腸内細菌叢が産生するGlcNacは、NK細胞を調節することで宿主のインフルエンザ抵抗性を増強する

2023年12月7日 10:45

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腸内微生物
第15巻 2023年-第2号
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研究論文
腸内細菌叢が産生するGlcNacは、NK細胞を調節することで宿主のインフルエンザ抵抗性を増強する

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/19490976.2023.2271620

胡暁東,孫小禄,趙雅,イブ長傑,孫小梅,金美林 & show all
論文 2271620｜2023年2月23日受理、2023年10月12日受理、オンライン版公開：2023年11月12日
引用
https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2271620
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要旨
微生物叢はインフルエンザ感染に対する宿主応答を調節することが知られているが、その機序はほとんど解明されていない。腸内代謝産物は、腸内微生物が抗インフルエンザ効果を発揮する鍵となるメディエーターである。インフルエンザ抵抗性の高いマウスの糞便代謝産物を抗生物質処理したレシピエントマウスに移植すると、インフルエンザ感染に対する抵抗性が付与された。インフルエンザ抵抗性の高い個体と低い個体の糞便代謝物を比較した結果、N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）とアデノシンが、それぞれインフルエンザ抵抗性と強い正の相関を示し、in vivoまたはin vitroで抗インフルエンザ作用を示すことを同定し、検証した。特に、GlcNAcはNK細胞の割合と活性を増加させることにより、抗インフルエンザ効果を媒介した。Clostridium sp.、Phocaeicola sartorii、Akkermansia muciniphilaを含むいくつかの腸内微生物は、インフルエンザ抵抗性と正の相関があり、外因性の補充によってマウスの腸内のGlcNAcレベルを上昇させることができた。その後の研究で、3つの細菌を組み合わせてマウスに経口投与すると、GlcNAcで観察されたのと同様のNK細胞応答の調節が得られることが確認された。本研究は、腸内細菌が産生するGlcNAcが、NK細胞を制御することにより宿主をインフルエンザから保護することを実証し、宿主のインフルエンザ抵抗性を媒介する腸内細菌の作用機序の解明を促進するものである。

keywords: インフルエンザ腸内細菌叢異質性インフルエンザウイルス抵抗性 N-アセチル-D-グルコサミン予後予測因子
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はじめに
腸内細菌叢は、正常な生命活動の維持に不可欠である。Citation1-4 腸内細菌叢は、環境シグナルを統合することによって宿主の免疫応答を調節する可能性があり、Citation5-8 がん、Citation9-11 代謝性疾患、Citation12,Citation13 および病原性感染症の発症に深く影響している。Citation14-16 腸内細菌叢の変化は、局所の細胞機能や免疫応答に影響を及ぼすだけでなく、呼吸器疾患の発症にも重要な役割を果たす可能性がある。Citation17 しかし、腸内細菌叢が遠位臓器を感染から保護するメカニズムは、完全には解明されていない。

インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）に属し18、重篤な急性感染性呼吸器疾患の原因となっている。過去数十年間、インフルエンザの大流行は世界規模で公衆衛生を深刻に脅かしてきた。最近の人類の歴史では、4つの主要なインフルエンザ・パンデミックが発生した： 1918年のH1N1、1957年のH2N2、1968年のH3N2、そして2009年の豚由来のH1N1である。引用20 1918年のインフルエンザ・パンデミックは、疾病の予防と管理が不十分であった典型的な例と考えられており、少なくとも4,000万人の死亡をもたらした。 Citation22 新型インフルエンザは、ヒトまたは動物由来の既存のインフルエンザウイルス間のゲノムセグメントの再接種、または時折種の壁を越える自然変異によって出現する。Citation19,Citation23 例えば、2013年3月、H7N9 HPAIVが中国で初めて出現し、1568人の感染と616人のヒト死亡を引き起こし、Citation24 家禽産業に大きな損害を与えた。インフルエンザウイルスの宿主への感染は、腸内細菌叢の活性に大きく影響され、特定の微生物叢が破壊されたり除去されたりすると、不利な結果がもたらされる。Citation24,Citation25 腸内細菌叢が宿主の抵抗力を高めるメカニズムは、toll様受容体Citation24の活性化や、肺間質におけるIFN駆動性の抗ウイルス状態の制御など、いくつか解明されている。 Citation26微生物の代謝産物は、様々な重要な全身の表現型を調節することが知られておりCitation8,Citation27,Citation28、いくつかの研究では、腸内細菌叢が代謝産物を通じて、インフルエンザ感染を含む多くの疾患に関与していることが示されているCitation29,Citation30しかしながら、多くの詳細な研究が残されている。

感染に対する宿主応答の不均一性により、病理学的表現型の程度が異なる。免疫系は、ウイルス抵抗性と耐病性という2つの異なる戦略によって感染に対処している。本研究では、メタボローム解析を用いて、インフルエンザ抵抗性の程度が異なるマウス間で機能的な腸内代謝産物をスクリーニングすることにより、腸内細菌叢が宿主のインフルエンザ抵抗性にどのように影響するかを調べた。その結果、インフルエンザ抵抗性と正の相関を示す8つの代謝産物を同定し、N-アセチル-D-グルコサミン（GlcNAc）とアデノシンのin vivoおよびin vitroにおける抗インフルエンザ活性を明らかにした。私たちは、GlcNAcの抗インフルエンザメカニズムの根底にあるものを調べ、その生成に関連する腸内微生物を同定した。本研究は、腸内細菌叢の抗インフルエンザ作用に関する新たな知見を提供し、新規抗インフルエンザ薬開発のための経験的基盤を提供するものである。

研究結果
高抗インフルエンザマウスの腸内代謝産物はレシピエントマウスのインフルエンザ抵抗性を増強した。
インフルエンザ感染の不均一性が腸内微生物の代謝産物と関連しているかどうかを評価するために、図1aに示すような実験を計画した。その結果、同じ用量のインフルエンザウイルスをマウスに経鼻接種した場合、ウイルス量がマウスの個体間で有意に異なることがわかった（図1b）。正常マウスで観察された個体間差は、マウスを抗生物質で処理するとあまり顕著ではなくなった（図S1）。これらの結果から、マウスは同じ条件下で感染に対して異なる応答を示し、腸内細菌が感染に対する宿主の多様な応答において重要な役割を果たしていることが示唆された。次に、マウスをウイルス量に応じて選別し、ウイルス量の上位1/3をTH群（インフルエンザウイルス抵抗性が低い）、下位1/3をTL群（インフルエンザウイルス抵抗性が高い）に分けた（図1c）。Citation31 主に腸内微生物の代謝産物を含むこれらの水溶性腸内抽出物を、抗生物質で前処理したレシピエントマウスに、レシピエントマウスがインフルエンザウイルスに感染する5日前から経口投与した。THおよびNCドナー群と比較して、TL群の腸内微生物代謝産物はレシピエントマウスの生存率を30％または40％（P = 0.046）増加させ（図1d）、体重減少を促進した（P < 0.05）（図1e）。THドナー群とNCドナー群では、生存率や体重変化に差はなかった（図1d,e）。さらに、感染7日後のマウスの病理組織学的検査では、TL群マウスの肺における炎症細胞浸潤、肺胞萎縮、線維化が緩和され（図1f）、病理学的スコアが有意に低下した（P = .016）（図1g）。このことは、腸内代謝産物の変動がインフルエンザウイルス感染に対する宿主の抵抗性に影響を及ぼすこと、そしてTL群のマウスの糞便微生物叢には、感染に対する抵抗性をもたらす特定の腸内代謝産物が含まれている可能性が高いことを示唆している。

