ショットガンDNAシーケンスによる高齢者介護施設入居者の腸内・口腔マイクロバイオームおよびレジストームに対する抗菌薬治療の影響の探索

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Microbial Genomicsロゴ第10巻第2号
ショットガンDNAシーケンスによる高齢者介護施設入居者の腸内・口腔マイクロバイオームおよびレジストームに対する抗菌薬治療の影響の探索

https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/mgen/10.1099/mgen.0.001180

 オープンアクセス
北村憲和1、梶原俊樹1、Camila Gazolla Volpiano2,3、Myo Naung2,3、Guillaume Méric2,3,4,5、平林亜紀1、矢野博一1、山本雅也6、 吉田文昭7、小林常三郎8、山梨沙里9、川村忠雄10、松永信昭11、大河内二郎12、菅井基之1、矢原浩二1ORCID icon
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公開日：2024年2月20日
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要旨

抗生物質耐性菌（ARB）をモニタリングし、ヒトのマイクロバイオームおよびレジストームに及ぼす抗菌薬の影響を理解することは、公衆衛生にとって極めて重要である。しかしながら、入居者がARBのリザーバーとして機能しているにもかかわらずARBに関する全国的なサーベイランスの対象とはなっていない長期介護施設における抗菌薬治療とマイクロバイオーム・レジストームとの関連について検討した研究はない。われわれは、長期療養施設入所者の口腔および便検体のショットガンメタゲノムシークエンシングを実施し、過去6ヵ月の抗菌薬治療歴に基づく横断的比較と、単一の抗菌薬による治療前、治療中、治療後2～4週間の便検体間の被験者内比較の2種類を用いて、抗菌薬治療がヒトマイクロバイオームおよびレジストームに及ぼす影響を検討した。横断的解析により、抗菌薬投与歴のあるグループには2つの特徴があることが明らかになった。すなわち、古細菌であるメタノブレビバクター（Methanobrevibacter）だけが有意に存在量が増加し、抗菌薬耐性遺伝子（ARG）の総存在量も有意に高かった。被験者内比較では、治療中に分類学的多様性が減少することはなかったことから、通常の臨床治療における単一の抗菌薬の処方が腸内細菌叢に及ぼす影響は、たとえ超高齢者であっても、これまで考えられていたよりも小さい可能性が高いことが示唆された。ARGの検出限界について追加解析を行ったところ、コンティグカバレッジが2.0未満の場合には検出できないことが明らかになった。本研究は、通常の抗菌薬投与が長期療養施設入所者のマイクロバイオームおよびレジストームに及ぼす影響について報告した初めての研究である。

キーワード
抗生物質、抗菌薬耐性、マイクロバイオーム、微生物叢、長期療養施設、ショットガンメタゲノミクス

著者ノート
これらの著者は本研究に等しく貢献した。
すべての補助データ、コード、プロトコルは論文内または補助データファイルで提供されている。4つの補足図と1つの補足表は、本論文のオンライン版で入手可能である。
略語

AMR、抗菌薬耐性、ARB、抗菌薬耐性菌、ARG、抗菌薬耐性遺伝子、cpg、ゲノムあたりのコピー数、ESBL、extended-spectrum β-ラクタマーゼ、FDR、偽発見率。

データ概要

全サンプルのゲノムリードデータはDDBJに寄託され、BioProjectアクセッション番号PRJDB16443でNCBIにミラーされている。全サンプルのメタデータは、本論文のオンライン版で利用可能な表S1に要約されている。すべてのサポートデータ、コード、プロトコールが論文内または補足データファイルで提供されていることを確認した。

インパクトステートメント
抗菌薬耐性はヒトの健康にとって大きな脅威であり、介護施設入居者は抗生物質耐性菌の貯蔵庫として機能している。しかし、病院を中心とした全国的なサーベイランスの対象から除外されることが多い。サンプル数が少ないという制限はあるが、本研究は、長期療養施設入所者の便および口腔微生物叢に対する抗生物質の影響を定量的に評価した先駆的研究である。微生物叢に対する抗生物質の影響は、これまで考えられていたよりも小さいと推定された。これは、ディープメタゲノムシーケンスデータと、抗菌薬投与前、投与中、投与後2～4週間の被験者内比較を用いて達成された。また、便微生物叢における抗菌薬耐性遺伝子の総存在量と、過去6ヶ月間の抗菌薬投与歴との間に正の相関があることを示した。さらに、メタゲノムシークエンシングと抗菌薬耐性菌の分離との相補性、およびマイクロバイオーム中の存在量が少ない抗菌薬耐性遺伝子の検出にメタゲノムシークエンシングを用いる場合の注意点を定量的に示した。われわれの解析により、長期介護施設入居者の抗菌薬耐性に関するメタゲノム研究を拡大するための基礎的枠組みが確立され、多様な集団に広く応用できる可能性が示された。

