF-αとIL-6のmRNA発現レベルは、CRD投与群で低下していた（図S8A）。骨髄のローサイトメトリー分析でも単球集団の減少が認められた（図S8B）。このことは、CRD曝露が骨髄での単球産生を減少させ、扁桃体内の炎症性サイトカインレベルを低下させたことを示唆しているのかもしれない。
考察
本研究では、CRDの長期摂取により、SCFAの減少、腸管過敏症、腸管透過性の亢進など、化学的および生理的な腸管変化が誘発された。また、慢性CRDは迷走神経を介してオピオイド作動系を調節し、扁桃体ドパミン作動性異常を伴う不安を誘発することも明らかにした。
CRDによって誘発される不安は、特にビー玉埋没試験で観察されたが、野外試験や高架式十字迷路試験では観察されなかった。CRDによる不安は、不安を評価するためのそれぞれの行動テストの根底にある神経細胞メカニズムによって説明できる。セロトニン再取り込み阻害剤の反復投与は、マウスのビー玉埋没行動を抑制することができるが(28)、オープンフィールド試験や高架式十字迷路試験における不安様行動には効果がない(29)。29）ビー玉埋没行動は強迫性障害（OCD）のモデルとも考えられている。しかし、CRDを摂取したマウスが強迫性障害様の行動を示したとは考えにくい。第一に、CRD摂取は強迫性障害の病因と考えられている海馬のセロトニンレベルに影響を与えなかった。第二に、ナロキソンは患者において強迫性障害の症状を悪化させることが報告されているが、CRD誘発性の不安を抑制した(30)。30)以上より、CRDによる行動修飾はビー玉を埋めるテストでのみ認められ、一般的な不安症状にもOCD症状にも当てはまらない。従って、このCRD誘発行動修飾がヒトの病的状況のどの特異的症状であるかを特定するためには、鉱石を用いた詳細な評価が必要である。
また、不安誘発性CRD投与マウスでは、血清コルチコステロン濃度が上昇する傾向が見られたが、尿中コルチゾール濃度は有意に低下した。血清と尿でコルチコステロンの反応が異なるのは、どのようなストレスが反映されているかによるものと考えられる。血清コルチコステロンは、採血時の急激なストレスなど、急性ストレスを反映することが多い(31)。31)一方、尿中コルチコステロンは慢性ストレスを反映する。慢性ストレスによってコルチゾールが繰り返し上昇すると、コルチゾールの枯渇や負のフィードバック系の過敏性といったコルチゾールの機能障害を引き起こすことが報告されている(32)。32）このようなHPA軸のネガティブフィードバックによるコルチゾールの減少は、腰痛症（33）や筋原性顔面痛などの慢性疼痛患者において報告されている。34)これらの所見から、慢性疼痛や過敏症はHPA軸のネガティブフィードバックを増強し、コルチコステロンの分泌を抑制する可能性がある。35)したがって、尿中コルチコステロン濃度の低下は、CRD飼育マウスにおいてHPA軸の機能不全を呼び起こすような腸管過敏症などの慢性ストレスの増加を示している可能性がある。また、コルチコステロンの分泌が腸の蠕動運動を亢進させることが示唆されていることから、コルチコステロンの減少がCRD誘発性の腸の運動障害を引き起こすことも予想される(36)。36)
CRDによって誘発される不安の分子モジュレーターとして、我々はCRD動物で観察される扁桃体におけるドーパミンシグナル伝達の変化を提案する。扁桃体は不安と恐怖の調節役として知られており、これはうつ病、不安障害、PTSDなどの過剰な不安症状を伴う精神疾患患者における扁桃体の過剰な活性化によって証明される。37)。注目すべきことに、扁桃体へのD1RおよびD2Rアゴニストまたはアンタゴニストのマイクロインジェクションは、それぞれ抗不安作用または抗不安作用をもたらす。38）さらに、慢性的なドーパミン作動薬曝露は、ドーパミン作動性ニューロンのD2Rレベルを低下させる。39）本研究では、CRD動物において、DA放出と扁桃体におけるD2R mRNA発現以外のモノアミンが変化しないことを見いだした。従って、CRD曝露による扁桃体ドーパミン作動性システムの変化が、不安様行動の増加の原因の一つである可能性があると考えられる。しかしながら、ドパミン作動性活性は食事介入8週目と16週目の間で一貫していなかったため、慢性CRD状態下での行動修飾に対する修飾された扁桃体ドパミン作動性シグナルの関与を明らかにするためには、より詳細な研究が必要である。