図1. マウスのインフルエンザ抵抗性の不均一性は腸内代謝産物と密接に関連している。

(a)IMT実験のセットアップ。20匹のマウスを肺のウイルス量のレベルに基づいて高ウイルス量群（n = 10、TH）と低ウイルス量群（n = 10、TL）に分けた。水溶性代謝物を抽出し、抗生物質溶液で3日間前処理したSPFマウスに移植した。5日後、マウスに1×104 EID50 GXを感染させた。(b) 5dpi後の感染SPFマウスの肺におけるウイルスRNA転写産物数。(c) 5dpiにおける感染SPFマウスの肺のウイルス力価。(d）代謝物移植後のTHドナー、TLドナー、およびNCドナー（NC、PBSを用いた模擬感染）群の生存率および（e）体重変化曲線（各群n＝10）。(f）H&E染色したマウスの肺の代表画像。別の反復代謝物移植実験では、マウスを7dpiで犠牲にし、肺を採取した。生存率はlog-rank（Mantel-Cox）検定で評価した。(g)病理学的重症度を決定するために盲検切片を評価した。全体的な組織学的変化を評価するために、肺組織切片をパネルに指定された基準に従ってスコアリングした。使用した採点システムは以下の通りである： 0、病理学的変化なし；1、患部（≦10％）；2、患部（＜50％、＞10％）；3、患部（≧50％）。体重の変化は二元配置分散分析を用いて評価した。*P＜0.05、***P＜0.001（TLドナー vs NCドナー）; #P ＜0.05、##P＜0.01、##P＜0.001（TLドナー vs THドナー）。エラーバーは各処置の平均±SDを示す。すべての実験は同様の条件で少なくとも2回行った。
図1. マウスインフルエンザ抵抗性の不均一性は、腸内代謝産物と密接に関連している。
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8つの腸内代謝産物の発現上昇は高い抵抗性と相関していた
インフルエンザウイルスに対する抵抗性に影響を及ぼす代謝産物を同定するため、上述の感染モデルを再現した（図1a）。マウスは、感染後5日目に同じ用量のインフルエンザウイルスに感染した後、肺ウイルス量に有意な個体間不均一性を示した（図S1a、表S5）。より包括的なスクリーニングのために、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）およびガスクロマトグラフィー質量分析（GC - MS）をアンターゲットメタボロミクスに使用した（図 2a）。主成分分析（PCA）データから、すべてのサンプルが95%信頼区間内にあることが明らかになった（図2b）。潜在構造への直交投影-判別分析（OPLS-DA、適合性の良否をテスト）を用いると、3群間に有意差が認められた（図2cおよびS2b）。多変量解析-投影における変数重要度（VIP）-に基づくと、多くの代謝物のレベルがNC群と比較して感染後に変化していることが観察された（P < 0.05）（図2d）。さらに、TH群とTL群の間でいくつかの代謝物レベルに有意差が認められたが、これらの群間で差のある代謝物は、TH群とNC群の間に比べてはるかに少なかった。完全連鎖法を用いて発現量の異なる代謝物をクラスタリングしたユークリッド距離行列によると、TH群とNC群の間で189代謝物の存在量が有意に異なり（P < .05）（図S3a）、TL群とNC群の間では182代謝物の存在量が有意に異なっていた（P < .05）（図S3b）。しかし、TH群とTL群の間で発現が異なる代謝物は28種類しか同定されなかった（P < .05）（図2e、表. S6）。比較分析には、無関係な代謝因子による干渉を排除できるという利点があり、潜在的な抗インフルエンザ代謝物をスクリーニングするのに適している。抗インフルエンザ活性を有する代謝物をスクリーニングするために、3群間の28の差分代謝物の相対存在量の関係を評価した。その結果、8つの代謝物がTH群と比較してTL群で有意に発現量が増加していた（P < .05）。さらに、これらの代謝物はNC群よりも有意に高いか、少なくともNC群と同程度のレベルを維持していることがわかった（図2f）。8つの代謝産物の相対存在量とウイルス量との相関を解析したところ、アデノシン（P = 0.025）、GlcNAc（P = 0.032）、Glu-Pro（P = 0.029）、およびマルトース（P = 0.020）のレベルは、肺ウイルス量と負の相関を示した（図S4、表S7）。したがって、これらの代謝産物はインフルエンザウイルス感染に対する宿主抵抗性に関与していると推測された。

図2. 感染マウスのインフルエンザ抵抗性は、いくつかの腸内代謝産物の濃縮と関連している。

(a)メタボロームシーケンスのプロトコル。(b) NC、TH、TL、QC群のサンプルのPCA (c) TH、TL、NC群の代謝物組成の違いを示すOPLS-DA。(d) NC vs TH、NC vs TL、TH vs TLのボルケーノプロット比較。ボルケーノプロットの各ポイントは代謝物を表し、横軸は各グループの各物質の互いに比較した倍数変化を表し（底を2とする対数をとる）、縦軸はスチューデントのt検定のP値を表す（底を10とする対をとる）。散布点の大きさはOPLS-DAモデルのVIP値に対応する。有意に発現が増加した代謝物は赤で、発現が減少した代謝物は青で示した。(e) TH vs TLの階層的クラスタリング解析。横軸は異なる実験グループ、縦軸はグループ内で比較された差分代謝物、色ブロックは対応する位置での代謝物の相対発現レベルを表し、黄色は高発現レベル、青色は低発現レベルを示す。(f）TH群、TL群、NC群間の各代謝物の相対含量の比較。データは最小値、第一四分位値、中央値、第三四分位値、最大値で表示。*p < .05、**p < .001。
図2. 感染マウスのインフルエンザ抵抗性は、いくつかの腸内代謝産物の濃縮と関連している。
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GlcNAc in vivoおよびアデノシン in vitroは抗インフルエンザ効果を示した
我々の仮説を検証するため、これら8つの代謝産物の抗インフルエンザ効果をin vitroおよびin vivo実験で評価した。これらの代謝産物は腸から単離されたものであるため、GXインフルエンザウイルス感染に対して高い寛容性を示すCaco-2細胞をin vitro感染モデルとして選択した（図S5a）。まず、8種類の代謝物の細胞毒性を評価し、最適濃度を決定した（図S5b）。各代謝物について、無毒性範囲内の3つの異なる濃度で実験を行った。まず、RT-qPCRを用いてNPのmRNAレベルを検出し、ウェスタンブロットでウイルス性NPを測定した。その結果、アデノシンの3つの濃度すべてにおいて、NPの発現が用量依存的に阻害されることがわかった（図3a,b）。TCID50アッセイで推定したウイルス力価から、アデノシン処理細胞はコントロールと比較してウイルス増殖を抑制した（P < .05）（図3c）。また、アデノシンの抗インフルエンザ効果は、H5N6-GFPおよび（PR8）H1N1に感染したCaco-2細胞においても持続することが確認された（P < .05）（図S5c）。

図3. GlcNAcおよびアデノシンは、それぞれin vivoおよびin vitroで抗インフルエンザ効果を発揮する。

Caco-2細胞を異なる濃度の代謝物で12時間プレインキュベートし、0.1のMOIでGXに感染させ、対応する濃度の代謝物で処理した。感染から12、24、36時間後に細胞上清を採取した。(a) 異なる濃度の代謝物で処理したCaco-2細胞で核タンパク質（NP）レベルを測定した。(b）12、24、36時間後のGX vRNA量に対する代謝物の影響。(c）細胞上清中のウイルス力価をTCID50で検出した。(d）マウス実験のワークフロー。SPFマウスは、GlcNAc、アデノシン、L-アルギニン、セロビオース、マルトース、シトラコン酸、マロン酸またはGlu-Pro、あるいは同量のPBS（200μL）を1週間毎日経口投与された。すべてのマウスに1×104 EID50のH7N9インフルエンザウイルスを経鼻接種した（各群n＝10）。(e)生存率および(f)群ごとの残りのマウスの体重を14日間毎日モニターした。vRNA存在量、ウイルス力価および体重変化の統計は二元配置分散分析（way-way ANOVA）であった。生存率は対数順位（Mantel-Cox）検定で評価した。#P < .05 (コントロール vs 0.468 mM); +++P < .001, ++++P < .0001 (コントロール vs 0.935 mM); *P < .05, **P < .01; ***P < .001 (コントロール vs 1.87 mM)。エラーバーは各処置の平均±SDを示す。
図3. GlcNAcおよびアデノシンは、それぞれin vivoおよびin vitroで抗インフルエンザ効果を発揮する。
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これらの代謝物の抗インフルエンザ活性をin vivoで評価するために、まずマウスで毒性試験を行った。SPFマウスにこれらの代謝物を致死量の中央値の1/10の量で10日間投与したが、PBS群と比較して体重（図S5d）や健康状態に変化はなかった。レシピエントマウスには、インフルエンザウイルスを経鼻接種する1週間前からPBSまたは代謝物を経口投与した（図3d）。その結果、GlcNAc（500μg/kg）の経口投与は、レシピエントマウスの生存率を増加させ（P = 0.036）、9、10および11dpiにおける感染中の体重減少を減少させた（P = 0.033、P < 0.001、P = 0.047）（図3e、f）。しかし、アデノシンの経口投与には明らかな効果はなかった。

肺ウイルス力価、サイトカインレベルおよび組織学的変化により、GlcNAcの抗インフルエンザ効果を評価した。3dpiおよび5dpiにおけるGlcNAc群と比較して、PBS群では炎症細胞浸潤、肺胞萎縮、線維化とともに重篤な病変が認められ（図4a）、病理学的スコアも有意に高かった（P = 0.0079）（図4c）。肺切片の免疫蛍光染色から、AIV NP蛋白は肺の気管支および気管支肺胞接合部（BADJ）に多く存在することが示された。GlcNAc群の肺組織におけるインフルエンザウイルス核タンパク質の蛍光密度も、5dpiでPBS群より有意に低かった（P = 0.0193）。(P = 0.0193）（図4bおよび4d）。3dpiおよび5dpiにおいて、GlcNAc群の肺NP発現はPBS群のそれよりも有意に少なかった。qRT-PCR（P＜0.001）（図4e）およびウイルス力価（P＝0.018）（図4f）により決定されたウイルスNPのmRNAレベルに基づいて、GlcNAcの経口投与が肺におけるインフルエンザウイルスの増殖を阻害することを確認した。ELISAによると、肺IFN-γおよびIL-10のレベルは、PBS群と比較して、GlcNAc群では0dpi（P = 0.026）または5dpi（P < 0.001）で有意に高かった（図4g）。逆に、肺のIL-1βレベルは3dpiで有意に低かった（P =.028）。IFN-β、TNF-αおよびIL-6レベルは群間で変化しなかった。マウスを刺激するためにポリ（I:C）を点鼻薬として用いた場合、PBS群と比較して、GlcNAc群ではTNF-α mRNAレベルの有意な減少（P = .031）およびIFN-γ mRNAレベルの有意な増加（P = .047）が観察された。しかしながら、IFN-β、IL-10、IL-1βおよびIL-6のmRNAレベルには、両群間に有意差は認められなかった（図S6）。これらの結果から、GlcNAcは感染後のいくつかの炎症因子を減少させ、免疫調節作用を発揮するが、I型インターフェロンの産生とは無関係に作用することが示唆された。

