ヒト腸内細菌Faecalibacterium属の分類と定量化のための新しい遺伝子マーカー
ヒト腸内細菌Faecalibacterium属の分類と定量化のための新しい遺伝子マーカー
https://academic.oup.com/femsec/article/99/5/fiad035/7093396?login=false
丹野宏紀（データキュレーション）、Jean-Marc Chatel（調査）、Rebeca Martin（調査）、Denis Mariat（調査）、坂本光雄（方法論）、山崎正雄（プロジェクト管理）、Seppo Salminen（構想）、Miguel Gueimonde（調査）、遠藤章人（構想を描く）
FEMS Microbiology Ecology, Volume 99, Issue 5, May 2023, fiad035, https://doi.org/10.1093/femsec/fiad035
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2023年3月29日
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Faecalibacterium prausnitziiは、健康なヒトの微生物叢のバイオマーカーとして期待されている。しかし、これまでの研究では、この種の不均一性が報告され、F. prausnitzii株には種レベルでいくつかの異なるグループが存在することが判明していました。私たちの最近の研究では、F. prausnitziiの定量化のために以前に開発された方法は、F. prausnitzii種内の不均一性と、種の無効な遺伝子マーカーである16S rRNA遺伝子の適用により、種レベルでの特異性がないことが判明しました。したがって、これまで利用可能だったデータでは、異なるグループに関する情報を提供できず、宿主の健康に対するこの菌の重要性の理解に限界があった。ここでは、F. prausnitzi関連分類群を定量化するための代替遺伝子マーカーを提案する。rpoA遺伝子の配列をターゲットとして、合計9つのグループ特異的なプライマーペアを設計した。その結果、rpoA遺伝子を用いたqPCRにより、F prausnitzi関連分類群の定量に成功した。開発したqPCR法を健康な成人6名に適用したところ、便サンプル中の異なる標的グループの存在量と有病率に著しい差があることが判明した。本アッセイにより、Faecalibacteriumの集団がヒトの健康に与える影響を詳細に理解し、Faecalibacteriumの特定の集団の枯渇とヒトのさまざまな疾患との関連性を理解することができるようになります。
Faecalibacterium、グループ特異的定量、qPCR、recA、rpoA、分類学
課題欄です：
研究論文
略語の説明
MAM
微生物性抗炎症分子
炎症性腸疾患
炎症性腸疾患
エーエヌアイ
平均ヌクレオチド同一性
qPCR
クオンツピーアール
標準偏差
標準偏差
はじめに
Faecalibacterium prausnitziiは、ヒトの腸内で炭水化物の代謝から酪酸を生成する（Louis and Flint 2009）。酪酸は腸管上皮細胞の主要なエネルギー源であり、宿主の健康にとって様々な有益な特性を有している。酪酸は、ヒストンアセチル化やマイトジェン活性化プロテインキナーゼの制御など、さまざまな経路で有益な効果を発揮する（Davie 2003, Kida et al. 2006, Macfarlane and Macfarlane 2012）. また、マウスにおけるF. prausnitziiのコロニー形成は、サリチル酸やシキミ酸など、潜在的に有益な効果を発揮するいくつかの代謝産物に関連しています（Miquel et al. 2015）。さらに、この微生物は、宿主におけるNF-κB経路の活性化の低下に関連する微生物抗炎症分子（MAM）由来のペプチドを産生する（Quevrainら2016、Breynerら2017、Agerら2022）。これらの活性分子の有益な特性は、宿主動物における抗炎症特性、腸バリア機能の維持、腸管免疫恒常性、および大腸がん細胞のアポトーシス誘導と関連している（Kinoshita et al. 2002, Furusawa et al. 2013, Donohoe et al.） 腸内のこの微生物の枯渇は、炎症性腸疾患（IBD）、代謝障害、精神疾患を含むいくつかの疾患の発症や重症化と関連していた（Sokol et al. 2009, Lopez-Siles et al. 2017, Borkent et al. 2022, Michels et al.） これらの事実はすべて、この微生物が健康維持に重要であることを強調しています。