はじめに

抗菌薬耐性（AMR）は、ヒトの健康に対する最大の脅威の一つであり、世界レベルで監視し対処する必要がある[1, 2]。抗生物質耐性菌（ARB）による感染症の負担は世界的に増加している[3, 4]。世界保健機関（WHO）が策定したAMRに関する世界行動計画は、医療現場におけるAMRサーベイランスの強化と抗菌薬使用の最適化の重要性を強調している。

抗菌薬の最適な使用、あるいは抗菌薬治療プログラムの適切なスチュワードシップのために、重要な考慮点は、抗生物質が及ぼす選択圧と、ヒトのマイクロバイオームとレジストーム（すなわち、抗菌薬耐性遺伝子、ARGの集合体）に対する個々の薬剤の影響である [5] 。ー抗菌薬治療後のー [ー5-8]。先行研究ではー [ー5-8]。Pallejaら[6]は、健康な若年成人において、抗菌薬投与4日後および8日後に便微生物叢の種多様性が有意に減少し、その後1.5ヶ月以内にほぼベースラインの組成に回復したことを報告している。別の研究では、投与した抗菌薬の種類によっては、便微生物叢が最大数ヶ月にわたって著しく乱れる可能性があるのに対し、唾液微生物叢は便微生物叢よりもはるかに安定していたことが報告されている [8]。

ー長期療養施設はーARBのー[ー9-11]である。こうした施設は、2000を超える医療機関にまたがり、国内の全施設の4分の1以上を占める日本の広範なAMRサーベイランスシステムのような、国のAMRサーベイランスイニシアチブの対象外であることを考えると、これは特に重要である [12] 。

梶原ら [13] は最近、口腔および便サンプルの採取と培養、その後の追跡調査に基づいて、長期療養施設におけるARBの有病率とARBコロニー形成が臨床転帰に及ぼす潜在的影響について調査した。ー長期療養施設におけるー

ー長期療養施設入所者のー長期療養施設入所者のー 口腔（n=27）および便（n=81）サンプルからメタゲノムシークエンシングデータを取得し、抗菌薬治療歴のある群とない群の2群を比較した。、ー抗菌薬治療歴あり群とー抗菌薬治療歴なし。メタゲノム解析および統計学的解析により、抗菌薬治療の効果と関連性、および長期療養施設における抗菌薬使用の意味合いに関する定量的データが得られた。

方法

ー研究参加者のー登録、ー診療録のー口腔サンプルおよびー便サンプルのー取得ー
研究参加者は、日本の公的8地域のうち5地域を代表する、異なる地域にある6つの介護施設（具体的には老人保健施設）から募集した（図S1）。 過去6ヵ月間に抗菌薬投与歴のある入所者は6施設すべてから、過去6ヵ月間に抗菌薬投与歴のない入所者はいずれかの施設から募集した。これは、1施設あたりの抗菌薬投与歴のない入所者の数が、抗菌薬投与歴のある入所者の数よりもはるかに多いため、2群のサンプルサイズを同程度にし、不必要なサンプリングを避けるためであった。ー医療記録はー文書によるーインフォームド・コンセント（ー（ー倫理的なー） 各医療記録の不明な情報は空白とし、データ集計時には欠損値として扱った。コパンESwabを用いて、27人の参加者の口腔から唾液を採取した。口腔スワブサンプルは1人あたり2回採取し、1回はESwabのチューブに1mlのRNAlater安定化液をあらかじめ注入した状態で保存し、もう1回はESwabのチューブに既定の液体培養液とともに保存した。最初に101人の参加者から、スワブ（BBL CultureSwab Plus）と既定の液体培養液、または6mlのRNAlater安定化液をあらかじめ注いだスプーン付き便容器（Sarstedt）のいずれかを用いて便サンプルが採取された。研究期間中に参加者が発熱し、抗菌薬による治療を受けた場合は、治療中または治療後に2回目の追跡便サンプルを採取した（n=6）（表S1）。過去6ヵ月間に抗菌薬による治療歴があると記録されたが、前回の抗菌薬による治療日についての情報が欠如していた20人の参加者は、抗菌薬による治療歴のある群とない群を比較するその後の解析から、誤分類の可能性があるとして除外した。