図4. GlcNAcの経口投与は、レシピエントマウスにおけるH7N9感染を防御する。

(a) 1000 mg/kg GlcNAcまたはPBS（200 μL）を1週間毎日経口投与し、H7N9インフルエンザウイルスGXに感染させたマウスの組織学的検査（H&E染色）および（b）免疫組織化学。0、3、5dpiで、1群につき無作為に選んだ3匹のマウスを犠牲にした。(c)盲検切片を病理学的重症度のレベルについてスコア化した。包括的な組織学的変化を評価するために、肺組織切片をパネルに示した基準に基づいてスコアリングした。以下のスコアリングシステムを用いた： 0、病理学的変化なし；1、患部（10％以下）；2、患部（50％未満、10％以上）；3、患部（50％以上）。(d）肺におけるNPの蛍光強度の定量分析。蛍光強度は平均蛍光強度で算出した。さらに、30匹のSPFマウスを無作為に2群に分け、上記のように処置した。肺は、0、3、5dpiに1群につき無作為に選んだ5匹のマウスから採取し、PBS中でホモジナイズした（1mL/肺）。(e) NP mRNAレベルをqRT-PCRで測定した。(f)ウイルス力価は、10日齢のSPF胚化鶏卵を用いて測定した。 (g)サイトカイン濃度体重変化、ウイルス力価、およびサイトカイン濃度は、二元配置ANOVAを用いて評価した。*p < .05, ***p < .001, ****p < .0001。エラーバーは各処置の平均±SDを示す。
図4. GlcNAcの経口投与は、レシピエントマウスにおけるH7N9感染を防御する。
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GlcNAcはNK細胞の増殖を誘導し、インフルエンザ感染後の肺におけるNK細胞のIFN-γおよび表面CD107aの発現を増強した
GlcNAcが抗インフルエンザ効果を発揮するメカニズムを明らかにするために、NK細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞を含む免疫細胞に対するGlcNAc処理の影響を解析した。感染前後のマウスの血液、肺、脾臓におけるCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、NK細胞の割合をフローサイトメトリーを用いて検出した。CD4+およびCD8+ T細胞の割合には、サンプルの種類にかかわらず、感染前後でPBS群とGlcNAc群との間に有意差はなかった（図S7およびS8）。しかしながら、GlcNAcの経口投与は、感染していない状態のマウスの血液（P < 0.001）および脾臓（P < 0.01）におけるNK細胞の割合と数を有意に増加させた（図5a,e）。同様の傾向がGlcNAc処理後の肺でも観察されたが、これは統計的に有意ではなかった（図5c）。GlcNAc投与群の肺におけるNK細胞の割合は、1dpiおよび3dpiで対照群のそれよりも顕著に高かったが（P = 0.0417, P = 0.0229）、この差は5dpiで消失した（図5c）。非感染マウスと比較して、感染群の肺におけるCD3-CD49b+NK細胞の割合は1dpiで高く、3dpiで増加し続け、5dpiで減少した。対照的に、末梢血におけるNK細胞の割合は1dpiで劇的に減少した。これは、ウイルス感染後にNK細胞が末梢血を通じて感染臓器に移動することを示した先行研究と一致している32。異なる時点における両群の血液、脾臓、および肺におけるNK細胞の割合から、GlcNAcの経口投与により、特に感染初期の肺においてNK細胞の増殖が誘導されることが示された。

図5. GlcNAcの経口投与は、マウスにおける感染前後のNK細胞応答を増強した。

SPFマウスにGlcNAc（500 mg/kg）またはPBS（200 μL）を1週間毎日経口投与した。すべてのマウスに1×104 EID50のGXインフルエンザウイルスを経鼻接種した。局所排出縦隔末梢血（a、b）、肺（c、d）、または脾臓（e、f）からのリンパ球をフローサイトメトリーで分析した。(a)感染後の末梢血におけるリンパ球中のNK細胞の割合とNK細胞の総数を示す、ゲーティング戦略を用いた代表的フローサイトメトリープロットとサマリーグラフ。(b）ゲーティングされたCD3-CD49B+ NK細胞におけるIFN-γおよびCD107a表面発現の頻度。(c) (a)と同様であるが、肺のリンパ球を示す。 (d) (b)と同様であるが、肺のNK細胞を示す。 (e) (c)と同様であるが、脾臓のリンパ球を示す。(d）（f）と同様であるが、脾臓からのNK細胞を示す。ゲーティングされたCD3-CD49b+におけるNK細胞の割合と数、IFN-γとCD107a表面発現の頻度。フローサイトメトリーデータは二元配置分散分析を用いて評価した。*p < .05、**p < .01。エラーバーは各処置の平均±SDを示す。
図5. GlcNAcの経口投与は、マウスにおける感染前後のNK細胞応答を増強する。
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IFN-γの発現はNK細胞の活性化を反映し、CD107aの表面発現はNK細胞の細胞傷害性と相関する。Citation33 我々は、2群間のIFN-γ＋NK細胞は、血中の対応するNK細胞と同様の傾向を示すこと、すなわち、IFN-γ＋NK細胞の割合および数は、感染前のPBS群と比較して、GlcNAc群で有意に増加した（P = 0.0028, P < 0.0001）（図5bおよびS9a）が、感染後は有意ではなかったことを見出した。GlcNAc処理群では、脾臓のIFN-γ+ NK細胞が感染前（P < .0001）および1dpi時（P = .0208）に有意に高かった（図5fおよびS9c）。しかし、肺のIFN-γ+ NK細胞には2群間で有意差はなかった。さらに、GlcNAc群はPBS群と比較して、1dpiで脾臓のCD107a+ NK細胞の有意な増加（P = 0.0144）（図5fおよびS9c）、および3dpiで肺のCD107a+ NK細胞の有意な増加（P < 0.001）（図5dおよびS9b）を示した。感染前には有意な増加は見られなかった。血液中では、GlcNAc群のCD107a+ NK細胞の割合はPBS群と有意差はなかったが、CD107a+ NK細胞数は3dpiで有意に多かった（P = 0.0394）（図S9a）。これらの結果は、GlcNAcの経口投与が感染前後のNK細胞応答を増強することを示唆している。

GlcNAcはNK細胞を制御することにより抗インフルエンザ効果を発揮した
GlcNAcがNK細胞の殺傷活性に影響を及ぼすかどうかを検証するため、陰性選択マウスNK細胞濃縮キット（StemCell Technologies社製）を用いて、PBS投与マウスまたはGlcNAc投与マウスからNK細胞を精製し、カルセイン-AM標識YAC-1細胞を用いたカルセイン放出アッセイによりNK細胞活性を測定した。カルセイン放出アッセイにより、未感染状態および1dpiのいずれにおいても、GlcNAc群のNK細胞活性は、血液（P = 0.0001, P = 0.0124）（図6a）および脾臓（P = 0.0428, P = 0.0010）（図6c）において、PBS群よりも有意に高いことが明らかになった。さらに、感染していない状態の肺では、両群間のNK細胞活性に有意差は認められなかったが、1dpiおよび3dpiでは、GlcNAc群がPBS群よりも有意に高かった（P = 0.0119, P = 0.0153）（図6b）。これらの所見から、GlcNAcはNK細胞の増殖を誘導するだけでなく、NK細胞の活性も高めることが示唆される。

