ライフスタイルと関連疾患が血清CC16に及ぼす影響から、代謝、心臓、肺の複雑な相互作用が示唆される

先端研究ジャーナル
2023年6月16日オンライン公開
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ライフスタイルと関連疾患が血清CC16に及ぼす影響から、代謝、心臓、肺の複雑な相互作用が示唆される

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2090123223001686?via%3Dihub

著者リンク オーバーレイパネルを開くNathalie Rohmann a, Paula Stürmer a, Corinna Geisler a, Kristina Schlicht a, Carina Knappe a, Katharina Hartmann a, Kathrin Türk a, Tim Hollstein b, Alexia Beckmann b, Anna K. Seoudy b, Ulla Becker b, Perdita Wietzke-Braun b, Ute Settgast b, Florian Tran c d, Philip Rosenstiel c, Jan H. Beckmann e, Witigo von Schönfels e, Stephan Seifert f, Jan Heyckendorf g, Andre Franke c... Matthias Laudes a b
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https://doi.org/10.1016/j.jare.2023.06.005Get 権利と内容
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ハイライト

CC16は、呼吸器クラブ細胞に発現する抗炎症、免疫調節タンパク質である。

重度の腹部肥満と動脈性高血圧は、血清CC16を強力に減少させる。

ACEi/ARB、尿毒症、慢性心不全は血清CC16を強力に増加させる。

その影響は、脂肪組織の炎症、RAASや尿酸の障害によって媒介されている可能性がある。

代謝系、呼吸器系、循環器系の複雑な相互作用を示す知見である。
概要
はじめに
クララ細胞16kDaタンパク質（CC16）は、抗炎症性、免疫調節性の肺分泌タンパク質であり、最近のデータによれば、肥満では血清濃度が低下する。
研究目的
肥満が代謝や心血管系に及ぼす影響については、体重にのみ着目した研究では正しく反映されていない。そこで、本研究の目的は、原発性肺疾患の心・代謝系の併存を考慮した幅広い生理学的文脈でCC16を検討することであった。
研究方法
FoCus（N=497）および2つの減量介入コホート（N=99）のサブセットの血清サンプルにおいて、ELISA法を用いてCC16を定量化した。ライフスタイル、腸内細菌叢、疾患発生、治療戦略によるCC16の影響を評価するために、相関分析および一般線形回帰分析を適用した。決定因子の重要性と相互相関は、ランダムフォレストアルゴリズムを用いて検証した。
結果
CC16 A38G遺伝子変異、喫煙、低微生物多様性は、CC16を有意に減少させた。閉経前女性は閉経後女性および男性参加者と比較してCC16が低いことが示された。生物学的年齢と尿崩症治療薬はCC16を増加させた（すべてp < 0.01）。調整済み線形回帰では、高ウエスト・ヒップ比（推定-11.19 [-19.4; -2.97], p = 7.99 x 10-3）、重度の肥満（推定-2.58 [-4.33; -0.82], p = 4.14 x 10-3）、高血圧（推定 -4.31 [-7.5; -1.12], p = 8.48 x 10-3）の影響によりCC16の低下傾向が認められた。ACEi/ARB薬（p = 2.5 x 10-2）および慢性心不全（推定4.69 [1.37; 8.02], p = 5.91 x 10-3）は、CC16に増加効果を示した。CC16は、血圧、HOMA-IR、NT-proBNPと穏やかな関連が認められたが、高脂血症、2型糖尿病、食事の質、食事減量介入とは関連が認められなかった。
結論
CC16の制御における代謝および心血管異常の役割と、行動および薬理学的介入によるその修正可能性が示唆される。ACEi/ARBおよび尿糖による変化は、レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系とプリン代謝からなる制御軸を指し示すと考えられる。この結果は、代謝、心臓、肺の相互作用の重要性を補強するものである。
図解抄録
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はじめに
COVID19[1]などの感染症や喘息[2]、慢性閉塞性肺疾患[3]などの非感染性呼吸器疾患において、肺-代謝軸の重要性を指摘するエビデンスが増加しています。肥満と2型糖尿病は、急性期と慢性期の両方において、疾患の発症と予後の独立した危険因子として認識されています[4], [5] 。しかし、肥満や2型糖尿病のすべての人が肺の影響を示すわけではなく、このシステムの相互作用の個々の複雑な制御を示しています。
呼吸器系二次疾患の治療と予防を効率的に行うためには、有効かつ適用可能なリスク予測マーカーを特定する必要があります。最近のデータでは、呼吸器の上皮性クラブ細胞（旧クララ細胞）に発現する分泌タンパク質であるクララ細胞16kDaタンパク質（CC16）の高い可能性が示されています[6]。CC16は、気管支肺胞洗浄液に豊富に含まれるほか、他のクラブ細胞タンパク質と同様に、気管支肺胞血液関門を通過して血液中を全身に循環することができます [7]。興味深いことに、CC16は他の部位でも発現しているにもかかわらず、循環するCC16の濃度はほとんど肺に由来しているため、上皮の完全性、特にクラブ細胞の機能に関する有効なマーカーとなっている[8]。過去の研究では、CC16の局所的および全身的な抗炎症作用と免疫調節作用が提案され、急性および慢性肺疾患下で異なる発現が見られ、それによって基礎となる調節機構の複雑さが強調されました[6]。最近の研究では、より複雑な方法でCC16を評価し、気道および血清レベルの低下と肥満の関連性を示し、多くの交絡因子に対して強固であり、過体重および肥満の人々における喘息の発症と重症度にCC16が寄与すると結論付けました [9]。