ARBの単離と選択的ゲノム配列決定
広域β-ラクタマーゼ（ESBL）産生Enterobacteralesを迅速かつ推定的に同定するため、既定の液体培養で保存した口腔スワブおよび便スワブをCHROMagar ESBL培地プレート（関東化学）[14]に直接撒いた。CHROM寒天ESBLプレート上で、各スワブサンプルから単一の細菌コロニーを増殖させ、その後の検査に使用した。コロニーはMALDI-TOF MS（Bruker Daltonics）を用いて同定した。抗菌薬治療歴のあるグループの便検体から分離された細菌のうち、3人の患者のスワブサンプルから大腸菌3株を無作為に選択し、DNAを抽出し、Illumina NovaSeq 6000を用いて2×150 bpペアエンドランプロトコルでゲノムシークエンシングを実施した。

DNA抽出とメタゲノムシークエンシング
メタゲノムシークエンシング用のDNAは、RNAlater安定化液に保存した経口および便サンプルから酵素法を用いて抽出した[15, 16]。便サンプルについては、DNA抽出の際にヒトDNAを濾過した[15, 16]。抽出されたDNAサンプルは50～200 µlの純水中に保存され、そのうち20 µlがライブラリーの構築と、Illumina NovaSeq 6000を用いた2×150 bpペアエンドランプロトコルでのメタゲノムシーケンスに使用された。メタゲノムシーケンスは、1サンプルあたり最低10Gbのデータが得られるように実施した。シーケンスデータが10Gb未満のサンプルについては、総量が10Gbに達するまで追加のシーケンスランを行った。

前処理、アセンブル、分類学的およびARGプロファイリング、関連解析
DNAシーケンスデータの前処理（リードのトリミングやフィルタリング、ヒトゲノムGRCh38にマップされたリードの除去）にはEDGEパイプラインバージョン1.5[17]を使用した。リードのアセンブルにはSPAdesバージョン3.15.4 [18]を使用し、'-meta'オプションを付けた。各サンプルの分類学的プロファイリングはMetaPhlAn3 [19, 20]を用いて行い、リードデータを用いて各分類群の存在量を推定した。MetaPhlAn3はペアリードを独立に扱うため、あらかじめリードペアを1つの入力ファイルに連結しておいた。各サンプルのARGプロファイリングは、read-based法とassembly-based法の2通りの方法で行った。リードベース法では、ARGを予測し、16S rRNA含量に正規化した相対量を推定するディープラーニングモデルであるdeepARGを用いた[21]。アセンブリーベースのアプローチでは、最近提案された「ゲノムあたりのコピー数（cpg）」を、原核生物のシングルコピーのコア遺伝子のパネルに対して正規化したカバレッジ深さとして、各ARGについて計算した[22]。cpg値は、少なくとも遺伝子配列の80%にわたって80%のアミノ酸同一性の基準を満たす各ARGの各サンプルのアセンブルされたコンティグから、一般に利用可能なカスタムコード[22]を用いて計算され、Comprehensive Antibiotic Resistance Gene Database (CARD)のカスタムバージョンが使用された。αおよびβ多様性の解析は、R統計ソフトウェア（バージョン4.1.2）のphyloseqおよびveganパッケージを用いて行った。分類学的およびARGプロファイルと抗菌薬治療歴との関連は、ゼロ膨張、高次元および極めて非正規なマイクロバイオームデータを考慮したMaaslin2 [23]を用いて検証した。

分類学的分類とコンティグのカバレッジの計算
Contig Annotation Tool（CAT）[24]を用いて、各ORFから翻訳されたアミノ酸配列をNCBI nrデータベースと検索し、目的のコンティグを分類した。検索に続いて、ある分類学的分類（超境 界、門、綱、目、科、属、種）を個別に支持するORFからのすべてのスコアを合計し、その合計がORF全体でカットオフ値 （デフォルトでは0.5×合計スコア）を超えるかどうかをチェックする投票アプローチを行った。これは、分類精度と分類された配列の割合のバランスを表している。各コンティグのカバレッジは、Bowtie2 [25]を使ってリードをコンティグにマッピングし、SAMtools [26]を使ってカバレッジを計算した。