図6. GlcNAc は NK 細胞を制御することにより、H7N9 感染に対する宿主防御を改善する。

PBS群およびGlcNAc群（各群n = 20）に、PBSまたは1000 mg/kg GlcNAcを1週間経口投与し、H7N9インフルエンザウイルスGXに感染させた。0、1、3、5dpiで、各群から無作為に5匹のマウスを選び、安楽死させた。末梢血(a)、肺(b)、脾臓(c)からNK細胞を単離し、その活性をカルセイン放出測定法で測定した。(d) NK細胞養子移入の実験セットアップ。SPFマウスをPBS群とGlcNAc群に分け、上記のように処置した。両群のマウスの肺からNK細胞を精製し、1×106個のNK細胞を含む200μLのPBSを尾静脈からレシピエントマウス（各群n＝10）にi.v.注射した。対照群のレシピエントマウスには同量のPBSを注射した。すべてのレシピエントマウスに1×104 EID50 H7N9インフルエンザウイルスを経鼻接種した。(e)感染マウスの生存率および(f)体重。SPFマウスをPBS群とGlcNAc群に分け、上記のように処置した。(g）PBSまたは抗アシロGM1抗血清で処理した後、1日後に末梢血と肺のNK細胞をフローサイトメトリーで調べた。0日目に、マウスに1×104 EID50 GXインフルエンザウイルスを感染させた。(生存率はlog-rank（Mantel-Cox）検定で評価した。NK細胞活性アッセイと体重は二元配置分散分析を用いて評価した。エラーバーは各処置の平均±SDを示す。すべての実験は、同様の条件下で少なくとも2回行った。
図6. GlcNAcは、NK細胞を制御することにより、H7N9感染に対する宿主防御を改善する。
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生体内での効果を評価するため、PBSまたはGlcNAcで処置したマウスから単離したNK細胞を、ナイーブまたは感染マウスに移植した（図6d）。NK細胞は移植前にネガティブセレクションにより肺から精製し、フローサイトメトリーにより移植したNK細胞の純度が80％以上であることを確認した（図S10）。PBS-NK細胞移入群と比較して、GlcNAc-NK細胞移入は感染マウスの生存率を20％改善し（図6e）、9dpiにおける体重減少を有意に減少させた（P = 0.047）（図6f）。さらに、感染前にNK細胞を枯渇させるために抗アジアロGM1を用いた。血液および肺におけるCD3-CD49b+細胞の枯渇はフローサイトメトリーで確認された（図6g）。さらに、抗アジアロGM1はin vivoではCD4+およびCD8+ T細胞に有意な影響を及ぼさないことがわかった（図S11）。群間で体重に差はなかったが（図6i）、PBS+PBS群と比較して、GlcNAcの経口投与およびPBSの腹腔内注射を受けたマウスでは、生存率が40％増加した（30％対70％）（図6h）。しかしながら、生存曲線は、NK細胞が枯渇すると（10％ vs 10％）、有益な効果が消失することを示していた（図6h）。これらの結果から、GlcNAcは主にNK細胞を制御することによって抗インフルエンザ効果を発揮する。

GlcNacは、インフルエンザ感染時にいくつかの腸内細菌によって生成された
GlcNAcは、細菌や真菌を含む様々な生物の様々な多糖の基本単位である。いくつかの細菌は、キチンを分解することによってGlcNAcを産生することができる（引用35）。TL群とTH群の糞便微生物叢のメタゲノム配列決定を行い、PCoAを用いて異なる分類学的レベルでの群集構造と微生物量を評価した。感染群間の群集構造（門レベル）には差がなかったが（図S12a）、属レベル（図S12b）と種レベルでは顕著な変化が見られた（図7a、表S8）。両群で相対量が最も多かったのは、ファーミキューテス、バクテロイデーテス、プロテオバクテリアの3門であった（図7b、表.S9）。属レベルでは、Muribaculum、Alistipes、Bacteroides、Clostridium、Prevotellaが優勢であった（図7c、表. S10）。

図7. 特定の微生物叢のアップレギュレーションは腸におけるGlcNAc産生を増加させた。

メタゲノム解析のため、TH群とTL群について頭蓋内容物を採取した。(a) TH群とTL群間のUniFrac距離を種レベルで重み付けしたPCoA。TH群とTL群における(b)上位10属と(c)上位30属の相対存在量。(d)属レベルでの階層的クラスター化ヒートマップ解析；細菌属の相対値は色の濃さに対応する。(e)TH群（青棒）とTL群（黄棒）で存在量の異なる分類群。ヒストグラムの長さは、異なる種（LDAスコア＞2.0）の影響の大きさを表す。(f)KEGGパスウェイ濃縮解析により、発現量の異なる微生物叢におけるGlcNAc産生を制御する酵素が明らかになった。in vitro (g)およびin vivo (h)におけるUHPLC - MRM-MSによる糞便内容物中のGlcNAcの定量的測定。データはWilcoxon - Mann-Whitney検定を用いて評価した。GlcNAc 測定の統計は、in vitroではt検定、in vivoでは一元配置分散分析を用いた。*p < .05, **p < .01, ***p < .001, ****p < .001。エラーバーは各処置の平均±SDを示す。
図7. 特定の微生物叢のアップレギュレーションは腸におけるGlcNAc産生を増加させた。
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抗インフルエンザ菌の候補を明らかにするため、グループ間の相対存在量に統計的に有意な差がある上位50種を分析した（P < 0.05）。その結果、TL群ではTH群よりも存在量の多い（P < .05）細菌が42種同定され、その中にはP. sartorii、A. muciniphila、Candidatus Melainabacteria bacterium、Elusimicrobium sp. An273、Parabacteroides goldsteiniiが含まれていた（図7d、表. S11）。一方、TH群ではHelicobacter japonicus、Bacteroides uniformis、Bacterium 1XD8-92、Lactobacillus johnsoniiがより豊富であった（P < 0.05）。LEfSeによると、A. muciniphila、P. sartorii、C. M. bacteriumを含む9種類の細菌（LDA >2）の存在量は、TH群よりもTL群で顕著に高かった（図7e、表. S12）。

腸内容物中のこれら9つの細菌の相対的存在量とGlcNAcの絶対レベルとの関係を評価したところ、A. muciniphila、P. sartorii、ファーミキューテス属細菌、およびC. M. bacteriumの相対的存在量とGlcNAcレベルとの間に強い正の相関が認められた（図S13）（P < 0.05）（表S13および表S14）。KEGG解析に基づくと、キチナーゼ、β-N-アセチルヘキソサミニダーゼ、N-アシルグルコサミン2-エピメラーゼ、およびN,N'-ジアセチルキトビオースホスホリラーゼは、GlcNAc産生の重要な経路であるキチンの異化における重要な酵素である。キー酵素を9つの細菌のゲノム位置にアラインメントしたところ、Faecalibacterium sp.、Clostridium sp.、F. bacterium、Eubacterium sp.、P. sartorii、およびA. muciniphilaがキー遺伝子の少なくとも1つに濃縮されていることがわかった（図7f）。このことは、これらの細菌がGlcNAcのアップレギュレーションとインフルエンザに対する宿主抵抗性に寄与している可能性を示唆している。次に、Clostridium sp.、A. muciniphilaおよびP. sartoriiの培養上清中のGlcNAc含量を定量したところ、培養48時間後にClostridium sp.とA. muciniphilaの培養上清中のGlcNAc含量の有意な増加が観察された（P < 0.0001）（図7gおよび表. S16）。一方、P. sartoriiの上清中のGlcNAc含量は明らかに減少した。しかし、マウスにClostridium sp.、P. sartoriiおよびA. muciniphilaをそれぞれ経口投与したところ、腸内GlcNAcのレベルはいずれも有意に増加した（P = 0.0018, P < 0.001, P = 0.026）（図7hおよび表S16）。次に、これらの細菌がNK細胞に与える影響をさらに調べた。その結果、3種類の細菌を混合して経口投与したところ、血液、肺、脾臓においてNK細胞が有意に増加した（P < .001, P = .006, P = .0012）（図S14a）。CD107a＋NK細胞は両群間に有意差はなかったが、混合細菌群のIFN-γ＋NK細胞は、血液および脾臓の両方でPBS群より有意に高かった（P＝0.048、P＝0.003）（図S14b）。一方、IFN-γ＋NK細胞と同様の結果が、NK細胞活性検出実験でも得られた。すなわち、NK細胞活性は、血液および脾臓の両方において、PBS群と比較して混合細菌群で有意に上昇した（P＜0.001、P＝0.0011）（図S14c）。この結果は、Clostridium sp.、P. sartorii、およびA. muciniphilaを含む特定の細菌が、直接的または間接的に腸内のGlcNAcの発現を増強し、それによってNK細胞を調節することによって宿主のインフルエンザ抵抗性を高める可能性があることを示している。

考察
腸内細菌叢は、インフルエンザウイルス感染の結果を決定する上で重要な役割を果たしているCitation24,Citation39。微生物叢が有益な効果を発揮するメカニズムは依然として不明であるが、特定の微生物代謝産物がウイルス感染に対する抵抗性を媒介する可能性があることを示す証拠があるCitation40,Citation41。したがって、抗インフルエンザ効果を有する新たな微生物代謝産物を同定するための効果的なスクリーニング戦略を確立することは価値がある。微生物代謝産物の組成は複雑かつ多様であるため、無効な干渉因子を除外し、機能性代謝産物の同定を目標とすることは依然として困難である。感染に対する宿主の反応は一般的にかなりの不均一性を示すが、その主な理由はウイルス抵抗性や疾患耐性の能力に個人差があるためである。本研究では、宿主の抵抗性（TH群は低抵抗性、TL群は高抵抗性）を考慮し、腸管内容物のメタボローム解析を併用することで、抗インフルエンザ腸内代謝産物を同定する有効な戦略を確立した。その結果、いくつかの抗インフルエンザ腸内代謝産物の同定に成功し、GlcNAcとアデノシンがそれぞれin vivoとin vitroで抗インフルエンザ作用を示すことを示した。メタボローム解析特有の技術的な問題により、重要な情報が省略される可能性があるが、Citation45のデータは、我々のアプローチが、腸内代謝物から特定の抗インフルエンザ代謝物をスクリーニングするための科学的かつ効果的な戦略であることを証明するのに十分である。このことは、感染に対する宿主の反応に不均一性をもたらす他のどのような要因も使用できるという、これまでの見解を支持するものである。我々の研究は、内在する異質性の視点に基づいて病原体と宿主の相互作用を理解することが可能であることを確認した。今後の研究では、マウスのインフルエンザ感染症以外の疾患モデルでもこのアプローチを採用すべきである。

