口腔内口臭に対する口腔内細菌叢移植：Wistarラットにおける口腔内細菌叢コロニー形成試験に基づく実現可能性の分析

哉百名

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BMC Microbiol. 2024; 24: 170. オンライン公開 2024年5月17日. doi: 10.1186/s12866-024-03322-4
PMCID: PMC11100045PMID: 38760711
口腔内口臭に対する口腔内細菌叢移植：Wistarラットにおける口腔内細菌叢コロニー形成試験に基づく実現可能性の分析

https://bmcmicrobiol.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12866-024-03322-4

黄志強、程永保筆者
著者情報 論文ノート 著作権およびライセンス情報 PMC Disclaimer
関連データ
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要旨
背景
口腔内口臭（IOH）は、全身疾患に加えて口腔内で局所的に発生する口臭であり、現代社会における対人コミュニケーション障害や精神障害の主な原因の一つである。しかし、現在の治療法ではIOHを緩和するのみであり、根絶することはできない。そこで我々は、IOH患者における口腔内微小生態系の機能差に基づき、口腔内微小生態系のバランス回復を目的とした微生物叢移植治療を提案し、Wistarラットを用いた口腔内細菌叢コロニー形成試験によりその実現可能性を解析する。

目的
IOH患者および健常者から唾液細菌叢を採取し、Wistarラットの口腔内細菌叢コロニー形成試験により、IOH治療における口腔内細菌叢移植（OMT）の実現可能性を解析した。

方法
2017年6月から2022年6月までに口臭を主訴に新疆医科大学第一附属病院を受診したIOH患者7名と健常者3名を無作為に抽出した。ハリメーター携帯型口臭検出器を用いて口臭値を記録し、唾液フローラサンプルを採取した。16匹のSPFグレードの雄性Wistarラットを新疆医科大学動物実験センターで飼育し、無作為に実験群（E群）と対照群（C群）に分け、口腔内細菌叢コロニー形成試験を行った。16SrRNAシークエンシング技術とPICRUSt代謝解析を用いて、ウィスターラット試験中の口腔内細菌叢の種組成と関連代謝解析を行った。また、試験中のラットの呼気値の変化を記録した。

結果
ポルフィロモナス、フソバクテリウム、レプトトリキア、ペプトストレプトコッカスの割合は、IOH患者の唾液細菌叢をコロニー形成した後、C群と比較してE群で有意に高く（すべてP < 0.05）、ジェメラの存在量はコロニー形成前はゼロであったが、コロニー形成後のC群ではベースラインと比較してコロニー形成は認められなかった。PICRUSt代謝解析でも、E群ではコロニー形成後にIOH関連代謝経路が有意に亢進し（すべてP＜0.05）、ベースラインおよびC群と比較して呼気値が有意に高かった（すべてP＜0.0001）。健常人由来の唾液細菌叢によるコロニー形成後、E群ラットは、関連する悪臭原因菌のコロニー形成量の減少、関連する代謝の低下、呼気値の有意な低下を示した。一方、C群では、IOH患者の唾液フローラによるコロニー形成後、ベースラインと比較してフローラ構造と呼気値に差のある変化も認められた。

結論
IOHに対するOMTは有望なグリーン治療法であるが、環境因子や個人差の影響も無視できない。

キーワード 口腔内口臭、口腔内細菌叢、細菌叢不均衡、微生物叢移植、16SrRNA遺伝子配列決定、PICRUSt代謝解析
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背景
口腔内口臭（IOH）は、口腔内細菌叢異常症の一般的な疾患であり、症状の長期的な再発は不快な感情をもたらし、IOH患者はコミュニケーションへの恐怖、不安、抑うつ、自尊心の低下、苦痛、その他の否定的感情を示すようになり、人々の社会的相互作用や心身の健康に深刻な影響を及ぼす [1-4] 。疫学調査によると、中国における口臭の有病率は約27.5％であるのに対し、欧米諸国では50％にも上り、IOHはその85％以上を占めている［5］。以前は、IOHの原因はいくつかの口腔疾患（歯周炎や歯肉炎など）に起因するとされ、歯科を受診する理由の第3位（第1位と第2位はそれぞれ、う蝕と歯周病）であった［6］が、近年、口臭を訴えて消化器科クリニックを受診する患者数が増加しており、その大多数は、専門的な口腔介入（スケーリングやスクレイピングなど）を行った後に短期的な有効性を報告するが、長期的な結果はまだ満足のいくものではない。しかし、消化器学的検査の結果、明らかな全身疾患は発見されなかった。IOHの原因はまだ完全には解明されておらず、口腔内の微小生態学的環境、食習慣、衛生習慣[7]、生活環境、自己免疫、薬物など様々な要因に影響されている。生活の質が向上し続けるにつれて、口臭治療を必要とする人の数も増加しているが、現段階では、IOHの治療はまだ抗菌洗口液、舌清掃、歯科治療、一部の抗生物質の使用に限られており、IOHを緩和することしかできず、根絶という目的を達成することはできない。IOH患者の口腔内細菌叢構造の特徴に合わせて、より環境に優しく、より効果的な標的治療をさらに探求することは、間違いなく新しい方向性である[8]。

ヒトの生態環境における微生物叢は、生体の主要な生命維持器官として知られており、粘膜バリア機能、自然免疫反応および適応免疫反応の重要な構成要素であるとともに、病原体のコロニー形成を抑制する作用もあり、細菌叢が乱れると有害な結果を引き起こす [9] 。消化管には、細菌が生存するためのさまざまな生態学的部位があり、そのため人体で最大の細菌密度を有している [10] ；そして、消化管の始まりである口腔は、外部環境とつながっているため微生物の生存に適した条件を有しており、したがって微生物の多様性の増殖に適した領域となっている。現在までに、口腔微生物叢の29門365属が同定されており、その中で最も顕著な属は、レンサ球菌属、ジェメラ属、グラヌリカテラ属、ロチア属、ナイセリア属、プレボテラ属である[11]。これらの非常に豊富な属は、その表面に特異的な付着体を有し、口腔内の異なる生態学的部位に存在する特異的な糖タンパク質レセプターに結合し、最終的に選択的にそれらのレセプターにコロニー形成し、口腔内の異なる生態学的部位に存在する常在細菌叢を構成する[12, 13]。