脳内モノアミンに加え、最近の研究では、脳内炎症も情動に関与している可能性が示唆された。扁桃体における炎症性サイトカインIL-6とTNF-αの増加は不安様行動の誘発と関連しており(27)、扁桃体TNF-αの抑制は不安様行動を改善する(40)。40）そこで、不安誘発性の慢性CRD曝露が脳内炎症を引き起こすかどうかを確認した。驚いたことに、CRDは扁桃体におけるIL-6とTNF-αのmRNA発現を減少させた。興味深いことに、CRDを投与したマウスでは、骨髄と脾臓のCD11b陽性単球集団が減少した。単球は血管を循環し、脳内でTNF-αを放出し、シナプスのターンオーバーに関与することが報告されている(41)。41)したがって、扁桃体TNF-αの減少は、長期CRD曝露による骨髄および脾臓の単球レベルの減少によるものと考えられる。さらに、慢性CRDによる行動修飾は脳の炎症によるものではないと結論した。
本研究により、腸内環境の悪化が神経細胞の変化とそれに続く不安の増強の主な原因であることが明らかになった。長期CRDはSCFA濃度の低下を誘発し、盲腸pHの上昇を引き起こし、腸内環境の悪化を反映した。また、RDの摂取は腸管透過性を増加させ、腸管運動と排便回数を減少させたことから、腸内環境の全体的な悪化が示唆された。SCFAは腸管でのセロトニン産生を促進し、正常な蠕動運動を維持することが知られている(42)。42）SCFAの一つである酪酸塩は腸管組織のChAT免疫反応性ニューロンを増加させ、コリン作動性神経支配による大腸収縮を増強する。21)。SCFAsはまた、タイトジャンクションを増強し、いくつかの精神疾患でしばしば失われる腸管バリアを維持する(20)。43）興味深いことに、迷走神経切断マウスでは、SCFAの減少や盲腸pHの上昇といった腸内環境の悪化にもかかわらず、不安や扁桃体ドーパミンの増加は認められなかった。この結果は、CRD自体が直接的な不安誘発作用を持つのではなく、迷走神経の活性化を通じて中枢神経系に影響を及ぼすことを示している。以上のことから、CRD曝露によるSCFAのダウンレギュレーションは、迷走神経を介した腸-脳軸を介して、腸透過性の亢進や運動障害など、腸に生理的な悪影響を及ぼし、精神医学に悪影響を及ぼす可能性がある。
もう一つの興味深い発見は、CRDを投与した動物はカプサイシンやAITCによる侵害刺激に対して腸管過敏症を示したことである。また、TRPA1という最もよく知られた疼痛関連カチオンチャネルが特に増加していることも判明し、CRD慢性暴露後の腸管過敏症の発現を説明することができた。一般に、TRPファミリータンパク質は、末梢神経の温度、pH、浸透圧、化学的刺激、機械的刺激に応答し、侵害受容器を活性化することにより、これらの刺激を中枢神経系に伝達する受容体である(44)。44)TRPA1は、AITCのような機械的刺激や化学的刺激に強く反応することが示されている。RPA1はまた、セロトニン分泌を介して迷走神経を活性化する腸クロム親和細胞（EC）にも特徴的に発現している(45)。45)。これらの知見は、CRDによるTRPA1の発現亢進が腸管過敏症を誘発し、過剰な迷走神経シグナルを呼び起こすことを示唆している。
興味深いことに、TRPV1の発現に変化がないにもかかわらず、CRD投与マウスではカプサイシン誘発性疼痛関連行動が亢進することも見いだされた。TRPA1はTRPV1と共発現し、互いにクロストークすることが知られているからである。例えば、マスタードオイルによるTRPA1の活性化はTRPV1を感作し、カプサイシン誘発TRPV1活性を増強する(46)。46）TRPV1/TRPA1二重陽性の感覚ニューロンは、グルタミン酸曝露によりカプサイシンによって誘導されるTRPV1を介する電流が劇的に増加する。47）さらに、TRPA1陽性後根神経節ニューロンのTRPV1介在電流の促進は、マウスの熱痛覚過敏を生じる。47)これらの結果から、CRD動物で観察されたように、TRPA1の発現を増加させることで、カプサイシンによって誘発されるTRPV1活性（知覚過敏を含む）が増強される可能性が示唆される。