これまで、過体重や肥満の文脈でCC16を評価する場合、研究では体重の増加のみに焦点が当てられており、重度の肥満症例で特に影響を受ける代謝系やレノ心血管系の複雑な意味合いが反映されていない。そこで、本解析の目的は、適切なヒトのコホートを用いて、ライフスタイルに関連する危険因子の評価から生理的変化、一般的な心・代謝の併存疾患、適切な介入戦略まで、CC16を代謝中心に評価した最初のものであった。
患者および方法
研究デザインおよび対象者
ヒトの肥満におけるCC16の正確な代謝中心の評価のために、ドイツの人口ベースの横断的フードチェーンプラス（FoCus）コホートの被験者サブセットのデータを使用しました。コホートの詳細な説明は、最近Geislerらによって発表されました[10]。簡単に説明すると、募集は、地元の登録事務所とキールのUniversity Medical Center Schleswig-Holstein (UKSH) の肥満クリニックを通じて行われた。データ収集は、18歳から75歳の成人を含む2011年から2014年の間に行われた。コホートの設定において、さらなる選択基準は適用されなかった。代謝研究のために特別に設定された質問票を使用して、例えば、心臓・代謝疾患の報告および対応する薬の摂取を含む広範な健康関連データが収集された（さらなる詳細については、補足S1を参照）。さらに、人体測定、代謝および炎症パラメータ、腸内細菌叢16S rRNAシーケンスデータ、参加者の食事、身体活動、睡眠時間および喫煙状態に関する情報、ならびに遺伝子変異が得られ、解析に利用可能であった。この研究のために、参加者は異なる肥満度の特定の代謝表現型に基づいて選択された（0：BMI < 25 kg/m2, I： BMI≧30 and < 35 kg/m2, II: BMI≧35 and < 40 kg/m2, III: BMI≧40 kg/m2）により、N = 497人の被験者（女性：N = 345, 男性：N = 152）が選ばれました。
さらに、2つの独立した強い肥満の研究集団（BMI≥40 kg/m2）を評価した。これらのコホートは、キールのUKSHで提供されている異なる減量介入療法に由来し、ヒトにおける減量の効果を広範に評価するために使用することができます。
(1) Kiel Intervention Cohort (KIK)： 日内科病院において、N=49名（女性：N=37名、男性：N=12名）の患者が12週間の絶食（超低カロリー配合食、800kcal/日）とその後の14週間の維持（バランス低カロリー配合食、1200-1600kcal/日）を、適度な運動、医療、心理ケアを伴って実施しました。ベースライン時（0週目）と介入終了時（26週目）に、人体計測データと血液パラメータを収集した。
(2) 肥満手術介入コホート：肥満手術（スリーブ胃切除術（N=28、女性：N=19、男性：N=11）、胃バイパス（N=22、女性：N=18、男性：N=4））を受けた患者を観察した。手術後1週間は、訓練されたスタッフによる食事と行動の推奨を受け、高タンパク低カロリーの食事と重要な栄養素の毎日の追加補充、適度な身体活動を一貫して行うことが期待されます。手術前の検査（0週目）と手術後6ヶ月のフォローアップ（26週目）では、体重に関する人体測定データと血液サンプルが収集されました。
研究目的の観点から、研究集団の設定、データの利用可能性、実施状況を図1に示します。
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図1. コホートの設定と研究のワークフロー。本研究では、肥満とそれに伴う心・代謝への影響を幅広く研究するために構成された北ドイツの2つのコホートのデータを使用しました。横断的なFoCusコホートでは、18～75歳のn = 497人の参加者が含まれています。縦断的なKiel Intervention Cohort（KIK）からは、保存的な食事療法による減量プログラムに参加した、または肥満手術を受けた重度肥満者（BMI≧40kg/m2）n＝99人で、ベースラインと6ヶ月の体重減少データが解析可能な人が含まれている。本研究の目的は、肺の抗炎症・免疫調節マーカーであるCC16の代謝を中心とした総合的な評価である。これは、既知の非修正性CC16決定因子（生物学的年齢、性別、ホルモン状態など）の検証、ライフスタイルレベルでのさらなる影響因子の特定、心・代謝疾患の存在、重症度、介入の評価、およびCC16と決定因子の両方の変数の重要性と相互相関の推定を含んでいます。このため、CC16は、ELISA法を用いて血清サンプルで定量化され、相関検定、マルチパラメーター線形回帰モデル、検証としてのランダムフォレストベースの機械学習を用いて、いくつかの心臓代謝変数との関連性が評価されました。
倫理に関する声明
参加した各患者から、書面によるインフォームドコンセントを得た。研究プロトコルは、1975年のヘルシンキ宣言の倫理ガイドラインに準拠し、ドイツのキール大学医学部の地方倫理委員会から事前に承認されている（FoCus：A156/03、介入試験：D523/18）。
健康関連アンケート
参加者の健康状態に関する情報は、栄養医学研究目的で特別に構成された質問票を用いて収集された。アンケートを通じて、様々な代謝性疾患や心血管疾患の有無、薬物摂取の有無に関する情報を得た。
体格測定
患者は、靴を履かない軽装でデジタルスケールで体重を測定した。身長はスタディオメーターで測定した。ウエストとヒップの周囲径はメジャーで測定した。体格指数（BMI）およびウエスト・ヒップ比（WHR）を算出した。血圧は、上腕に伸縮性のあるカフを装着して測定した。すべての測定は、訓練を受けたスタッフが、校正された器具を用いて二重に実施した。解析は平均値を用いて行った。
生化学
UKSHの中央研究所で代謝および炎症パラメータの生化学的測定を行い、静脈穿刺により絶食血液を採取した。インスリン抵抗性の恒常性モデル評価」（HOMA-IR＝空腹時グルコース［mg／dl］×空腹時インスリン［μU／l］／405）と「β細胞機能の恒常性モデル評価」（HOMA-β＝360×空腹時インスリン［μU／l］／（空腹時グルコース［mg／dl］-63））は計算した［11］．CC16は、市販のELISAキット（ab238266、Abcam、Cambridge、MA、USA）を用いて、製造者の指示に従い、血中血清サンプルにおいて定量化した。ELISAキットの検出可能な濃度は6.3〜400pg/mlで、感度は1.4pg/mlであった。適用前に、解凍したサンプルを予想濃度に応じて1:200、1:250、1:400または1:1000に希釈した。サンプルは二重に測定し、変動係数は10%未満とし、統計解析の前に平均値を作成した。
