大西洋とグリーンランドのオヒョウ集団の循環マイクロバイオームに関する洞察：種特異的および環境要因の役割

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発行：2023年4月12日
大西洋とグリーンランドのオヒョウ集団の循環マイクロバイオームに関する洞察：種特異的および環境要因の役割

https://www.nature.com/articles/s41598-023-32690-6

Insights into the circulating microbiome of Atlantic and Greenland halibut populations: the role of species-specific and environmental factors - Scientific Reports

ファニー・フロントン
ソフィア・フェルキオ
...
イヴサンピエール
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Scientific Reports 13巻、記事番号：5971（2023） この記事を引用する
メートル法詳細
アブストラクト
気候変動に対応した野生魚の個体群を管理・保全するためには、微生物に基づく長期的なモニタリングプログラムを確立することが重要です。多くの場合、このような研究は腸内細菌、そして少ないながらも皮膚（粘液）細菌を対象として行われてきた。ここでは、経済的・生態的に重要な2種のノーザンオヒョウの循環細菌マイクロバイオームを研究するために、リキッドバイオプシーの概念を利用しました。FTAカードに固定した1滴の血液を用いて16S rRNA遺伝子の増幅と配列決定を行い、カナダのセントローレンス湾に生息する大西洋オヒョウとグリーンランドオヒョウの集団のコアとなる血液マイクロバイオームを特定した。循環マイクロバイオームDNA（cmDNA）が遺伝的および環境的要因によって駆動されていることを示す証拠を提供した。より具体的には、循環マイクロバイオームのシグネチャーは種特異的であり、性別、サイズ、温度、条件因子、地理的な局在によって変化することを見いだした。全体として、本研究は、漁業管理、特に気候変動の状況下で、野生魚の集団におけるディスバイオシスのシグネチャーと病気のリスクを検出するための新しいアプローチを提供するものである。
はじめに
大西洋オヒョウ Hippoglossus hippoglossus (Linnaeus, 1758) (H. hippoglossus) とグリーンランドオヒョウ Reinhardtius hippoglossoides (Walbaum, 1792) (R. hippoglosides) は、北西大西洋に広く分布しセントローレンス湾（GSL）では異なる集団によって特徴づけられるヒラメ類の2種です1、2。これらの個体群は、この地域で最も価値のある2つの地上魚漁業を支えており、管理のための科学的アドバイスを提供するために隔年で評価されている3,4. 大西洋オヒョウの資源量は着実に増加しているのに対し、グリーンランドオヒョウの資源量は過去20年間に減少しています。これらの変動の理由は完全には明らかではないが、GSL の深層水路の急速な温暖化3,5 とグリーンランドオヒョウに対するアカメの競争激化6,7 がこれらの変化を引き起こす主要因であると考えられている。このような変化が魚の生理学に与える影響を考えると、これらの資源の健康状態を詳細に追跡調査するためには、感度と予測性の高いバイオマーカーの開発が不可欠です。
マイクロバイオーム（宿主種に存在する微生物の核酸プール）は、個人の健康状態を評価する予測バイオマーカーとして、近年、科学者から大きな注目を集めている8。マイクロバイオームは、免疫反応や宿主のエネルギー代謝など、いくつかの生理的プロセスの制御に寄与しているため、生物の健康状態を決定する重要な要素となっています。