TRPA1の発現が増加する理由として、以下の3つが考えられる。第一に、TRPA1の活性化がECにおけるセロトニン産生を促進し、それが蠕動運動を刺激することが示唆されている(45)。45)。CRD曝露により蠕動運動が低下したため、蠕動運動を正常な状態に戻すためにTRPA1の発現が上昇した可能性がある。次に、炎症がTRPA1の発現とTRPV1/TRPA1応答性ニューロンの数を増加させることが知られており(48)、炎症がTRPA1の発現と活性を制御していることが示唆された。また、CRD曝露により回腸IL-1βが増加したことから、わずかな炎症の亢進がTRPA1の増加の引き金となった可能性が示唆された。また、過去の研究において、Nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (NRF2)の活性化を介した活性酸素種のTRPA1発現上昇への寄与が示されており(49)、SCFAによってこの活性酸素種が減少する可能性がある(50)。50)したがって、CRD摂取によるSCFA濃度の低下は酸化ストレスを増加させ、NRF2活性化によるTRPA1発現のアップレギュレーションを引き起こす可能性がある。また、CRDの摂取は、H2O2処理したECで増加することが報告されているSGLT1も上昇させることから(51)、酸化ストレスの寄与が最も有力な説であると予想される。
TRPA1やSGLT1が迷走神経シグナルを刺激する可能性を示した(22,48)。迷走神経は孤束核に投射することが知られており、腹側被蓋野（VTA）や脊髄軌跡などの他の脳領域を介して間接的に扁桃体活動に影響を与えることが示唆されている(52)。52)最近の研究では、迷走神経シグナルはまずエンケファリンを介した内因性オピオイド作動系を活性化し(24,25)、次にVTAのドーパミンニューロンを活性化することが示されている(53)。本研究では、ナロキソンの急性投与により、CRD誘発不安様行動に対する内因性オピオイド系の寄与を確認することができた。内因性オピオイド系は、VTAのGABA作動性系の抑制を介して、間接的に扁桃体のドーパミン作動性活性化を促進する(54)。54）さらに、腸脳軸の一部として、NTSに投射される迷走神経求心性神経は、ノルアドレナリン作動性経路を介してVTAのドーパミン作動性ニューロンを活性化すると言われている。55)そこで、我々は次のような仮説的スキームを提案する： すなわち、RDによるTRPA1の発現亢進は、まず迷走神経を介して脳への侵害刺激の伝達を亢進させ、これが内因性オピオイド系を活性化し、さらにVTAのドーパミン作動性ニューロンを活性化させ、CRD群では扁桃体でのドーパミン放出を亢進させるという仮説である（図7）。しかし、CRD投与マウスでは側坐核（VTAからのドーパミンニューロンの主要な投射領域）のドーパミンレベルは増加しなかったので（図S7C）、なぜ「特異的に」扁桃体がドーパミンを増加させるのか、我々の結果はまだ説明できない。このようなドーパミン作動性シグナル伝達の特異的制御（おそらくCRDによる）を明らかにすることが今後の展望である。
図7
図7. CRD誘発性不安の考えられるメカニズム。セルロースを多く含む食品（CRD）を慢性的に摂取すると、腸内のSCFAが減少する。tは、運動性の低下、腸透過性の亢進、TRPA1やSGLT1のアップレギュレーションといった腸障害を引き起こした。これらの生理学的変化は腸の過敏性をもたらし、おそらく迷走神経伝達を過剰に刺激したのであろう。腸からの迷走神経伝達は孤束核（NTS）に投射され、内因性オピオイド作動性システムを活性化する(25)。25)オピオイド作動性システムの活性化は、腹側被蓋野（VTA）のGABA作動性ニューロンを抑制し、扁桃体（Amyg）のドーパミンレベルを上昇させる可能性がある。図はBioRender.comで作成した。
また、腸内細菌叢が今回の所見に寄与している可能性も否定できない。過去の研究で、AIN-93Gの慢性摂取がマウスの腸内細菌叢を変化させることが示されている(56)。56)このように、AIN-93Gはマウスの主要属であるAllobaculumの存在を増加させた（43.4％）。(1)AIN-93Gはマイクロバイオームの多様性を著しく喪失させること、(2)AIN-93Gは高齢マウスの特徴として頻繁に観察される特定の微生物叢Allobaculumを増加させること、である。CRD（AIN-93M）はAIN-93Gと同様の組成を有することから、我々のモデルは腸内細菌叢に同様の変化を示し、腸脳軸に影響を与えて情動を修飾する可能性がある。また、CRDが誘発する不安には、他の分子メカニズムや経路が存在する可能性もあり、さらなる詳細な検討が必要である。
要約すると、われわれの新規知見は、CRDの摂取が（1）腸内環境の悪化と過敏症を引き起こし、それが（2）迷走神経を介するオピオイド作動性システムの過剰活性化につながり、おそらく（3）不安の増強と扁桃体ドーパミン作動性異常をもたらすことを示唆している。食物繊維の摂取が、代謝異常、心血管疾患、大腸がんなどのさまざまな疾患のリスクを低下させ、健康に有益であることを支持する最近の証拠は多数ある。56)MFとAIN-93 Mでは各栄養素の割合が異なるが（表1、2、3）、食物繊維が腸に最も大きな影響を与えることは間違いない。17)本研究は、食物繊維の中でも特に不溶性食物繊維が腸内環境を悪化させ、感情的な問題を引き起こす可能性があることを初めて示した。本研究は、食事が精神疾患の発症リスクに影響することを確認するものであり、特定の食品・栄養に不安誘発作用や抗不安作用があるかどうかなどを明らかにするために、食事をさらに詳細に検討することの重要性を示唆するものである。