栄養
食事摂取量は、ポツダムのドイツ人間栄養研究所（EPIC-FFQ）のEuropean Investigation into Cancer and Nutritionプロトコルによる有効な半定量12ヶ月レトロスペクティブ食品頻度アンケートを用いて評価した［12］。EPIC-FFQは、143種類の食品の摂取頻度と平均ポーションサイズに関する質問から構成されている。その後、「EPICsoft」を用いて分析が行われ、微量栄養素、多量栄養素、食品成分の1日の摂取量が算出された[13]。EPIC-FFQは、参加者の身体活動レベルや睡眠時間に関する質問も含んでいる。EPIC-FFQの検証は、Nöthlingsら[14]が以前に説明した初期検証、および被験者の10％における抜き打ちの24時間食事リコールによる追加精度検証の2段階で実施された。参加者の食事の質を総合的に評価するために、EPIC-FFQのデータに合わせて特別に修正した健康的な食事指数（HEI-EPIC）を使用した。von Rüstenら[15]のプロトコルに従った結果、0-100のスコアリングシステムとなり、値が高いほどドイツの食品摂取ガイドラインに適合していることを示す。すなわち、1.十分摂取（飲み物、野菜、果物）、2.適量摂取（甘いもの、脂肪分の多いお菓子）、3.適量と適量の混合（穀物、穀物製品、ジャガイモ、牛乳・乳製品、肉、加工肉、魚、卵、脂肪・油）です。） それぞれ、摂取量の増加、減少、またはその両方の組み合わせで点数がつけられる。後者の場合、消費量が推奨量を超えていない参加者は、カテゴリーが適切であるとして扱われた。推奨量を超えている場合、カテゴリは中庸として扱われた。これは、これらの食品は適量が推奨されているものの、過剰な摂取は1日のエネルギー摂取に大きく寄与することを考慮したものである[15]。468人のFoCus被験者のデータが利用可能であった。
宿主の腸内細菌叢
便サンプルからのDNA抽出、細菌16S rRNA配列決定、品質管理、分類学的分類は、ドイツ、キール大学の臨床分子生物学研究所によって実現された。その手順は、以前に他の場所でよく説明されており[16]、[17]、以下ではそれに従って要約されます。
DNA抽出： 糞便サンプルからのDNA抽出は、QIAcube（Qiagen）上で自動化されたQIAamp DNA fast stool mini kitを用いて行った。材料は、InhibitEx溶解バッファーで前処理したGarnet Beadチューブ（Dianova）に与えられた。SpeedMill PLUS (Analytik Jena)を用いてビーズビーティングを行った。サンプルは95℃で5分間加熱し、製造元のプロトコールにしたがって手順を継続した。DNA抽出物は、PCR増幅まで-20℃で保存した。サンプル抽出の間、ブランクをコントロールとして使用した。
細菌の16S rRNA遺伝子の配列決定： 16S rRNA遺伝子可変領域V1 V2は、Caporasoら[18]に従ってデュアルバーコードを使用して増幅された。DNAはPCR前に希釈し、PCR産物はアガロースゲルの電気泳動で確認し、SequalPrep正規化プレートキット（Thermo Fisher Scientific）を用いて正規化した。その後、PCR産物を等モルでプールし、Illumina MiSeq v.3.2 (Illumina Inc.)で塩基配列を決定した。配列決定後のデマルチプレックスは、バーコード配列bcl2fastqの0ミスマッチを基準とした。
品質管理および分類学的分類 品質管理と分類のワークフローはGitHub（@mruehlemann）を通じて評価可能である。簡単に言うと、データ処理は、アンプリコン配列変異（ASV）の存在量表を提供するビッグデータセット用のDADA2ワークフローを使用して実行されました。すべてのシーケンスランは、エラー修正、リードマージ、およびキメラ検出のために別々に処理された。ASVは、RDPデータベース（v.16）を分類学的参照としてDADA2に実装されたナイーブベイズ分類器を用いて分類学的注釈を行い、可能であれば種レベルで配列を分類した [19], [20].
遺伝的変異
CC16 A38G多型（rs3741240）は、呼吸器系の上皮細胞からのCC16の発現に影響を与えることが知られており、慢性肺疾患の発症を否定的に促進することが表示されています。この多型は血清レベルの低下とも関連しており[21], [22]、そのため私たちはこの多型を分析に含めたのです。ジェノタイピングは、ドイツ・キール大学の臨床分子生物学研究所で実施した。全血サンプルと得られたDNA抽出物の入手状況に応じて、Infinium® Global Screening Array (GSA) v1.0とIlluminaプラットフォームを使用してジェノタイピングを実施しました。SNPCHIPDBは、標準的なPLINKフォーマットで遺伝情報を提供するために使用されました。N=445人の参加者のうち、190人が野生型、200人がホモ接合型、55人がヘテロ接合型の多型を示し、遺伝情報が入手できました。
統計解析
統計解析および可視化は、R（R Core Team, 2022）およびRStudio Version 4.1.2（Rstudio.Inc.） CC16濃度が平均値＋3標準偏差より高い5名の被験者を解析から除外した。Shapiro-Wilk検定を使用して、変数を正規分布について検定した。正規分布データは平均値±標準偏差、非正規分布データは中央値（四分位範囲）、カテゴリー変数は被験者数およびパーセンテージで示した。CC16と連続変数との相関分析は、スピアマン順位相関（rs）を用いて行った。CC16の群間比較には、Mann-Whitney U（2群）またはKruskal-Wallis（＞2群）テストを適用した。
