マウスのうつ病様行動の促進には、腸内細菌叢の変化に迷走神経の完全性が必要である

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公開日：2023年05月02日
マウスのうつ病様行動の促進には、腸内細菌叢の変化に迷走神経の完全性が必要である

https://www.nature.com/articles/s41380-023-02071-6

Gut microbiota changes require vagus nerve integrity to promote depressive-like behaviors in mice - Molecular Psychiatry

エレニ・シオピ
マチュー・ガレルネ
...
ピエール＝マリー・ルルド
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分子精神医学 (2023)この記事を引用する
1 Altmetric（アルトメトリック
メトリックス詳細
アブストラクト
慢性的なストレスはうつ病の主要な危険因子であり、腸内細菌叢（GM）を含むホメオスタシスの様々な側面を破壊する可能性があります。我々は最近、GMのアンバランスが成体海馬（HPC）の神経新生に影響を与え、うつ病様行動を誘発することを明らかにしましたが、その正確なメカニズムについては、現在、活発に研究されています。そこで我々は、腸と脳をつなぐ重要な双方向通信経路である迷走神経（VN）が、ストレスによるGMの変化が海馬の可塑性と行動に及ぼす影響を中継する可能性があると考え、この仮説を立てた。我々は、予測不可能な慢性マイルドストレス（UCMS）を持続したマウス由来の糞便サンプルを用いて、健康なマウスに接種し、不安行動やうつ様行動に関する標準的な行動読み取りの評価、成体HPC神経新生に関する組織学的および分子解析を行い、神経伝達経路や神経炎症を評価しました。GMの変化が脳機能と行動に及ぼす影響を媒介するVNの潜在的役割を調べるため、GM移植前に横隔膜下迷走神経切断術（Vx）を受けたマウスを使用しました。その結果、健康なマウスにUCMSマウスのGMを接種すると、VNが活性化し、脳幹とHPCのセロトニンとドーパミンの神経伝達経路に早期かつ持続的な変化を引き起こすことがわかった。これらの変化は、成体HPCの神経新生における迅速かつ持続的な障害と関連し、HPCにおける早期かつ持続的な神経炎症反応を誘発する。Vxは、成体HPCの神経新生障害、神経炎症、うつ病様行動を消失させることから、GMを介した脳への作用には迷走神経求心性経路が必要であることが示唆された。
はじめに
腸内細菌叢（GM）が海馬（HPC）の可塑性に影響を与え、情動行動に影響を与えるというデータが続々と発表されていますが、その正確な基礎メカニズムはまだ十分に解明されていません [1,2,3,4]。迷走神経（VN）の消化管枝は、腸と脳の間の直接的な双方向通信経路を構成しており、末梢状態の変化に関連する神経メッセージを脳に伝えるのに適している [5,6,7,8,9,10,11]。例えば、いくつかの腸内細菌株が不安様行動を誘発し、HPCにおける脳由来神経栄養因子（BDNF）とGABA受容体サブユニットの発現を変化させる能力は、迷走神経求心性に依存しています[7,8,9]。同様に、腸迷走神経のシグナル伝達は、HPCの可塑性と成人の神経新生に影響を与えます [10, 11]。一方では、HPC神経新生の障害はうつ病状態と関連しており、他方では、fluoxetineや身体運動などの神経原性刺激がHPC神経新生を促進し、うつ病に対抗する [12,13,14,15,16].
慢性的なストレスは、うつ病発症の主要な危険因子である。このストレスは、マウスとヒトの両方で腸内細菌叢の変化とHPCの障害を誘発し、その原因はある程度、成体HPC神経新生の障害にある [3, 4, 17, 18, 19, 20, 21, 22]. 我々は最近、トリプトファン代謝と脳内セロトニン利用能を阻害することにより、慢性ストレスに関連したGM障害が、マウスのうつ病状態および成体HPC神経新生障害の発症の原因因子であることを証明した[3]。興味深いことに、VN求心性神経は、脳内のセロトニン生物学的利用能に不可欠な脳幹核、すなわち、HPCを含む脳全体にセロトニン作動性の神経を提供し、HPCの神経可塑性を制御するセロトニン作動性背側ラペ核を神経支配します [23,24,25]. 重要なことに、VN刺激によりHPCニューロンへのセロトニン作動性入力が増加し、ラットの情動行動に影響を与えることが報告されている[26]。これらのことから、GMがVNを利用して脳内の主要な神経伝達経路を制御し、HPCの神経可塑性と行動に影響を与えているのではないかという疑問が生じます。
この疑問を解決するため、我々は、うつ病様行動を誘発する予測不可能な慢性軽度ストレス（UCMS）モデルを採用し、成体HPCの神経新生に影響を与え、うつ病様行動を促進するためには、それに伴うGM障害にVNが無傷である必要があるかどうかを検討しました。
材料と方法
動物たち
実験は、Janvier labs (St Berthevin, France)から購入した成体（8-10週齢）の雄C57BL/6jマウスを用いて実施した。彼らは5匹のグループに収容され、齧歯類の実験的研究のために正式に登録されたパスツール研究所動物飼育施設（動物飼育施設の承認番号：A 75-15-01-6 2014-720）において、標準条件（室温および湿度の制御、12時間/12時間明暗サイクル、午前8時に点灯、乾燥フードペレットおよび水への自由なアクセス）で維持した。すべての研究は、フランスの法律（2013年2月1日の法令、2013-118）および2010年9月22日の欧州共同体理事会指令（2010/63/EEC）を遵守して実施されました。すべての動物実験は、3Rのルールに従って設計され、フランス研究省の承認を得た（プロジェクトCETEA #2013 -0062, #2016 -0023）。サンプルサイズは、自由にダウンロードできるG powerソフトウェアを使用して、3Rの原則を尊重しつつ、適切な統計的検出力を確保するように選択しました。行動解析は1グループあたり10人、細胞解析は1グループあたり6～8人、分子解析は1グループあたり5人の被験者を対象としました。
予測不能な慢性マイルドストレス（UCMS）手順
マウスは、既報[3, 4, 27, 28]の通り、毎日ランダムに投与される予測不可能な軽度ストレス因子に8週間にわたり慢性的に曝露された。ストレッサーは毎日2種類、朝と夕方に投与し、いずれのストレッサーも餌や水の欠乏は行わなかった。異なるストレス要因としては、ケージ揺らし（5分）、ケージ傾斜45℃（2時間）、湿潤寝具（2時間）、夜間照明（12時間）、昼夜逆転（24時間）、拘束（30分）、ケージ交換（2時間）、捕食者臭（ラットまたはキツネ尿）への曝露があった。行動実験は、UCMSプロトコルの8週目から1週間かけて実施した。9週目にマウスを安楽死させ、カウンターバランスデザインを用いて組織学的解析または分子解析にランダムに割り付けた（補足表1参照）。対照動物は社会的に収容され（5匹/ケージ）、日常的な清掃を含む必要な処置以外は邪魔されないようにされた。
治療方法