予測ツールとしてのマイクロバイオームシグネチャーの使用に関する研究の多くは、当初は臨床環境で行われましたが、16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子アンプリコンを解析するための次世代シーケンサー（NGS）技術へのアクセスが向上したことにより、魚の集団の研究を含むさまざまな研究分野での応用が容易になりました9。魚の皮膚や腸内細菌のマイクロバイオームに関する研究により、バランスのとれたマイクロバイオームが宿主の健康に重要な役割を果たし、病原体から保護すると同時に、栄養面でのメリットをもたらすことが明らかになっています10。このバランスが崩れると、しばしばディスバイオシスと呼ばれ、特定の細菌群集の生物多様性と存在量が変化し、しばしば健康上の合併症につながります11。
その経済的・生態的な重要性を考慮し、近年、鯨類のマイクロバイオームシグネチャーの定義に焦点を当てた研究が増加しています。これらの研究により、マイクロバイオームのシグネチャーは、宿主の遺伝学、形態学、生物学的および生物学的要因を含むいくつかの環境要因に依存することが示されている12,13。しかし、ほとんどの場合、これらの研究は実験室/実験環境または養殖場で実施され、腸内細菌叢と、それほどでもないが皮膚（粘液）細菌叢を対象に行われてきた13,14,15。しかし近年、循環型マイクロバイオームという概念が、侵襲的で致死的、かつ論理的に困難な組織生検に代わる興味深い選択肢として浮上してきた。歴史的に健康な人では血液は微生物から免除されていると考えられてきたとしても、現在では、細菌、ウイルス、真菌、その他の微生物のゲノムが血液（血球または血漿）中に存在することは反論の余地がありません16, 17, 18, 19, 20. この特徴により、組織生検の必要なく、生物の微生物相を研究することができるようになりました。循環型マイクロバイオームの概念は、ルーチンバイオマーカーや予測型バイオマーカーの開発に特に適しています。このアプローチの有用性は、最近、臨床の場で実証されており、ヒトのいくつかの疾患について説明されたものと同様に、生態学21,22,23,24におけるバイオマーカーの開発に新しい視点を提供しています16,20,25。実際、血液中のマイクロバイオームの存在は、豚、ブロイラー鶏、ラクダ、牛、ヤギ、猫、犬など、ヒトや動物で現在広く受け入れられている概念です21,23,24,26,27,28,29。
本研究では、生態学的および経済的に興味深いGSL産の2つの野生魚集団、大西洋オヒョウとグリーンランドオヒョウの血中16S rRNAマイクロバイオームのシグネチャーを初めて特徴付けた。この2つの種は、正反対の個体数推移を示すのが特徴である。私たちの一般的な仮説は、生理的および環境的な要因が彼らのマイクロバイオームシグネチャーに影響を与えるというものです。気候変動がオヒョウの個体群に与える影響を調べる今後の研究の参考とすることで、私たちのアプローチが野生魚個体群の状態や健康をモニタリングするための新規バイオマーカーの開発に役立つとさらに考えている。
材料と方法
サンプリング
グリーンランドオヒョウ（n = 97、体長：316.2 ± 15.1 mm）およびアトランティックオヒョウ（n = 86、762.0 ± 30.1 mm）の血液サンプルは、漁業海洋省（DFO）によってGSL（カナダ）の北および南セクターで行われた年次ボトムトロール調査中に、2019年8月15日から10月1日に収集した（表1）。トロールに取り付けたScanmar水中音響センサーと、温度を記録するための導電率、温度、深度（CTD）プローブが使用された。血液サンプルはトロール回収時に直ちに採取し、少なくとも1種について56地点でリキッドバイオプシーを実施した（図1）。ステーションごとに実施されたリキッドバイオプシーの数（1～14）は、日和見的であり、いずれかのオヒョウ種が存在するかどうかや、そのサイトでの作業量に依存するものであった。血液サンプルは、滅菌したナイフで背部を切開し、ヘパリンコートした3mL滅菌注射器と22G針で採取した。血液を採取し、直ちにFTA（Flinders Technology Associates）カード（Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada）に保存した。サンプルは風乾させ、Cazaら（2019）が記載したように、乾燥剤を入れたビニール袋に保管した。サンプリングした各個体の性別は、DFO科学クルーによる標本の解剖後、生殖腺の目視確認により決定した。フィールドサンプリングされた動物の世話と使用は、カナダ政府の動物福祉法、ガイドライン、およびカナダ漁業海洋省が承認した方針に従った。すべての方法は、ARRIVEのガイドライン（https://arriveguidelines.org/）に従って実施された。