近年[14-18]、ハイスループットシークエンス技術により、Fusobacterium nucleatum、Porphyromonas gingivalis、Treponema denticola、Solobacterium moorei、Prevotella intermedia、Tannerella forsythia、Peptostreptococcus、およびナノバクテリアがIOHと密接に関連していることが明らかにされ、in vitro培養技術によりF. nucleatum、P.gingivalis、T.denticolaは、いずれも含硫基質（システイン、メチオニン、トリプトファン、アルギニン、リジンなどの含硫アミノ酸[18-20]）を分解し、揮発性硫黄化合物（VSC）を放出して臭気を発生することが培養技術により確認されている。しかし、口腔内には約500～700種の細菌が存在し[11, 21]、その遺伝子プールは宿主の約100倍も多様であるため[22]、臭いを発生させる細菌を対象とした研究が続けられている。IOH患者では、唾液や舌の微生物構造に大きな違いがあることが示されており [23, 24]、糞便細菌叢移植（FMT）療法にヒントを得て、口腔内細菌叢構造を回復させることを目的とした口腔内細菌叢移植（OMT）療法が期待されている。本研究では、ウィスターラットを用いた口腔内細菌叢コロニー形成試験を通じて、IOHに対するOMTの実現可能性をさらに深く検討した。

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結果
塩基配列決定、品質管理、ASV（amplicon sequence variants）
16匹のラットから得られた合計30個の口腔内細菌叢サンプルの塩基配列が決定され、1サンプルあたり平均100,451個のダウンストリームデータが得られた。ダウンストリームデータの品質管理を行ったところ、1サンプルあたり平均76,736件の高品質データが得られ、品質管理効率は76%、平均配列リード長は421.9 bpであった。Shannon指数とChao1指数によって決定されるスパース曲線はいずれも平坦な傾向にあり、全サンプルのシーケンスデータ量とシーケンス深度が妥当であり、サンプルの微生物情報を十分に反映できることが示唆された（図1）。ラット口腔内細菌叢サンプルの高品質な非重複配列をクラスタリングし、ASVの類似度100%で菌種をアノテーションした結果、合計7084のASVがアノテーションされた。E群では、基礎口腔内細菌叢、IOH患者の唾液腺細菌叢コロニー形成後、健常者の唾液腺細菌叢コロニー形成後のサンプル中のASV数は、それぞれ1994、351、380であった（図2）。また、C群では、基礎口腔内細菌叢、IOH患者唾液叢コロニー形成後、健常人唾液叢コロニー形成後のサンプル中のASV数は、それぞれ3983個、461個、409個であった（図2）。

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オブジェクト名は12866_2024_3322_Fig1_HTML.jpgである。
図1
Chao1指数とShannon指数から求めた疎な曲線。曲線の平坦度は、シーケンスの深さがサンプルの多様性に与える影響を反映しており、曲線が平坦であるほど、シーケンスの結果はサンプルに含まれる多様性を反映するのに十分であり、シーケンスの深さをさらに増やすと、まだ見つかっていない新しいASVを大量に検出することができなくなる；Ej, Ez, Ey： Ej、Ez、Ey：E群、Cj、Cz、Cy：C群；j、z、yはそれぞれ、基礎口腔内細菌叢サンプル、IOH患者の唾液叢のコロニー形成後サンプル、健常者の唾液叢のコロニー形成後サンプルを表す。

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オブジェクト名は12866_2024_3322_Fig2_HTML.jpg。
図2
ラットの口腔内細菌叢サンプルのASVのベン図。Ej、Ez、Ey：E群、Cj、Cz、Cy：C群。jはラットの基礎口腔内細菌叢サンプル、zはIOH患者の唾液叢のコロニー形成後サンプル、yは健常者の唾液叢のコロニー形成後サンプルを表す。

口腔内細菌叢の多様性
αダイバーシティの結果、E群、C群ともに口腔内基礎細菌叢の存在量および多様性に有意差は認められなかった（いずれもP＞0.05）（図3A）。C群でコロニー形成されたIOH患者の唾液細菌叢と比較して、E群の口腔細菌叢の多様性は有意に低かった（Shannon index P = 0.021）が、細菌叢の存在量の差は有意ではなかった（P > 0.05）（図3B）。C群のIOH患者の唾液細菌叢コロニー形成前後における口腔内細菌叢の存在量および多様性の差は有意ではなかった（すべてP＞0.05）（図3C）。しかし、C群の健常人の唾液フローラと比較すると、コロニー形成後のラットの口腔内フローラの多様性は有意に低かった（Simpson index P = 0.034）が、フローラの存在量には有意差はなかった（P > 0.05）（図3D）。唾液細菌叢コロニー形成後のC群の健常者の口腔内細菌叢と比較すると、E群のラットでは口腔内細菌叢の多様性が上昇していたが、細菌叢の存在量に有意差はなかった（P＞0.05）（図3E）。

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オブジェクト名は12866_2024_3322_Fig3_HTML.jpg。
図3
2群のラットにおける口腔のα多様性の箱ひげ図。Ej、Ez、Ey：E群、Cj、Cz、Cy：C群。jはラットの基礎口腔内細菌叢サンプル、zはIOH患者の唾液叢のコロニー形成後サンプル、yは健常者の唾液叢のコロニー形成後サンプルを表す。

E群とC群におけるbray_curtisに基づくPCoA解析の結果、PCo1が31.2％、PCo2が14.5％の場合、2群のラットの基礎口腔内細菌叢は群間で有意な分離傾向は認められなかったが、C群のIOHラットのコロニー形成前後の唾液細菌叢と健常者のコロニー形成前後の唾液細菌叢はそれぞれ群内で凝集しており、群間で異なる位置と形態分布を示した（図4）。アドニス解析の結果、基礎口腔内細菌叢のラットの2群間の差（R2＝0.080、P＝0.261）は有意ではなかった。一方、IOHを有するC群ラットの唾液叢コロニー形成前後の口腔内細菌叢（R2 = 0.347, P = 0.008）と健常者の唾液叢コロニー形成前後の口腔内細菌叢（R2 = 0.664, P = 0.021）成分は有意に異なっていた。しかし、唾液叢コロニー形成後のIOHラット（R2＝0.349、P＝0.054）と唾液叢コロニー形成後の健常者（R2＝0.422、P＝0.100）の2群間の差は有意ではなかった。