様々な疾患の発症において、腸内微生物の代謝産物が重要な役割を果たしていることを示す研究が増えてきている。短鎖脂肪酸（Citation41）、デアミノチロシン（Citation40）、CoA（Citation39）などの特定の腸内代謝産物は、さまざまなメカニズムで抗インフルエンザ効果を発揮する。しかし、ほとんどの研究は、既知の代謝産物を外因性投与することによって抗インフルエンザ作用を有する代謝産物をスクリーニングしており、感染時の腸内代謝産物の変化と感染に対する宿主免疫応答との関係を理解することはできなかった。我々は、特定の腸内代謝産物の変化が宿主肺におけるウイルスクリアランス能と密接に関連していることを見出した。さらに、GlcNAcとアデノシンという2つの新規抗インフルエンザ腸内代謝産物の同定に成功し、感染時に腸内の内因性GlcNAcをアップレギュレートすることで、宿主がウイルス抵抗性を増強できることを明らかにした。これらのデータを総合すると、腸内代謝産物の抗インフルエンザ作用に関する知見が深まっただけでなく、宿主の感染反応における不均一性の生成に関する新たな知見も得られた。

NK細胞は重要な免疫細胞であり、伝統的に特定のウイルス感染や腫瘍に対する防御の第一線とみなされている。いくつかの研究で、GlcNAcはNK細胞およびT細胞の増殖と活性化を促進することにより抗がん作用を発揮することが示されている引用48,引用49。しかし、病原体による感染症におけるGlcNAcの役割は報告されていない。我々の研究では、GlcNAcの経口投与により、インフルエンザ感染前後にNK細胞の割合と殺傷活性が増加し、それによって宿主を感染から保護することが示された。インフルエンザ感染におけるNK細胞の役割は複雑であり、ウイルスの用量によって異なるが、H7N9感染患者を対象とした研究では、NK細胞のレベルが高いほど、疾患の進行中に回復が促進されることが示されている。さらに、抗シアロGM1を用いてNK細胞を枯渇させると、GlcNAcの抗インフルエンザ効果は消失することが確認された。以前の研究で、抗アシアロGM1はNK細胞を標的とする一方で好塩基球も枯渇させることが示されたCitation52。実際、我々の研究でも抗アシアロGM1が好塩基球を枯渇させることが見出され（図S15a）、好塩基球の影響の可能性が示唆された。しかしながら、我々の結果は、GlcNAc処理がNK細胞のみに影響を及ぼし、好塩基球には影響を及ぼさないことを示している（図S15b）。これらの所見は、GlcNAcが主にNK細胞を通して抗インフルエンザ効果を発揮することを裏付けている。GlcNAcは天然の小さな無毒性分子であり、実質的に副作用がないことから、Citation53,Citation54今後の研究では、新規インフルエンザ治療薬の一部としての可能性を検討すべきである。

GlcNAcは、胃炎および炎症性腸疾患、Citation55,Citation56損傷軟骨、Citation35関節リウマチ、および癌の治療において大きな可能性を秘めている。ここで我々は、ウイルス抵抗性の高い感染者の腸内において内因性GlcNAcがアップレギュレートされていることを示し、腸内微生物がこれらの変化に寄与しているという仮説を立てた。キチンは、自然界でセルロースに次いで2番目に大きな炭水化物でありCitation57,Citation58、細菌によって分解されてGlcNAcを産生することができる。Citation35 キチン異化経路の4つの主要な酵素に基づき、Clostridium sp.、P. sartorii、A. muciniphilaが腸内のGlcNAcのアップレギュレーションに有意に関連していると推論した。次に試験管内で、Clostridium sp.とA. muciniphilaがGlcNAcを直接産生できることを確認した。しかしながら、P. sartoriiはGlcNAcを直接生産することができなかった。それにもかかわらず、in vivo実験では、これら3つの細菌はいずれも腸内のGlcNAcレベルを上昇させることができた。このことから、P. sartoriiは他の細菌と相互作用して間接的にGlcNAcを産生する可能性が示唆された。さらに、Clostridium sp.、P. sartoriiおよびA. muciniphilaは、GlcNAcの効果と同様に、経口投与後にマウスのNK細胞の比率と活性を高めることが明らかになった。これらの結果から、Clostridium sp.、P. sartoriiおよびA. muciniphilaは、GlcNAcをアップレギュレートすることにより、宿主のインフルエンザ抵抗性を増強できることが示された。しかし、腸内細菌叢が他の免疫細胞や腸内微生物の代謝産物を通じて抗ウイルスNK細胞応答を調節しているのかどうかについては、さらなる調査が必要である。

我々はまた、アデノシンがin vitroで複数のインフルエンザウイルス亜型の増殖を阻害することも示した。アデノシンの経口投与はインフルエンザ感染に対する防御をもたらさなかったが、アデノシンの腹腔内注射は感染マウスの生存率を改善した（図S16）。この違いは、アデノシンが循環系と比較して消化管で分解されることに起因すると考えられる。アデノシンの主な臨床用途は、心血管疾患の治療であるCitation59。Citation61,Citation62 しかし、アデノシンの抗インフルエンザメカニズムについては、さらなる研究が必要である。

我々の研究は、NK細胞活性の制御を介したGlcNAcの抗インフルエンザ作用について、強力な実証的支持を与えるものである。我々は、インフルエンザ感染後にGlcNAcの内因性発現が増加し、それが主にClostridium sp.、P. sartorii、A. muciniphilaなどの腸内細菌叢によって制御されていることを確認した。この結果は、腸内細菌が代謝産物産生を介してインフルエンザに対する宿主の抵抗性を高めることを示唆している。今後の研究では、腸内微生物の群集構造や代謝産物の内因性産生を操作することが、インフルエンザ感染に対する宿主の抵抗性や耐性に及ぼす影響について検討すべきである。

材料と方法
細菌とウイルス
Akkermansia muciniphila ATCC BAA-835およびClostridium sp. BNCC195293はBeNa Culture Collection（蘇州、中国）から入手した。Phocaeicola sartorii JCM 17,136はBiobw Culture Collection（中国、北京）から入手した。A.muciniphilaは、0.25％ムチンを添加したBD Brain Heart Infusion（BHI）寒天培地（Becton Dickinson, Heidelberg, Germany）でストリークした。Clostridium sp.は、5％滅菌脱脂羊血を添加したColumbia（Qingdao Hope Biotechnology, Qingdao, China）で培養した。P. sartoriiは、5％滅菌脱脂羊血を添加したTSA（Becton Dickinson）中で、37℃の嫌気条件下で48時間培養した。

インフルエンザウイルスA/chick/Guangxi/YL01/2017（H7N9）、A/Puerto Rico/8/1934（H1N1、PR8）、および緑色蛍光タンパク質（GFP）組換えH5N6（A/duck/Hubei/WH18/2015）は、10日齢のニワトリ胚のアラント嚢で増殖させ、以前に記載されたように精製した引用63。精製したインフルエンザウイルスは使用するまで-80℃で凍結保存した。H7N9およびH5N6ウイルスのHA切断モチーフは、高病原性鳥インフルエンザウイルスの基準を満たしており、マウスに高い病原性を示した。

動物
特定病原体フリー（SPF）雌性C57BL/6Jマウス（8週齢）を中国三峡大学実験動物センターから入手した。すべての動物は、特定病原体フリー（SPF）条件下で、同じ部屋、同じ設備で飼育され、自由に餌と水を摂取できた。すべての動物実験は、動物バイオセーフティレベル3（ABSL3）の条件下で行われた。すべての動物実験プロトコールは、中国湖北省実験動物監視委員会の「実験動物の飼育と使用の手引き」に従って実施され、華中農業大学科学倫理委員会の承認を得た（許可番号：HZAUMO-2019-018）。

抗生物質投与
SPFマウスに抗生物質溶液（ATB）を投与した。アンピシリン（1 mg/mL）、ストレプトマイシン（5 mg/mL）、バンコマイシン（0.25 mg/mL）、およびコリスチン（1 mg/mL）（Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス）をマウスの滅菌飲料水に3日間添加し、腸内代謝産物移植（IMT）の前日に中止した。