抗生物質（ABX）化合物は、1週間の間、飲料水中に適用され、以前に記載されたように、アンピシリン（1 mg/ml）、ストレプトマイシン（5 mg/ml）、コリスチン（1 mg/ml）、バンコマイシン（0.5 mg/ml）およびアンホテリシン（0.1 mg/ml）の混合物で構成されていました［3］。全体として、便の一貫性/形状、粘液や血液の存在、下痢による毛染めにおいて、ABXに誘発される有意な変化を目撃することはなかった。微生物叢移植の1日前に、ABX処理を中止し、滅菌水に置き換えた。移植プロトコルに使用した糞便サンプルは、接種の当日にドナーマウス（CTまたはUCMS）から採取した。糞便懸濁液は、1mgの糞便を5mlの滅菌PBSに溶解することにより製造した。糞便懸濁液（マウス1匹あたり300μl）は、ABX中止の1日後および4日後に経口ガベージにより送達した。
横隔膜下迷走神経切断術
横隔膜下迷走神経切断術は、以前に記載したように行った [7, 11]. マウスはケタミン/キシラジン（10 mg/g BW, Sanofi）で麻酔した。皮膚と腹壁を中側で切開し、胃と食道下部を静かに露出させ、腸を後退させ胃にアクセスできるようにした。胃への入口で食道に結紮器をかけ、緩やかに後退させ、両迷走神経幹を明確に露出させた。これらを剥離し、横隔膜より下の食道を囲むすべての神経および結合組織を除去し、すべての小迷走神経枝を切断した。行動実験が行われる前に2週間の回復期間を設けた。
実験セット
本研究では、合計280匹のマウスが使用され、6つの別々の実験セットで割り当てられた。ここに示したデータはすべて、宿主の研究室で少なくとも2回再現されており、一部の結果（例えば、微生物接種が行動と神経新生に与える影響）は4回まで再現された。遅れてきた時点（接種後3週間と7週間）で安楽死させたすべての被験者を行動解析に供し、その後、単純な無作為化によって細胞解析または分子解析に割り付けた。後者は、Microsoft Excelの関数RANDを用いて被験者と治療法のリストを作成することで行われた。解析は、実験条件について盲検化された研究者によって行われ、数値コード化が用いられた。サンプルサイズは、G Powerソフトウェアを用いたパワー分析によって決定された。行動解析には1群につき少なくとも10匹、分子・細胞解析には1群につき5～8個のサンプルを組み込んだ。本研究で使用したすべての実験セットの詳細な模式図は、補足表1に記載されている。
行動学的評価
すべての行動試験において、マウスは試験の少なくとも1時間前に試験室に移された。GMドナーマウスは、動物がUCMSの最終週を持続している間、1週間にわたって試験された。GMレシピエントマウスは、アイソレーターから出た時点でテストを行った。すべての分析は、実験者が実験条件を知らない状態で行われた。
オープンフィールド
動物は白いプレキシグラス製の容器（43×43cm）に入れられ、30分間ビデオカメラで行動を記録した。追跡システム（Noldus Ethovision 3.0）を用いて、中心部と周辺部のゾーンをマッピングし、各ゾーンでの滞在時間を算出した。
高架式プラス迷路
テストは、床から58cmの高さにある、中央のプラットフォーム（7×7cm）から伸びる2本の開閉アーム（30×6cm）からなる、黒いプレキシガラス製のプラスクロス型の装置を用いて行われました。Noldus Ethovision 3.0トラッキングシステムを用いて、6分間の行動を記録した。中央、オープンアーム、クローズドアームの各ゾーンでの滞在時間と入場回数を算出した。
ライトボックスとダークボックス
暗室（黒壁、上蓋あり）と明室（300ルクス、白プレキシガラス壁、上蓋なし）を含む2区画の箱を使用した。両室は壁の中央にある10×10cmの扉でつながっていた。動物はライトチャンバーの片隅に壁に向かって置かれ、10分間自由に探索させられた。行動の記録にはNoldus Ethovision 3.0トラッキングシステムを使用した。不安様状態の代理として、入室回数と光室内で過ごした総時間を推定した。
ショ糖嗜好性試験
スクロース溶液（1％、飲料水で希釈）を入れたボトルと飲料水を入れたボトルの2つを、24時間自由に選択させた。水とショ糖液の消費量は、ボトルの重量を測定することで算出した。スクロース嗜好性は、スクロースと水の総消費量に対するスクロース溶液の消費量の割合として測定された。
ノベルティ抑制摂食試験
試験容器は、白色プラスチックボックス（50×50×20cm）で、床は木製の寝具で覆われているものを使用した。試験の24時間前に、ホームケージからすべての餌を取り除いた。ワットマン紙に餌（レギュラーチャウ）を1粒貼り付け、明るく照らされた容器の中央に配置した。10分間、食事までの待ち時間を測定した。各セッション終了後、動物をホームケージに移し、その後の5分間で摂取した餌の量を測定し、摂食意欲のコントロールとした。
尾部懸垂試験
マウスを尾の先から約3分の1の位置で、通常のテープを使って、ストレインゲージに接続されたアルミ棒に吊るした。マウスの尾の先端から2cmのところにテープを貼り、30cmの高さにある金属棒にマウスを吊り下げた。テストは5分間で記録された。録画したビデオを見ながら、動かない姿勢で過ごした総時間を測定した。マウスが逃げようともがくのをやめ、尻尾で受動的にぶら下がり、動かなくなったとき、不動と判断した。
強制水泳試験
マウスは、水（22℃）を満たしたプレキシグラスの透明な円筒（高さ25cm、直径10cm）に入れられ、5分間のテストセッションを受けた。無動状態の持続時間は、ビデオ録画を見ながら測定した。無動とは、浮遊に必要な動作以外の能動的な動作がないことと定義した。
組織採取
免疫蛍光研究に割り当てられたマウスは、キシラジン・ケタミンの混合物（10 mg/g bw, Sanofi）で深く麻酔され、0.9% NaClを含む溶液で経心的に灌流し、続いてリン酸緩衝液（pH 7.3 ）中の4% パラホルムアルデヒド（PFA、4℃）で処理した。実験的バイアスを最小化するために、動物は無作為に犠牲となった。その後、マウスは断頭され、脳は慎重に取り出された。分子生物学的解析に割り当てられたマウスは、キシラジン・ケタミン（10 mg/g bw, Sanofi）で深く麻酔された。HPC全体を注意深く解剖し、直ちに液体窒素中でスナップ凍結し、さらに処理するまで-80℃に維持した。糞便サンプルは、ドナーマウスではUCMSプロトコルの終了時に、レシピエントマウスではアイソレーターから出た時に採取した。
定量的RT-qPCR
脳組織からTotal RNAを抽出し、Cells-to-Ct Kit（Applied Biosystems）を用いて、製造者の指示に従いcDNAを合成した。リアルタイムPCRはSYBR Green Master Mix（Applied Biosystems）を用いて行い、生成物はApplied Biosystems ViiA 7 Real-Time PCR Systemで検出した。Th、Tph2、Ddc、GluR1、Gls1、Gls2、Grid1、Gad1、Gad2、Gabra2、Gabrb2の相対発現は、2（11C.t/）法を用いて算出した。リアルタイムPCRの条件は、95℃で10分間の初期変性、95℃で15秒間、60℃で1分間の増幅サイクルを行った。
ウェスタンブロット