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図4
ラットの口腔のβ多様性のPCoAプロット。図中の各点は細菌叢サンプルを示し、同じ色は同じグループを示す；Ej、Ez、Ey：Eグループ、Cj、Cz、Cy：Cグループ。jはラットの基礎口腔細菌叢サンプル、zはIOH患者の唾液細菌叢コロニー形成後サンプル、yは健常者の唾液細菌叢コロニー形成後サンプルを示す。

門および属レベルでの種の違いの分析
門レベルでは、E群およびC群の基本的口腔内細菌叢の中で、シアノバクテリアのみが存在量の上位50門で有意に増加していた（P = 0.017, Z=-2.381）が、残りの門の差は統計的に有意ではなかった（すべてP > 0.05）。IOH患者の唾液叢コロニー形成前のE群と比較すると、ファーミキューテス（Z=-2.717、P=0.007）、プロテオバクテリア（Z=-2.038、P=0.042）、シアノバクテリア（Z=-2. 466, P = 0.014）の割合が有意に低く、Fusobacteria（Z=-3.030, P = 0.002）とTM7（Z=-2.324, P = 0.020）の割合が有意に高かった。一方、C群では、同時に採取した口腔内細菌叢において、放線菌（Z=-2.208、P=0.027）、藍藻（Z=-2.766、P=0.006）、TM7（Z=-1.988、P=0.047）の割合が有意に低かった。E群では、コロニー形成のない健常者の唾液叢と比較して、コロニー形成後、ファーミキューテス属（Z=-2.121、P=0.034）の割合が有意に高く、放線菌属（Z=-2.121、P=0.034）の割合が有意に低かった。一方、C群ではコロニー形成のない健常者の唾液叢と比較して、コロニー形成後に放線菌（Z=-2.121、P=0.034）とフソバクテリア（Z=-2.341、P=0.019）が有意に増加し、プロテオバクテリア（Z=-2.121、P=0.034）が有意に減少したが、残りの門では有意差は認められなかった（いずれもP>0.05）。

属レベルでは、E群とC群の基礎口腔細菌叢の差は、高存在属では有意ではなかったが（すべてP＜0.05）、低存在属では若干の差がみられた（表1）。IOH患者の唾液叢コロニー形成後、E群のラットはC群と比較して、同時期にStreptococcus属、Mycoplasma属、Fusobacterium属、Leptotrichia属、Dietzia属、Lachnoanaerobaculum属、Haemophilus属、Peptostreptococcus属、Nitriliruptor属の割合が有意に高く、Facklamia属、Cellulosimicrobium属、Granulicatella属の割合が有意に低かった（表2）。C群では、IOH患者の唾液細菌叢は、コロニー形成前と比較して、コロニー形成後では上位50属の存在量が異なっていた（表3）。E群の健常人の唾液叢コロニー形成後では、コロニー形成前と比較して、Streptococcus属、Aggregatibacter属、Gemella属、Facklamia属、Staphylococcaceae_Staphylococcus属、Enterococcus属、Ralstonia、 MycoplasmaおよびSphingomonasの割合が有意に低く、Rothia、Veillonella、Actinomyces graevenitzii、Neisseria、Bacillaceae_BacillusおよびActinobacillusの割合が有意に高かった（表4）。また、E群では健常人の唾液叢をコロニー形成前に比べてコロニー形成後にFusobacterium、Leptotrichia、Haemophilusの割合が減少したが、その差は統計学的に有意ではなかった（すべてP > 0.05）（表4）。一方、C群ではそのような症状は見られなかった。

表1
ラット2群間のベースライン口腔内細菌叢の差（属レベル）

E群 C群 Z値 P値
乳酸菌 0.02125 ± 0.05720 0.03658 ± 0.07705 -2.205 0.027
ブドウ球菌科_ブドウ球菌 0.00027 ± 0.00019 0.00390 ± 0.00502 -3.046 0.002
腸球菌 0.00002 ± 0.00006 0.00082 ± 0.00076 -2.973 0.003
ビフィズス菌 0.00092 ± 0.00244 0.00086 ± 0.00067 -2.212 0.027
マイコプラズマ 0 0.00116 ± 0.00194 -2.208 0.027
アシネトバクター 0.00005 ± 0.00010 0.00027 ± 0.00025 -2.412 0.016
うどんこ病菌 0.00003 ± 0.00009 0.00059 ± 0.00085 -2.430 0.015
赤痢菌 0.00011 ± 0.00013 0.00050 ± 0.00027 -2.633 0.008
シレネ 0 0.00010 ± 0.00017 -2.208 0.027
ブラウティア 0.00002 ± 0.00005 0.00099 ± 0.00237 -2.315 0.021
ローズブリア 0 0.00085 ± 0.00171 -2.554 0.011
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表2
唾液中細菌叢コロニー形成後のIOHラット2群間における口腔内細菌叢の違い（属レベル）

グループE グループC Z値 P値
レンサ球菌 0.480000 ± 0.070000 0.280000 ± 0.140000 -2.021 0.043
ファクラミア 0.001000 ± 0.000300 0.020000 ± 0.020000 -2.309 0.021
マイコプラズマ 0.002000 ± 0.002000 0.000090 ± 0.000100 -2.033 0.042
フソバクテリウム 0.002000 ± 0.002000 0 -2.460 0.014
レプトトリキア 0.001000 ± 0.002000 0 -1.984 0.047
ディエチア 0.000200 ± 0.000100 0 -1.984 0.047
セルロースイミクロビウム 0.000010 ± 0.000030 0.000200 ± 0.000040 -2.366 0.018
Lachnoanaerobaculum 0.000200 ± 0.000200 0 -1.984 0.047
グラヌリカテラ 0.000003 ± 0.000006 0.000100 ± 0.000100 -2.366 0.018
ヘモフィルス 0.000100 ± 0.000060 0 -2.460 0.014
ペプトストレプトコッカス 0.000080 ± 0.000050 0 -2.460 0.014
ニトリロプテル 0.000030 ± 0.000020 0.000020 ± 0.000020 -0.744 0.457
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表3
IOH患者唾液叢のコロニー形成前後におけるグループCの唾液叢の違い（属レベル）