表1 cmDNA解析に使用した魚類サンプルの概要。
フルサイズの表
図1
サンプルサイトを5つの区域に分けた地図。各ゾーンの地域別気温が示されている（平均±SE）。
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DNA抽出、増幅、シークエンス
すべてのDNA抽出および精製手順は、汚染を最小限に抑えるために圧力、温度、および湿度が制御された白い部屋で実施された。滅菌した5.0mm単丸穴パンチを使用してFTAカードから個々のディスクを切り出し、QIAamp DNA Investigator Kit（Qiagen, Toronto, ON, Canada）を使用して、製造元のプロトコルに従って全DNAを分離した。Quant-iT PicoGreen dsDNA detection kit (Molecular Probes, Eugene OR, USA)を用いてDNAを二重で定量化した。16SリボソームRNA（rRNA）遺伝子のV3-V4領域の増幅および全DNAサンプルの16S遺伝子アンプリコンシーケンスは、Centre d'Expertise et de Services, Génome Québec (Montréal, QC, Canada)で実施しました。増幅にはユニバーサルプライマー341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）および805R（5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′）を用いた。配列ライブラリーは、TruSeq DNA Library Prep Kit（Illumina, San Diego, CA, USA）を用いてGenome Quebecで調製し、Kapa Library Quantification Kit for Illumina platform（Kapa Biosystems）を用いて定量化した。ペアエンド配列は、MiSeqプラットフォームPE300（Illumina Corporation, San Diego, CA, USA）で、MiSeq Reagent Kit v3を用いて600サイクルで生成した（Illumina, San Diego, CA, USA）。生データファイルはNCBI Sequence Read Archive (PRJNA853332)で一般公開されています。
16S rRNAデータ処理
イルミナ配列データ（FASTQファイル）は、Cutadapt（バージョン2.8）を用いてトリミングした。16S rRNA（V3-V4）アンプリコン配列バリアント（ASV）は、DADA2パイプライン（バージョン1.16.0；Callahanら（2016））で生成し、その後R環境（Rバージョン4.0.3、チーム（2021））内で行った。ASVの割り当てには、Ribosomal Database Project（RDP）16データベースを使用しました。微生物コミュニティの特徴付けには、ソフトウェアパッケージのphyloseq（1.36.0）30、microbiomeSeq（0.1）31、microbiomeMarker（0.99.0）32、vegan（2.5.7）33が使用されました。マップは、ggplot2（3.3.6）34とrnaturalearth（0.1.0）35というパッケージを使用して作成した。ASVは、最小有病率（サンプル群における存在率）が70％で、検出閾値が相対存在量0.01％である場合に、コアマイクロバイオームの一部とみなされた36。コア属については、同様の決定木が適用されたが（同属のASVの存在量は合計された）、有病率は90%であった。先行研究37,38,39で報告されているように、90%という厳しい閾値が選択された。有病率はマイクロバイオーム研究によって大きく異なり、10%以上から100%まで22,36,37,39,40,41,42の範囲である。したがって、本研究は管理された条件下ではなく、特にサンプルサイズを考慮すると、より大きな変動が予想される野生集団で行われたため、コアマイクロバイオームを100％の有病率で制限しないことを選択しました。