マウス盲腸代謝物抽出および移植
合計40匹のC57BL/6マウスを正常/対照（NC）（模擬リン酸緩衝生理食塩水感染、n = 10）とH7N9感染群（n = 30）に分けた。すべてのマウスに、100μLの滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）中のケタミン／キシラジン混合液（それぞれ100および5mg/kg）を腹腔内注射して麻酔をかけた。引用65 感染群には1×104 EID50のH7N9を経鼻接種し、NC群には同量のPBSを接種した。インフルエンザ感染5日後にマウスの盲腸内容物を採取し、直ちに-80℃で保存した。感染マウスの肺を採取し、PBSに入れ、セラミックビーズを用いてホモジナイズし、ウイルス含量に応じて選別した： 20検体を高ウイルス量群（ウイルス量の上3分の1の検体、TH群）と低ウイルス量群（ウイルス量の下3分の1の検体、TL群）に均等に分けた。同様に、盲腸内容物もTH群とTL群に分けた。IMT実験では、NC群、TH群、TL群の腸内容物を別々にPBSに懸濁し、ホモジナイズした。サンプルを4,000 g、4℃で10分間、14,000 g、4℃で30分間遠心し、上清を採取し、0.22 mmフィルターを通した。その後、微生物代謝物を15mLの飲料水に添加した。

抗生物質で前処理したマウス（n = 48）を4群（各群n = 12）に無作為に割り付けた：モック、NCドナー、THドナー、TLドナーである。各マウスは、200μLのNC、TH、TLの微生物代謝産物、またはPBSを毎日経口投与された。5日後、すべてのマウスにケタミン／キシラジン混合液（それぞれ100および5 mg/kg）を腹腔内注射して麻酔をかけ、NCドナーのマウス、THドナーのマウスおよびTLドナーのマウスには1×104 EID50のH7N9ウイルスを含む50 μLのPBSを経鼻接種し、モック群のマウスにはPBSを接種した。7日後、各群から無作為に選んだ2匹のマウスを安楽死させ（マウスはケタミン・キシラジン麻酔下で犠牲にした）、肺サンプルの採取と組織学的検査を行った。各群の残りのマウスの生存率と体重を15日間（0～14dpi）モニターした。

糞便分析実験のためのマウス感染とサンプル採取
SPFマウス（n = 38）をNC群（模擬PBS感染、n = 8）とH7N9感染群（n = 30）に分けた。すべてのマウスにケタミン／キシラジン混合液を腹腔内注射して麻酔し、感染群にはH7N9（1×104 EID50）を経鼻接種し、NC群にはPBSを接種した。5日後、盲腸内容物サンプルを採取し、-80℃で保存した；肺組織を採取し、PBSに入れ、ホモジナイズし、ウイルス含量に従って選別した（TH群およびTL群はそれぞれn＝8）。NC、TH、TL群の盲腸内容物は、メタボロームおよびメタゲノム解析に使用した。

特定の代謝化合物によるマウスのin vivo処理
8種類の特異的代謝化合物の抗インフルエンザ効果を評価するため、抗生物質で前処理したマウスに、GlcNAc（1000 mg/kg）、アデノシン（2 mg/kg）、L-アルギニン（500 mg/kg）、セロビオース（20 mg/kg）、マルトース（3000 mg/kg）、シトラコン酸（200 mg/kg）、マロン酸（400 μg/kg）またはGlu-Pro（20 mg/kg）、またはPBSを毎日経口投与（200 μL）し、1週間飼育した。マウスを上記のように麻酔し、H7N9（1×104 EID50、1群あたりn＝10匹）を経鼻接種した。各群の残りのマウスの生存率と体重を15日間毎日モニターした。

0、3、5dpiにおける疾患の進行を評価するため、48匹の抗生物質で前処理したマウスを、PBS群とGlcNAc群の2群（n＝24）に無作為に割り付けた。PBS群のマウスには200μLのPBSを経口投与し、GlcNAc群のマウスには1日あたり1000mg/kgのGlcNAcを投与した。インフルエンザ感染は上記のように行った。0、3および5日後、各群5匹のマウスの肺を採取し、ウイルス力価およびサイトカインレベルを測定した。組織学的検査のため、各群の残りのマウスを感染後0、3、5日目に安楽死させ（各時点でn＝3）、肺を採取し、4％ポリメチレンホルムアルデヒドで固定した。

GlcNAcの抗インフルエンザ効果におけるNK細胞の機能を調べるため、50匹のSPFマウスを3群に分けた：モック群（n = 10）、PBS群（n = 20）、GlcNAc群（n = 20）である。上記のように経口摂取を行い、PBS群とGlcNAc群から無作為に10匹のマウスを選んでNK細胞の枯渇を行った。1日後、各マウスに経鼻感染させ（1×104 EID50）、Mock群マウスにはPBSを接種した。各群の体重と生存率を14日間毎日モニターした。

腸内常在菌のコロニー形成とサンプル採取
抗生物質で前処理したSPFマウスの腸を特定の細菌株で処理した。A. muciniphila、Clostridium sp.およびP. sartoriiを別々に37℃の嫌気条件下で48時間培養し、遠心分離（5,000 rpm、5分間、4℃）により採取し、1×109 CFU/mLの濃度でPBSに再懸濁した。抗生物質で前処理したマウス（n＝20）を無作為に4群（各群n＝5）に分け、ビヒクル（滅菌PBS、200μL/マウス、第1群）、A. muciniphila懸濁液（200μL/マウス、第2群）、Clostridium sp.懸濁液（200μL/マウス、第3群）、またはP. sartorii懸濁液（200μL/マウス、第4群）を毎日経口投与した。1週間後、マウスの盲腸内容物を採取し、超高速液体クロマトグラフィー-多重反応モニタリング-質量分析（UHPLC-MRM-MS）分析を行った。

病理組織学および免疫組織化学
採取した肺を4%パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋した。パラフィン包埋した各組織サンプルを5μm厚の切片に切り出した。組織切片を脱パラフィンし、再水和し、ヘマトキシリン-エオシン（HE）で染色して病理組織学的解析を行った。肺切片はAxioVert 200 M（Zeiss, Oberkochen, Germany）の光学顕微鏡を用いて評価した。染色したスライドをPannoramicスライドスキャナー（Pannoramic 250/MIDI）を用いてスキャンし、形態学的変化を半定量的スコアで評価した。スコアリングには、引用文献66,引用文献67を参考にした二重病理組織学的スコアリングシステムを用い、病理学的重症度を評価した。各基準について、スコア0＝なし、1＝肺切片の1～10％、2＝肺切片の11～25％、3＝肺切片の26～50％、4＝肺切片の50％以上が影響を受けている。

免疫組織化学実験は2番目の切片で行った。肺切片をPBSで洗浄し（3×5分）、PBST（PBS中0.3％Triton X-100）中で室温で30分間インキュベートした後、PBSで洗浄した（3×5分）。切片をPBS-Tween（0.05%）中の5%正常ヤギ血清で室温で1時間ブロッキングした。一次抗体（ウサギ抗インフルエンザ核タンパク質[NP]、希釈度1:500、GeneTex Irvine, CA, USA）を加え、4℃で一晩インキュベートした。PBSで洗浄後（5×15分）、切片をCoraLite594標識ヤギ抗ウサギIgG（希釈度1:400、Proteintech社、武漢、中国）と室温で1時間インキュベートした。画像はPannoramicスライドスキャナー（Pannoramic 250/MIDI）で得た。

盲腸内容物のメタボローム解析
ガスクロマトグラフィー質量分析計（GC - MS）および超高速液体クロマトグラフィー - MS（UPLC - MS）を用いてグローバルなメタボローム解析を行った。GC - MS 分析は、PEGASUS HT 飛行時間型質量分析計 (LECO) を搭載した Agilent 7890B ガスクロマトグラフを用いて実施しました。UPLC - MS 分析は、Agilent 1290 Infinity UPLC および AB triple TOF 5600/6600 質量分析計 (AB SCIEX) を使用して実施しました。再現性を評価するために、サンプル等価物を混合して品質管理（QC）を調製した。詳細なサンプル調製、GC - MSおよびUPLC - MS分析、QC調製については、補足資料のMethodsセクションに記載されている。GC - MSから生成されたイオンピークはLECO-Fiehn Rtx5データベースでアノテーションされ、UPLC - MSからのものはMetDDAデータベースおよびLipDDA法でアノテーションされた。すべてのデータは統計解析の前に正規化のために対数変換した。

細胞生存率アッセイ
CCK-8キット（Donjindo, Kumanoto, Japan）を用いて、薬剤処理したCaco-2細胞の生存率をメーカーのプロトコールに従って測定した。Caco-2細胞を96ウェルプレートに播種し、80％コンフルエントに達するまで培養した。細胞を異なる濃度の化合物で24時間処理した後、10μLのCCK-8溶液を加え、37℃で3時間インキュベートした。450nmの吸光度をSpark 10 M（Tecan Austria GmbH Untersbergstr, Grödig, Austria）を用いて測定した。