最近の研究では、F. prausnitzii株の間で大きなゲノム異質性があることが報告され、検査した株の中に種レベルで異なる8つのグループが存在することがわかりました（Fitzgerald et al. 2018, Tanno et al. 2022）。8グループのうち3グループは、平均塩基配列同一性（ANI）解析によるゲノムレベルの同一性に基づき、主にFaecalibacterium属の新規種としてごく最近再分類されました。それらは、ヒトの腸に由来するFaecalibacterium duncaniae, F. hattorii, F. longumと名付けられた（Zou et al.2021, Sakamoto et al.2022）．その他のグループはまだ再分類のための研究が行われていない。また、先に述べた8つのグループから外れていたFaecalibacterium butyricigeneransもヒトの腸から報告されている（Zou et al.2021年）。さらに、鶏の腸からのFaecalibacterium gallinarumが記載された（Sakamoto et al.2022）。これまでの研究では、アトピー性皮膚炎患者および小児IBDにおけるFaecalibacteriumの異なるグループ間の明確な集団が報告されています（Song et al. 2016, Zhang et al. 2018）。さらに、最近の研究では、Faecalibacteriumの異なるグループに由来するMAMが異なる抗炎症特性を示すことが報告されました（Auger et al. 2022）。これらの研究は、異なるグループが宿主の健康に対して様々な影響を与えることを示唆しています。
16S rRNAをコードする遺伝子（16S rRNA遺伝子）は、細菌分類のための最もよく研究され特徴付けられた遺伝子マーカーである。16S rRNA遺伝子の配列類似度の種閾値は約98.7%〜99.0%（Stackebrandt and Ebers 2006）であり、異なる種が99%以上の類似度を共有することもあります。一方、Tannoらは、Faecalibacterium属は一般に1ゲノムあたり6コピーの16S rRNA遺伝子を持ち、1ゲノム/株内のコピー間の配列類似度は、種の閾値である98.7%より低いこともあると報告している（Tanno et al. 2022）。このような低い類似性は、コピー間で、特に16S rRNA遺伝子のV6領域でかなりのヌクレオチド置換があるためである。さらに、低い配列類似性を共有する16S rRNA遺伝子のコピーは、他のグループ、すなわち他の種の株と高い配列類似性を示すこともあった。16S rRNA遺伝子配列の不均一性により、あるグループは16S rRNA遺伝子に基づく系統樹によって2〜3つのクラスターに分けられた（Tanno et al. 2022）。これらの結果は、16S rRNA遺伝子がFaecalibacterium属の同定や分類に適した遺伝子マーカーではないことを明確に示している。 非常に多くの場合、16S rRNA遺伝子はFaecalibacteriumの定量のための標的遺伝子として使用される。F. prausnitziiの定量化のために、リアルタイム定量PCR（qPCR）と組み合わせた多くのプライマーペアが開発され、健常者と特定の疾患を持つ患者の間で微生物の存在量が異なるという研究（Bartosch et al.2004, Rinttilä et al.2004, Balamurugan et al.2008, Sokol et al.2009 ）で定量データが含まれています。しかし、16S rRNA遺伝子配列の不均一性により、使用されたプライマーペアのいくつかは、Faecalibacteriumの一部のグループのみを対象としていた（Tanno et al. 2022）。プライマーペアがすべてのグループをカバーするとしても、定量される集団はFaecalibacteriumのすべてのグループ（旧F. prausnitzii sensu latoグループ）の合計であり、特定のグループではない。したがって、ヒト腸内のF. prausnitziiおよび関連グループの個々の集団は、本種が健康な微生物叢の有望なバイオマーカーとみなされているものの、まだ特徴づけられていない（Lopez-Siles et al. 2017）。
本研究では、Faecalibacterium属を分類するための新しい遺伝子マーカーとして、ハウスキーピング遺伝子を評価した。 また、ハウスキーピング遺伝子を用いて、Faecalibacteriumの各グループに固有のプライマーペアを設計し、特異的に定量化した。
材料と方法
ゲノムデータの取得とANIに基づく菌株のグループ化
本研究では、前回の研究（Tanno et al. 2022）で使用したF. prausnitzii株86株のゲノムデータを対象としました。これらは、潜在的な不完全性やコンタミネーション株（除外、ゲノムサイズ2.6Mbp未満または3.5Mbp以上）を除外した後、解析時点（2020年1月）でNCBIデータベースに登録されているF. prausnitzii株の完全またはドラフトゲノム配列すべてでした。さらに，F. butyricigenerans AF52-21TとF. longum CM04-06TのゲノムデータをCNGBdbデータベースから取得し，88株のリストを作成した．ANI値を算出することで菌株のゲノムレベルの同一性を判定し、ANI値を用いてANI分岐を表す距離行列（100％ANI）およびグループ分離（閾値約94％）のために、前述のように準備した（Tanno et al. 2022）。
ハウスキーピング遺伝子に基づく系統解析