属 植民地化前 植民地化後 Z値 P値
Rothia 0.29538 ± 0.17628 0.04894 ± 0.05786 -2.208 0.027
アグリガティバクター 0.13611 ± 0.20731 0.51099 ± 0.25481 -2.038 0.042
バリオボラックス 0.07941 ± 0.08341 0.00034 ± 0.00047 -2.552 0.011
セルロースイミクロビウム 0 0.00015 ± 0.00004 -3.233 0.001
ビフィズス菌 0.00871 ± 0.00903 0.00006 ± 0.00008 -2.552 0.011
ラルストニア 0.00002 ± 0.00006 0.00050 ± 0.00049 -2.651 0.008
ルミノコッカス 0.00076 ± 0.00069 0.00003 ± 0.00005 -2.161 0.031
ヨトウガリコッカス 0.00318 ± 0.00347 0.00003 ± 0.00007 -2.566 0.010
バチルス科_バチルス属 0.00137 ± 0.00169 0.00006 ± 0.00007 -2.378 0.017
アシネトバクター 0.00242 ± 0.00261 0.00021 ± 0.00040 -2.212 0.027
アドレルクロイツア 0.00084 ± 0.00106 0.00006 ± 0.00011 -2.161 0.031
アクチノバチルス 0 0.00073 ± 0.00133 -2.675 0.007
赤痢菌 0.00113 ± 0.00087 0.00003 ± 0.00006 -2.161 0.031
シレネ 0.00148 ± 0.00211 0 -2.466 0.014
ブラウティア 0.00042 ± 0.00047 0 -2.176 0.030
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表4
E群における健常人の唾液細菌叢とのコロニー形成前後の唾液細菌叢の差（属レベル）

属 コロニー形成前 コロニー形成後 Z値 P値
レンサ球菌 0.47612 ± 0.06533 0.23152 ± 0.02637 -2.121 0.034
ロチア菌 0.05036 ± 0.03205 0.33565 ± 0.04539 -2.121 0.034
アグリガティバクター 0.29452 ± 0.06033 0.10290 ± 0.01860 -2.121 0.034
ベヨネラ 0.02203 ± 0.01989 0.11403 ± 0.04552 -2.121 0.034
ジェメラ 0.09711 ± 0.04063 0.01339 ± 0.00592 -2.121 0.034
放線菌 0.00604 ± 0.00353 0.04823 ± 0.01007 -2.121 0.034
ファクラミア 0.00060 ± 0.00029 0.00419 ± 0.00286 -2.121 0.034
ブドウ球菌科_ブドウ球菌 0.00131 ± 0.00090 0.00004 ± 0.00004 -2.121 0.034
腸球菌 0.00494 ± 0.00265 0.00037 ± 0.00007 -2.121 0.034
ラルストニア 0.00145 ± 0.00073 0 -2.201 0.028
ナイセリア 0.00002 ± 0.00003 0.00172 ± 0.00077 -2.201 0.028
マイコプラズマ 0.00206 ± 0.00181 0.00007 ± 0.00006 -2.121 0.034
バチルス 0.00007 ± 0.00003 0.00167 ± 0.00075 -2.121 0.034
アクチノバチルス 0.00003 ± 0.00003 0.00141 ± 0.00075 -2.141 0.032
スフィンゴモナス

フソバクテリウム

レプトトリキア

ヘモフィルス

0.00020 ± 0.00009

0.00179 ± 0.00198

0.00133 ± 0.00217

0.00013 ± 0.00006

0

0.00097 ± 0.00045

0

0.00012 ± 0.00005

-2.201

0

-1.755

-0.354

0.028

1.000

0.079

0.724

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PICRUSt（Phylogenetic investigation of communities by Reconstruction of Unobserved States）機能予測解析
臭いを発生させる主な物質はVSCであるため、含硫アミノ酸の代謝が特に注目される。C群と比較して、IOHを有するE群ラットは、唾液叢コロニー形成後、システインおよびメチオニン代謝、ならびにアルギニンおよびプロリン代謝が有意に高いレベルを示した（表5）が、ベースラインではこの代謝差は示されなかった（表6）。しかし、唾液叢コロニー形成後のE群ラットでは、C群と比較して、システインおよびメチオニン代謝、ならびにアルギニンおよびプロリン代謝は、健常者では有意な低下を示さなかった（表7）。しかし、システインおよびメチオニン代謝は有意に低下し、アルギニンおよびプロリン代謝も唾液叢コロニー形成前のE群健常者と比較してコロニー形成後に低下傾向を示した（表8）。

表5
IOHラット2群における唾液フローラコロニー化後の口腔内フローラの代謝経路の違い

代謝経路 E群 C群 Z値 P値
システインおよびメチオニン代謝 537.275 ± 17.397 457.321 ± 44.806 -2.309 0.021
アルギニンとプロリンの代謝 248.201 ± 4.950 229.206 ± 11.810 -2.309 0.021
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表6
初期IOH関連代謝経路の2群間差

代謝経路 E群 C群 Z値 P値
システインおよびメチオニン代謝 470.45 ± 23.52 478.10 ± 28.31 -0.289 0.773
アルギニンとプロリンの代謝 227.82 ± 19.83 232.37 ± 35.42 -0.289 0.773
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表7
ラット2群における健常人との唾液叢コロニー形成後の口腔内細菌叢の代謝経路

代謝経路 E群 C群 Z値 P値
システイン・メチオニン代謝 488.516 ± 11.563 470.882 ± 8.897 -1.528 0.127
アルギニンとプロリンの代謝 246.465 ± 7.943 242.102 ± 3.626 -0.655 0.513
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表8
唾液フローラコロニー化前後の健常人E群ラットの口腔内フローラの代謝経路

コロニー形成前後の代謝経路 Z値 P値
システインおよびメチオニン代謝 537.275 ± 17.397 488.516 ± 11.563 -2.121 0.034
アルギニンとプロリンの代謝 248.201 ± 4.950 246.465 ± 7.943 -0.354 0.724
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ラットにおける呼気値の変化
E群の唾液細菌叢がコロニー形成されたIOH患者と健常者のラットの口腔内における経過中の呼気値の変化を理解するために、ラットを用いて2週間ごとに呼気検査を行った。C群のIOH患者の唾液フローラコロニー化後の呼気値にはベースラインと比較して統計学的な差が認められたが（t=-2.250, P = 0.041）、E群では有意差が認められた（t=-9.144, P < 0.0001）。また、唾液フローラコロニー化後の呼気値の差は、IOH患者の2群間で有意であった（t＝7.827、P＜0.0001）。健常人の唾液フローラコロニー化後の呼気値の差は、E群ではIOH患者と比較して有意であったが（t=-6.575, P < 0.0001）、C群では有意差はなかった（t=0.128, P = 0.902）。唾液フローラコロニー化後の健常人の2群間の呼気値の差は有意ではなかった（t = 0.415, P = 0.689）。両群のラットの呼気値の変化を折りたたんだグラフを図5に示す。