環境データおよび形態データに基づくクラス分け
環境および個体発生の影響を評価するため、個々の魚は分類された。オスの50％が生殖可能なサイズに達する体長（L50），すなわち，グリーンランドオヒョウ3,7では360 mm，アトランティックオヒョウ43では920 mmが知られており，これに従って成熟と未成熟に分類した。多くの個体から性情報が欠落していたため，成熟した個体が未熟と誤認される可能性が低いオスの L50 を選択した。食餌組成はマイクロバイオームに影響を与える可能性の高い要因であるため、我々はグリーンランドオヒョウの標本を、食餌組成の大きな変化が以前に報告されている体長に基づいて、4つのサイズクラスに分けた44。すなわち、（1）クラス1：小型の餌を食べる200mm未満の個体、（2）クラス2：中間の餌を食べる200～400mmの個体、（3）クラス3：大型の餌を食べる400mm以上の個体であった。大西洋オヒョウについては、大小の個体数が少なすぎるため、体長階級を定義することは不可能であった。また、水温によってもクラスが定義された。水温が5℃未満の個体は「冷水」、5℃以上の個体は「温水」とみなされた7。大西洋オヒョウの水温許容範囲は測定値よりも広いことから、水温に基づく分析には含まれな い45,46。最後に、魚類の広範な健康指標である相対状態 K ファクターも、各個体の体長と体重に基づいて算出した47,48。log10（体重）とlog10（体長）の間で以下のように線形回帰を行った：
\とした。\left(W)・right(W) = ⑰log_{10}. \左）＋blog_right（右）。\ここで、Wは体重、Lは体長、aおよびbは定数係数である。
係数a、bを計算し、以下の式で長さから各個体の予想体重Weを推定するのに用いた：
W_{e} = aL^{b}$$ である。
最後に、Le CrenのKrelを以下のように算出した：
K_{rel} = \frac{W}{{W_{e} }}$$
個体の実際の体重と予想体重を比較することで、その魚のふくよかさ、健康状態を垣間見ることができるのです。基本的に、同じ魚種で同じ体長の個体よりも痩せている場合、その個体はストレス下にあり、Krelは1以下となります。逆に、ふくよかな魚は環境の影響を受けていると考えられ、Krelは150を超えます。
統計解析（Durbin Watson、Breusch-Pagan、Shapiro-Wilk 検定）により、誤差項の自己相関、均等分散性、線形回帰残差の正規分布が検証されました。Krel > 1が「高条件」、Krel < 1が「低条件」に相当するクラスが作成された47,50。
空間分析
全体として、5つの地理的ゾーンが定義された。空間ゾーンは、以下のような類似した特性を持つサンプルサイトに基づいて、湾内の異なる生息地を分離するために作成された（例：、 河口-西湾エリアは西経 65 度から 69 度、北緯 49.7 度から 51 度まで広がり、グリーンランドオヒョウ51 の主要な育児場と考えられている。北東湾エリアは西経 57 度から 63.7 度、北緯 49 度から 51 度、ローレンスチャネルエリアは西経 59 度から 65 度、北緯 47 度から 49.7 度まである。 7°N の間にあり、110m より深いサンプルサイトがある（含まれる）、Chaleur Bay エリアは、西経 64° と西経 67°、北緯 47.5° と北緯 48.5° の間のサンプルサイトを含み、最後に Southern Gulf エリアは西経 60.5° と西経 65.5° および北緯 45.5° と 48°N にあり、110m よりも深いサンプリングサイトはない（含まれない）。グリーンランドオヒョウについては、エリアごとの数は、Estuary-Western Gulf tがn=22、Chaleur Bayがn=19、Northeast Gulfがn=22、Laurentian Channelがn=34であった。大西洋オヒョウについては、Estuary-Western Gulfでn = 14、Southern Gulfでn = 11、Northeast Gulfでn = 17、Laurentian Channelでn = 44の魚数であることがわかった。
統計分析