16S rRNA遺伝子はFaecalibacterium属のグループレベルでの分類・同定に適した遺伝子マーカーではなかったため、他のBacillota（旧名Firmicutes）メンバーや関連菌の分類・同定に特徴があるatpA, dnak, groEL, pheS, recA, rpoAといった6種類のハウスキーピング遺伝子（Toriani et al. 2001, Naser et al. 2007, Neumann and Rehberger 2009, Muñoz et al. 2017, Liu et al. 2018）が最初のスクリーニングに含まれました。しかし、6つの遺伝子のうち2つ（atpAとdnak）は、完全に配列決定された株のゲノムに2つのコピーが存在するため、この解析から除外された（データは示さず）。残りの4つのハウスキーピング遺伝子は、ゲノム中に1つのコピーとして存在していたため、系統解析に含まれた。ハウスキーピング遺伝子の配列は、88株のゲノムから取得し、アライメントしてClustalW (Larkin et al. 2007)を用いて系統樹を作成した。ブートストラップ複製数は1000であった。ハウスキーピング遺伝子の塩基配列の類似性は、Genetyx software ver. 13 (Genetyx, Tokyo, Japan)を用いて評価した。
各群の特異的な定量を行うためのrpoAベースのプライマーペアの設計と評価
rpoA遺伝子の塩基配列を利用して、Faecalibacteriumに従来見出されていた異なるグループに対する特異的なプライマーペアを設計した。プライマーの設計にあたっては、解析時点（2021年7月）でNCBIデータベースに寄託されていたrpoA遺伝子配列を含むF. prausnitziiとFaecalibacterium sp.のすべての完全ゲノムとドラフトゲノム（n = 147）を、元の88株にさらに追加した。この追加は、88株を使用した際に、もともと1株、3株、4株、2株、1株を含むグループ2、5、7、8、9の株数が限られていたためである。新たに追加された菌株について、既述の通りANI値を求め（前野ら2016）、その値に基づいて菌株をグループに分離した。この分離後、グループ2、5、7、8、9の株数はそれぞれ3、7、8、8、4株と増加した（データ示さず）。さらに、解析時点（2022年7月）で入手可能な全配列株（n = 21）を用いて、ゲノムごとの16S rRNA遺伝子のコピー数をカウントした。
プライマーは、対象グループとの配列ミスマッチがなく、非対象グループとの配列ミスマッチが極力存在することを考慮し設計した。プライマーの特異性は、試験菌株に対するプライマーBLASTと、寄託されているすべてのDNA配列に対するBLASTNを用い、初期設定値で評価した。設計した特異的なプライマーのリストを表1に示す。
表1.
本研究で使用したプライマー
プライマー配列（5'→3'）TargetReferencesF-Bact_1369 CGGTGAATACGTTCCCGG Total bacteria Lopez-Siles et al. (2016) R_Prok_1492 TACGGCTACCTTGTTACGACTT Total bacteria Lopez-Siles et al. (2016) Fprau223F GATGGCCTCGCGTCCGATTAG Faecalibacterium genus Bartosch et al. (2004) Fprau420R CCGAAGACCTTCCTCC Faecalibacterium genus Bartosch et al. (2004) Faecali-group1-sp-F CCTGAGTGGCACATTGCAACT グループ1（F．prausnitzii） 本研究 Faecali-group1-sp-R TAAATGCTGTCAACGGGAAGG Group 1（F. prausnitzii） 本試験 Faecali-group2-sp-F CCAAGCTCGTCATGGAGCTC グループ2 本試験 Faecali-group2-sp-R ATGGTCAGCTTGTCGTAGTCA グループ2 本試験 Faecali-group3- sp-F AACCTGTCCGATGAGGCAGCC グループ3 本試験 Faecali-group3-sp-R TCTTCCACCGTGTTGATGCCT グループ3 本試験 Faecali-group4-sp-F GCCATCATCGAGAAGAATGAC グループ4（F．longum） 本試験 Faecali-group4-sp-R TGTGCATTGATCGTGCCATCC グループ4（F. longum） 本試験 Faecali-group5-sp-F GAAATTGTCCTGAACCTGAAA グループ5 本試験 Faecali-group5-sp-R CCTGTTTGTTGCGCTCAGCC グループ5本試験 Faecaligroup6-sp-F AAGGGCCGCGTTATGTGCCT グループ6 （F. duncaniae） 本試験 Faecali-group6-sp-R TAATCGATGGCCTGTCCAACG グループ6（F. duncaniae） 本試験 Faecali-group7-sp-F CCTGAATGGCACATCGCAACCT グループ7（F．hattorii） 本試験 Faecali-group7-sp-R ATGCTATCGACGGGAAGCGTA グループ7（F. hattorii） 本試験 Faecali-group8-sp-F GGTGAATTACAATGTTGAGAA グループ8本試験 Faecali-group8-sp-R TCTCGGTGCCAGCGCCTCA グループ8本試験 Faecali-GR9-sp-F AATGTCGAGCACCCGTG グループ9（F. butyricigenerans） 本試験 Faecali-group9-sp-R GATCTCAGCGCCAGCGCCTCG グループ9（F. butyricigenerans） 本試験