画像やイラストなどを保持する外部ファイル。
オブジェクト名は12866_2024_3322_Fig5_HTML.jpgである。
図5
2群のラットの呼吸値の変化の折れ線グラフ。グラフの各点は2群のラットの同時刻における呼吸値の平均値を示す。

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考察
口臭と口腔微生物学
口臭はIOH、口腔外口臭（EOH）、一過性口臭の3つに分類することができ、IOHは口腔内微小生態学と密接な関係があり、EOHは主に全身性疾患（肝臓、腎臓、内分泌疾患など）やある種の薬剤によって引き起こされ[25, 26]、一過性口臭はある種の食品（ニンニク、タマネギなど）やその残留物によって引き起こされる。口腔内微小生態系は、腸内微小生態系に次いで2番目に複雑な微小生態系として、多数のコロニー形成生態学的部位を有しており、Nicola Segataら[10]は、ファーミキューテス（Firmicutes）とバクテロイデーテス（Bacteroidetes）の比率により、(i)口腔粘膜、角化歯肉および硬口蓋、(ii)唾液および舌、(iii)歯肉縁上および歯肉縁下プラークの3つのグループに分類している。多くの口腔疾患に関する研究から、口臭については唾液と舌で、う蝕については歯肉縁上歯垢で、歯周炎については歯肉縁下歯垢で、それぞれ微小生態学的差異が検出されており [27, 28]、口腔内細菌叢がこれらの疾患の発症に重要な役割を果たしていることが示唆されている [30] 。唾液は口腔内細菌叢全体を代表するものであり、疫学的研究や集団遺伝学的研究のDNA源としてますます利用されるようになってきている[31]。地理的な要因が遺伝的構造に大きく影響する今日、唾液マイクロバイオームは地理的な場所による大きな違いは見られず[32]、口腔内細菌叢の恒常性の維持にも重要な役割を果たしている[27]。唾液の主な細菌叢成分は、口腔内の各生態部位を洗浄することによって産生され、その取得が簡単で遺伝的安定性が高く、代表性が高いことから、口腔内細菌叢を研究するための一般的なサンプルとなっている[33, 34]。そこで、本研究では、IOH患者および健常者の唾液叢を選択し、Wistarラット口腔内細菌叢コロニー形成試験を行い、IOHに対するOMTの実施可能性をさらに検討した。

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呼気試験
現在、臨床および研究において呼気検査に一般的に使用されている主な機器および方法は、ハリメーター呼気検出器、ガスクロマトグラフィー、およびオルガノレプティックスコアリングである。口臭の有無と重症度をスコアで判定するオルガノレプティック・スコアリング（OLS）は、実施が容易であるため口臭研究に広く用いられているが、主観的で再現性に欠けるという欠点がある[35]。ハリメーター口臭検出器は、ガス中のVSCsの量を検出することによって口臭を判定するもので、器質的スコアリング法よりも客観的であるが、VSCsを構成する主な物質（硫化水素、メチルメルカプタン、ジメチルサルファイド）を区別して表示することができず、他の臭いの原因物質（プロピオン酸、酪酸、カダベリン、プトレシン、便臭物質、インドールなどの短鎖脂肪酸[36]）を検出することができない[37]。ガスクロマトグラフィーは、VSCだけでなく、主な臭気原因物質を定量的に区別して精密に分析し、その他の臭気原因物質を検出するための最良の方法と考えられているが、操作性が悪いため、臨床現場ではほとんど使用されていない[38]。したがって、IOHの主な原因物質がVSCであることと合わせて、本研究では、IOH患者の採取とラットの呼気検査に携帯型のハリメーター呼気検出器を使用した。

微生物叢移植の新戦略
微生物叢移植（MT）とは、健康な被験者の特定の部位から微生物叢を採取し、それを患者の病原部位に特定の方法でコロニー形成させ、治療目的のために健康な微生物生態系を再確立するプロセスである。この手法の歴史は数千年前にさかのぼる [39] 。中国の漢方医葛洪が、食中毒やひどい下痢の患者を治療するために健常者の糞便懸濁液を使用したところ、非常に良好な結果が得られたため、糞便微生物叢移植（FMT）として知られるようになった。FMTは、難治性のクロストリジウム・ディフィシル感染症（CDI）の再発患者を対象に初めて報告され［40］、現在では、炎症性腸疾患、慢性伝染性便秘、非アルコール性脂肪性肝疾患（NAFLD）、アレルギーなど、さまざまな疾患に対する治療効果が随時報告されている［41, 42］。近年、アトピー性皮膚炎に対する皮膚微生物叢移植（SMT）[43, 44]、細菌性膣炎に対する膣微生物叢移植（VMT）[45, 46]、歯周炎およびう蝕に対する口腔微生物叢移植（OMT）[47, 48]、子宮内膜炎に対する子宮微生物叢移植（UMT）[49]など、細菌叢不均衡疾患の治療に対する細菌叢移植技術に関する研究が急速に進められている。しかし、腸、膣、子宮は細菌叢の安定性が高く、外部環境の影響を受けにくい閉鎖環境であるのに対し、口腔は開放環境であり、食事や環境の影響を受けやすいため、OMT治療の研究開発は比較的遅れている。本研究では、IOH患者と健常者の唾液細菌叢の有意差とその高い安定性を利用し、口腔内細菌叢のマイクロエコロジーの回復を目的としたOMT治療が口臭治療の新たな戦略であることを提案する。

口腔内口臭に対する微生物叢移植
Wisterラット口腔内細菌叢コロニー形成試験において、IOH患者と健常人から最も代表的な唾液細菌叢を選択し、ラットE群口腔内コロニー形成試験を行った。IOH患者7名の唾液叢と健常者3名の唾液叢を混和してからコロニー形成し、個人差をなくした。その結果、コロニー形成前の2群のラットの存在量と多様性に有意差はなく、アドニス分析では群間の差は小さく、門および属レベルの高存在種の差は有意ではなかった。