細菌の分類学的α多様性（サンプル内）は、Rパッケージのmicrobiome（1.14.0）52で実装されているリッチネス、シャノン指数およびシンプソン指数を用いて推定した。2つの種間の細菌のα-多様性と分類群の存在量の変動は、どの変数も正規分布を示さないことから、Kruskal-Wallis検定またはWilcoxon-Mann-Whitney検定のいずれかを用いて評価した。また、長さ・温度・条件因子K48によるクラス間のα-diversityも算出した。Kruskal-Wallis検定に続いて、p値（p）が有意（p < 0.05）であれば、ペアワイズWilcoxon-Mann-Whitney検定が行われました。β多様性（標本間）は、主座標分析（PCoA）により評価した系統的重み付けUNIFRAC非類似度を用いて推定した。群集組成の違いは、R veganパッケージ（2.5.7）またはペアワイズAdonisパッケージ（0.4）に実装されている、999通りの並べ替えによる重み付けUNIFRAC指標の並べ替え多変量分散分析（PERMANOVA）を用いて検証した。形態学的データおよび環境データとの変異に関する詳細な統計解析は、補足情報に示す。差はα=0.05で統計的に有意とみなした。線形判別分析（LDA）効果量（LEfSe）は、各種のマイクロバイオームと異なるクラスについて実施し、各クラスの判別可能な分類群を強調した。この解析は、microbiomeMarkerパッケージ（0.99.0）を用いて実施した。カットオフは、log10（LDAスコア）≧4のLDAスコアで選択した。すべての解析はR studio (v4.0.5)53で行われた。
結果
cmDNAの予備的な特徴づけ
2019年の夏の終わりから初秋にかけて、セントローレンス湾で合計183のアトランティックおよびグリーンランドオヒョウの血液サンプルを収集した（図1）。cmDNA シグネチャーは、16S rRNA 遺伝子の V3-V4 超可変領域を配列決定することで決定した。フィルタリング後に約600万本の生リードが検索された（大西洋オヒョウとグリーンランドオヒョウはそれぞれ250万本と350万本）。サンプルあたりの配列数は3,985から55,077の間であった。個体あたりの平均リード数は、グリーンランドオヒョウとアトランティックオヒョウでそれぞれ35,575±971と29,296±1 185であった。サンプルカーブごとのASV数から、シーケンスの深さがASV数をプラトーさせるのに十分であることが確認された（図S1）。合計7,105個のユニークなASVが得られ、そのうち7,102個は細菌起源と同定されました（古細菌起源の3個は解析から除外）。合計6,450個のASVは、相対的な存在量が0.01%以上であった。全体として、3,362個のASVがアトランティックオヒョウに存在し（個体当たり平均値＝112±7）、5,023個がグリーンランドオヒョウに存在した（個体当たり平均値＝161±9）。
循環微生物叢の門レベルでの違い
オヒョウの両種が遺伝的・行動的に異なることを踏まえ、まず、大西洋産とグリーンランド産のオヒョウの間でマイクロバイオームが異なるという仮説を検証した。全体として、30種類の門（アトランティックオヒョウとグリーンランドオヒョウでそれぞれ23と29）、63種類のクラス（44と59）、121種類の目（88と112）、241種類のファミリー（189と224）、685種類の属（473と587）が確認された（表2）。門レベルでは、血液マイクロバイオームのシグネチャーは、Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、およびActinobacteriaによって支配されていた（図2）。しかし、プロテオバクテリアの平均相対存在量は、グリーンランドオヒョウで有意に高かった（81.6 ± 1.5% 対 Atlanticオヒョウの62.4 ± 2.3%）（Wilcoxon-Mann-Whitney test; p < 0.001）. 同様に，他の3つの主要なフィラでは，Firmicutesが9.3 ± 0.9% 対 6.9 ± 0.8% (p = 0.032), Bacteroidetesが 6.6 ± 0.7% 対 4.4 ± 0.5% (p = 0.044), Actinobacteriaが 4.0% ± 0.5% 対 2.6 ± 0.4 (p = 0.0028) と，大西洋オヒョウでは有意に高い値となった（図2A）．それにもかかわらず、大西洋オヒョウでは、未同定菌の平均相対存在量は重要であり、平均で～15％を占めた。この発見は、個体相対量に基づくとさらに明白であり、一部の個体は60％の未特定細菌を保有していた（図2B）。他の分類群とのマイクロバイオーム構造は、補足図S2-S3に記載されている。