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設計したプライマーペアの特異性を確認するため、qPCRを用いたプライマー評価を3つのステップで実施した。第一段階として、Faecalibacterium属12株のrpoA遺伝子全塩基配列（954-969bp）をEurofins Genomics社（東京、日本）によりpEX-A2J2ベクターに挿入し、合成した。この12株には、全グループから少なくとも1株ずつ、グループ1からは3株、グループ6からは2株が含まれている（図2）。qPCRは、合成したDNA100 pg（= 7.43 log10rpoA遺伝子コピー）と特異的プライマーの組み合わせにより実施した。DNA Calculator（https://www.molbiotools.com/dnacalculator.html）を用いて、合成したDNA100 pg中の分子数を求めた。FastStart Essential DNA Green Master MixとLightCycler 96 system（Roche, Basel, Switzerland）を組み合わせて、製造者の説明書に従ってqPCRに使用した。標準曲線は、各プライマーペアについて、各対象グループの合成DNAを用いて作成し、グループ1および6については、それぞれATCC 27768TおよびA2165をリファレンスとして使用した。特異的な増幅を確認するため、融解曲線解析を実施した。サンプルは同じプレートで3回繰り返し実行し、平均値とSDを求めた。qPCRの検出限界は、連続希釈した合成DNAを用いて得られた結果に基づいて評価された。
プライマーの特異性確認の第2段階として、各グループの代表的な菌株から分離したDNAのうち、公的な培養コレクションや私たちのコレクションで入手できるものをqPCRに使用した。グループ1のBCRC 81047T（= F. prausnitzii ATCC 27768T）、グループ2のCNCM 4541、グループ3のCNCM 4540、グループ4のJCM 39211T（= F. longum CM04-06T）、JCM 31915T（= F. . duncaniae A2-165T）を第6群に、JCM 39210T ( = F. hattorii APC922/41-1T）を第7群に、JCM 39212T ( = F. butyricigenerans AF52-21T) を第9群に、分離したDNA10ngを本研究で使用しました。BCRC株はバイオリソース・コレクション・アンド・リサーチ・センター（BCRC）から，JCM株は日本微生物コレクション（JCM）からそれぞれ入手した．CNCM株は、当社のプライベートコレクションから入手したものである。解析時点（2022年3月）では、グループ5および8の菌株は公開培養コレクションに存在しなかった。 各グループに特異的なプライマーを組み合わせたqPCRは、上記の方法で実施した。サンプルは同じプレートで3連で行い、平均値とSDを求めた。
プライマー特異性評価の第3段階として、F. prausnitzii BCRC 81047T（グループ1）またはF. duncaniae JCM 31915T（グループ6）の培養物（約107個）を200mgの乳児便（9ヶ月齢）に加え、QIAamp DNA Stool Mini Kit（Qiagen、東京、日本）を用いて細菌培養物を加えた便サンプルまたは加えない便サンプルからDNA抽出をした。サンプル採取はヘルシンキ宣言のガイドラインに従って行われ、東京農業大学の倫理委員会の承認を得た。乳児の親から書面によるインフォームドコンセントを得た。分離されたDNAは、9グループのrpoAベースのqPCRに使用された。qPCR産物は、以前に記載された方法（Endo and Okada 2005）により配列決定された。また、Faecalibacterium属は、表1に示すBartoshら（Bartosch et al. 2004）が設計したFprau223F/Fprau420Rの16Sベースのプライマー対と先行研究（Tanno et al. 2022）に含まれるATCC27768Tの合成16S rRNA遺伝子を標準曲線として定量した。qPCRと組み合わせたプライマーペアは、先行研究（Tanno et al. 2022）のFaecalibacteriumのすべてのグループを等しく定量し、プライマーペアはOscillospiraceaeの他のメンバーの16S rRNA遺伝子とかなりの配列ミスマッチがあった。qPCR条件は別の場所（Tanno et al. 2022）に記載されていた。さらに、表1に示すように、F-Bact_1369/R_Prok_1492の16Sベースの細菌ユニバーサルプライマーペア（Lopez-Siles et al. 2016）を用いて、Faecalibacterium属と各グループの相対存在量を評価するために全菌の16S rRNA遺伝子コピー数を定量化した。標準曲線にはATCC 27768Tの合成16S rRNA遺伝子を用い、qPCRプログラムは95℃10分の初期変性、95℃10秒、60℃10秒、72℃15秒の45サイクルであり、サンプルは同一プレートで3重に実行し、平均値とSDを求めた。qPCR の検出限界は、F. prausnitzii BCRC 81047T を添加した便サンプルからの連続希釈 DNA を用いて得られた結果に基づいて決定された。
健常者の便サンプルにおける異なるFaecalibacteriumグループの定量化