脳組織は、プロテアーゼ（cOmplete、Sigma）およびホスファターゼ（phosSTOP、Sigma）阻害剤を補充したRIPA溶解バッファ（25 mM Tris-HCl pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 0.1% SDS）（Pierce Thermo Scientific）中でホメジ化した。タンパク質濃度は、ウェスタンブロットアッセイの前に、Pierce BCA protein Assay Kit（ThermoFischer Scientific）を用いて測定した。組織溶解物を4×NuPage LDSローディングバッファー（Invitrogen）および還元剤（Invitrogen NP0004）と混合し、タンパク質を12％SDS-ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen NP0329）で分離し、続いてセミドライまたは液体転写によってPVDF膜（トランスブロットターボミニPVDF、Biorad）上に転写した。ブロットをTween入りトリス緩衝生理食塩水（TBS-T）中の5％BSAでブロックし、一次抗体とインキュベートした、ウサギポリクローナル抗cFos（Merck、Cat No. ab179800）、マウスモノクローナル抗CREB-1（Santa-Cruz、Cat No.sc-240）、ウサギポリクローナル抗phosphoCREB（Merck、Cat No SAB1306301）、ウサギポリクローナル抗Cx3cr1（abcam、Cat No. ab8020）、鶏ポリクローナル抗DCX（abcam）、ウサギポリクローナル抗DCX（abcam、Cat No ab153668）、ウサギポリクローナル抗Iba1（Wako、Cat No 019-19741）、マウスポリクローナル抗IL1β／IL-1F2（R＆D Systems、Cat No AF-401-SP) 、ウサギポリクローナル抗IL6 （abcam, Cat No. ab208113）、ウサギポリクローナル抗Ki67（abcam、Cat No.ab15580）、マウスモノクローナル抗Sox2（abcam、Cat No. ab79351）、ウサギポリクローナル抗TGFβ 1（abcam, Cat No.ab92486） 、ウサギポリクローナル抗TNFα (abcam, Cat No. ab66579). タンパク質シグナルを検出するために、以下のホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用した： Goat Anti-Rabbit IgG (H + L)-HRP Conjugate (1:6000, Biorad, Cat No. 1706515) および Goat Anti-Mouse IgG1 heavy chain (HRP) (1:6000, abcam, Cat No. ab97240) および rabbit anti-goat IgG (H + L)-HRP (1:6000, Invitrogen, Cat No. 31402). タンパク質の化学発光検出は、Chemidoc Imaging System（Biorad）において、Luminata Crescendo Western HRP Substrate（Merck Millipore）を用いて実施した。バンドは、Image Labソフトウェアを用いて定量化した。
免疫蛍光法（Immunofluorescence
灌流した脳を振動ミクロトーム（VT1000S、Leica）を用いて40ミクロン厚の冠状切片に切断した。免疫染色は、自由浮遊切片で行った。非特異的な染色は、0.25% Tritonと10% ロバ血清アルブミン（Sigma-Aldrich）でブロックした。切片を以下の一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートした：ウサギ抗DCX（1：400、abcam、猫番号ab18723）、鶏抗DCX（1：400、abcam、猫番号ab1536668）、ウサギ抗Ki67（1：200、abcam、猫番号 ab15580）、ウサギ c-Fos （1/1500、メルク-ミリポア、猫番号ABE457）。切片を二次抗体（Alexa-conjugated secondary antibodies at 1:800 dilution, Jackson ImmunoResearch Laboratories）とともに室温で1Hインキュベートした。蛍光切片を核色素Hoechstで染色し、Fluoromount aqueous mounting medium (Sigma-Aldrich) を用いてマウントした。
画像処理と定量化
画像は共焦点レーザー走査型顕微鏡（LSM 710、Zeiss）とApotomeを用い、Zen Imagingソフトウェア（Zeiss）を用いて取得した。歯状回のZスタックは、シーケンシャルスキャンを使用して得た（ステップサイズ：0.5-1μm）。細胞カウントは、手動またはIcyオープンソースプラットフォーム（http://www.icy.bioimageanalysis.org）を使用して行った。値は、1動物あたり8～10切片の免疫陽性細胞数の平均値として表される。
微生物抽出と腸内細菌叢プロファイリング
糞便サンプルは接種後7週目に採取した。オートクレーブしたエッペンドルフチューブに採取し、さらに処理するまで-80℃で保存した。細胞DNAは、QIAamp DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Cat# 51504)を用いて、製造者の指示に従い、DNAの結果を最適化するためにビーズをかけるステップを含めて抽出された。DNAは、16 S rRNA遺伝子のV3領域に特異的なプライマーを用いたPCRによって増幅されました。アンプリコンをランダム化し、その後、V3領域の配列の違いに基づいてPCRアンプリコンの分離を可能にする25〜65％の化学勾配（尿素とホルムアミド）を含むアクリルアミドゲルを用いた変性勾配ゲル電気泳動（DGGE）により分析しました。DGGEプロファイルは、Bionumerics Version 4.5 (Applied Maths)で、DNAプロファイルのミックスをマーカーとして用いて解析した。
16S配列決定データ解析
配列は運用分類学的単位（OTU）にクラスタリングされ、MASQUEパイプライン（https://github.com/aghozlane/masque）を用いてアノテーションされました。16S rRNA標的アンプリコンの最終リストは、細菌分類群（門と科）の発現の負の対数に変換された。最終データは、実験条件にわたるOTU発現の負の対数の平均値として表現した。すべてのデータのインデックス付け、分離、プロットは、Matlab（Mathworks Inc.、2015年リリース）のカスタムメイドのスクリプトを使用して実施した。さらなる統計テストは、Prismソフトウェア（GraphPad, version 6, San Diego, USA）で実施した。得られた微生物相プロファイルは、主座標分析（PCoA）、相対存在量プロットおよびShannon Indexを使用して、以前に記載されたようにさらに特徴付けられた[3]。コードはリクエストに応じて入手可能です: https://github.com/SohamSahaNeuroscience/Microbiota-analysis.