腸内細菌叢の評価は、パッケージ「phyloseq」、「microbiome」、「vegan」を用いてRで実施した。参加者の40%以上に存在し、相対的存在量が0.05%以上の58種類のアンプリコンシークエンスバリアント（ASV）を含む測定可能なコアマイクロバイオタ（CMM）が抽出されました。腸内細菌組成の全体的な個人間変動は、Bray Curtis非類似度指数 [23] と、CMMを用いたバイナリJaccard指数 [24] によって評価された。対応するp値は、CC16のterciles間で計算された（low： 0.2～7.61ng/ml、中位：7.61～13.3ng/ml、高位：13.3～44.0ng/ml）間で、順列多変量分散分析（PERMANOVA）によりp値を算出した。個体内の微生物多様性は、個体ごとに代表される明確な種の数を示す微生物種の豊かさと、微生物分布の均等性を示す追加指標としてのシャノン指数として決定した。CC16レベルとの関連における指標の有意性は、スピアマンの順位相関検定を用いて評価した。微生物組成の分類学的変化を評価するため、調整済み線形回帰モデルを用いて、中核属の相対的存在量をCC16区分間で比較した。
最初の単変量解析では、A38G多型（chr11:3741240）、生物学的性別、年齢、喫煙習慣、腸内細菌種の豊富さ、尿酸降下薬の摂取がCC16血清レベルに対する強い効果因子（p<0.01）だった。その結果、代謝性疾患および心血管疾患とそれに対応する治療の影響は、特定された交絡因子で調整された一般線形回帰モデルを用いて評価された。すべての疾患の分析において、疾患のない人を基準群とした。
減量効果の評価については、0週目から26週目までのBMIとCC16血清濃度の差を、ペアのWilcoxon検定を用いて検証した。
結果の概要
FoCus研究集団の特徴
ドイツの人口ベースのFoCusコホートの横断的コホートデータを用いて、N = 497人のヒト被験者の代謝プロファイル、疾患の発生と治療、ライフスタイル、腸内細菌の多様性と遺伝子変異に関するデータを用いて、肥満とその他の代謝性疾患および心血管疾患が呼吸器マーカーCC16の血清レベルに及ぼす影響を正確に調べることを目的とする。この研究集団の臨床的特徴および変数とCC16血清濃度との初期相関を表1に表示する。
表1. FoCus研究集団における代謝プロファイルの特徴。
空細胞非肥満肥満症被験者数、n（％）205（41.25）292（48.75）-女性性別、n（％）a149（72.68）196（67.12）-0.22歳、年b51（42；60）**3（46；61.25）0.2691. 11 × 10-9 人体計測値身長、cmb171 (167; 178)170 (164; 179)0.157.78 × 10-4 体重、kgb63.05 (56.4; 69.95)117.08 (98.83; 138.9)-0.0440.33BMI, kg/m2,b21.59 (19.76; 23.35)40.51(33.76; 46.74)-0. 0830.07ウエスト-ヒップ比ob0.81 (0.75; 0.88)0.95 (0.9; 1.01)0.0360.46SBP, mmHg120 (110; 130)135 (130; 140)0.0130.78DBP, mmHg80 (70; 80)80 (80; 90)-0.0240.59metabolic markersglucose, mg/dlb91 (87; 98)104 (94; 113)-0.0320.58Insulin, mmDg2 (0.05; 3) 0140.78 インスリン、μU/lb6.2 (4.5; 8.7)17.9 (11.7; 26.7)-0.0680.17HOMA-IRb1.43 (0.99; 2.04)4.49 (2.97; 7.38)-0.0680.18HOMA-βb84 (61.41; 114.55)157.97(110.92; 230.05)-0.0730. 14トリグリセリド、mmol/lb77 (60; 101)136.5 (104.75; 193.5)-0.070 14炎症マーカーCRP、ng/lb2 (1.3; 3.6)*5.6 (2.95; 10.3)-0.1371.45 × 10-2IL-6, ng/lb3.2 (2.2; 4.97)4.6 (3.4; 6.25)0.010. 85wnt5a, ng/mlb0.39 (0.24; 0.54)0.37 (0.26; 0.56)-0.0710.23SFRP5, ng/mlb6.1 (2.08; 13.61)8.86(3. 98; 19.39)*0.1020.1CC16, ng/ml10.7 (6.47; 16.17)9.86 (5.99; 15.26)--cardiac markerNT-proBNP, ng/l8.56(8. 48; 152.75)8.48 (8.48; 109.76)0.0820.11 心代謝疾患有病率動脈硬化症、n (%)a37 (18.23)220 (76.39)-0.61 高脂血症、n (%)a45 (22.5)125 (43.71)-0.09 2型糖尿病、n (%)a8 (3.9)145 (49.66) 9)145 (49.66)-0.51 慢性心不全, n (%)a4 (1.96)24 (8.45)-5.7 × 10-4 冠動脈疾患, n (%)a6 (2.99)20 (7.12)-3.65 × 10-2 心筋梗塞, n (%)a4 (1.95)16 (5.54)-1.9 × 10-2
Shapiro-Wilk検定を用いて、変数が正規分布しているかどうかを検証した。正規分布のデータは平均値±標準偏差、非正規分布のデータは中央値（四分位範囲）、カテゴリー変数は被験者数およびパーセンテージで表示。メタボリックステータスで層別化した解析で確認されたCC16との有意な関連は、各ボックスに p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 として示されている。略語： BMI = Body Mass Index; SBP = 収縮期血圧; DBP = 拡張期血圧; HOMA-IR = Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance; HOMA-β = Homeostatic Model Assessment of beta-cell function; CRP = C-reactive Protein； IL-6 = インターロイキン6; wnt5a = wingless-type MMTV integration site family, member 5A; SFRP5 = Secreted Frizzled Related Protein 5; CC16 = Clara cell 16-kDa protein; NT-proBNP = N-terminal prohormone of brain natriuretic peptide.