1. 食事の栄養組成（%）a
栄養素 MF（標準食） AIN-93 M（セルロースリッチ食）
ロテイン粗タンパク質 [g] 23.2 カゼイン [g] 14.0000
-システイン [g] 0.1800
炭水化物 粗糖質 [g] 54.7 コーンスターチ [g] 46.5692
-コーンスターチ [g] 15.5000
ウクロース [g] 10.0000
粗脂肪 [g] 4.9 大豆油 [g] 4.0000
食物繊維 粗食物繊維 [g] 3.3 セルロース [g] 5.0000
テル可変繊維 [g] 0
ミネラル粗灰分 [g] 5.9 AIN93ミネラルミックス [g] 3.5000
ビタミン AIN93 ビタミンミックス [g] 1.0000
酒精水 [g] 8.1 酒石酸コリン [g] 0.2500
-ブチルヒドロキノン [g] 0.0008
オリエンタル酵母工業株式会社、株式会社クレアジャパンのホームページを参考に作成（MF：https://www.oyc.co.jp/bio/LAD-equipment/LAD/ingredient.html、AIN-93M：https://www.clea-japan.com/company/outline.html）。詳しい組成は表2に記載。* 詳細な組成は表3に記載。
表2. MFの詳細栄養成分（100g中の含有量）a
ミネラル ビタミン アミノ酸
カルシウム [g] 1.04 ビタミンA* [IU] 1638 イソロイシン [g] 0.92
リン [g] 0.81 ビタミンD3 [IU] 111 ロイシン [g] 1.77
アグネシウム [g] 0.24 ビタミンE [mg] 8.9 リジン [g] 1.27
アトリウム [g] 0.21 ビタミンK3** [mg] 0.04 メチオニン [g] 0.43
アリウム [g] 0.99 ビタミンB1 [mg] 1.92 シスチン [g] 0.36
ロン [mg] 11.1 ビタミンB2 [mg] 1.01 フェニルアラニン [g] 1.06
オッパー [mg] 0.74 ビタミンC [mg] 5 チロシン [g] 0.74
inc [mg] 5 ビタミンB6 [mg] 0.87 スレオニン [g] 0.89
アンガネース [mg] 5.2 ビタミンB12 [μg] 4.6 トリプトファン [g] 0.3
ノシトール [mg] 467.3 バリン [g] 1.11
イオチン[μg] 30.1 アルギニン[g] 1.47
アントテン酸[mg] 2.14 ヒスチジン[g] 0.62
アラニン[g] 1.19
ホリン [g] 0.18 アスパラギン酸 [g] 2.12
オレイン酸 [mg] 0.16 グルタミン酸 [g] 3.94
リシン [g] 1.15
ロリン [g] 1.28
エリン [g] 1.1
オリエンタル酵母工業株式会社ホームページ（https://www.oyc.co.jp/bio/LAD-equipment/LAD/ingredient.html）を参考に作成。
できる 3. AIN-93Mの詳細栄養成分 [%]a
IN93ミネラルミックス AIN93ビタミンミックス
aCO335 .7000 ショ糖 97.3474
ウクロース 20.9782 ビタミンE（50%） 1.5000
H2PO425 .0000 ニコチン酸 0.3000
aCl 7.4000 D-パントテン酸Ca 0.1600
3C6H507-H2O4.6600 D-ビオチン(100%) 0.0020
2SO42 .8000 ビタミンB2 (98%以上) 0.0600
gO 2.4000 ビタミンB6 0.0700
eC6H5O7-XH2O0.6060 ビタミンB1 0.0600
nCO30 .1650 ビタミンA (325,000 IU/g) 0.1231
a2SiO3-9H2O0.1450 ビタミンD3 (100,000 IU/g) 0.1000
nCO30 .0630 葉酸 0.0200
uCO3Cu (OH)2 0 .0324 ビタミンB12 (0.1%) 0.2500