統計解析
すべてのデータは、平均値±SEMで表した。統計解析はPrismソフトウェア（GraphPad、バージョン9）を用いて行い、p < 0.05を統計的に有意とみなした。データは、対にならない両側マン・ホイットニー検定、または二元配置のANOVA反復測定、および適切な場合にはボンフェローニ・ポストホック検定を使用して分析した。PCA分析は、ペルマノバテストを使用して実施した。データは適用された検定の前提を満たし、分散は異なる実験条件における異なるグループ間で類似していた。被験者は、試験を終えることができない、またはできない場合、行動評価から除外された（例えば、水槽で溺れる危険性がある、または尾部懸垂試験で尾部を切り離すことができないなど）。外れ値は、ROUT法（GraphPad Prism、バージョン9）を用いて除外した。詳細な統計解析は、補足資料に記載されている。
結果
ストレスをトリガーとする腸内細菌叢の接種により迷走神経が活性化される
GMドナーマウスとして、8週間のUCMSを持続したマウス（8週齢、C56BL6/j）およびそのコントロール（CT）を使用した（図1A）。UCMSプロトコルの終了時に、ドナーマウスから新鮮な糞便サンプルを採取し、GMレシピエントマウス（8週齢、C56BL6/j）に経口ガベージで移した。ストレス由来のGMを接種することでVNが活性化するかどうかを調べるため、VN活性化の標準的なプロキシであるNTSにおけるc-Fos免疫活性パターンを調べた［29］。その結果、UCMS-trマウスは、既述のように2時間後に有意なc-Fos免疫活性を示し、このパターンは接種後少なくとも24時間まで持続していた（図1B）。この結果をさらに検証するため、CT-trマウスとUCMS-trマウスの脳幹サンプルを用いてRT-qPCR解析を行ったところ、UCMS-trマウスでcfosの発現が増加していることがわかった（補足図1A）。次に、ストレス由来のGMを接種することで、脳幹の主要な神経伝達経路であるセロトニン、ドーパミン、GABA、グルタミン酸に関わる主要な速度制限酵素の遺伝子発現が変化するかどうかを検討した。RT-qPCR解析の結果、UCMS-trマウスは接種後4時間で、トリプトファン水酸化酵素（Tph2）の脳幹発現が増加し、グルタミナーゼ2（Gls2）とグルタミン酸イオン受容体δ型サブユニット1（Grid1）の発現が減少することがわかった（図1c）。しかし、これらの迅速な変化は接種後24時間では持続せず、ドーパミンやセロトニンなどのカテコールアミンの生合成に関わる律速酵素であるチロシン水酸化酵素（Th）およびドーパ脱炭酸酵素（Ddc）の発現が著しく低下していることが確認された。一方、グルタミン酸受容体1（GluR1）の特異的な発現は、有意に増加した（図1D）。一方、その他のグルタミン酸関連およびGABA関連の酵素や受容体の発現には変化が見られなかったことから（補足図1B）、UCMS-trマウスの腸内細菌を接種すると、脳幹におけるセロトニンおよびドーパミンの神経伝達経路が優先的に損なわれる可能性が示唆された。
図1：慢性ストレスマウスからの腸内細菌叢の移入は、迷走神経の急速な活性化と脳幹の神経伝達経路の変化を誘発する。
A 実験デザインおよび実験グループ。B CTマウス（CT-tr群）またはUCMSマウス（UCMS-tr群）から採取した腸内細菌叢を接種したマウスにおいて、接種後2時間および24時間における孤束路核（NTS）におけるc-Fos免疫染色の代表写真。C, D 腸内細菌叢接種後4時間および24時間におけるマウスの脳幹におけるTh、Tph2、Ddc、GluR、Gls2およびGrid1の相対発現（三重で行ったRT-qPCR）。mRNA発現の定量化は、CT-trマウスに対する相対値である。データは平均値±SEM、n = 5/グループで示す。*p < 0,05および**p < 0.01である。データはノンパラメトリックのマン・ホイットニー試験で解析した。4Hのタイムポイントについては、CT-tr対UCMS-tr．Th (p = 0.84, U = 11), Tph2 (p = 0.03, U = 2), Ddc (p = 0.42, U = 8), GluR1 (p = 0.22, U = 6), Gls2 (p = 0.008, U = 0), Grid1 (p = 0.01, U = 1). 24Hのタイムポイントについては、CT-tr vs UCMS-tr．Th (p = 0.01, U = 0), Tph2 (p = 0.55, U = 9), Ddc (p = 0.01, U = 1), GluR1 (p = 0.01, U = 0), Gls2 (p = 0.30, U = 7), Grid1 (p = 0.84, U = 11).