非修正因子とCC16血清濃度との関連性
これまでの研究で、CC16血清濃度の変化に寄与するいくつかの決定因子が、非修正可能な因子も含めて同定された。そこで、この最初の解析では、遺伝的変異、参加者の生物学的性別、年齢、閉経と循環CC16との関連を評価した。A38G多型（chr11:3741240）は、上皮細胞からのCC16の発現を減少させ、血清中濃度を低下させることが知られています。この遺伝子座のホモ接合体変異は、評価対象者のうち200人に、ヘテロ接合体では55人に認められた。野生型と比較して、どちらのタイプの遺伝子変異もCC16が有意に減少した（ホモ接合体：p = 3.5 × 10-2; ヘテロ接合体：p = 1.1 × 10-3、図2A）。生物学的な女性は、男性よりも有意に低いCC16血清レベルを示した（p = 2.1 × 10-7）。興味深いことに、この差は閉経後に減少した（p = 0.69、図2B）。性別や閉経とは無関係に、CC16血清濃度は参加者の年齢と強い相関があった（p = 1.1 × 10-9、図2C）。
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図2. CC16血清濃度と選択された影響因子との関係。我々は、497人の被験者から得たデータを用いて、CC16血清濃度に関する非修正可能な代謝リスク因子と一般的な修正可能な代謝リスク因子の初期同定を行った。その結果、（A）遺伝子座chr11:3741240の変異（ホモ接合体およびヘテロ接合体の両方がCC16の低下と関連している）、（B）閉経前の女性でCC16が低下する参加者の生物学的性別、（C）参加者の年齢との強い正の相関（D）、が大きく寄与することが明らかにされた。また、CC16の低下は、積極的な喫煙、（E）腸内微生物の種の豊富さの低下（F）でも見られた。それに引き換え、高尿酸血症の治療薬である尿酸降下薬の摂取は、血清CC16を有意に増加させました。統計的有意性は、カテゴリー変数については一変量ペアワイズMann-Whitney-U検定、連続変数についてはスピアマンの順位相関検定を用いて検定した。表示された強く有意な影響（p < 0.01）に基づき、これらの因子は以下の解析のための交絡因子と定義された。
修正可能な生活習慣関連リスク因子とCC16血清濃度の関連性
これらの非修正可能な決定要因の他に、ライフスタイルは、肺疾患、代謝性疾患、心血管疾患など、すべての慢性疾患の発症と経過に強く影響している[25]。次の分析では、食事、身体活動、睡眠時間、喫煙習慣、腸内細菌の多様性を評価することで、CC16血清レベルと参加者のライフスタイルの関係を明らかにすることを目的としました。詳細な結果は、表2に表示されています。
表2. FoCus研究集団における生活習慣要因の特徴。
空細胞非肥満肥満症被験者数、n（％）a205（41.25）292（48.75）-ダイエットHEI-EPIC、0-100b 52.15 ± 9.551.37 ± 9.730.0430.35 総エネルギー摂取、kj/日b 8617.95 (7492.25; 10649)8463.5 (7037.3; 10724.8)0. 0160.73 水, l/日b2.95 (2.48; 3.58)3.34 (2.78; 4.06)-0.0870.06 アルコール, g/dayb2.64 (0.96; 4.53)0.93 (0.4; 2.54)0.0130.78 身体活動中程度の活動, h/weekb15.12 (9.12; 26.41)14.75 (10; 24.25)-0.0570. 22スポーツ、時間/週b4 (2; 7.09)1.5 (0; 4)0.0160.73 テレビ視聴、時間/週b2 (1.5; 3)3 (2; 5)-0.0460.32 睡眠睡眠、時間/24 hb7.25 (7; 8)7 (6.5; 8.5)-0.0160.73 喫煙習慣現在の喫煙者はn (%)c38 (19.29)47 (16.61)-6. 83 × 10-7強度、タバコ/日b10 (7; 20)20 (10; 25)-0.0530.38 腸内微生物の多様性種数、n種b228 (178.75; 277.75)214 (164.5; 273.5)0.1179.24 × 10-3 シャノン指数 4.08 (3.71; 4.4)3.88±0.510.0030.94
a
b 統計的有意性は、単変量Spearmanの順位相関検定を用いて検定した。 c 統計的有意性は、単変量Mann-Whitney U検定を用いて検定した。メタボリックステータスで層別化した分析で確認されたCC16との有意な関連は、それぞれのボックスに p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001Abbreviation として示されている： HEI-EPIC = EPIC-Food Frequency Questionnaireのデータを用いて算出したHealthy Eating Index。
食事、身体活動、睡眠 まず、EPIC-FFQのデータから算出したHealthy Eating Index（HEI-EPIC）を用いて、参加者の食生活を評価しました。0から100までの値で、参加者のバランスのとれた一般的に健康的な食事の順守を反映するものであるが、循環CC16との相関はなかった。1日の総カロリー摂取量や水分摂取量も、血清レベルには影響を与えなかった。さらに、身体活動時間や睡眠も、CC16に影響を与えませんでした（表2）。
喫煙 喫煙習慣は、「吸ったことがない」「過去に吸ったことがある」「3ヶ月未満」「現在吸っている」の4つのカテゴリーで層別化された。これらのグループを比較すると、現在の喫煙者は、他のすべてのグループの現在非喫煙の参加者と比較して、CC16血清濃度が有意に低下していることがわかった（図2D）。一方、1日の喫煙本数と血清CC16濃度との相関で評価した喫煙行動の重症度は、有意な関連を認めなかった（表2）。
腸内細菌の多様性 腸内細菌の多様性の低下は、いくつかの好ましくない健康上の転帰と関連しており、肥満および関連する併存疾患における代謝的影響の発現に強く寄与していると想定されている[26]。493人のFoCus被験者の利用可能な16S rRNAシーケンスデータを用いて、CC16濃度三分位間の微生物個人間分散を計算したところ、統計的有意性に達しなかったため、CC16レベルの変化の原因として微生物組成の変化を指摘することはできませんでした（Bray Curtis: p = 0.06; Jaccard: p = 0.14）。また、個人ごとの微生物叢に存在する微生物株の数として評価される個人内の種の豊かさは、循環CC16と正の相関を示した（rs = 0.117, p = 9.24 × 10-3, 図2E）が、微生物叢の豊かさとは別に株の分布も考慮するShannon指数は、CC16血清レベルと有意な相関を示さなかった（rs = 0.003, p = 0.94, 表2）。