E群のラット細菌叢の多様性は、IOH患者の唾液細菌叢がコロニー形成された後のC群よりも有意に低かったことから、IOH患者の唾液細菌叢がコロニー形成されると口腔内細菌叢の多様性が低下することが示され、これは細菌叢間の競合効果に関連していると考えられた。しかし、アドニス分析によると、コロニー形成後の2群間の差はまだ小さく、コロニー形成後のE群の細菌叢構造はC群と有意な差はないことが示唆された。しかし、IOH患者の口臭に関連する菌種であるFusobacteria属、Porphyromonas属、Fusobacterium属、Gemella属、Leptotrichia属[17]、Peptostreptococcus属の割合は、コロニー形成前のこれらの菌種の存在量はすべてゼロであったのに対し、コロニー形成後のE群のラットでは有意に高かった。一方、フソバクテリウム属、レプトトリキア属、ペプトストレプトコッカス属の菌量はゼロのままであり、ポルフィロモナス属の菌量はC群ではコロニー化後も有意に変化しなかったことから、IOH患者の唾液中の悪臭原因菌はE群でもコロニー化する可能性が示唆された。ハリメーター呼気検出器から得られたデータは、両群とも増加傾向を示したが、E群のIOH患者の唾液細菌叢は、コロニー形成後にベースラインと比較して有意な増加を示し、コロニー形成後にC群と比較して極めて有意な差を示したことから、環境因子は口臭に何らかの影響を及ぼす可能性があるが、根本的な原因は口腔内細菌叢のアンバランスにあることが示唆された。PICRUSt代謝予測解析の結果、システインとメチオニンの代謝経路およびアルギニンとプロリンの代謝経路は、コロニー形成後のC群と比較してE群で有意に亢進し、統計学的に有意な差が認められたが、ベースラインではそのようなパフォーマンスは認められず、C群ではベースライン時とコロニー形成後の対象代謝経路の間に統計学的に有意な関係は認められなかった。このことから、口臭関連細菌叢は明らかにコロニー形成して代謝機能を発揮することができ、環境因子との関係は依然として重要ではないことが示唆された。以上より、E群のIOH患者の唾液細菌叢は、コロニー形成後の臨床患者の唾液細菌叢と類似した特徴を有していた。IOHとの関連性が明らかなFusobacterium、Leptotrichia、Haemophilusの割合は、唾液フローラコロニー化前のE群の健常者に比べ、コロニー化後は減少した。C群の健常者の唾液フローラコロニー化と比較して、E群のフローラの多様性は有意に高く、健常者の唾液フローラコロニー化によりE群のラットの口腔内フローラの多様性が回復したことが示唆された。PICRUSt代謝予測解析の結果、E群の健常者は唾液コロニー形成前と比較して、システインとメチオニンの代謝、アルギニンとプロリンの代謝が低下することが示唆された。同様に、唾液フローラコロニー化前のE群の健常者と比較して、コロニー化後の呼気値は有意に減少し、C群のレベルに近づいた。健常人の唾液腺細菌叢コロニー形成後のE群ラットの種組成の変化と代謝の変化は、サンプルサイズや不確実な環境などの交絡因子の影響を受ける可能性があるが、相関する変化と呼気値の有意な変化の傾向があり、OMTがIOH治療に有効であることをある程度示すことができるが、大規模サンプルによる長期コロニー形成試験でのさらなる検証が必要である。唾液中の細菌叢α多様性については、ベースラインのC群とコロニー形成後のIOH患者との間に有意差は認められなかったが、PCoA分析では有意な分離傾向が認められた。門および属レベルでの低存在細菌叢の構造変化、およびコロニー形成前後における健常人の唾液細菌叢α多様性の有意な減少を合わせると、環境因子は口腔細菌叢の構造と多様性を変化させることはできるが、細菌叢の存在量を変化させることはできないことが示唆された。

口腔内口臭治療における微生物叢移植の有用性
本研究では、IOHをターゲットとし、FMT療法の成功経験を生かし、歯周炎に対するMT療法に関する過去の動物実験の結果を参照し、IOH治療に対するOMTの実現可能性を検討した。第一に、IOH患者の唾液細菌叢をラットの口腔内にコロニー形成させ、微生物の相互作用と代謝ネットワークを最大限に保存したIOHのラットモデルを作成し、患者の臨床症状、微生物、代謝変化をよくシミュレートした； 第二に、健常人の唾液細菌叢をモデルラットの口腔内にコロニー形成させ、モデルラットにおける口腔内細菌叢の構造、代謝経路、呼気値の変化を評価することで、IOH治療にOMTが可能であることを間接的に実証した。全体として、IOH患者および健常者の唾液フローラを動物実験に用い、臨床評価システムを採用した本方法論は、臨床応用が可能な知見を有しており、IOHに対する新たな微生物治療薬の今後の開発、および微生物-メタボロミクス機構と標的-フローラ相互作用の分野における研究および翻訳に重要な手がかりを提供するものである。

本研究の欠点
(i)被験者の歯周状態の簡単な臨床評価のみが行われ、歯科専門職の系統的評価（プラーク指数、歯肉指数、プロービング時の出血など）は行われなかった。 ii）本研究で使用したPICRUSt代謝予測分析は、細菌叢の代謝機能を予備的に予測することしかできず、正確に評価することはできない。iii）本研究で使用した16SrRNA配列決定技術は、標的細菌叢のコロニー形成の有無を予備的に確認することしかできないが、その起源を正確に決定することはできない； (iv）本研究は、IOH患者の唾液叢のコロニー形成能と口腔健常者の唾液叢のコロニー形成能を通じて、間接的にOMT治療の実行可能性を探っているに過ぎず、系統性に欠ける。

展望
本研究の実験結果に基づき、我々は以下の展望を立てることができる：(i)口腔指標を系統的に評価した後、メタボロームアプローチを用いた口臭関連代謝の正確な評価、および細菌叢相互作用の詳細な研究のための種共生に基づく代謝ネットワークの構築、(ii)微生物トレーサー技術を用いた標的細菌叢のコロニー形成および生存率の正確な評価、または一塩基ポリペプチドキャラクタリゼーションに基づく解析、およびIOHに対するOMTの安全性および有効性の系統的評価は、さらなる研究の方向性である。