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ストレスが引き金となる腸内細菌は歯状回ニューロンを活性化し、成体海馬の神経新生を低下させる
これらの結果を踏まえ、GMによるVN活性化がHPCの神経細胞活性化パターンに影響を与えるかどうかを、CT-trおよびUCMS-trマウスのHPCにおけるc-Fosタンパク質レベルを測定することによって明らかにしようとした。その結果、UCMS-trマウスの歯状回（DG）におけるc-Fos免疫活性は、接種後2時間から少なくとも24時間まで有意に増加した（図2A、B、D-E）。この迅速かつ持続的な神経細胞活動の増加は、海馬溶解液のウェスタンブロット分析によって裏付けられた（補足図1C）。興味深いことに、神経原性DG全体のc-Fos発現を調べたところ、UCMS-trマウスにおけるc-Fos免疫反応性の増加は、ダブルコルチン陽性（DCX+）ニューロンの数の減少に関連していることが確認された（図E）。DGのDCX+細胞のプールは、新生ニューロンの成熟過程のステップであることに加え、視床下部-下垂体-副腎ストレス軸のネガティブフィードバックを緩衝する上で重要である [30]。しかし、c-FosとDCXの共局在は観察されなかったことから、この神経細胞活性化の増加は、主に既存の神経細胞に関係し、新たに生成された神経細胞には関係しないと考えられる。HPCの初期反応におけるGM接種の効果をさらに検討するため、主要な神経伝達経路、すなわちセロトニン、ドーパミン、GABAおよびグルタミン酸神経伝達に関わる主要な酵素および受容体の発現を評価した。RT-qPCR解析の結果、UCMS-trマウスは、脳幹で観察された初期の変化を反映し、セロトニンの利用可能性とドーパミンの生合成の障害を示す、HPCのThとDdcの発現が著しく低下した（図2F）。さらに、GluR1とGad2の有意な減少、Gls1の増加が観察された（図2F、補足図1D）。その他のグルタミン酸関連、GABA関連の酵素や受容体の発現には影響がなかった（補足図1D）。
図2：ストレスが引き金となった腸内細菌叢は、レシピエントマウスにおいて神経原性因子のレベルおよび成体海馬の神経新生に変化をもたらすことが明らかになった。
A CT（CT-tr群）またはUCMS（UCMS-tr）のいずれかの腸内細菌叢を糞便移植した2時間後のc-Fos免疫染色の代表写真。B CTおよびUCMS由来の微生物叢を接種した2時間後の歯状回におけるc-Fos陽性細胞の平均数を描いた棒グラフ（p = 0.008, U = 0, n = 5/グループ）。C 接種後24時間におけるCREBタンパク質レベルのウェスタンブロットおよび対応する定量的バープロット（p = 0.02, U = 0, n = 5/グループ）。D, E CT-trおよびUCMS-trマウスの歯状回におけるC-FosおよびDCX免疫染色の代表写真と、それぞれの陽性細胞数を示す棒グラフ（それぞれp = 0.008, U = 0およびp = 0.03, U = 35, n = 5/group）。F 接種後24時間のCT-trおよびUCMS-trマウスのHPCにおけるTh、Ddc、GluR1およびGls1の相対発現（RT-qPCRは三重に実施）。CT-trとUCMS-trの比較： Th (p = 0.05, U = 2), Ddc (p = 0.008, U = 0), GluR1 (p = 0.008, U = 0), Gls1 (p = 0.03, U = 1), n = 5/group. G 接種後24HのHPCにおけるBdnfおよびFoxo相対発現（三重で行ったRT-qPCR）（それぞれp = 0.05, U = 3およびp = 0.02, U = 0, n = 5/group）。データは平均値±SEM、n = 5-6/グループで示す。*p < 0,05および **p < 0.01。タンパク質およびmRNAの発現レベルの定量化は、CT-trマウスに対する相対値である。データはノンパラメトリックのMann-Whitney testを用いて解析した。
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そこで、成体HPCの神経新生を制御し、うつ病の病態生理に重要な働きをすることが知られている様々な因子、すなわち脳由来神経栄養因子（BDNF）、転写因子cAMP応答要素結合タンパク質（CREB）、フォークヘッドボックスO転写因子（FOXO）のHPC内のレベルを測定しました。その結果、UCMS微生物群の接種により、これらの因子が有意に減少したことから、これらの変化が成体HPCの神経新生障害に関与している可能性が示唆されました（図2C、G）。
これらの結果を総合すると、摂動したGMを接種すると、NTSとHPCの神経細胞の活性化が進み、セロトニンとドーパミンの生合成に関わる主要酵素の発現が低下し、HPCの神経原性因子が減少し、最終的にHPCの神経原性ニッチ内の神経細胞の分化に急激な影響を与えることがわかった。これらの影響を総合すると、HPCに依存するいくつかの行動に影響を与える可能性があります。
ストレスに関連したマイクロバイオームを投与されたマウスにおけるうつ病様反応
我々は、以前に示されたように[3, 4]、ストレスによって誘発されたGMの不均衡が、情動行動を変調させるのに十分かどうかを調べることにした。この疑問を解決するため、GM接種後の初期および遅発の時点における行動を評価した（図3A）。その結果、UCMS-trマウスは、うつ病様反応を特徴とするドナーストレスマウスの行動表現型を採用していることがわかった。スクロースプレファレンステストでは、UCMSおよびUCMS-trマウスのいずれも、うつ病様状態の標準的な指標である対照マウスと比較して、スクロース消費量の著しい減少を示した（図3B）。新規性抑制摂食（NSF）試験では、UCMSおよびUCMS-trマウスの両方が、不安および抑うつ様行動の増加を反映する、食べるまでの待ち時間が有意に増加した（図3C）。さらに、尾部懸垂試験および強制水泳試験のいずれにおいても、UCMSおよびUCMS-trマウスは、コントロールと比較してより不動性を示し、抑うつ様行動を示唆しました（図3D-E）。これらの抑うつ状態が成体HPCの神経新生の持続的な変化と相関しているかどうかをさらに調べるために、DCXの免疫染色を行ったところ、ストレス由来のGMを移植すると、DGのDCX+ニューロンの数が著しく減少し、成体生まれのニューロンの成熟段階における障害が反映されることがわかりました（図3F-G）。
図3：慢性ストレスマウスの腸内細菌叢は、宿主マウスのうつ病様行動を促進し、成体海馬の神経新生を減少させる。