CC16血清濃度に対する薬物摂取の影響
疾患の有無に関連して血清プロファイルを評価する場合、影響源となりうるものとして、薬の使用を考慮する必要がある。毎日の薬の摂取量に関する情報は、健康アンケートを通じて提供され、その後、31のカテゴリーに層別化された。これらのカテゴリーを分析した結果、特定の向精神薬と避妊薬の摂取下ではCC16の血清濃度が穏やかに低下し、逆にオピオイドと尿崩症薬の摂取下では上昇した（n = 28, p = 8.37 × 10-4, 図2F）。完全な薬物分析は、Supplement S2に記載されています。
代謝および心血管疾患プロファイルがCC16血清濃度に及ぼす影響
次の一連の分析では、生物学的年齢、性別、喫煙習慣、CC16 A38G多型（rs3741240）の有無および尿崩症摂取で調整した一般線形回帰モデルを用いて、CC16血清濃度に対する代謝および心血管疾患ならびに関連表現型プロファイルの存在および必要に応じて治療効果の効果を評価した。詳細な結果は図3に表示されています。すべての疾患解析において、疾患がないことを基準群とした。
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図3. CC16血清濃度に対する代謝および心血管系の意味合いの影響。生物学的年齢、性別、喫煙習慣、CC16 A38G多型（rs3741240）の有無、尿糖摂取量で調整した一般線形回帰モデルを用いて、CC16血清濃度に関連する代謝性疾患および心血管疾患の存在と、必要に応じて治療に関する497人のヒト被験者のデータを評価しました。これらの解析から、重度の肥満、特に高いウエスト-ヒップ比によって反映される腹部の体脂肪分布とCC16血清濃度の逆相関が示されました。さらに、未治療の動脈性高血圧は、降圧剤治療によって打ち消すことができる循環CC16の減少と関連している。動脈硬化性心疾患（心筋梗塞、冠動脈疾患、慢性心不全）は、CC16血清濃度の上昇を示し、慢性心不全の場合、交絡因子に対してロバストで、統計的に有意であることがわかった。また、血圧、トリグリセリド値、インスリン抵抗性を示すHOMA指数などの心・代謝系指標では、小さな効果量ながら穏やかな相関が認められました。すべての疾患の分析において、不在を参照グループとした。結果は、推定値（95％信頼区間）および対応するp値で表示されています。略語 CRP = C反応性タンパク質、HOMA-IR = Homeostatic Model Assessment of Insulin Resistance、CI = 信頼区間。
肥満について CC16血清濃度に関連する肥満についての情報を得るために、参加者をWHOの重症度別に層別化した。その後の一般線形回帰により、重症度が高いほどCC16が減少することが明らかになり、肥満度IIIで統計的に有意となった（est. = -2.58 (-4.33; -0.82), p = 4.14×10-3) ）。代謝的に好ましくない脂肪分布の指標である高いウエスト・ヒップ比は、CC16血清レベルに対してさらに強い低下作用を示す（推定値＝-11.19 (-19.4; -2.97), p = 7.99 × 10-3）。一方、肥満と関連する重要な因子である微生物異常は、血清CC16にわずかな影響しか与えず、同定された21のコア属の調整線形回帰では、CC16が高いダイアリスタの割合が統計的に有意に低くなることだけが明らかになりました（推定値 = -0.01 (-0.002; -0.02), p = 1.3×10-2）．
肥満による代謝の影響がCC16の血清レベルに及ぼす影響をさらに評価するために、肥満（BMI 30kg/m2以上）を有する被験者のみを含む解析を行ったところ、いわゆる代謝性炎症に重要な炎症性サイトカインであるwnt5aとCC16血清レベルの負の相関（est. = -5.58 (-10.85; -0.3), p = 4×10-2）が調整線形回帰により示されました。興味深いことに、wnt5aレベルは、慢性呼吸器疾患が同時に存在する肥満の参加者でも上昇していた（p = 3.5 × 10-2）。
動脈性高血圧： 本研究の対象者のうち、高血圧症は52.34%にみられた。これらの被験者を降圧剤の有無で層別化した。調整済み線形回帰分析により、動脈性高血圧を報告していない被験者と比較して、高血圧の被験者ではCC16のレベルが有意に低下していることが明らかになった（推定値 = -4.31 (-7.5; -1.12), p = 8.48 × 10-3））．高血圧の診断や治療とは無関係に、CC16の血清レベルは血圧と相関していた。しかし、この関係は小さな効果量しか示さなかった（収縮期：推定値 = -0.08 (-0.14; -0.02), p = 5.76 × 10-3; 拡張期：推定値 = -0.18 (-0.28; -0.08), p = 3.08 × 10-4）.
高脂血症について 次に、肥満で見られる共通の併存疾患であり、動脈硬化の主要なリスクファクターである脂質異常症について検討しました。しかし、高脂血症の有無や治療（スタチンによる治療など）は、CC16の変化と関連しませんでした。
インスリン抵抗性と2型糖尿病： 糖代謝の障害の評価は、インスリン抵抗性とβ細胞機能のHOMAを用い、2型糖尿病の有無とそれぞれの治療形態を評価しました。その結果、CC16の血清レベルとインスリン抵抗性の程度との関連は軽度であったが（est. -0.1 (-0.18, -0.02), p = 2.02 × 10-2）、β細胞機能の低下、2型糖尿病の発現、いかなる治療形態による変化も認められなかった。
構造的な心血管系疾患 心血管疾患による影響の評価には、冠動脈疾患、慢性心不全、心筋梗塞の既往の有無が含まれました。3つの疾患タイプはすべて、単変量のマン・ホイットニーU検定を用いてCC16の増加を明らかにした。しかし、線形回帰を用いて交絡因子を調整した後、この関係は慢性心不全でのみ統計的に有意であった（est. = 4.69 (1.37; 8.02), p = 5.91×10-3）．また、年齢と性別に応じた基準範囲に基づく層別化では、心機能の血清マーカーであるN-terminal fragment of proBNP（NT-proBNP）値が病的な参加者に、CC16血清レベルの上昇が見られた（p = 2.19-4）。しかし、この関連性は、線形回帰を用いた交絡因子の補正後に弱まった（p > 0.05）。
確立された代謝および心血管治療がCC16血清濃度に及ぼす影響