結果

抗菌薬治療歴に関連する微生物とARGの総量
81検体の便のショットガンメタゲノムデータ（9. 8Gb（ヒトのリードを除去した後、配列カバレッジの違いを考慮し、各サンプルから同数のリードをサブサンプリングした）および27検体の経口サンプル（ヒトのリードを除去した後、各サンプル2.3Gb）のショットガンメタゲノムデータを用いた（表S1）結果、過去6ヶ月間の抗菌薬治療歴の有無と有意に関連する3つのクラスが明らかになった（表1）。口腔検体では、どの微生物クラスも、偽発見率（FDR）0.05において、他のグループと比較して抗菌薬治療歴のあるグループと有意な関連を示さなかった。便検体では、微生物クラスMethanobacteria（クラス内で最も一般的な分類群[27]であり、ヒト腸内生態系で支配的な古細菌[28]であるMethanobrevibacterのみが検出された）の相対存在量は、FDR 0.05で、抗菌薬投与歴のある群で他の群より有意に高かった（図1の左）。逆に、CoriobacteriiaクラスとActinomycetiaクラス（いずれも放線菌門に属する）の相対量は、前者のグループで有意に低かった。3つの微生物クラスの対数変換した存在量を箱ひげ図として図1に示した（左：抗菌薬治療歴のある群とない群の比較）。各群における3つの微生物クラスの相対的存在量のペアワイズ解析により、メタノバクテリアと放線菌の間に負の相関が、またコリオバクテリアと放線菌の間に正の相関（それぞれスピアマンの相関係数-0.24および0.27）が認められ、これは抗菌薬投与歴のある群でのみ観察された。便サンプルの微生物クラスレベルでの全体的な系統プロフィールを図S2の左側に示す。抗菌薬投与歴との関連を属レベルで検証したところ、FDR 0.05で有意な関連を示したのはメタノバクテリア属に属するメタノブレビバクターとコリオバクテリア属に属するコリンセラのみであり、クラスレベルの結果と一致した。

図1.
注目すべき3つの微生物クラスの相対存在量。3つのクラスは抗菌薬治療歴と有意に関連していた（表1）。Y軸は対数変換した相対存在量を示す。存在量がゼロのサンプルはこの図から削除した。個々の参加者を表すドットは、中央の線が中央値、箱の下と上が25パーセンタイルと75パーセンタイルを示す箱ひげ図に重ねた。横断比較（左）と被験者内比較（右）は縦の点線で区切られている。左上の赤線と青線は、表1に示した有意な正と負の関連に対応する。右上の赤線は、図5（a）に示すように、被験者内比較において、治療前から治療中にかけてメタノブレ ビバクターの相対量が増加したことを示す。
Fig.
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表1.
クラスレベルでの抗菌薬治療歴に関連する便微生物叢中の微生物

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クラス

関連性の方向

PFDR

メタノバクテリア

陽性

0.002

コリオバクテリア

陰性

0.002

放線菌

陰性

0.03

*陽性は、抗菌薬治療歴のあるグループにおける存在量の増加を示す。

tbl1fn2†図5に裏付けを示す。

次に、検体あたりのARGの総存在量を算出したところ、便検体のうち、過去6ヵ月間に抗菌薬治療歴のある群では、他の群に比べて有意に高かった（P＝0.015、Wilcoxonの順位和検定、図2の右側）。一方、口腔検体では両群間に統計学的有意差は認められなかった（図2左）。これは少なくとも部分的には、後述するように抗菌薬治療歴のある個体からの5検体を含む27検体というサンプル数の少なさに起因しているのかもしれない（考察参照）。総存在量の指標として、最近提唱された「ゲノムあたりのコピー数（cpg）」を各ARGファミリーについて計算し、原核生物のシングルコピーのコア遺伝子のパネルに関して正規化した総和を用いた[22]。我々は、ARGデータベースで定義された標的配列の少なくとも80%にわたって少なくとも80%の配列同一性を満たすARGのメタゲノム集合体からこれを計算し、ショートリードから直接計算したサンプル中の16S rRNA含量に対して正規化した相対存在量の総和と高い相関を見出した[21]（図S3）： スピアマンの相関係数は経口サンプルで0.98、便サンプルで0.91であった。

図2.
図2. 抗菌薬耐性遺伝子の総存在量（ゲノムあたりのコピー数）の分布。各ドットは、各ARGファミリーについて計算された「ゲノムあたりのコピー数（cpg）」[22]として表される存在量のサンプルごとの総和に対応する。ドットは箱ひげ図に重ねた。
図2.
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さらに、抗菌薬治療歴に関連する特定のARGを探索したが、FDR 0.05の時点では、口腔または便サンプルにはそのようなARGはなかった。これはおそらく、多重検定補正に使用した753の検査済みARGサブクラス（表S1）と比較して、サンプルサイズが小さい（81の便サンプルと27の経口サンプル）ことに起因している。

α多様性（シャノンの多様性指数）を便検体の2つのグループで比較しても、統計的に有意な差は見られなかった（図3a）。β多様性の主座標分析（Bray-Curtis非類似度）でも2群間の分離は見られず（図3b）、全体的な分類学的構成は群間で大きな違いはないことが示された。