細胞培養と処理
Caco-2細胞は、10％ウシ胎児血清（FBS）（PNA-Biotech、ドイツ）を含むDMEM（Gibco 11,320-033）中、5％CO2、37℃で培養した。Caco-2細胞を12ウェルプレートに1×105個／ウェルで80％のコンフルエントに達するまで播種した。処理した細胞をMOI 0.1のインフルエンザウイルスに1時間感染させ、その後PBSで2回洗浄した。対応する濃度の化合物を添加し、感染細胞とインキュベートした。感染後異なる時点（12、24、36時間）で細胞培養上清を採取し、ウイルスRNA（vRNA）を定量し、50％組織培養感染用量（TCID50）を決定した。その後、細胞ペレットをウェスタンブロッティングに供した。

ウェスタンブロッティング
細胞を哺乳類タンパク質抽出試薬中で氷上溶解した。ウェスタンブロッティングは、以前に記載されたとおりに実施した。ウェスタンブロットアッセイに用いた抗体は以下の通りである：ウサギ抗インフルエンザNPタンパク質抗体（希釈度1:3000、GeneTex、Irvine、CA、USA）およびウサギ抗GAPDH抗体（希釈度1:3000、Cali-Bio、Coachella、CA、USA）。結合したAbsは、HRP標識抗ウサギIgG二次抗体（希釈度1:5000、ZSGB-BIO、北京、中国）およびECL現像（Pierce）を用いて、製造元のプロトコールに従って検出した。

TCID50分析
前述のように、MDCK細胞を用いてTCID50-凝集（TCID50-HA）アッセイによる滴定を行った。MDCK細胞を96ウェルプレートに播種し、感染細胞の上清をDMEM（Sigma-Aldrich）で連続希釈し、96ウェルプレートのMDCK細胞に1時間吸着させた。接種液を除去し、細胞をPBSで洗浄し、新鮮なDMEMで維持した。MDCK細胞を37℃で72時間インキュベートし、Spearman - Karber法を用いてlog10 TCID50/mLを計算することによりウイルス力価を決定した。

肺サンプル中のウイルス量の滴定
ウイルス力価を測定するために、10日齢のSPF胚化鶏卵に肺ホモジネートの希釈上清を接種した（マウスの肺サンプル調製に記載）。37℃で72時間後、血球凝集のためにアラント液を採取した。ウイルス力価は、ReedとMuenchが記載した方法で算出した。

サイトカイン濃度の測定
肺ホモジネートの上清および血清中のIFN-β、IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、およびIL-10を含むサイトカイン濃度は、酵素結合免疫吸着測定（ELISA）キット（NeoBioscience Technology Company、深セン、中国）を用いて検出した。

RNA抽出およびqRT-PCR
感染肺組織中のvRNAを定量するために、全肺をPBS（1 mL/肺）中でホモジナイズし、ホモジネートを8000 rpmで5分間遠心分離し、上清を使用するまで-80℃で保存した。上清からTRIzol（Invitrogen）を用いて、製造者の指示に従って全RNAを抽出した。 vRNAは、U12プライマーを用いてAMV逆転写酵素（タカラバイオ、日本）で逆転写した。qRT-PCRは、ABI ViiA 7 PCRシステム（Applied Biosystems、米国）とSYBR Green PCR Kit（Roche、スイス）を用いて行った。pCAGGS-NPプラスミドを用いて標準曲線を作成し、vRNAの数を算出した。IAVの相対的なNP mRNAレベルをGAPDH mRNAに対して正規化し、閾値サイクル計算法（2-ΔΔCT）によって解析した。qRT-PCRに使用したプライマーを表S1およびS2に示す。

in vivoでのCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、およびNK細胞応答の決定
SPFマウス（総数40）を、PBS群とGlcNAc群の2群（n = 20）に無作為に割り付けた。PBS群のマウスには200μLのPBSを経口投与し、GlcNAc群のマウスには1日あたり1000mg/kgのGlcNAcを投与した。インフルエンザ感染は上記のように行った。0、1、3、および5dpiに、各群から3匹のマウスの血液、脾臓、および肺を採取し、フローサイトメトリーによりCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、およびNK細胞の反応を測定した。

末梢血単核球、肺リンパ球、脾臓単核球の分離
血液サンプルをNa2EDTAで抗凝固し、0.84% NH4Cl溶液に再懸濁して赤血球（RBC）を溶解した。末梢血単核球（PBMC）は、PBSで2回洗浄した後に回収し、細胞数は細胞数プレートを用いて算出した。

肺リンパ球は、以前に記載されたように単離された引用70 肺内の血液量を最小限にするため、マウスは眼窩腔から失血死させた。単細胞懸濁液を得るため、肺を摘出し、セルストレーナー（BD Falcon）に通した。細胞を35％パーコール液（PBS緩衝液中）に再懸濁し、1,500rpm、室温で15分間遠心した。リンパ球ペレット中の赤血球を0.8% NH4Clで溶解し、PBSで2回洗浄した。

脾臓を摘出し、セルストレーナー（BD Falcon）に通して単一細胞懸濁液を得、0.84% NH4Clで赤血球を溶解し、脾臓白血球を分離した。

フローサイトメトリー
血液中のNK細胞応答を調べるために、脾臓および肺の単細胞懸濁液を、若干の修正を加えて、以前に記載されたように染色した。その後、製造業者の指示に従って、細胞を表面マーカーで染色し、固定、透過処理し、サイトカインについて細胞内染色した。フローサイトメトリーに使用した抗体と試薬は以下の通り： PE-抗マウスCD49b（Cat. #108907 ）、FITC-抗マウスCD3（Cat. #100204 ）、PE-抗マウスCD8a（Cat. #100707 ）、APC-抗マウスCD4（Cat. #100412 ）、抗マウスCD16/32（Cat. #101320 ）、APC-抗マウスCD107a（Cat. #121613 ）、APC抗マウスFceRla（Cat. #134316 ）およびPE/Cyanine7-抗マウスIFN-γ（Cat. #505825 、BioLegend）を用いた。染色した細胞は、Cytoflex-LXフローサイトメーター（Bekeman）を用いてフローサイトメトリーで解析した。データはFlowJoソフトウェア（Tree Star）を用いて解析した。

NK細胞の精製
NK細胞は、EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit（StemCell Technologies社製）を用い、製造元の指示に従って精製した。肺または脾臓の単細胞懸濁液（1×106 cells/mL）を、2% FBSおよびペニシリン-ストレプトマイシンを添加したRPMIで処理した。細胞（2 mL）を5 mLチューブに移し、100 µLの分離カクテルと混合し、室温で10分間インキュベートした。あらかじめボルテックスしておいたRapidSpheres（200μL）を加え、混合し、室温で5分間インキュベートした。チューブを（蓋をせずに）磁石の上に置き、インキュベートした後、反転させ、濃縮したNK細胞懸濁液を新しいチューブに移した。最後に、ノイバウアー血球計数器を用いて全有核細胞数を測定した。

NK細胞養子移植
10匹のSPFマウスをPBS群とGlcNAc群の2群（n = 5）に無作為に割り付けた。経口投与は前述のように行った。マウス初代NK細胞を、EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit（StemCell社製）を用いてC57BL/6マウスの脾臓から精製し、1×106個のNK細胞を含む200μLのPBSを、尾静脈からレシピエントマウス（各群n＝10）に静脈内注射した。同日、すべてのレシピエントマウスにケタミン／キシラジン混合液を腹腔内注射して麻酔し、1×104 EID50 H7N9を経鼻接種した。感染マウスの生存率と体重を毎日モニターした。

NK細胞の枯渇
44匹のマウスにPBSまたはGLcNAcを1週間経口投与した後、4群に分けた： PBS+PBS群、PBS+抗アシアロGM1群、GlcNAc+PBS群、GlcNAc+抗アシアロGM1群である。NK細胞の枯渇は前記のように行った。引用70 B6マウスは感染の1日前に50μLの抗アジアロGM1（和光ケミカルズ）で処理した。その他のマウスにはPBSを腹腔内注射した。NK細胞の枯渇は、フローサイトメトリーにより肺中のNK細胞の割合を測定することで確認した。

NK細胞活性測定
NK細胞活性は、標的細胞としてカルセイン-AM標識YAC-1細胞を用いたカルセイン放出試験により測定した。標的細胞をカルセイン-AMで標識するために、1×106個のYAC-1細胞を、5μMのカルセイン-AMを含むRPMI-1640培地に懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。標識した標的細胞（1×104個/ウェル）を96ウェルプレートに移した。分離したNK細胞を、エフェクター対標的（NK：YAC-1）比50：1でプレートに加え、37℃で4時間インキュベートした。カルセイン-AM標識YAC-1細胞からのカルセイン放出を測定するため、Infinite M200 PROマイクロプレートリーダー（Tecan社、スイス、メネドルフ）を用いて、採取した上清の蛍光強度を励起485 nm、発光530 nmで測定した。自発的放出は、エフェクター細胞が存在しない標的細胞領域の蛍光で判定した。最大蛍光放出は、標識標的細胞を1% Triton X-100で処理することで判定した。NK細胞活性（殺傷率）は以下のように計算した：特異的放出（％）＝100×（［実験蛍光放出］-［自発蛍光放出］）／（［最大蛍光放出］-［自発蛍光放出］）。すべての試験は3連で行った。