これまでの分析で、呼吸器マーカーであるCC16に対する代謝および循環器系の強い影響力を示すことができましたが、これは代謝系と呼吸器系の共同制御経路を示唆しています。結果として生じる健康リスクに対抗するためには、行動変容や薬物療法などの適切な介入により、関連する修正可能な寄与因子を制御することが不可欠である。以下の分析の目的は、これらの介入戦略がCC16の循環に影響を与えるかどうかを評価することである。
喫煙： 禁煙は、慢性的な喫煙による健康被害を軽減するための最も効果的な方法である。我々のデータは、現在喫煙している人のCC16血清濃度が有意に低下していることを示した。しかし、過去に喫煙したことのある参加者はこの変化を示さず（図2D）、これはこの暗示の可逆性を示唆するものである。
高血圧症： 降圧剤は、慢性的な高血圧を正常化するために最も効果的な治療法です。我々の分析では、未治療の動脈性高血圧の参加者において、CC16の血清濃度が有意に低下していることが明らかになりました（図3）。また、降圧剤の摂取を表明した参加者は、未治療の参加者と同様のレベルを示し、このことは、この治療形態がCC16血清濃度の効果的な正常化を開始することができることを示しています。興味深いことに、1種類の降圧剤（ACEi/ARB、カルシウムチャンネルブロッカー、利尿剤、ベータブロッカー）のみを報告した参加者をフィルタリングしたところ、CC16の効果はACEi/ARBによって開始され、他の種類の降圧剤にはないことがわかった（詳細は、補足S2参照）。
体重の減少 過体重や肥満に関連する健康障害を克服するために、減量は非常に効果的な治療法である。異なる治療形態の効果を評価するために、食事介入プログラム（n = 49、75.5 %女性）または肥満手術（スリーブ胃切除術：n = 28、67.9 %女性、胃バイパス：n = 22、81.8 %女性）を受けた2つの独立したコホートを対象としました。26週間にわたり、すべての被験者がBMIの有意な減少を達成し（図4A-C）、代謝の改善が期待された（データは示さず）。外科的介入後、変化は血清CC16の穏やかな減少を伴うが（スリーブ胃切除術：p = 3.58 × 10-2、胃バイパス：p = 3.29 × 10-2、図4E-F）、食事介入プログラム終了時の濃度には差がなかった（p = 0.72、図4D）。
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図4. 血清CC16濃度に対する体重減少の影響。3つの異なる介入タイプ：非外科的保存的肥満複合療法（食事介入、n = 48）、外科的スリーブ胃切除術（n = 22）、外科的胃バイパス術（n = 28）によって達成された26週間という時間経過における体重減少の効果を評価しました。データによると、食事療法または外科的介入により、患者のBMIは劇的に低下し（A-C）、代謝プロファイルは改善した（データは示さず）。外科的介入後、変化は全体的に血清CC16の穏やかな減少を伴っている（E+F）が、食事介入プログラムの終了時には濃度に差はなかった（D）。統計的有意性は、一変量対のウィルコクソンテストを用いて検定した。
ランダムフォレストによる変数の重要性と関係性の解析
今回の一次解析により、CC16血清濃度に関連する、または関連する可能性のある変数として、人体測定値、代謝バイオマーカー、代謝および心血管疾患の有無、さらに栄養状態の総合指標である調整健康食指数、腸内細菌のαおよびβ多様性のいくつかの指標からなる23の変数が同定された。上記の知見を検証するため、ランダムフォレストベースの機械学習を用いたこれらの変数の追加分析により、CC16レベルへの影響と潜在的交絡因子の両方について、それらの関係を評価した。詳細な説明は、Supplement S3に記載されている。要するに、この機械学習分析によって、CC16と年齢、生物学的性別、女性の閉経状態、尿毒症治療薬、構造的心疾患の存在との関連に関する主な知見が確認され、この分析によって、評価した特徴の根本的な相互作用に関する深い洞察も得られた。
考察
本研究により、ほとんど肺から分泌されるタンパク質であるCC16が、肺の病態だけでなく、代謝や心血管系の状態によっても影響を受けるという証拠を得ることができました。本研究で見出された肥満とA38G多型の影響は、4つの独立したコホートを使用した最近の報告[9]の結果と同様であったことを指摘したいと思います。このことは、我々のFoCusコホートデータが有効であり、より広範なCC16の代謝特性を明らかにするのに適していることを示しています。本研究では、肥満の他に、体脂肪分布が好ましくないことを代表する高いウエスト-ヒップ比が、CC16の循環量に最も強い減少効果を示し、重要な修正可能および非修飾可能な交絡因子に対して頑健であることが示された。逆に、慢性心不全は、血清CC16を強力に増加させた。これらの結果から、システム生物学的なレベルで、代謝、心臓、肺の間に複雑な相互作用が存在し、肥満 [4] や構造的な心血管系疾患 [27] を併発している慢性および急性肺疾患の被験者の転帰を悪くしている可能性があることが明らかになったのです。
これまでの研究で、CC16の血清濃度は、生物学的年齢、性別、閉経の開始など、さまざまな非修飾的決定要因に依存することがすでに示されている[28], [29]. このような背景から、野守らは、肺クラブ細胞によるCC16の合成と分泌に性ステロイドホルモンが関与することを提案しました。彼らは、女性のCC16が男性に比べて思春期から減少し、閉経後に増加することを発見した[30]。これらの知見は、今回のFoCusのデータと一致し、我々の結果をさらに正当化するものである。また、CC16は年齢と正の相関があり、女性の閉経を考慮すると、以前は低かったレベルが閉経後に上昇し、男性に見られるレベルに達することがわかりました。
タバコの喫煙が肺の健康に与える影響はよく知られているため、この行動がCC16レベルに与える影響はすでに多くの研究で評価されており、非喫煙者に比べて喫煙者ではCC16が減少していることが一貫して示されています [7], [28], [31]. この関連性は、呼吸器官におけるCC16を発現するクラブ細胞の減少によって説明された[32]。Guerraらはさらに、元喫煙者と喫煙経験のない被験者がCC16の血清レベルに差を示さなかったことから、禁煙後にこの意味合いが再生する可能性を示した[29]。興味深いことに、本研究ではこれらの知見を再現することができた。