図3.
抗菌薬治療歴の有無によるαおよびβ多様性の比較。(a) シャノン多様性指数。(b) Bray-Curtis非類似度の主座標プロット。
図3.
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過去6ヵ月間に抗菌薬投与歴のある群では、16例が介護施設入所後に抗菌薬投与を受けていた。そのうち14例が経口抗菌薬による治療を受けており、フルオロキノロン系抗菌薬1例、ペニシリン系抗菌薬4例、マクロライド系抗菌薬1例、第3世代セファロスポリン系抗菌薬7例、ホスホマイシン系抗菌薬1例であった。患者に投与された抗菌薬の処方量と回数は標準的なガイドラインに従った。他の臨床的因子も抗菌薬投与歴との横断的関連に影響を与える可能性がある。便サンプルが採取された81人の住民のうち、抗菌薬治療歴のある群では、以下の因子の割合が他の群よりも有意に高かった（表2）：入院（80％対53％）、Charlson comorbidity index highまたはvery high（53％対28％）、ベッドで座ったり寝返りを打ったりすることができない（48％対23％）、うがいまたは歯磨きができない（55％対17％）。年齢中央値も、抗菌薬治療歴のある群では他の群より有意に高かった（86.5歳対83.5歳；表2）。しかし、上記の5つの因子のそれぞれについて、メタノバクテリア、コリオバクテリアおよび放線菌の存在量、ならびにARGの総存在量との関連は、統計的に有意ではなかった。4つのカテゴリー因子のうち、Charlson comorbidity indexが高いか非常に高い場合のみ、放線菌の相対的存在量との関連で0.07のP値（Wilcoxonの順位和検定）を示し、年齢は放線菌、コリオバクテリアの相対的存在量およびARGの総存在量との関連でそれぞれ0.06、0.07および0.08のP値（Spearmanの相関）を示した。しかし、その他はすべてP値＞0.2を示した。したがって、これらの因子は、それぞれ特定の微生物およびARGの総存在量との関連性の統計的検定において、共変量として調整すべき交絡変数とはみなされなかった。

表2.
便サンプルが採取された長期介護施設入居者における抗菌薬治療歴に関連するその他の臨床的因子

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因子

治療歴あり群

(N=47)

治療なし群

(N=34)

P

年齢、中央値（年、IQR）

86.5 (82.0-92.8)

83.5 (74.8-90.3)

0.043

病院からの入院

80 %

53 %

0.017

男性

41 %

33 %

n.s.

認知症

91 %

77 %

n.s.

シャルソンの併存疾患指数：高いまたは非常に高い

53 %

28 %

0.030

Barthel指数：重度または全依存

82 %

63 %

n.s.

ベッドに座れない、寝返りが打てない

48 %

23 %

0.034

うがい・歯磨きができない

55 %

17 %

0.001

tbl2fn1 P値は、年齢についてはWilcoxonの順位和検定、その他のカテゴリー変数についてはカイ二乗検定を用いて算出した。

抗菌薬投与前、投与中、投与後の検便の被験者内比較
便サンプルが採取された入所者のうち、6人が発熱しており、抗菌薬治療中（6～8日、n=2）または治療後2～4週間（n=4）に追跡便サンプルが採取された。追跡サンプルのショットガンメタゲノムシーケンスにより、バックグラウンドバイアスをコントロールした被験者内比較が可能となった。ヒトのリードを除去し、9.8Gbのデータをサブサンプリングした後、抗菌薬処理前、処理中、処理後の被験者内比較では、種の豊富さ（各サンプルのメタゲノムデータから検出された種の数）に有意差は見られなかった（P=1、Wilcoxonの符号順位検定）（図4a）。シャノンの多様性指数は、6サンプルすべてにおいて抗菌剤処理中または処理後にわずかに増加した（P=0.03、Wilcoxonの符号順位検定）（図4b）。これらの結果は以前の報告[6]とは対照的であり、おそらく使用した抗菌薬の違いに起因していることがわかった（考察参照）。

図4.
抗菌薬投与前、投与中、投与2～4週間後の分類学的プロファイリングの被験者内比較。左：抗菌薬投与前と投与中（6～8日）に便サンプルを採取した2個体。右：抗菌薬投与前と投与2～4週間後に便サンプルを採取した4人。線の色は治療に使用した特定の抗菌薬クラスを示す。(a) 種の豊富さ。(b) シャノン多様性指数。
図4.
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抗菌薬投与前、投与中、投与2～4週間後の各サンプルにおける各細菌属の存在量の差の分布を図5に示す。抗菌薬処理前と処理中（図5a、sd=1.44）の間で計算された分布は同じではなく、処理前と処理後2～4週間（図5b、sd=0.77）の間で計算された分布よりも広かった（P=0.01、Kolmogorov-Smirnov検定）。これらの2つの分布における外れ値を比較すると、Blautiaは抗菌剤処理中および処理後に一貫して存在量が減少していることが示された。存在量が増加した外れ値のうち、Methanobrevibacterは、抗菌薬投与歴のある群で濃縮を示した群間比較の結果と一致した（表1、図1）。