便サンプル提供前に8週間以上抗生物質を投与していない、または2週間以上プレバイオティクスを投与していないボランティアを募集し、先行研究（Endo et al. 2020）で肥満度が22～25の健康成人男性6名（ボランティアA～F、平均±SD、26.3±6.7歳）から便サンプルを採取しました。排便後、便サンプルは直ちに嫌気性ジャー（アネロパック・アネロ、三菱ガス化学、東京、日本）に入れ、実験室に運び、採取後2時間以内に-80℃で保存した。サンプル採取はヘルシンキ宣言のガイドラインに従って行われ、東京農業大学倫理委員会の承認を得た。ボランティアからは、書面によるインフォームドコンセントを得た。採取したサンプルから、既出の方法（Takahashi et al. 2014）を用いて2週間以内にDNAを抽出した。Faecalibacterium（rpoAベース）、Faecalibacterium属（16Sベース）、総菌数（16Sベース）の9グループの定量化は、前述の方法で行った。FaecalibacteriumおよびFaecalibacterium属における各グループの相対存在量（％）は、総菌数を用いて算出した。16S/rpoA比は、16SベースのFaecalibacterium属qPCRとrpoAベースの9群特異的qPCRの合計を使用して求めた。サンプルは同じプレートで3回実施し、平均値とSDを求めた。
結果
Faecalibacterium属の分類のための新規遺伝子マーカー候補の選定
合計88株をANI値に基づくグループ分け、すなわち先行研究（Tanno et al. 2022）で記載された8グループにF. butyricigeneransの9番目のグループを追加して9グループに分けた（図S1、Supporting Information）。グループ1はF. prausnitzii sensu stricto、グループ4、6、7、9はそれぞれF. longum、F. duncaniae、F. hattorii、F. butyricigeneransでした。その他のグループは、F. prausnitziiとは種レベルで明らかに異なるが、まだ分類学的に再考され、この分類群から分離されてはいない。遺伝子の塩基配列に基づく系統樹では、9つのグループが樹上で独立したクラスターを形成していることがわかった（図1a；図S2、Supporting Information）。4つの遺伝子のうち、recAはグループ間配列類似度が最も低かった（図1b；図S1b、S1d、S1f、Supporting Information）。recA遺伝子のグループ間配列類似度の値が最も高かったのは、グループ4と9の株間で94.2%であった（表S1a、Supporting Information）が、グループ4の株間では98.5%を超える配列類似度が共有されていた。グループ内のrecA遺伝子の配列類似度の中央値は、グループ1では97.7%以上であったが、グループ間のそれはグループ4と9の間で記録された93.7%未満であった（図1b）。この結果は、recA遺伝子が高い識別力を持ち、Faecalibacterium属の分類・同定に適した遺伝子マーカーであることを示唆している。
図1.
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Faecalibacterium属88株のrecA遺伝子塩基配列（A）、グループ内（赤棒）およびグループ間（黒棒）のrecA遺伝子配列類似性（B）に基づく系統樹。最良適合進化モデルを用いて最尤樹を構築した。枝の値は1000回の高速ブートストラップによるブートストラップ支持率で、90%以上の値のみ表示した。Subdoligranulum variabile DSM 15176 (GCA_000157955.1) をアウトグループとして使用した。スケールバーは部位ごとの置換度を意味する。ANI値（図S1、Supporting Information）に基づくグループを異なる色で示し、グループ1、4、6、7、9はそれぞれF. prausnitzii sensu stricto, F. longum, F. duncaniae, F. hattorii, F. butyricigeneransとした。(B)において、1〜9の棒グラフはそれぞれグループ1〜9に対する配列類似度の中央値を示し、エラーバーはSDを示す。また、各グループの株数を示した。
各グループを選択的に定量するための新規特異的プライマーセットの設計と評価
4つのハウスキーピング遺伝子（groEL、pheS、recA、rpoA）のうち、recA遺伝子はグループを識別する力が高い。しかし、この遺伝子はグループ内配列の乖離が大きく、recA遺伝子配列を標的としたグループ特異的プライマーの指定ができなかった。一方、rpoA遺伝子の配列はグループ内配列の分岐が少なく、グループ特異的な配列領域が維持されており、グループ特異的なプライマーの設計が可能であった。設計したプライマーペアは、対象グループのrpoA遺伝子配列とは配列の不一致がなかったが、非対象グループの配列とはかなりの配列の不一致があった（表1）。BLASTN解析により、データベースに登録されているすべてのDNA配列が、プライマー配列と完全に一致しないことが確認された。
設計したプライマーペアは、まず合成したDNAを用いて評価を行った。その結果、新たに開発したrpoAベースのqPCRアッセイは、対象となるグループ（約7.43 log10rpoA遺伝子コピー）を正確に定量することができた。また、非標的群の標的群に対する相対増幅率は概ね1%未満であり、非標的群の50%以上は検出されないか、合計で検出限界（101.7分子/反応）以下であった（図2）。
図2.