A 実験のタイムライン。B 微生物叢ドナーマウスおよびレシピエントマウスにおけるスクロースプレファレンスの割合を示す棒グラフ（CT vs UCMS: p = 0.0005, U = 7.5; CT-tr vs UCMS-tr: p = 0.01, U = 16）。C 新規性抑制摂食試験（NSF; CT vs UCMS: p < 0.0001, U = 2.5; CT-tr vs UCMS-tr: p = 0.05, U = 24）における食事までの待ち時間を描いた棒グラフである。D, E 絶望的な行動を示す尾部懸垂試験および強制水泳試験における全無動性。微生物接種後3週間および7週間の評価には、異なるレシピエントマウスコホートを使用した［CT vs UCMS］： 尾部懸垂試験（p = 0.02, U = 20.5）および強制水泳試験（p = 0.0007, U = 8）. CT-tr vs UCMS-tr： 接種3週後の尾部懸垂試験（p = 0.48、U = 40）および接種7週後の尾部懸垂試験（p = 0.03、U = 21）。強制水泳試験：接種後3週間（p = 0.0001、U = 4.5）および接種後7週間（p = 0.002、U = 10.5）]. F, G CT-trおよびUCMS-trマウスの歯状回におけるDCX+免疫染色の代表写真と、異なる実験群におけるDCX陽性細胞の平均数を示す棒グラフ（CT vs UCMS: p = 0.002, U = 0; CT-tr vs UCMS-tr: p = 0.004, U = 1）. データは平均値±SEMで示す。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001。データはノンパラメトリックのMann-Whitney検定で解析した。NSFの新規性により摂食が抑制された。
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最後に、GMドナーマウスとレシピエントマウスの糞便サンプルについて16S rRNA遺伝子V3-V4領域の塩基配列を決定し、UCMSがGM組成に及ぼす影響を検証した（図4A-C、補足図2）。主座標分析（PCoA）では、CT群とUCMS群はレシピエント群と同様に異なるクラスタリングを示し（図4B、補足図2A）、UCMSが腸内細菌叢に与える影響と微生物接種の有効性が確認された。さらに分類学的解析により、UCMSに関連するいくつかの細菌科および系統の変化（図4C、補足図2B）、およびシャノン指数（補足図2C）で表される細菌の多様性の変化が明らかになりました。
図4：慢性ストレスによる腸内細菌叢の摂動が情動行動と成体海馬の神経新生に及ぼす影響は、迷走神経が介在している。
A 糞便移植のパラダイムと実験群を模式的に示す。マウスは、コントロールマウス（CT）またはUCMSマウスの腸内細菌叢を接種する2週間前に迷走神経切断（Vx）を受けている。B 16S rRNA発現データのPCoA（キャンベラ距離）は、異なる実験グループ間の細菌ファミリーレベルのグループ差（PC1：23,4%、PC2：14.9%、Permanova、p < 0,001）を示す。C 16 S rRNAの発現パターンをファミリーレベルで示したバープロット。細菌ファミリーは右側に表示されている。D スクロース嗜好性を示す棒グラフ（CT-tr vs UCMS-tr： p = 0.01, U = 16.5; UCMS-tr vs UCMS-tr-Vx: p = 0.04, U = 22.5). E-G 新規性抑制摂食試験におけるペレットを食べるまでの待ち時間を示す棒グラフ（CT-tr vs UCMS-tr： p = 0.03, U = 9.5; UCMS-tr vs UCMS-tr-Vx: p = 0.005, U = 6）および尾部懸垂における全不動（接種後7週目のCT-tr vs UCMS-tr：p = 0. 0002、U＝0；UCMS-tr -Vx vs UCMS-tr-Vx at 7 weeks post-inoculation：p＝0.001、U＝6）、強制水泳試験（CT-tr vs UCMS-tr at 3 weeks post-inoculation：p＝0.0001，U＝4.5 and 7 weeks post-inoculation：p＝0.03, U＝10. 接種後3週目のUCMS-tr vs UCMS-tr-Vx：p＜0.0001、U＝2、接種後7週目：p＝0.003、U＝4）。H-J CT-tr、UCMS-tr、CT-tr-Vx、UCMS-tr-Vxマウスの歯状回におけるKi67+細胞およびDCX+細胞の代表画像と対応するバープロット。スケールバー： 100μm。CT-tr vs UCMS-trの場合： DCX陽性ニューロン（p = 0.001、U = 3）およびKi-67陽性細胞（p = 0.004、U = 1）。すべてのデータは、平均値±SEMで表される。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. 統計的有意性はノンパラメトリックのマン・ホイットニー検定で算出した。PCA解析はPermanovaで実行した。NSFノベルティは摂食を抑制した。
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ストレスが引き金となる腸内細菌が情動行動や成体海馬の神経新生に及ぼす影響を迷走神経が媒介すること
VNがストレスによるGMの変化を情動行動や成体HPCの神経新生に伝達するかどうかを評価するために、糞便移植の2週間前に横隔膜下迷走神経切断術（Vx）または偽手術を受けた動物のコホートを追加採用した（図4A）。その結果、VNを切除することで、GMによる抑うつ様状態の伝達が阻害されることがわかった。より正確には、迷走神経切断マウスは偽手術マウスと異なり、UCMS-微生物叢を接種してもスクロース選好性の低下を示さなかった（図4D）。さらに、偽手術動物にUCMS-微生物叢を接種すると、NSFにおける食事までの待ち時間、尾部懸垂および強制水泳試験における無動性が有意に増加したが、迷走神経切断動物ではこれらの抑うつ様反応は認められなかった（図4E-G）。さらに、Vxは、DGにおけるKi67+およびDCX+細胞の数によって描かれるように、UCMS採取GMの接種によって誘発される細胞増殖および神経細胞分化の減少から保護した（図4H-J）。これらの結果は、攪乱されたGMを接種した後のうつ病様表現型と成体HPCの神経新生欠損の伝達には、VNの完全性が必要であることを示す。なお、Vxまたは抗生物質処理のみによる不安・抑うつ様行動や体重の変化は目撃されなかった（補足図3、4、5A-I）。
ストレス由来の腸内細菌は、迷走神経依存的に初期および持続的な神経炎症を誘発する。
成体HPCの神経新生に悪影響を及ぼし、うつ病の病態生理に関連する要因として、神経炎症が重要な役割を果たすことを指摘する証拠が増えている [31] 。さらに、VN求心性神経を介したGMと脳との間の相互伝達において、神経炎症が重要な役割を果たすという新たな証拠が示されている[32, 33]。このような背景から、我々はまず、GMによるVN活性化がHPCの神経炎症に影響を与えるかどうかを調査した。その結果、UCMS-trマウスは、接種後24時間で、炎症性サイトカインである腫瘍壊死因子α（TNFα）、インターロイキン1β（IL-1β）、インターロイキン6（IL-6）のレベルの上昇という、神経炎症の兆候を実際に示した（図5A）。この神経炎症状態は、少なくとも接種後7週間まで持続した。このとき、ミクログリア細胞動員マーカーCx3cr1の有意な増加、COX2のわずかだが有意でない増加、および親神経原性トランスフォーミング成長因子β（TGFβ）の減少が見られた（図5B）。重要なことに、Vxを持続的に接種したマウスで炎症性メディエーターと神経原性因子のレベルを調べたところ、群間で差がなかったことから（図5C、D、補足図5J）、乱れたマイクロバイオームが神経炎症に及ぼす影響を媒介するには、VNの完全性が必要であると考えられる。