喫煙行動は肺疾患の重要な引き金と考えられていますが、食事と腸内細菌叢の変化は、今日までそのように見られておらず、我々の知る限り、CC16との関連でまだ評価されていません。CC16血清レベルの決定要因としての食事の可能性を最初に評価するために、私たちは、全体的にバランスのとれた健康維持のための食事の遵守を測定するツールである健康的な食事指数を計算しました [15], [33]. 低い指数は、様々な慢性疾患に関連しているが[34]、我々の分析では、循環CC16に影響を与えない。6ヶ月間の食事療法に基づく減量介入中にCC16に変化がなかったことと合わせて、さらなる食事の評価を行うと、我々のデータは、食事がCC16血清濃度の変化に大きく寄与していないことを示唆している。一方、腸内細菌の多様性を評価したところ、種の豊富さが低いことと、血清中のCC16濃度が低いことの関連性が明らかになりました。食事の質の低さと同様に、腸内細菌叢の多様性の低さは、代謝性疾患、心血管疾患、呼吸器疾患など、多様な健康への影響と関連しています[35]。後者については、免疫応答の相互変化を介して疾患発症に関連する腸肺軸を示す新たな証拠があり[36]、これは我々の所見と一致する。
尿酸を循環から除去するために投与される薬剤である尿酸降下剤の摂取は、CC16濃度の上昇と強く関連していた。興味深いことに、血清および肺の尿酸濃度が高いことは、現在、肺高血圧症、COPDおよび肺癌を含む呼吸器疾患の病態生理学で議論されている[37], [38], [39], [40]. この知見は、尿酸との相互作用を介した上皮クラブ細胞、したがってCC16の発現の障害を指し示しているのかもしれない。
CC16血清レベルに対する内的および外的要因のこれらの多様な影響を説明するために、調整済み線形回帰モデルを使用して代謝および心血管疾患の影響を評価しました。その結果、肥満度が高くなるにつれてCC16は減少し、ウエスト-ヒップ比が高い内臓脂肪の蓄積ではさらに顕著であることがわかりました。これらの知見は、Goudarziら[9]の知見と一致する。彼らの解析では、肥満マウスとヒトでCC16を発現する細胞の数が減少していることも記述されており、潜在的なメカニズムが示唆されています[9]。我々の結果と一致するように、先行研究では、体脂肪分布パターンは体重やBMIよりも肺機能（FEV(1)とFVCで測定）に強い影響を与えることが示されました [41], [42]. この知見に基づき、Kashtanovaらによる最近の研究では、下気道障害の他のマーカーの中で、CC16が、腹部肥満を伴う慢性気管支炎患者において減少していることが示されました。著者らは、この効果は、脂肪組織からの別の慢性炎症源の存在に起因する可能性があると結論付けています[43]。それを裏付けるように、腹部肥満に関連する代謝性炎症の主要な制御因子である炎症性アディポカインwnt5aに対するCC16の関連性が明らかにされた[44]。
動脈性高血圧は肥満の非常に一般的な併存症であり、CC16濃度の低下とも関連していました。この効果は、降圧剤であるACEi/ARBを摂取すると減少し、CC16とレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系（RAAS）の相互作用を示唆していると思われます。興味深いことに、我々は、慢性心不全において最も顕著であった構造的な心血管疾患において、CC16濃度が強く上昇していることを発見した。この疾患は、炎症促進、線維化促進、肥大化促進作用の開始を通じた病態生理学的寄与のあるRAASの障害によって特徴づけられる [45]. このことは、RAASの障害に対応して、CC16の発現が代償的にアップレギュレーションされることを示すと考えられる。しかし、循環中のCC16の有意な増加は、肺の発現レベルを表すものとしてだけでなく、むしろ気管支肺胞-血液バリア障害の指標として見られることに留意すべきである［6］。
炎症と心血管への影響に加え、インスリン抵抗性の誘導と2型糖尿病の顕在化も、肥満でよく見られることである。しかし、2型糖尿病の存在下でCC16に変化は見られず、これらの代謝性疾患における免疫学的制御の違いが示唆されました。
個々のCC16の血清レベルは、多臓器疾患のリスクマーカーとして臨床的に重要であると考えられる。最近の研究では、COVID-19の初期段階においてCC16と死亡率との相関が示された[46]が、将来的にバイオマーカーとしてのCC16の適用可能性を示す一例となるかもしれない。CC16は、COPDの増悪、心筋梗塞、総死亡などの疾患特異的・総合的な臨床エンドポイントとの相関が必要であろう。予後予測マーカーとしての性能を導き出すためには、大規模な臨床試験でCC16のレベルを観察することが有用であり、バイオバンクのサンプルからも可能性がある。CC16の血清レベルが高ければ、個々の薬物療法を変更したり、一般的な治療を強化したりすることができるかもしれない。
我々は、500人以上の被験者を含むコホートデータを用いて、CC16の広範な心臓代謝評価を初めて提供したが、いくつかの限界も指摘しなければならない： CC16の血清濃度以外に、我々の知見を補強しうる肺機能に関するさらなるデータは入手できなかった。さらに、減量治療を受けている患者のデータは限られており、交絡因子を調整することができなかったため、観察されたCC16の変化の有意性に影響を及ぼす。
結論
結論として、我々は、抗炎症性免疫調節マーカーであるCC16の循環レベルに対する代謝および心血管健康への影響の複雑な影響を明確に示した。また、行動学的および薬理学的介入によってCC16が変化することを示し、ACEi/ARBおよび尿酸降下剤による変化は、臨床に関連する新しい制御軸を特定するための道を開くことができる。全体として、循環するCC16はほとんど肺クラブ細胞に由来するため、我々の発見は、疾患の予防と管理において考慮すべき代謝、心臓、肺の間の相互作用の存在を強化するものである。さらなる研究、特に機能検査への拡張が必要である。
資金提供について
本研究は、Bundesministerium für Bildung und Forschung（FoCus - Food Chain Plus（0315539A））、Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft、JPI HDHL（BIONUGUT: 2816ERA14E; INTIMIC: 01EA1906A ）およびElse Kröner-Fresenius-Stiftung（ekfs, Number 2018_Kolleg.01 - Clinician Scientist）から支援を受けた。
競合する利害関係の宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる既知の競合する金銭的利益または個人的関係がないことを宣言する。
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