rK (SO4)2-12H2O0.0275 ビタミンK1 0.0075
3BO30 .0082
aF 0.0064
iCO3-2Ni(OH)2-4H2O0.0032
iCl 0.0017
a2SeO40 .0010
IO30 .0010
NH4)6Mo7O24-4H2O0.0008
aVO30 .0007
CLEA Japan, Inc.のウェブサイト（https://www.clea-japan.com/company/outline.html）を参考に作成した。
方法と材料
動物
実験開始時 8 週齢の ICR マウス（東京実験動物）を用いた。ICRマウスは、22±2℃、湿度60±5％、12時間照明（100-150 lx）の部屋で飼育した： 2時間の暗黒サイクル（8:00～20:00に点灯）。行動観察時以外は、飼料と水を自由に摂取できるようにした。合計2つのコホートを用意した： F（オリエンタル酵母工業株式会社、東京、日本）-標準食（SD）群およびAIN-93 M（日本クレア株式会社、東京、日本）-セルロースリッチフード（CRD）群。AIN-93 Mは食物繊維としてセルロースを5％しか含まないのに対し、MFは水溶性・不溶性ともに粗繊維を3.3％含むことから、eはAIN-93 Mを「高セルロース食」と定義した。なお、SDとCRDの総カロリーは同じ（3.58kcal/g）である。上表1-3はその詳細な組成を示している。食事介入の期間は最長18週間で、8週目と16週目に主要な行動試験と解剖を行った。実験は早稲田大学理工学術院動物実験委員会の許可（許可番号A23-093）を得て、日本政府の法律（第105号）および通知（第6号）に従って行った。
敷物
ほとんどの試薬および薬剤は富士フイルム和光純薬（大阪）から、抗体はBeckton Dickinson（米国ニュージャージー州）から購入した。
行動試験
不安を評価する行動試験（大理石埋没試験、野外試験、高架式十字迷路）および腸管過敏症（AITCまたはカプサイシン誘発過敏症）を行った。各試験は摂食期間の2～4週目、6～8週目、16～18週目に、それぞれ1週間の間隔をあけて行った。ll実験は、時間帯による行動の変化を避けるため、17:00～20:00に実施し、データはソフトウェアによる自動データ収集またはブラインド方式による個々の観察者により評価した。
大理石埋没試験
大理石埋没試験は、先行研究(57)に若干の修正を加え、摂食期間の4週目、8週目、16週目に実施した。直径1.5cmのさまざまな色のビー玉20個を4×5の格子状に並べたケージ（24×37×17cm）にマウスを入れ、それぞれ5cmの白色針葉樹布団の上に置き、15分間放置した。大理石の高さの3分の2以上が敷材で覆われているものを埋没大理石とした。各試験ケージについて、一定の角度と距離でデジタル写真を撮影し、独立した観察者が埋もれた大理石を数えた。
ペンフィールド試験
摂食開始2週目、6週目、17週目にペンフィールドテストを行った。マウスをケージ（24×37×17cm）の隅に置き、5分間自由に行動させた。その活動軌跡をビデオカメラで記録し、ビデオ追跡ソフトANY-maze（Stoelting社、米国）を用いて解析した。中心ゾーンへの進入回数、中心ゾーン滞在時間、移動距離を測定し、評価した。
高架式十字迷路試験
高架式十字迷路試験は、摂食期間の3週目、7週目、18週目に実施した。高架式十字迷路は29×7cmの開口アーム2本、29×7cmの閉塞アーム2本、7cm四方の中央ゾーンから構成された。マウスをその中心に置き、5分間自由に行動させた。活動軌跡はビデオカメラで記録し、ビデオトラッキングソフトウェアANY-maze（Stoelting社、米国）を用いて解析した。開閉腕での滞在時間、開閉腕での移動距離、開閉腕への進入回数を測定し、評価した。
ITC誘発過敏症
イソチオシアン酸リル（AITC）誘発過敏症は、以前に記載された方法を用いて評価した(58)。58)マウスを15cm×10cm×8cmの観察ケージで20分間馴化させた。ITC（ナタネ油中2％vol-1；ナカライテスク株式会社、京都、日本）を直腸内に0.05mL投与し、その後15分間行動を観察した。腹部を舐める、腹部を伸ばす、下腹部を床に押しつける、無動などの行動を観察した。行動は5秒間隔で評価され、点数は以下のように計算された： 痛みに関連した行動が5秒のうち3回以上あった場合は1点、5秒のうち3回未満であった場合は1点、5秒の間に一度もその行動を行わなかった場合は0点とした。
カプサイシン誘発過敏症