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結論
結論として、口腔内の微生物生態学的バランスを回復させることを目的としたOMT治療法は、実現可能性が高く、有望なグリーンな治療法であり、臨床的なトランスレーショナルバリューもあるが、環境因子や個人差の影響を考慮する必要がある。

方法
サンプリング集団
2017年6月から2022年6月までに新疆医科大学第一付属病院に通院したIOH患者7名を抽出し、その内訳は男性4名、女性3名；年齢31～46歳、平均年齢（40.0±2.79）歳；同期間に新疆医科大学第一付属病院健康管理センターで受診した健常者3名を抽出し、その内訳は男性1名、女性2名；年齢27～45歳、平均年齢（35.67±2.79）歳であった。IOH患者7名と健常者3名の歯肉の色はピンク色で、歯肉からの出血はなく、歯肉縁は歯に密着しており、歯周組織の腫脹や炎症はなく、痛みや不快感はなく、著しい歯肉ポケットの形成や深さはなく、歯のゆるみはなく、口臭の違いを除き、視覚的な歯周健康状態に有意差はなかった。IOH患者の組み入れ基準 (1)口臭を訴えて新疆医科大学第一付属病院を受診した患者、(2)歯周病が健康である、(3)全身疾患がない、(4)年齢が18歳以上である、(5)受診時の呼気検査値が110ppb以上である、(6)受診者全員がインフォームドコンセントに署名している。IOH患者の除外基準 (1）1年以内に歯周病治療を受けた者、（2）6ヵ月以内に局所または全身性の抗生物質を投与された者、（3）3ヵ月以内に非ステロイド性抗炎症薬を使用した者、（4）喫煙者、（5）全身疾患を有する者、（6）妊娠中または授乳中の者、（7）本臨床試験への参加が不可能または不本意な者。

実験動物
平均体重254.27±37.06gの6～8週齢のSPFグレードのWistar系ラット16匹（雄、一般健康状態、生産ライセンスSCXK (Xin) 2018-0003）を新疆医科大学動物実験センターから選択した。ラットは以下の環境で飼育した： (i)バリア環境：温度23°∽25°、相対湿度50%∽70%、明暗交互、(ii)一般環境：温度18°∽26°、昼夜交互、12時間。バリア環境飼育では無菌飼料と水を与え、一般環境飼育では特定の病原体を含まない飼料と水を与えた。すべてのラットは5日ごとに寝具を交換し、IOH患者の唾液コロニーはコロニー形成前に食事と水を制限しなかった。コロニー形成後、E群には10%濃度のショ糖水を継続的に与えた。実験終了後、WistarラットをCO2実行チャンバーに入れ、CO2吸入により安楽死させた。この方法は、複数のラットを同時に安楽死させることができ、ラットの体の構造を破壊することなく、他の方法よりも安全で確実な方法である。動物実験手順はすべて動物実験の倫理要件に適合しており、新疆医科大学実験動物倫理委員会の承認を得た（承認番号：IACUC-20210405-14）。

サンプル採取と実験手順
唾液サンプル採取：朝、口腔内洗浄を行わず、絶食条件下で非刺激性唾液（唾液腺から刺激がない場合に自然に分泌される唾液）2.5mlを採取し、凍結乾燥チューブに入れ、液体窒素ですべて直ちにスナップ凍結し、全サンプル採取後、-80℃冷蔵庫に移し凍結保存した。ラット口腔内細菌叢サンプルの採取 各サンプリング前に、イソフルラン（流量4L/min、濃度4％）を用いて1分間麻酔をかけた後、ラットを試験台に固定し、ラットの歯および口腔粘膜を使い捨て滅菌綿棒で3回拭き取り、PBS緩衝液とともに凍結乾燥チューブに入れ、-80℃の冷凍庫で凍結保存した。

2%カルボキシメチルセルロースナトリウム、0.1%次亜塩素酸ナトリウム溶液、23µMアスコルビン酸ナトリウムで構成され、上記の試薬はすぐに使用できる。IOH患者7名と健常者3名の唾液叢を別々に混合し、2％カルボキシメチルセルロースナトリウムを等量添加した後、20％グリセロール含有PBSを等量添加し、分注（1ユニット2ml）し、-80℃冷蔵庫で保存した。

実験手順： (1)朝の空腹状態において、携帯型呼気検出器ハリメーター（仕様型式：RH-17 K、製造元：米国インタースキャン社）を用いて口腔内ガスのppb値を検出し、1回5分の間隔で3回繰り返し、平均値をとった。使用説明書（http://halimeter.com/ calibration-procedure）に従い、ppb≧110を口臭、ppb＜110を正常呼気と定義した。対象者の基本情報を表9に示す。唾液サンプルはIOH患者と健常者からそれぞれ採取した。(2)すべてのラットを1週間バリア内に収容した後、麻酔下で口腔内細菌叢を採取し、無作為にE群とC群に分け、各群8匹ずつに耳札を付け、携帯型ハリメーター呼気検出器を用いてラットの口腔内のガスppb値を検出し、1回5分の間隔で3回繰り返し、平均値をとり、実験ラットの基本情報を表10に示した。次に、一般環境下で麻酔をかけた後、生理食塩水に浸した綿棒を用いて全歯および口腔粘膜を機械的に洗浄した。1週間の日常給餌後、全顎の歯と粘膜の洗浄を繰り返した後、0.1％NaoClで5分間洗浄し、不活化のために23μM緩衝化アスコルビン酸ナトリウムで10分間再度洗浄し、再び麻酔下で口腔内細菌叢のサンプリングを行った[48]。分注したIOH患者用菌液をE群ラットの歯と口腔粘膜に塗布した後（塗布方法：針を外した1 mlシリンジを使用し、小分けにしてゆっくり塗布）、各ラットに0.25 mlを1日1回投与し、塗布後1時間は絶食させ、その後、麻酔下で口腔内細菌叢をサンプリングした後、10%ショ糖水を6週間連続投与した。C群は、同期間、日常的に飼育し、サンプリングした。E群は、健常人にバクテリオファージ移植を6週間継続し、一般環境下で上記条件でサンプリングした。C群は、同期間、日常的に飼育し、サンプリングした。実験方法は、麻酔下でハリメーター呼気検知器を用いて2週間ごとに両群の口腔内ガスのppb値を測定した。