図5.
抗菌薬投与前、投与中、投与2～4週後における各微生物属の存在量の差の分布。x軸の単位は％。各点は、(a)抗菌薬投与前および投与中（6-8日）に便サンプルを採取した2個体、(b)抗菌薬投与前および投与後2-4週間に便サンプルを採取した4個体における各属の存在量の差の平均値を示す。
図5.
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抗菌薬投与前と投与中／投与後2-4週間の微生物クラスレベルでの全体的な系統学的プロファイルを図S2の右側に示したが、抗菌薬投与中にメタノブレビバクター（横線で示した）の存在量が増加していることが確認された。しかし、その存在量は抗菌薬投与後2～4週目には1％未満に減少し（Fig. S2）、抗菌薬投与歴のある群では、ない群（Table 1）に比べて増加はごくわずかであった（Fig.） したがって、Methanobrevibacterの存在量の増加はおそらく一過性のものであろう。全体として、系統プロファイルは、「抗菌剤処理中」の条件では一対のスピアマンの相関係数が最大でも0.43であった以外は、5つの条件のうち4つの条件で互いに高い相関があった（一対のスピアマンの相関係数は0.78以上）。

抗菌薬処理中と処理後でARGの総存在量がどのように変化するかを調べるため、6つのサンプルの被験者内比較を行った。ARGの総存在量は、抗菌薬処理中に2検体のうち1検体で顕著に減少した（図6の左）が、どの分類群で顕著に減少したARGを保有しているかは特定できなかった。一方、抗菌剤処理から2-4週間後の4検体では、一貫した変化は見られなかった（図6右）。Fig.6（被験者内比較）とFig.1またはS2（グループ間比較）の結果の関係については後述する。

図6.
抗菌薬投与前、投与中および投与2-4週後のサンプル間の抗菌薬耐性遺伝子の総存在量の被験者内比較。y軸：図2と同様に各ARGファミリーについて計算した「ゲノムあたりのコピー数（cpg）」[22]で表した存在量のサンプルごとの合計値。左：抗菌薬投与前と投与中（6-8日）に便サンプルを採取した2個体。右：抗菌薬投与前と投与2～4週間後に便サンプルを採取した4個体。線の色は、図4と同様、治療に使用された特定の抗菌薬クラスを示す。
図6.
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メタゲノムデータからのblaCTX-M検出とESBL選択培地を用いて得られた分離株からの検出との関係
さらに、メタゲノムシークエンシングと選択培地を用いたARB分離が相補的であることも明らかになった。メタゲノムシークエンシングとそれに続くARGの相対存在量の推定により、81検体の便サンプルのうち19検体または33検体（ショートリードから直接計算した16S rRNA含量で正規化したcpg値または相対存在量を使用した場合）で、blaCTX-Mの陽性存在量が明らかになった。ESBL選択培地を用いて81検体中45検体から分離されたEnterobacterales属菌（45/81=56 %）は、日本の6つの長期療養施設から得られた最近の研究[13]と一致していた。2つの方法の一致を図S4に示すが、ESBL選択培地を用いて得られた45のEnterobacterales分離株のうち21株は、メタゲノムから検出できなかった（図S4の右下）。一方、メタゲノムのデータからblaCTX-Mの存在量（16S rRNA含量で正規化）が陽性であった33検体のうち9検体は、ESBL選択培地を用いてスクリーニングした分離株として検出できなかった（図S4の左上）。BlaCTX-Mに加え、BlaTEMとBlaSHVの存在もESBL選択培地での増殖能に関係している可能性があるが、BlaTEMとBlaSHVにはESBL型と非ESBL型の対立遺伝子があり、相対量の計算では区別できない。

さらに、ESBL選択培地を用いて得られた3株についてゲノムシークエンシングを行ったところ、2株の大腸菌がblaCTX-M-15を、1株の大腸菌がblaCTX-M-27を保有していることが判明した。これらのblaCTX-M遺伝子は、3サンプルのメタゲノムデータからアセンブルされたコンティグから検出され、3つのコンティグのカバレッジは、777（全コンティグのカバレッジのうち上位0.02 %）、19.6（上位3 %）、2.0（上位59 %）であった（図7）ことから、カバレッジが2.0以上かつ上位59 %以内のコンティグから抗菌遺伝子を検出できることがわかった。この結果は、2×ゲノムカバレッジの条件下で大腸菌ARGのARG検出率の中央値が約60～90 %であったと報告した先行研究[29]の結果と一致する。つまり、カバレッジがこれより低いと、このような低存在遺伝子はメタゲノミックデータから検出されない可能性がある（図S4の右下に対応）。