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合成rpoA遺伝子とrpoAに基づくグループ特異的プライマーペアを用いた、標的グループに対する相対増幅率。各PCR反応には100pg（=7.43 log10rpoA遺伝子コピー）のDNA量を使用した。(A)〜(I)はそれぞれグループ1〜9に対する特異的なプライマーペアを使用する。グループ1および6では、それぞれATCC 27768およびA2165をリファレンスとして使用した。サンプルは同じプレートで3連で行い、平均値とSDを求めた。ND, 検出されなかった。BDL, 検出限界以下。
また、9グループのうち7グループ由来の培養物から分離したDNAを用いて、プライマーの特異性評価も実施した。rpoAベースのqPCRアッセイでは、標的グループは正確に定量されたが、非標的グループの定量は標的グループの1％未満であった（図3）。合計で60%以上の非標的グループが検出されなかったか、検出限界以下であった。
図3.
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培養物から分離したDNAとrpoAに基づくグループ特異的なプライマーペアを用いた、標的グループに対する相対増幅率。各PCR反応では10ngのDNA量を使用した（A）〜（G）はそれぞれグループ1〜9に特異的なプライマーペアを使用した。サンプルは同じプレートで3回繰り返し行い、平均値とSDを求めた。ND, 検出されなかった。BDL, 検出限界以下。
さらに、グループ1、3、6、9が検出限界以下と非常に少ない乳児便（9ヶ月児）に培養液を添加し、プライマーの特異性を評価した（表2）。F. prausnitzii BCRC 81047T（＝ATCC 27768T、グループ1）の培養物（約107個）を便サンプルに添加した後、DNAを分離し、qPCRに使用しました。グループ1のレベルは、培養物添加後に増加した。グループ1に対するグループ3と6の相対量は約0.2％であり（表2）、その他のグループは検出限界以下（105.6細胞/糞便）または検出されなかった。F. duncaniae JCM 31915T（＝A2-165T、グループ6）の培養液を便検体に添加した場合も、同様の結果が得られた。グループ6の濃度は培養液添加後に上昇したが、他のグループは検出限界以下または検出されなかった（表2）。グループ1特異的qPCRおよびグループ6特異的qPCRの産物は、それぞれグループ1のBCRC 81047T（アクセッション番号NZ_PXUP000000.1、LocusTag C7J97_RS08250） およびグループ6のJCM 31915T（アクセッション番号NZ_CP022479.1、LocusTag CG447_RS10630）のrpoA遺伝子配列と100％の一致をみた。さらに、16S-based qPCRを適用して、培養添加の有無にかかわらず、乳児便サンプル中のFaecalibacterium属を定量し、rpoA-based qPCRの結果と比較した。培養液を添加しない幼児便には、Faecalibacterium属は含まれていなかった。16SベースのqPCRで測定した細胞数（Faecalibacterium属として）は、培養添加後に増加した。16SベースのFaecalibacterium属qPCRで得られた値とrpoAベースの群特異的qPCRの合計を用いて計算した16S/rpoA比は、4.5～5.3倍だった（データ示さず）。完全に配列決定されたFaecalibacteriumの全株（n = 21）は、16S rRNA遺伝子を6コピー保有していた（Table S2, Supporting Information）。
表2.
F. prausnitzii BCRC 81047T（グループ1）またはF. duncaniae JCM 31915T（グループ6）の培養物を添加した場合と添加しない場合の乳児便中の各グループの相対存在率（％）。
Group123456789添加なし* BDL - BDL - - BDL + BCRC 81047T** 100 - 0.2 BDL - 0.2 - - BDL + JCM 31915T*** BDL BDL - BDL 100 - - BDL
-, Not detected; BDL, below detection limit (< 105.6 cells/g of feces).
*
全グループとも、培養液を添加しない便サンプルでは、検出されなかったか、BDLが検出された。
**
グループ1に対する相対的存在量(%)。
グループ6との相対量(%)。
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健康成人における各Faecalibacteriumグループの定量化
rpoAを用いた群特異的qPCRアッセイでは、健康な成人6名において、群間の有病率と存在量に著しい差が見られた（図4a）。グループ3はすべての被験者で観察され、6人中3人（被験者A、D、E）で最も多いグループであった（図4b）。4群F. longumと9群F. butyricigeneransは2番目に多い群で、6人中5人の被験者から検出された。6群F. duncaniaeは6人中4人から検出され、2人（被験者BとF）の被験者で最も多い群であった。グループ1のF. prausnitziiとグループ5は、6人中2人の被験者で定量された。グループ2、グループ7のF. hattoriiおよびグループ8は、検査したすべての被験者で検出されなかったか、検出限界以下であった。9群の相対存在量の合計は0.152%～0.759%（中央値±標準偏差（SD）＝0.521±0.237%）の範囲であった。16SベースのqPCRで評価したFaecalibacterium属の相対存在量は、6人の被験者で0.86%から8.48%（中央値±SD = 3.37±2.68%, 図4）であった。また、Faecalibacterium属のqPCRに基づいて算出した16S/rpoA比と、解析した9つの特定群の合計は、4.7～14.4（中央値±SD = 6.81±3.91 ）でした。
図4.