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図6
研究構造の枠組み図

表9
対象者の基本情報

臨床指標 H群（n=7） N群（n=3） t/χ2 P値
年齢（年） 40.00 ± 2.79 35.67 ± 2.79 1.088 0.308* 性別 女性 3(43.0%)
性別 女性 3(43.0%) 2(67.0%) 0.218 0.490$.
男性 4(57.0%) 1(33.0%)
呼気中濃度(ppb) 211 ± 93 65 ± 18 2.610 0.031** 1.088 0.308
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  • は2独立標本t検定、$はカイ二乗検定による計算を示す。

表 10
Wistar系ラットを組み入れた場合の基本情報

検査指標 E群（n = 8） C群（n = 8） t P値
呼気価(ppb) 22 ± 5 20 ± 6 0.847 0.411* 体重(g) 256.7
体重(g) 256.7 ± 27.9 251.9 ± 46.4 0.251 0.805* 0.805
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  • は2つの独立標本のt検定による計算を示す。

実験試薬
カルボキシメチルセルロースナトリウム（25 g）およびアスコルビン酸ナトリウム（100 g）は、Beijing Solabao Technology Co. 品番はそれぞれC8621とS9440である。次亜塩素酸ナトリウム溶液（500ml）およびグリセロール（500ml）は、Shanghai Maclean Biochemical Technology Co. 商品番号はそれぞれS817441およびG6201である。PBS（500ml）は、北京西濃因子技術有限公司から購入した。商品番号はCBS004S-BR500。イソフルラン（100 ml）は河北金達富医薬有限公司から購入した。ロット番号20,220,202。塩化ナトリウム注射液（500ml）は四川科連製薬有限公司から購入した。ロット番号L122041203。

DNA抽出およびPCR増幅
DNA抽出、品質管理、増幅、精製はすべてShanghai Personal Biotechnology Co. 増幅領域は細菌の16 S rRNA V3-V4の保存領域で、プライマーはF: ACTCCTACGGGAGGCAGCA R: GGACTACHVGGGTWTCTAATであった。PCR増幅ステップは、98℃で2分間の前変性、98℃で15秒間の変性、55℃で30秒間のアニーリング、72℃で30秒間の伸長、合計25-30サイクル、72℃で5分間の最終伸長であった。増幅されたDNAは、Novaseq-PE250シーケンシングプラットフォーム（米国イルミナ社製）でダブルエンドシークエンシングを行い、DNA断片化とその後のバイオインフォマティクス解析を行った。

データ整理とバイオインフォマティクス解析
すべての生データはExcelスプレッドシートを用いて記録した。配列のノイズ除去にはQIIME2のdada2解析プロセスを選択し、その結果得られたいくつかのノイズ除去された配列ASVを100%の類似度でクラスタリングした。Silvaデータベース[50]を使用し、QIIME2[51]のclassify-sklearnアルゴリズムを、各ASVの特徴配列について、デフォルトのパラメータでQIIME2ソフトウェアで使用し、事前に訓練されたNaive Bayes分類器を使用して、種のアノテーションを行った。Chao1指数とObserved species指数を用いてサンプルの存在量を評価し、Shannon指数とSimpson指数を用いてサンプルの多様性を評価した。主座標分析（PCoA）はQIIME2ソフトウェアを用い、Bray-Curtis距離に基づいて作成した。

統計手法
データはSPSS 26.0ソフトウェアを用いて処理し、正規分布に適合する測定データの記述には平均±標準偏差を用い、カテゴリーデータにはt検定を優先した。QIIME2プラットフォームを使用して、異なるサンプルデータの種組成、アルファ多様性、ベータ多様性を個別に分析した。グループ間の差の有意性の検定にはアドニス分析を用い、グループ間の比較には順位和検定（マン・ホイットニーのU検定）を用いた。検定水準はすべてα=0.05であった。

にした：
謝辞
シーケンシングサービスはShanghai Personal Biotechnology Co. データは、無料のオンラインプラットフォームPersonalbio GenesCloud（https://www.genescloud.cn）を用いて解析した。

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略語
IOH 口腔内口臭
VSC 揮発性硫黄化合物
EOH 口外口臭
OLS オーガノレプティックスコアリング
PICRUSt 未観測状態の再構成による群集の系統的調査
FMT 糞便微生物叢移植
SMT 皮膚微生物叢移植
VMT 膣微生物叢移植
OMT 経口微生物叢移植
UMT 子宮微生物叢移植
ASV アンプリコン配列バリアント
PCoA 主座標分析
MT 微生物叢移植
CDI クロストリジウム・ディフィシル感染症
NAFLD 非アルコール性脂肪性肝疾患
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著者貢献
ZHは研究デザインと研究作業の監督を行い、YCは実験デザインの指導と研究作業への提案を行い、ZHとYCはデータ解析を行い、ZHは原稿を作成した。ZHは原稿を作成した。著者全員が結果の解釈と原稿作成に貢献した。著者全員が最終原稿を読み、承認した。

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資金提供
本研究は、中国新疆ウイグル自治区高レベル人材導入プロジェクト（助成金番号(13)111）の助成を受けた。

研究成果
データの利用可能性
本論文で報告した生配列データは、China National Center for Bioinformation / Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (GSA: CRA016060)のNational Genomics Data Center (Nucleic Acids Res 2022)のGenome Sequence Archive (Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2021)に寄託され、https://bigd.big.ac.cn/gsa/browse/CRA016060。

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宣言
倫理承認および参加同意
ウィスターラットは新疆医科大学動物実験センターから購入し、資格番号はSCXK（新）2018-0003。製造許可番号はSCXK (Xin) 2018-0002である。すべての動物実験は、新疆医科大学のInstitutional Animal Care and Use Committee（承認番号：IACUC-20210405-14）のガイドラインに従って行われた。また、本研究はARRIVEガイドライン（https://arriveguidelines.org）に準拠している。被験者の倫理は、新疆医科大学第一付属病院倫理委員会（K202303-23）により承認された。ボランティア参加者全員から書面によるインフォームドコンセントを得た。

出版に関する同意
該当なし。

競合利益
著者らは競合する利益はないと宣言している。

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脚注
出版社ノート

シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。

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参考文献

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