表2 大西洋オヒョウ（H. hippoglossus）およびグリーンランドオヒョウ（R. hippoglossoides）のcmDNA中の分類群数。
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図2
門レベルでのマイクロバイオーム構造。(A) 大西洋オヒョウ（H. hippoglossus）およびグリーンランドオヒョウ（R. hippoglossoides）の血液マイクロバイオームに存在する4つの主要フィラの平均相対存在量（％）．(B）アトランティックオヒョウ（n = 86）とグリーンランドオヒョウ（n = 97）の主要フィラの相対存在量（％）の個体差。
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属人的なコア循環型マイクロバイオーム
両種のマイクロバイオームシグネチャーが異なるという仮説をさらに検証するため、属レベルでの詳細な解析を実施しました。Pseudoalteromonas、Psychrobacter、Acinetobacterの3属が、両種のサンプルの90%に存在した（ASVは属レベルで集約した）。大西洋オヒョウでは，これらの属が最も多く，平均相対存在量の12.9％，12.1％および8.7％をそれぞれ占めた。90％のサンプルに存在した第4の属はStaphylococcusで、平均相対存在量は3.2％であった（図3A）。グリーンランドオヒョウでは、これら3つの属はそれぞれ平均血液マイクロバイオームの23.6%、16.6%、3.4%を占めていたが、Vibrioは平均相対存在量6.9%で第4の中核属であった。合計で685属が見つかり、そのうち375属はオヒョウの両種に存在した（54.7％）（図3B）。50％の有病率で見つかった属のほとんどは両種に共通していたが，大西洋オヒョウのEnhydrobacterとグリーンランドオヒョウのOleispiraのように，各種に固有の属もあった（図3C）．この属の分布は2種間で異なり、主な違いは、グリーンランドオヒョウではVibrioが多く、Acinetobacterが少なかった。また、有病率50％の属の数は、大西洋オヒョウよりもグリーンランドオヒョウの方が多かった。
図3
コア血液マイクロバイオーム解析。(A）大西洋オヒョウ（H. hippoglossus）（上）とグリーンランドオヒョウ（R. hippoglossoides）（下）の血液マイクロバイオームのcmDNAに集約（90%有病率）されたコア属の平均相対存在量（%）。平均相対存在量は各円グラフに、集約されたASVの数は各円グラフの横に表示されている。(B）血液マイクロバイオームにおける一般的な属と特徴的な属を示すベン図。(C) コアマイクロバイオームのヒートマップ。これらのヒートマップは、オヒョウの両種に最も多く存在する細菌を特定するものである。アトランティックオヒョウ、n=86、グリーンランドオヒョウ、n=97。
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種間の細菌多様性の比較解析
次に、UniFracベースのPCoAを用いて両種間のcmDNAの全体的な生物多様性を比較したところ、マイクロバイオームは種によってクラスター化する傾向があるが、マイクロバイオームを構成する種内の変動が大きく、2軸で説明できる分散の割合は低い（32.8%）ことがわかった（図4A）。PERMANOVAにより、オヒョウの2種間の有意差が確認されたが（p < 0.001）、残差（R2 = 0.94）に比べてグループの効果量は非常に低く（R2 = 0.06） 、これらの魚類マイクロバイオーム間で個体の種は強い決定要因ではないことが示された。これらの結果は、ヒラメ（Pleuronectidae）の腸内細菌叢が家族間で類似していることを示す最近の研究（Huang et al.、2020）を支持している。α-多様性指標については、均等性や多様性に2種間で大きな違いは認められず、平均Simpson指数（アトランティックオヒョウ、0.11、グリーンランドオヒョウ、0.13）および平均Shannon多様性指数（アトランティックオヒョウ3.36、グリーンランドオヒョウ3.37）は同等だった（図4B）。しかし、豊かさ指数はグリーンランドオヒョウの場合、個体当たり平均161±9 ASVであったのに対し、大西洋オヒョウでは個体当たり112±7 ASVであった（p < 0.001）。