図5：迷走神経は、ストレスをトリガーとする腸内細菌叢の接種によって誘発される海馬の神経炎症反応を媒介する。
A UCMS-trマウスの海馬で検出された、接種後24時間のさまざまな神経炎症メディエーターのタンパク質レベルの上昇を示すウェスタンブロット膜と対応するバープロット。B UCMS-trマウスの海馬において、接種後7週目に検出された神経炎症性メディエーターのタンパク質レベルの増加を示す代表的なウェスタンブロットと対応するバープロットである。C 接種24時間後の迷走神経切断レシピエントマウスの海馬における神経炎症性メディエーターのウェスタンブロット膜および対応する定量は、群間で差がないことを示す。D接種後7週目の迷走神経切断レシピエントマウスの海馬におけるさまざまな神経炎症メディエーターのレベルを示すウェスタンブロット膜とそれに対応する定量化。タンパク質発現の定量化はCT-trマウスとの相対値である。データは平均値±SEMで示し（n = 5/グループ）、ノンパラメトリックMann-Whitney検定を用いて解析した。
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ディスカッション
VNは、腸から脳へ、あるいはその逆へと信号を伝達する導管として機能するが、GMと脳の間のコミュニケーションにどの程度関与しているのか、この相互作用を支えるメカニズムについては、まだ活発に研究されている。本研究では、慢性的なストレスによるGMの異常がVNを活性化し、脳幹とHPCにおけるセロトニンとドーパミンの神経伝達障害、早期から遅れて起こる神経炎症、成体HPCの神経新生の障害を誘発し、最終的にレシピエントマウスの鬱状態を定着させることを明らかにした。このことから、迷走神経系は脳神経系を制御するシステムの主要な構成要素であり、うつ病を含むストレス関連疾患の治療標的である可能性が示唆されました。
この結果は、ストレスの実験モデルやうつ病の被験者において、便および糞便の微生物叢組成が変化していることを示す先行研究を支持するものである [3, 4, 34,35,36] 。これらのGMの変化は、神経伝達物質の放出や免疫／炎症など、迷走神経求心性に依存する生理的プロセスを変化させることにより、ストレス関連うつ病の神経進行に寄与する可能性がある [37,38,39]. 迷走神経求心性端末は、消化管前膜内に位置し、そこで直接または間接的にマイクロバイオームと相互作用し、消化管から発信される免疫または内分泌シグナルを感知することができる [40]. 我々の結果は、慢性的なストレスを受けたマウスのGMを接種すると、VNが急速に活性化し、ドーパミンとセロトニンの生合成と利用可能性に関与する律速酵素の減少を伴うことを示し、セロトニンとドーパミンの神経伝達に障害があることを示唆しています。実際、VNはセロトニン作動性ニューロンのハブであるLCとDRNに直接投射しているため、VNの活性化はセロトニンの放出と関連している[41]。DRNのセロトニン作動性ニューロンは、HPCを含むいくつかの前脳領域に軸索を投射しており、脳幹内のセロトニン生物学的利用能の変化がHPCに直接影響を及ぼす可能性があることを意味している。ウイルスを用いたトレーシング技術により、腸に由来する迷走神経シグナルがNTSから内側中隔を経て海馬のグルタミン酸作動性ニューロンに伝達されることが示されており、VNを介して伝達される腸由来のシグナルがHPC依存機能を制御し、神経原性マーカーや神経栄養マーカーの発現を低下させることが可能であることが示されている[10]。
私たちの実験パラダイムでは、乱れた腸内細菌を接種すると、HPCはすぐに影響を受け、神経原性DGにおけるc-Fos発現の増加やDCXタンパク質レベルの減少によって示され、成体生まれのニューロンの成熟過程における障害を反映することが示された。重要なことは、DGにおける成体神経新生は、うつ病性疾患の病態生理と治療の両方において、十分に立証された細胞基質であるということである [12,13,14] 。しかし、DCXは標準的な神経新生マーカー[42]として、また移動する神経前駆細胞[43]として広く用いられているが、他の研究ではDCXの発現だけでは神経新生と切り離される可能性があると主張していることにここで注目することが重要である。この立場は、DCX KOマウスが正常レベルの神経新生を示すという報告[44]や、成体で生まれたニューロンの成熟は、これらの細胞の増殖や生存とは部分的に独立しているという報告[45]によって裏付けられている。しかしながら、我々の実験パラダイムを用いると、UCMS由来のGMを接種すると、増殖する細胞の数が減少するだけでなく、DGのEdU陽性「生存」細胞の数も減少することが以前に示されている（EdUは犠牲の3週間前に注入された）［4］ので、我々のモデルは、成人神経形成のすべてのよく知られた段階、すなわち成人出生ニューロンの増殖、分化および成熟に障害をもたらすことを示唆している。さらに、接種によって誘導された成体神経新生への影響は、脳のもう一つのよく知られた神経発生ニッチである脳室下帯にも影響を与え、嗅覚、視力、記憶などの関連機能に影響を与える可能性があることに留意されたい。この可能性は本明細書では取り上げず、将来の研究の範囲とする。
GMの接種がHPCに及ぼす初期の影響は、少なくとも部分的には、セロトニンとドーパミンのバイオアベイラビリティの変化、およびHPC内の神経原性因子のレベルの変化によって媒介されると考えられる。実際、シナプスのセロトニン、ドーパミン、BDNFレベルの変化は、シナプス可塑性の変化やHPCの神経新生と連動することが広く認められている[46]。我々の解析では、脳幹で観察されたのと同様に、ThとDdcの遺伝子発現レベルもHPCで低下しており、成体神経新生に関連するいくつかの重要な転写因子、すなわちCREB、Foxo、Bdnfも低下していることを確認した。これらの因子によって制御されるプロセスは多岐にわたるが、シナプス可塑性の制御への関与が最も多く報告されている。さらに、抗うつ薬は、CREBやBDNFを含む、細胞生存経路に関わる様々な因子を間接的に制御する[47]。
我々の結果はまた、UCMS由来のGMを接種することで、HPCにおいて早期かつ持続的な神経炎症反応が起こることを示している。実際、多くの研究が、うつ病と血液および脳脊髄液の両方における炎症の末梢マーカーとの間に強い関連が存在することを説明している[48, 49]。さらに、臨床的および前臨床的な証拠から、神経炎症は、大うつ病性障害のほとんどの神経生物学的相関関係、すなわち脳内セロトニンの枯渇、HPA軸の調節障害、成人HPC神経新生の変化と相互作用する重要な要因であることが示唆されている [31] 。興味深いことに、VNが中枢神経系における神経炎症反応を制御することが報告されている。例えば、急性または慢性のVN刺激は、視床下部およびHPCにおけるIL-1βの発現を増加させることが報告されている[50, 51]。この結果は、細胞のホメオスタシスと行動に対するGM駆動の刻印の伝達には、VNの完全性が必要であることを強く示唆している。重要なことに、臨床研究では、VN刺激（VNS）が治療抵抗性うつ病に良好な結果をもたらし、VNSの治療期間が長いほど奏効率と寛解率がさらに高まることが示されています[52,53,54]。これらの結果は動物モデルでも裏付けられ、VN活性を操作することで抑うつ症状やHPC神経新生障害が有意に減弱することが実証されている [55,56,57] 。重要なことは、VNS療法は現在、欧州連合、米国、カナダで治療抵抗性うつ病に対して承認されていることであるが、その正確な作用機序はまだ解明されていない。デンマークとスウェーデンの医療登録から、迷走神経切断術とパーキンソン病の発症リスク低減との関連を示すヒトでの観察データが増えつつあることは注目に値する[58]。うつ病だけでなく神経変性疾患の病態生理と治療におけるVN回路の重要性が強調されている。