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健康な成人6名の総菌数に対する各グループおよびFaecalibacterium属の相対存在度（％）。サンプルは同一プレートで3回実施し、平均値を求めた。積み重ねられたバー（A）は、6人の被験者における各グループ（rpoAベース）の相対存在量を示す。積み重ねられたバーの色はグループを示す。グループ2、7、8は、検査したすべての被験者でNDまたはBDLであったため、表示していない。B）では、各グループ（rpoAベース）とFaecalibacterium属（16Sベース）の相対存在量をヒートマップで示し、相対存在量の値を表示した。16S/rpoA比は、Faecalibacterium属の相対存在量とグループ1〜9の相対存在量の合計に基づいて算出した。ND, 検出されなかった。BDL, 検出限界以下。
考察
Faecalibacterium属が私たちの健康状態にとって最も重要であると考えられているとしても、分類学的な問題や最適とは言えない遺伝子マーカー（16S rRNA遺伝子）の利用により、これまでの定量化方法にはいくつかの問題がありました。この事実は、これらの微生物の役割に関する我々の理解を制限するものでした（Tanno et al.） 16S rRNA遺伝子は、細菌の分類と複雑な微生物叢の研究にとって、明らかに最も特徴的な遺伝子である。これは、97％以上の細菌種に対して信頼できるマーカーである（Větrovský and Baldrian 2013）；しかし、Faecalibacterium属は残りのグループに属している（Tanno et al.） そこで、Faecalibacterium属の分類と定量化のための代替遺伝子マーカーを検討した。
試験したハウスキーピング遺伝子のうち、recA遺伝子はグループ間の配列類似度が最も低く、Faecalibacterium属の分類と同定に最も適した遺伝子マーカーであった。recA遺伝子は、系統推論に適した120種類の細菌マーカー遺伝子の一つであり（Parks et al. 2017）、系統的に関連する微生物間の正確な鑑別を提供する（Pietilä et al. 2000, Torriani et al. 2001, Zbinden et al. 2011）。一方、recA遺伝子の配列はグループ内で発散しすぎており、グループ特異的なプライマーを設計することはできませんでしたが、rpoAはこれらのプライマーを設計するのに適した遺伝子マーカーでした。ハウスキーピング遺伝子を標的としたqPCRアッセイは、ヒト腸内細菌叢におけるビフィズス菌と乳酸菌の定量に適用されています（Junick and Blaut 2012, Costa et al.2014）。今回設計したrpoAベースのプライマーとqPCRを組み合わせることで、非常に低い交差反応性（1％未満）で標的グループを正確に定量することができ、開発したqPCRアッセイがFaecalibacterium属をグループ（種）レベルで定量するのに有用であることが示されました。これまでに報告されているqPCRアッセイは、Faecalibacterium属を種レベルで定量することができず、旧F. prausnitzii sensu lato（丹野ら2022）のグローバル定量に依存していました。
培養添加した乳児便では、16S/rpoA比は4.5から5.3の間であった。これは、使用した遺伝子間でコピー数が異なるためであった。16S rRNA遺伝子は、完全に配列が決定されたFaecalibacterium属の単一ゲノムにおいて、合計6コピーが共通して保存されているが、rpoAは1コピー遺伝子である。したがって、16SベースのqPCRで評価した相対量は、rpoAベースのqPCRで評価した相対量の6倍（16S/rpoA比）と理論上なる。同様の結果は、Mascoら（Masco et al. 2007）により報告されており、彼らは16SベースおよびrecAベースのプライマーペアを用いてプロバイオティクス製品中のビフィズス菌を定量化しました。細胞濃度に基づく標準曲線に培養物のDNAを使用すれば、このバイアスは取り除けるかもしれません。しかし、解析時（2022年3月）には、9グループのうち2グループの菌株が公的な培養コレクションや当社のプライベートコレクションで入手できなかったため、全グループの標準曲線を作成するために合成DNAを使用しました。便サンプルからのDNA抽出は、常に異なる抽出効率を含み（Yang et al. 2020）、微生物の定量に大きな影響を与える。合成遺伝子は抽出バイアスや異なる増幅効率から解放されるため、合成遺伝子に基づく標準曲線は、便サンプル中の絶対細胞数の測定には適切ではない。しかし、得られた値は全細菌の細胞数で正規化されるため、相対的な存在量を評価することは可能である。