図7.
図7. ESBL産生大腸菌株を分離し、ゲノム配列を決定した3つの便サンプルのコンティグカバレッジ分布とBlaCTX-M遺伝子をコードするコンティグの位置。BlaCTX-M遺伝子をコードするコンティグは、赤矢印で示したヒストグラムクラスに含まれている。(a)ではBlaCTX-M遺伝子はBlaCTX-M-27であるが、(b)と(c)ではBlaCTX-M-15である。
図7.
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考察

我々は、抗菌薬治療と微生物またはARGとの関連を、抗菌薬治療歴のある群とない群との比較（図1およびS2の左、図2-3）と、抗菌薬治療前、治療中、治療後の便検体間の被験者内比較（図1およびS2の右、図4-6）の2種類の解析を用いて検討した。被験者内比較では、抗菌薬投与中（6～8日）と投与後2～4週間は種の豊富さとシャノンの多様性指数が減少しないことが示されたが、これは平均年齢23.4歳の健康な白人男性12人を対象とした以前の有力な研究[6]とは逆の結果であった。前者ではサンプル数が少なく、母集団や年齢層が異なるため、本研究と前者との定量的な比較は困難である。しかし、質的な相違は明らかである。この不一致は、おそらく使用した抗菌薬介入の違いによって説明される；500mgのメロペネム、500mgのバンコマイシン、40mgのゲンタマイシンからなるカクテルは、直接的な副作用を引き起こすことなく、できるだけ多くの腸内微生物を根絶するように設計された［6］。本研究は、標準的な臨床治療として処方される単一の抗菌薬が便微生物叢の種の豊富さと多様性に及ぼす影響は、おそらく人為的に強力な広域抗菌薬介入を行った場合よりもはるかに小さいことを示唆している。本研究では、通常の臨床治療として処方される単一の抗菌薬と広域スペクトル抗菌薬介入との直接的な比較を行っていないため、この解釈には注意が必要である。

単一抗菌薬の効果は、特定の属（図5）およびクラス（図1）の存在量の変化として観察された。サンプル数が少ないため、被験者内比較で統計的検定はできなかったが、抗菌薬投与後2～4週間よりも投与中の方が効果が大きかったと考えるのが妥当であろう（図5、図S2の右パネル）。抗菌薬投与中」の条件を除き、4つの条件間で系統学的プロファイルは互いに高い相関を示した（一対のスピアマンの相関係数＞0.78）。このことは、長期療養施設の超高齢者（平均84歳）であっても、抗菌薬投与1ヵ月後には便微生物叢の全体的な系統学的プロファイルが基本的に回復することを示唆している。抗菌薬投与数ヵ月後の便微生物叢に残る影響が予後不良と関連しているかどうかを調べるためには、よりサンプル数の多いさらなる研究が必要である [8] 。

Methanobacteria（Methanobrevibacterのみが検出された）は、抗菌薬治療中に存在量が顕著に増加した（図5a、図S2の右）。このクラスはまた、過去6ヵ月間に抗菌薬治療歴のある群では、他の群と比較して高い存在量を示したが（図1、表1）、増加後も微生物叢中の存在量は低いままであった（図S2の左）。Methanobrevibacterはヒトの腸内生態系において支配的な古細菌属である[28]。古細菌は一般に抗菌薬に対して広域に耐性を示すという特徴があり[30, 31]、本研究における抗菌薬処理中の増加も考えられる。

Blautia（Clostridia属）は、抗菌薬投与中および投与2～4週後に異常値として存在量の減少を示したが（図5）、抗菌薬投与歴との有意な関連は認められなかった。近年、Blautiaの生物学的変化や宿主の健康を制御し、代謝症候群を緩和する能力など、Blautiaのプロバイオティクス効果に広範な研究が集中している[32]。パラバクテロイデス（Parabacteroides）の存在量は抗菌薬処理中に減少し、抗菌薬処理後2～4週間でベースラインに戻った（図5）。この分類群は最近、宿主の健康状態（メタボリックシンドローム、炎症性腸疾患、肥満など）と密接に関連していることが報告されている[33]。抗菌薬投与中および投与後のこの減少を検証するためには、さらなる研究が必要である。確認された場合、この減少が予後不良と関連しているかどうかを調べることは貴重であろう。