カプサイシン誘発過敏症は以前に記載された方法を用いて評価した(59)。59)マウスを15cm×10cm×8cmの観察ケージで20分間馴化させた。アプサイシン（0.1wt%vol-1、4%Tween80/0.9%生理食塩水）を0.1mL直腸内投与し、15分間行動を観察した。AITC誘発過敏症試験と同様にして、AITCに関連する行動を評価した。
アロキソン投与
アロキソン（1mg kg-1）を生理食塩水に溶解し、ビー玉埋没試験の20分前にマウスにi.p.注射した。試験は、4日間の回復期間を設けたクロスオーバー試験として実施した。運動活性に対するナロキソン投与の影響は、ビー玉埋没試験直後の野外試験によって評価した。
組織採取
組織採取は、最終的なビー玉埋設試験の3～5日後に行った。簡単には、マウスを急速断頭により安楽死させ、脳、脾臓、骨、全腸（幽門から直腸の間）を氷上で素早く採取した。脳は、モノアミン測定とRT-PCRに使用するため、前頭前皮質（PFC）、扁桃体、線条体、側坐核、海馬に分離した。胸膜と骨はフローサイトメトリー用に処理した。腸は盲腸、空腸、回腸、結腸に分離し、短鎖脂肪酸測定とRT-PCRに使用した。
レインモノアミンレベル測定
雨モノアミンレベルは、以前に報告されたように、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）により測定した(60)。60)試料はまず0.2M過塩素酸溶液（100M EDTA-2Na含有）に内部標準物質としてイソプロテレノール（Sigma-Aldrich, USA）を加えて処理した後、超音波ホモジナイズし、15,000rpmで10分間遠心分離してモノアミンを含む上清を回収した。試料と標準物質を0.45μmのフィルター（EMD Millipore, USA）で精製し、電気化学検出器（HTEC-510, Eicom Co.） 検体のオノアミ ン濃度は、標準物質の測定結果に基づいて測定した。移動相は0.1 M酢酸-クエン酸緩衝液（5 mgL-1EDTA-2 Na、190 mgL-11-オクタンスルホン酸ナトリウム塩、15%メタノールを含む）を用いた。流速は500μL min-1、カラム温度は25℃、電圧はAg/AgClそれぞれ+750mVであった。データ解析にはPC-300ソフトウェア（バージョン2.5.10、Eicom）を使用した。
NA抽出
RNAの発現量は、以前の研究に記載されたプロトコルを用いて、リアルタイムRT-PCRにより測定した(40)。40)脳組織は、500 μLのTrizol（Ambion、米国）を含むチューブに直接集め、Tissuelyser II（Qiagen、ドイツ）を用いてホモジナイズした。その後500μLのクロロホルムを加え、15,000rpmで10分間遠心して上清を回収した。上清の3分の1量のCIA溶液（クロロホルム：イソアミルアルコール＝49：1）を加え、11,500rpmで10分間遠心した。上清を別のチューブに移し、100μLの3M酢酸ナトリウムと100μLのイソプロパノールを加え、室温で20分間インキュベートした。サンプルを11,500rpmで20分間遠心し、80％エタノールでペレットを洗浄した後、DEPC（日本遺伝子株式会社、東京、日本）20μLに溶解し、リアルタイムRT-PCRを行った。
リアルタイムRT-PCR
分光光度計（NanoDrop, Thermo Fisher Scientific, USA）を用いて、RNA濃度が50 mg/mLになるようにRNAサンプルをDEPCで希釈した。調整したサンプルは、One Step SYBR RT-PCR Kit（株式会社タカラ、東京、日本）とPIKO REAL 96 Real-Time PCR System（Thermo Fisher Scientific、米国）を用いてリアルタイムRT-PCRを行った。各遺伝子の増幅に用いたプライマー配列とRT-PCRの設定を補足表S1-2に示す。各標的遺伝子の相対発現を18s rRNAの相対発現で正規化し、ΔΔCt法で解析した。
agotomy
agotomyは以前の研究に若干の変更を加えて行った。61)膣切開は三段階複合麻酔（塩酸メデトミジン（ドミトール、ゼノアック、日本）、酒石酸ブトルファノール（ベトルファール、明治、日本）、ミダゾラム（サンド株式会社、日本））で行った。腹側正中線を切開し、腹筋壁を2回目の切開で開いた。胃靭帯を細い鉗子で切断し、胃を静かに後退させると、下行性腹側食道と腹側横隔膜下迷走神経幹が現れた。この迷走神経の肝枝を細い鉗子で切断した。Sham群は迷走神経幹の切断以外は同じ手順で行った。迷走神経切断の成功は、CCK-8（8μgkg-1、i.p.）に対する反応によって確認した。CCK-8を投与した対照群の平均より摂餌量が少なかった氷は偽迷走神経切開とみなし、実験群から除外した。CCK試験の結果を図S9および表S4-5に示す。