rpoAベースのqPCRは、健康な日本人成人6人のFaecalibacteriumの各グループを定量するために適用されました。グループ3は最も優勢で豊富なグループであり、0.173±0.121%（中央値±SD）の相対量ですべての被験者から検出されたが、本研究では限られた数の被験者しか対象としていないため、グループ3が最も優勢であった。その優位性にもかかわらず、このグループはまだ分類学的に特徴づけられていない。今後、このグループの分類学的位置づけを確立し、ヒトの健康への潜在的影響を研究することが不可欠である。グループ1（F. prausnitzii）とグループ6（F. duncaniae）のゲノムは公開データベースに豊富に含まれており（図S1、参考情報）、この2つのグループがよく分離され特徴づけられていることを示している。グループ1および6は、それぞれ、参照株であるATCC 27768T（F. prausnitziiのタイプ株）および最も特徴的なFaecalibacteriumのA2-165株（＝JCM 31915T, F. duncaniaeのタイプ株）を含む。これら2つのグループは、成人6名のうち2～3名で豊富（相対量0.1％以上）であったが、他の被験者では検出限界以下であったことから、特定の成人では豊富であるが、流行はしていないことが示唆された。Faecalibacteriumの有病率や存在量を含む腸内細菌叢は、宿主の年齢や地理などのいくつかの要因によって影響を受けるため（De Filippis et al. 2020, Sang et al. 2022）、これらの要因を考慮して各Faecalibacteriumグループの集団を調べることは興味深いことである。
6名の被験者の16S/rpoA-ratioは6.81±3.91（中央値±SD）であり、上述のように理論値である6に近い値であった。一方、被験者CとDの比率は理論値より著しく高く（図4b）、Faecalibacterium属の未同定グループが優勢であることが示唆された。最近の研究で、参照用Faecalibacteriumゲノムと多様な宿主に由来するFaecalibacterium様メタゲノム集合ゲノムを用いてFaecalibacteriumのゲノム多様性が報告された（De Filippis et al. 2020）。本研究では、22種類の種レベルのクレードを同定し、そのうち11種類はヒト由来のものであった。この11のクレードには、本研究で検出された8つのグループが含まれていたが、グループ9のF. butyricigeneransは含まれていなかった。また、健常者との比較により、特定の疾患を持つ患者や肥満者におけるクレードの有病率を特徴付けることもできた。しかし、得られた知見は定性的なものであり、定量的なものではありませんでした。たとえ有病率が重要であっても、定量的なデータは、ヒトの健康に対するFaecalibacteriumの各グループの重要性について、より良い洞察を提供するでしょう。
数多くの研究が、F. prausnitziiといくつかの疾患との逆相関を報告しており、したがって、ヒトの健康な微生物叢の有望なバイオマーカーと考えられている（Lopez-Siles et al. 2017）。しかし、本種はもはや単一種ではなく、近年複数の種に分けられ（Zou et al. 2021, Sakamoto et al. 2022）、バイオマーカーとしての役割は不明確である。ここでは、複雑なヒト腸内細菌叢に含まれる9群のFaecalibacteriumを定量するための新しいアッセイを確立した。Faecalibacterium 属の定量用アッセイは、「F. prausnitzii sensu lato」の定量用として既に開発されていた（Bartosch et al.2004, Ramirez-Farias et al.2009 ）。これらのアッセイを組み合わせることで、Faecalibacterium属および特定のグループが人間の健康に与える影響について、より詳細に理解することができます。例えば、クローン病や2型糖尿病などの疾患患者において、特定のグループの欠乏を特定するために、これらのアッセイを適用することが可能になります。また、健康な腸内細菌叢の真のアクティブバイオマーカーを再設定することも重要である。
著者貢献
丹野宏紀（データキュレーション、形式分析、調査、方法論、ソフトウェア、検証、可視化、執筆 - レビュー＆編集）、Jean-Marc Chatel（調査、方法論、リソース、検証、執筆 - レビュー＆編集）、Rebeca Martin（調査、方法論、 リソース、バリデーション、ライティング - レビュー＆編集）、Denis Mariat（調査、方法論、リソース、バリデーション、ライティング - レビュー＆編集）、Mitsu Sakamoto（方法論、リソース、監督、バリデーション、ライティング - レビュー＆編集）、Masao Yamazaki（プロジェクト管理、 SeppoSalminen（概念化、調査、監督、検証、執筆-レビュー＆編集）、Miguel Gueimonde（調査、方法論、監督、検証、執筆-レビュー＆編集）、遠藤章人（概念化、データキュレーション、形式分析、資金獲得、調査、方法論、プロジェクト管理、資源、ソフトウェア、監督、検証、可視化 執筆-オリジナルドラフト、執筆-レビュー＆編集）
謝辞
丹野宏紀は、日本学術振興会特別研究員の助成を受けた。計算解析は、ROISのスーパーコンピュータNIGで行った。
利益相反
宣言したものはない。
資金調達について
本研究は、日本学術振興会科研費（助成番号JP20K05792、JP21J11100）の助成を受けた。
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本研究で使用したすべてのゲノムデータは、NCBIおよびCNGBdbデータベースから入手したものである。
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© The Author(s) 2023. FEMS に代わってオックスフォード大学出版局から発行されました。
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