UHPLC-MRM-MSによる腸内容物中のGlcNAcの検出
各サンプルのアリコートを秤量し、2mLのエッペンドルフチューブに移した。1000μLの抽出液（アセトニトリル：メタノール：水＝2：2：1）を加えた後、サンプルを30秒間ボルテックスし、40Hzで4分間ホモジナイズし、氷水浴中で5分間超音波処理した。ホモジネートと超音波処理のサイクルを3回繰り返し、12,000rpm、4℃で15分間遠心した。透明な上清のアリコートを、UHPLC - MS/MS分析用にさらに10倍に希釈した。

UHPLC 分離は、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 (2.1 mm × 150 mm、1.8 μm) を搭載した Agilent 1290 Infinity II シリーズ UHPLC システム (Agilent Technologies) を用いて行いました。移動相Aは水中0.2%ギ酸、移動相Bはメタノール。溶出グラジエントをTableに示す。S3. 流速は300μL/分、カラム温度は35℃、オートサンプラー温度は10℃、注入量は1μLとした。アッセイ開発には、AJS エレクトロスプレーイオン化 (AJS-ESI) インターフェースを備えた Agilent 6495 トリプル四重極質量分析計 (Agilent Technologies) を使用しました。イオン源パラメータは、キャピラリー電圧 = -2500 V、ノズル電圧 = -1500V、ガス (N2) 温度 = 250℃、ガス (N2) 流量 = 11 L/分、シースガス (N2) 温度 = 400℃、シースガス (N2) 流量 = 12 L/分、ネブライザー = 35 psi でした。対象分析物のMRMパラメータは、各分析物の標準溶液を質量分析計のAPIソースに直接注入して最適化した。分析対象物ごとに少なくとも2つのMRMトランジション（すなわちQ1/Q3ペア）を取得し、最も感度の高い2つのトランジションをMRMスキャンモードで使用して、各Q1/Q3ペアのコリジョンエネルギーを最適化した。分析物ごとの2つのMRMトランジション間で、最も高い感度と選択性を示したQ1/Q3ペアを定量モニタリングに使用した（表S4）。追加のトランジションは、標的分析物の同一性を確認するための修飾子として機能しました。MRM データの取得および処理には、Agilent MassHunter Work Station ソフトウェア (B.10.00, Agilent Technologies) を使用しました。

DNA 抽出とメタゲノムライブラリーの配列決定
すべての糞便サンプルは、採取後直ちに-80℃で凍結し、氷上で実験室に輸送した。Citation73 DNA濃度と品質の検出には、Nanodrop 2000 spectrophotometer（NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA）、Qubit 3.0 fluorometer（Life Technologies, Carlsbad, CA, USA）、0.8%アガロースゲル電気泳動を用いた。

適格なDNAサンプル（1 µg）をCovaris社製の超音波破砕機を用いて約350 bpの断片にランダムに分割し、末端修復、テールの付加、シークエンスアダプターの付加、精製、PCR増幅を行って全ライブラリーを調製した。予備定量にQubit 3.0を用い、ライブラリーを2ng/µLに希釈し、Agilent 2100（Agilent Technologies）でライブラリーのインサートサイズを検出した。ライブラリーの有効濃度を決定するためにqPCRを用いた。ライブラリーの品質を保証するために、ライブラリーの有効濃度は3 nM以上でなければならない。

β-多様性指標の決定
β-多様性は加重UniFrac距離を用いて計算し、主座標分析（PCoA）を用いて評価した。サンプル間のBray - Curtis距離は、Rソフトウェア（バージョン3.6.0）（The R Foundation, Vienna, Austria）のデフォルト関数を用いて主成分分析に用いた。各グループ化変数について、veganパッケージとapeパッケージを用いて95%信頼楕円を計算した。

メタゲノム解析、遺伝子カタログ作成、遺伝子発現量計算
MGIseq2000を用いて適格なライブラリーの塩基配列を決定した。クリーンなデータを作成するために、リードの一定割合（デフォルトは40bp）を超える低品質塩基（品質値≦38）、リードの一定割合（デフォルトは10bp）に達するN塩基、および一定閾値（デフォルトは15bp）を超えるAdapterとのオーバーラップを除去した。ホストリードはBowtie2を用いてフィルターした。Citation74,Citation75 オーバーラップしたリードを、ゲノムを使用せずに、スプライシングソフトウェアidbaud - de Bruijnグラフに基づく-でリンクした（http://i.cs.hku.hk/~alse/hkubrg/projects/idba_ud/）。Citation76,Citation77 有効な配列をスプライシングし、アセンブルした。k値をsmallからlargeまで繰り返し、短いコンティグや深さの浅いコンティグを閾値に基づいて除去した。遺伝子の長さが100 nt未満の配列を除去した後、デフォルトのパラメータで遺伝子予測にMetaGeneMark softwareCitation75を用いた。各サンプルについて遺伝子予測結果を混合し、CD-HIT softwareCitation78,Citation79を用いて冗長性を除去した。冗長遺伝子カタログを95%同一性、90%カバレッジパラメータでクラスタリングし、各クラスの最長遺伝子を代表配列として、非冗長遺伝子セットを構築した。

遺伝子量を決定するために、各サンプルのクリーンデータをBowtie2を用い、アラインメントパラメータ:Citation80,Citation81 -end-to-end, -sensitive, -I 200, -X 400で非冗長遺伝子カタログと比較した。各サンプルについてリード数を計算し、＜＝1リード数を支持する遺伝子を決定し、絶対量情報を得た。遺伝子の長さとシーケンスの深さがアバンダンスの推定に与える影響を考慮し、絶対アバンダンス情報は上記のように正規化する必要がある。

分類学的アノテーションとアバンダンスプロファイリング
DiamondソフトウェアのBLASTpコマンド（v0.9.12.113）Citation84を用いて、ユニゲンのタンパク質配列をNR（non-redundant protein）のバクテリアライブラリー（E = 1-5）とアライメントし、最もスコアの高いヒットを最終的なアノテーション結果として選択し、NRライブラリーに対応する分類学的情報データベースを通じて種のアノテーションを取得し、次に種に対応する遺伝子存在量の合計を用いて種の存在量を計算した。ドメイン、王国、門、綱、目、科、属、種レベルでの種の存在量は、対応する遺伝子量の総和として算出した。

統計解析
線形判別分析効果量（LefSe）を用いて、種レベルでの差異効果に対する存在量の影響の大きさを推定した（対数線形判別分析（LDA）スコア閾値2を使用）。wilcox.test（バージョン3.6.0）を用いて、異なる分類レベルでの微生物群集の存在量を比較した。

生存率はKaplan - Meier分析により推定し、均質性はlog-rank検定により評価した。マウスおよび細胞モデルのデータは平均値±SDで表した。統計的有意性は、両側Student's t-test、一元配置分散分析、または必要に応じて二元配置分散分析により検定した。統計的有意性はP <.05とした。解析は、GraphPad Prism v9.0.0.121（GraphPad Software, San Diego, CA, USA）を用いて行った。

著者の貢献
実験は主にXTHが行い、一部の実験はXLS、YZ、CJL、XMSの協力を得た。X.H.、Q.Z.、M.J.はデータを解析した。XTHは共著者の意見を取り入れながら原稿の第1版を執筆し、QZとMLJは原稿を確認し、最終版の一部を執筆した。

補足資料
補足資料
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謝辞
メタゲノム解析にご協力いただいた武漢Frasergen Bioinformatics Co.Ltd、メタボロミクスにご協力いただいた上海Biotree Biotech CO.

情報開示
著者による潜在的な利益相反は報告されていない。

データ利用声明
本研究で作成したデータセットは、BioProject accession PRJNA861413としてNCBISRAデータベースに寄託した。本研究で生成・解析されたメタボロミクスデータセットは、MetaboLightsリポジトリ（アクセッション番号MTBLS5410、http://www.ebi.ac.uk/metabolights/MTBLS5410）で利用可能です。UHPLC - MRM-MSの生データは、https://doi.org/10.6084/m9.figshare.20377545.v1 および https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24042927.v1。その他の関連データは、データアクセス契約に署名の上、合理的な要求があれば、対応する著者から入手可能である。通信および資料請求はMeilin JinまたはQiang Zhangまで。

補足資料
本論文の補足データは、https://doi.org/10.1080/19490976.2023.2271620。

追加情報
資金提供
本研究は、中国国家自然科学基金（32172891）、NSFC国際（地域）協力交流プロジェクト（31820103015）、湖北省自然科学基金（助成金番号2021CFA018）、中央大学基礎研究基金（2662021SYQD002）の助成を受けた。
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