図4
生物多様性解析。(A) 加重UniFrac距離に基づく血液微生物叢のβ-多様性のPCoAプロット。(B）大西洋オヒョウ（青）とグリーンランドオヒョウ（赤）のcmDNAのα-多様性の指標。: p < 0.001. (CおよびD)。両オヒョウ集団のcmDNAにおける門レベルおよび属レベルでの判別可能な分類群（p < 0.05）。アトランティックオヒョウ、n = 86、グリーンランドオヒョウ、n = 97。
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LEfSeによる2種の比較
2つのオヒョウ種の循環マイクロバイオームの違いをさらに調べるために、log10（LDAスコア）≧4をカットオフとして、線形判別分析Effect Size（LefSe）を実施した。この基準により、2種の血液マイクロバイオームの構造について、門レベルおよび属レベルでいくつかの違いを観察することができた（図4CおよびD）。特に、グリーンランドオヒョウではProteobacteriaがより豊富に見つかったのに対し、大西洋オヒョウではActinobacteria、FirmicutesおよびBacteroidetesがより豊富に見つかった（Fig. 4C）。属レベルでは、より多くの属がグリーンランドオヒョウを識別した（図4D）。これらの属には、中核属であるPseudoalteromonasおよびPsychrobacterまたはVibrioと、Photobacterium、BurkholderiaおよびEscherichia/Shigellaといった他の属が含まれた。核となるStaphylococcus属とAcinetobacter属は、大西洋オヒョウに限って識別可能であった。
生物学的および生物学的要因との相関関係
環境と生理がマイクロバイオームに与える影響を考慮し、次に、各魚種内の血液マイクロバイオームのシグネチャーが、成熟階級（体長）、水温（トロールのサンプリング深度で測定）、性別、Fultonの条件因子（K）などの異なる変数によって変化するという仮説を検証しました。その結果、両種とも成熟期によって血液中のマイクロバイオーム構造が門・属レベルで変化していることがわかった。(図5A）グリーンランドオヒョウの場合、Corynebacterium、Staphylococcus、Burkholderia、Pseudoalteromonas、PsychrobacterおよびVibrioの存在量に有意差が認められた（図5A、図S4）。属レベルでは、成熟クラスと未成熟クラスで最も大きな差があったのはVibrioの場合で、成熟クラスではほぼ3倍に減少した（9.7％から3.3％；p < 0.001）（表3）。また，グリーンランドオヒョウの成熟クラス（0.7%）と未成熟クラス（4.5%）のBurkholderiaの差も有意であった（p < 0.001）。大西洋オヒョウの場合，両クラス間で識別可能な属はPsychrobacterとEscherichia/Shigellaの2種のみであった（図5B，図S5）．αおよびβ多様性に関しては、成熟個体と未成熟個体の血液マイクロバイオームとの間にいくつかの有意な違いが認められた。グリーンランドオヒョウの場合、リッチネス指数に有意な差が認められたが（図5C）、アトランティックオヒョウの場合は差が認められなかった（図S9）。また，成熟個体と未成熟個体のβ多様性には，オヒョウの両種において有意な差が認められた（図S6およびS7）。
図5
成熟度分析。血液マイクロバイオームのLEfSe解析により、（A）グリーンランドオヒョウ（未成熟、n = 55、成熟、n = 42）および（B）大西洋オヒョウ（未成熟、n = 56、成熟、n = 25）の成熟魚（青）と未熟魚（赤）で有意に異なる分類群を示す。(C).未成熟および成熟グリーンランドオヒョウのα-多様性指標。: p < 0.001.