糞便pHおよび短鎖脂肪酸（SCFA）測定
または盲腸pH測定は、解剖した盲腸にpHメーター（Euthech Instruments, USA）のプローブを直接挿入し、値の変動が止まるまで待った。その後、盲腸内容物を氷上で速やかに回収し、モデル 7890B または 5977B（AgilentTechnologies, Inc. 盲腸内容物約50mgに硫酸0μL、クロロホルム200μL、ジエチルエーテルを加えた。その後、100μLのトリメチルシリル化試薬（TMSI-H; GL Science Inc. その後、試料を60℃で30分間、氷上で10分間インキュベートした。tを室温で14,000rpm、30秒間遠心分離し、その上清1μLをGC-MSにかけた。酢酸、プロピオン酸、乳酸、酪酸を含む標準混合物も試料と同様に操作した後、GC-MSに供して検量線を作成した。キャピラリーカラムはInertCap Pure-WAX（30m×0.25mm、df=0.5μm）（GLサイエンス社製）を使用し、測定時のキャリアガスにはヘリウムガスを用い、初期温度80℃から最終温度200℃まで昇温した。
チャコールミール試験
チャコールミールテストは、先行研究を若干改変して実施した(59)。59)試験の約16時間前にマウスを絶食させた。朱墨を10 mL/kg体重で経口投与した。投与10分後に氷を犠牲にし、十二指腸と小腸（幽門と結腸の間）を摘出し、直ちにアルミニウム板上に広げた。通過率は、インクの輸送距離を腸管の全長で除して求めた。
腸管透過性試験
腸管透過性試験は、以前の研究に若干の変更を加えて実施した。59)FITC-デキストラン（MW 4000）溶液（50 mg/mL；Merck KGaA, Darmstadt, Germany）200μLをマウスに経口投与した。イソフルラン麻酔下で眼窩神経叢からサンプルを採取し、室温で1時間インキュベートした後、3000rpmで20分間遠心分離し、上清を回収した。上清を回収し、Milli-Q水で5倍希釈後、BioTek Synergy H1（アジレント・テクノロジー株式会社、東京）を用いて血漿中FITC濃度を蛍光強度として測定した。
食餌および採尿
氷を代謝ケージ（株式会社夏目製作所、東京、日本）に3日間収容し、3日目に糞便と尿を24時間採取した。尿サンプルは1000 gで遠心分離し、上清はコルチコステロン濃度の測定に使用するまで-80℃で保存した。排便回数は3日目の24時間中の糞便片の数とし、糞便量はその時点で測定した。
オルティコステロンELISA
ELISAキット（株式会社フナコシ、東京、日本）を用いて、尿中および血清中のコルチコステロン濃度を測定した。オルチコステロンの測定は、ELISAキットに記載されている説明書に従って行った。簡単に説明すると、尿サンプルは上記のように代謝ケージを用いて採取し、緩衝液で20倍に希釈した。erumサンプルは、イソフルラン麻酔下で眼窩神経叢から採取し、室温で1時間インキュベートした後、3000rpmで20分間遠心分離し、上清を使用するまで-80℃で保存した。血漿サンプルを緩衝液で100倍に希釈し、キットの説明書に従って処理した。コルチコステロン濃度は、BioTek Synergy H1（アジレント・テクノロジー株式会社、東京、日本）を用いて吸光度として測定した。
ローサイトメトリー
フローサイトメトリーには、胸膜と骨髄を用いた。採取したばかりの脾臓と骨髄から、以下の手順で細胞懸濁液を調製した： まず、脾臓をプランジャーで潰し、0.5mLの1xACK緩衝液とともに70μmフィルターに通す。mLのFACSバッファーで大腿骨と脛骨から骨髄を洗い流す。細胞懸濁液を1xACK緩衝液で溶血した後、1500rpmで10分間遠心し、上清を捨てた。細胞懸濁液を再度洗浄し、抗マウスCD16/32（Bio X Cell, NH, USA）を用いてさらに非特異的Fc結合を行った後、細胞表面マーカーを以下の抗体で染色した（補足表3）：抗マウスCD19-BV510（GK1． ）、CD5-BV421（53-6.7）、NK1.1-APC（PK136）、CD11b-PerCP-Cy5.5（M1/70）、Ly6C-FITC（AL-21）、Ly6G-eF450（1A8、Thermo Fisher Scientific）、I-A/I-E-APC-Cy7（M5/114.15.2、Biolegend）。ローサイトメトリーはCytoFLEX S（Beckman Coulter）で行い、CytExpertソフトウェア（Beckman Coulter）を用いて解析した。ゲーティング戦略を図S3Cに示す。細胞集団のみが、選択され解析された実験コホート間で有意差を示した。