本研究で採取した経口検体数は27検体で、抗菌薬治療歴のある人から5検体、ない人から22検体であり、便検体数に比べてはるかに少なかった。この差は、おむつからの便検体採取が容易であるのに対し、経口検体採取には医師と介護施設入所者の双方にさらなる労力が必要であることに起因する。経口サンプルのさらなる課題は、ヒトのリードの混入であった（平均37％、本研究では最小0.1％、最大73.9％）。RNAlater安定化溶液に保存された便サンプルからのDNA抽出プロセスでは、ヒトDNAをフィルターで除去するプロトコルが使用された[15, 16]が、RNAlaterに保存された口腔サンプルについては、同様の確立された方法はまだ利用できない。口腔サンプルは、唾液をチューブに注入して直接採取するのではなく、唾液を吸収させた綿棒を用いて採取した。これは、高齢者の口腔内は乾燥しており、唾液の量も少ないことから、1mlの唾液を採取することが困難であることを考慮した結果である。特筆すべきことに、本研究は、高齢者（平均年齢84歳）の口腔ぬぐい液サンプルから抽出したDNAのメタゲノム配列決定が可能であることを実証した最初の研究であり、平均DNAインプット量は約800ng、最小値は43ngであった。しかし、ヒトのリードのコンタミネーションは73.9%にも達する可能性があることに留意すべきである。

ARGの総存在量について、被験者内比較では、抗菌薬処理中に減少する可能性が示された（図6の左側の水色で描かれている）が、抗菌薬処理後2-4週間（図6の右側）では、4つのサンプル間で一貫した変化は見られなかった。しかし、これらの変化は個体差によるものと思われ、統計的有意性を立証するにはサンプル数が少なすぎた。過去6ヵ月間に抗菌薬投与歴のある長期療養施設入居者の便サンプルにおけるARGの総存在量の有意な増加（図2の右側に描かれ、図6の破線で表される）は、ARGをコードする抗菌薬耐性株が抗菌薬投与後数ヵ月間微生物叢で増殖する可能性を示唆している。一方、抗菌薬投与中にARGの相対量が減少する可能性（図6の左側の水色）は、感受性株が相対的に増加し、抗菌薬耐性株の生産コストをかけずに近隣の抗菌薬耐性株によって社会的に保護される場合に起こる可能性がある[34]。

目的の特定のARGを持つコンティグの分類学的分類は、90％以上のコンティグについて、種、属、科、目のレベルでは不可能であった。分類学的分類の解像度を向上させるには、より多くのコード配列をコードする、より長いコンティグが必要である。ショートリードシーケンスの後に残ったDNAサンプルのロングリードシーケンスを行うために、さらなる研究が必要である。

結果セクションの最後に、メタゲノムシークエンシングと選択培地を用いたARB単離の相補性を示すデータ（図7およびS4）を示した。メタゲノムシークエンシングは、一次臨床検体で直接実施できる培養に依存しない検査として有利であることは広く認識されている[35]。対照的に、我々の研究では、ヒトリードを除去した後、1サンプルあたり約10Gbものシーケンスを行った場合でも、マイクロバイオーム中の存在量が低い（図7に定量的に示されるように、カバレッジが2.0×未満）抗菌薬耐性遺伝子を検出するためにメタゲノムシーケンスを適用する際の注意点を提示している。このような遺伝子は、これらの遺伝子をコードする微生物を分離するための選択培地を用いれば、より効果的に検出できる。

結論として、本研究は、標準的な臨床治療として処方される単一の抗菌薬が、長期介護施設入居者（平均年齢84歳）の便微生物叢に及ぼす影響を定量的に明らかにした初めての研究である。これは、サンプルサイズは小さいものの、ディープメタゲノムシーケンスデータ（ヒトリードを除去した後の便サンプルあたり約10Gb）と、抗菌薬投与前、投与中、投与後2～4週間の被験者内比較によって達成された。さらに、本研究は、便中マイクロバイオームにおけるARGの総存在量と過去6ヶ月間の抗菌薬投与歴との間に正の相関があることを示した初めての研究である。さらに、本研究は、メタゲノムシークエンシングとARB単離の相補性、およびマイクロバイオーム中の存在量が低い（具体的には、カバー率2.0×未満）抗菌薬耐性遺伝子の検出にメタゲノムシークエンシングを適用する際の注意点を定量的に実証した最初の研究である。我々の解析は、長期療養施設の居住者におけるAMRに関するメタゲノム解析のさらなる研究の基盤となるものであり、他の集団にも拡大されるべきである。

データ参考文献

1. 矢原、北村他、DDBJ. PRJDB16443 (2023)。

資金提供

本研究は、日本医療研究開発機構（AMED）の「新興・再興感染症研究プログラム」（助成番号23fk0108606）の助成を受けた。

謝辞

このプロジェクトに技術的な貢献をしてくださった藤村恵美氏、若井聡世氏、安西栄子氏、滝芳枝氏、鳴海栄子氏、小野寺隆介氏、英文校正をしてくださったエディテージ（www.editage.jp）に感謝する。計算は東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センターおよび国立遺伝学研究所で行った。

利益相反

著者らは利益相反がないことを宣言する。

倫理的声明

本研究に参加する前に、参加者全員から書面によるインフォームド・コンセントを得た。本研究は国立感染症研究所倫理委員会の承認を得た（承認番号：1426）。

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