我々の結果は、VNがネズミのストレス反応に対するいくつかのプロバイオティクス株の効果[7,8,9]、神経伝達と神経可塑性に対する効果を仲介することを示す以前の知見と一致する[11, 57, 59, 60] 。しかし、本研究では、VN-HPC回路を介して脳に影響を与える可能性のある特定の細菌株を特定することはできません。今後の研究では、電気生理学と組み合わせたウイルスオプトジェニック・トレーシングなどの次世代機能的CNS回路マッピング法を活用し、UCMS-微生物接種後に活性化する脳幹からHPCに至る特定の神経回路を特定することができる。さらに、DNAシーケンサーをメタトランスクリプトミクス、メタボロミクス、リピドミクス、プロテオミクスと組み合わせることで、GM-VN-脳軸の分子メディエーターを明らかにすることができる。また、本研究の弱点は、VN活性を消失させる手段として横隔膜下迷走神経切断術を用いたことである。その代わりに、ウイルスベースの方法を優先的に使用し、光遺伝学的または化学的にVN求心性神経を選択的に阻害または活性化し、行動と成体神経形成への影響を研究する必要がある[51]。最後に、脳へのすべての微生物シグナルがVNによって媒介されるわけではないことを強調する価値がある。例えば、軽度の胃腸感染によって誘発されたマウスの不安様行動は、迷走神経切断後も明らかである[61]。このことは、微生物の代謝物や副産物、免疫機構など、他の生物学的経路（その一部は微生物叢によって影響を受けることが知られている）が腸内細菌叢の不安誘発作用を媒介できることを示す。
VNを活性化するか腸内細菌叢を修正することによってGM-VN-脳経路を操作することは、治療抵抗性うつ病の代替療法を開発するための探求において、刺激的な機会となっている。治療抵抗性うつ病に対するVNS療法の投与試験は現在進行中であり[62]、これらの研究結果と臨床医による累積的な経験によって、将来の治療法の選択が決定される。VNS療法は、新しい治療法であると同時に、うつ病のメカニズムをより深く理解するための研究ツールである。ここでは、VNからHPCへの二次求心性投射を通じて、GMが脳機能に影響を与え、感情状態に直接影響を与えることができるという新たな仮説を支持する、さらなる論拠を提示することにする。
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謝辞
また、パスツール研究所のGnotobiologyセンターの方々には、改変/制御された微生物叢を持つマウスの技術的なサポートをしていただきました。この研究は、生命保険会社「AG2R-LA-Mondiale」（PML）、欧州糖尿病研究財団（EFSD）プログラム（ESおよびFO）、Fondation des Gueules Cassées（ES）により支援されています、 医学研究財団（MG、FO）、AGEMED-INSERMプログラム（FO）、NRJ神経科学財団（FO）、フランス国立研究機関（ANR）（FO、P-ML）、卓越研究プログラム「Revive」（P-ML）。
著者情報
著者ノート
これらの著者は同等に貢献した： Mathieu Galerne, Manon Rivagorda.
これらの著者は、この仕事を共同で監督した： Franck Oury, Pierre-Marie Lledo.
著者と所属
Institut Pasteur, Université Paris Cité, CNRS UMR 3571, Perception and Memory Unit, 75015, Paris, France.
Eleni Siopi、Soham Saha、Carine Moigneu、Mathilde Bigot & Pierre-Marie Lledo
パリシテ大学、CNRS、INSERM、Institut Necker Enfants Malades-INEM、75015、パリ、フランス
Eleni Siopi、Mathieu Galerne、Manon Rivagorda、Franck Oury
神経行動・代謝プラットフォーム、ネッカー研究所、26 INSERM US24/CNRS UAR 3633、75015、パリ、フランス
ステファニー・モリソー（Stéphanie Moriceau
貢献度
ESはP-MLの研究室でプロジェクトを開始し、分子解析にMGとMR、16S-RNAseqデータ解析にSS、迷走神経切断処置にCM、行動解析にSM、行動と免疫組織化学解析にMBの協力を得て研究を立案し、実験を行った。FO、P-ML、ESはリソースを提供した。ESとP-MLは原稿の執筆と編集を行った。
対応する著者
Eleni SiopiまたはPierre-Marie Lledoに対応する。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や所属機関の管轄権の主張に関して、中立的な立場を保っています。
補足情報
補足情報
補足図1
補足図2
補足図3
補足図4
補足図5
補足表
権利と権限
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転載と許可
この記事について
この記事を引用する
Siopi, E., Galerne, M., Rivagorda, M. et al. Gut microbiota changes require vagus nerve integrity to promote depressive-like behaviors in mice. Mol Psychiatry (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02071-6
引用元：ダウンロード
2022年9月08日受領
2023年4月3日改訂
2023年4月11日受理
2023年5月02日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41380-023-02071-6
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分子精神医学（Mol Psychiatry） ISSN 1476-5578（オンライン） ISSN 1359-4184（プリント版）
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