統計解析
llのデータは、GraphPad Prism version 10.2.0（GraphPad Software, USA）を用いて解析した。まず、D'Agostino-Pearson検定/Kolmogorov-Smirnov検定を用いてデータが正規分布に従うかどうかを確認し、F値検定/Bartlett検定を用いてデータが等分散であるかどうかを確認した。独立した2群間の有意性は、対応のないt検定によるパラメトリック解析、またはノンパラメトリック解析のMann-Whitney検定で評価した。独立した3群間の有意性は、一元配置分散分析（One-way ANOVA with uncorrected Fisher's LSD）、または一元配置分散分析（One-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test）を用いたパラメトリック分析により評価した。パラメトリック分析 異常分布データには、ダン多重比較検定を伴うクラスカル・ワリス検定を用いた。2因子のデータには、非補正フィッシャーLSDを用いた一元配置分散分析、またはシダックの多重比較検定を用いた。
補足情報
Supporting Informationはhttps://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsptsci.4c00270。
オープンファイル試験および高架式十字迷路試験における不安様行動、海馬、前頭前皮質、側坐核および線条体におけるモノアミンレベル、骨髄および脾臓細胞における単球集団、迷走神経切断マウスにおける盲腸pHおよびSCFA濃度、腸組織におけるタイトジャンクション、サイトカインおよびTRPV1遺伝子のmRNA発現、RT-PCR用プライマー配列、RT-PCR設定、フローサイトメトリーで使用した抗体（DOCX）
セルロースリッチ食は腸のホメオスタシスを破壊し、腸脳軸を介して不安をもたらす
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著者情報
責任著者
野崎英弘-早稲田大学先進理工学部（〒162-0056 東京都千代田区）;早稲田大学理工学グローバルセンター（〒162-0056 東京都千代田区）;https://orcid.org/0000-0002-0906-0670; Email:chihiron@aoni.waseda.jp
著者
伊藤 楓-早稲田大学先進理工学部、東京, 162-0056, 日本
細木ある香-早稲田大学先進理工学部、東京, 162-0056, 日本
笠井 宇也-早稲田大学先進理工学部、東京162-0056、日本
佐々木裕之-早稲田大学先進理工学部、東京162-0056、日本
原口 孜-早稲田大学先進理工学部、東京 162-0056, 日本
柴田英信-早稲田大学先進理工学部（日本、〒162-0056）、広島大学大学院医歯薬学総合研究科（日本、〒734-8553
著者貢献K.I.、C.N.、A.H.は、S.S.の協力のもと、本研究の構想および設計に貢献した。K.I.は主に、腸管透過性試験、フローサイトメトリーおよびその解析にH.H.、炭ミールにY.K.、GC-MSおよびHPLCにH.S.、迷走神経切開および行動試験にA.H.の協力を得て実験を行った。.I.、A.H.、C.N.、Y.K.はマウスの解剖とサンプリングを行った。.I.はC.N.とS.S.の協力を得て原稿を作成した。著者全員が原稿の修正に貢献し、提出された原稿を読み承認した。
ote著者らは、競合する金銭的利害はないことを宣言する。
謝辞
東京理科大学の山田大輔博士と吉岡俊則博士の技術的な支援と議論に感謝する。Sは、日本学術振興会科学研究費補助金（A, 19H01089）、JST-みらいプログラム（JMPJM120D5）の助成を受けた。Nは日本学術振興会の帰国外国人特別研究員育成研究（19K24693）の支援を受けた。Hは、日本学術振興会の科学研究費補助金若手研究（19K14018）の支援を受けた。
参考文献
本論文は62の文献を参照している。
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