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表3 成熟オヒョウと未成熟オヒョウのcmDNAに含まれる識別分類群の平均相対存在量
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次に、温度が循環マイクロバイオームのシグネチャーに影響を与えるかどうかを評価した。グリーンランドオヒョウの温度耐性が限られていることから54、5℃以下またはそれ以上の温度でサンプリングされたかどうかに基づいて、集団を2つのグループに分けた。大西洋オヒョウは、グリーンランドオヒョウ45,46よりも広い温度耐性を持ち、本研究で記録した温度よりも高い。このため、この種については温度分析は行わなかった。我々の結果は、グリーンランドオヒョウにおいて、門と属の両方のレベルで、温度に関連した有意な差異を示した（図6A、図S6）。Pseudoalteromonasの相対存在量は、比較的冷たい海域に分布する標本では34.4％であったのに対し、比較的温かい海域では19.9％であった（p = 0.005）（表4）。また、ビブリオの相対存在量は、グリーンランドオヒョウでは、冷水域（5.9％）よりも暖水域（9.8％）に分布する方が少なかった（p = 0.001）。同様の知見はPseudoalteromonasの場合にも観察された（図S8）。ここでも、グリーンランドオヒョウについて、温度クラス間でαおよびβの多様性に有意な変動が見られた（図S6およびS9）。
図6
海水温とサイズクラスに関連する判別分類群。(A)血液マイクロバイオームのLEfSe解析により、グリーンランドオヒョウの（A）寒冷海水（n = 25）および温暖海水（n = 72）に生息し、（B）サイズクラス（クラス1、n = 36、クラス2、n = 22、クラス3、n = 39）に応じて有意に異なる分類群であることがわかった。
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表4 寒流と暖流に生息するグリーンランドオヒョウのcmDNAから検出された識別分類群の平均相対存在量（％）。
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次に、循環マイクロバイオームがグリーンランドオヒョウのサイズクラスと関連して変化するかどうかを判定した。判別可能な分類群には、小型の餌を食べる魚でより豊富なPsychrobacterが含まれ（図6B）、このグループの平均相対存在量は27.9％と最も高かった（Kruskal-Wallis；p < 0.001 ）（表5）。他の2つのコア属は、中型の獲物を食べる魚で差別的に識別され、Vibrio（p < 0.001）およびPseudoalteromonas（p < 0.001）の平均相対存在量は10.4％であった（p < 0.001）。Corynebacterium、Staphylococcus、Acinetobacter、Burkholderiaは大型の餌食魚に対して識別可能であった（図S10）。これらの属はすべて、以前に、望遠魚の腸や皮膚のマイクロバイオームで記録されており、Acinetobacterは肉食魚のバイオマーカーとして同定された（Huang et al. 2020）。
表5 グリーンランドオヒョウ（R. hippoglossoides）のcmDNAで見つかった識別分類群のサイズクラス別の平均相対存在量（％）。
フルサイズ表
オスとメスの違いについては、統計的に有意な差はわずかしか見つからなかった（図S11）。ShewanellaとPsychrobacterはそれぞれグリーンランド産と大西洋産のオヒョウでより豊富であり、一方、Acinetobacterの相対量は大西洋産オヒョウの雌でより豊富であった。グリーンランド産オヒョウの雌と雄におけるこのShewanellaの存在量は有意であった（雄の3.2％に対して雌の0.4％）。また，いずれの種においても，オスとメスの間でαとβの多様性に変動は見られなかった（図S6，S7，S9）。
最後に，個体のふくよかさに基づく健康指標であるKrel conditionsという因子によると，Photobacteriumのみが低条件の大西洋オヒョウの識別属として強調された。一方、Streptococcusは高コンディションの個体のマーカーとなった（図S12）。グリーンランドオヒョウでは、相対条件係数（K）が低いグリーンランドオヒョウでEscherichia/Shigellaの存在量が低いことだけが有意な違いであった。
空間的な変動
次に、循環マイクロバイオームの変動が地理的分布に起因しているのではないかという仮説を検証した。LEfSe分析では、オヒョウの両種において、採取場所に依存する属レベルでのいくつかの変動が見られた（図7A、B）。より具体的には，グリーンランドオヒョウの場合，PhotobacteriumとBurkholderiaはローレンシャン海峡で他の地域よりも有意に多く，平均相対存在量はそれぞれ13.2 ± 2.8% (p < 0.001) と 5.2 ± 1.0% (p < 0.001) となった（図7C）．また、ExiguobacteriumとOleispiraは北東湾でより多く存在し（p < 0.001）、Oleispiraは河口と西湾で特に多く存在した（p < 0.001）。この結果は、Psychrobacterが北東湾とEstuary-Western gulfで同じように豊富であったが、Chaleur BayとLaurentian channelではあまり豊富でなかったことと対照的である。グリーンランドオヒョウの他の顕著な違いの中で、シャルール湾と北東湾でVibrioがより多く存在することがわかった（p < 0.001）。大西洋オヒョウの場合、南湾では北東湾に比べてBizionia（p = 0.009）とNeorickettsia（p = 0.015）が多く、河口と西湾に比べてStaphylococcusが少ない（p = 0.039）特徴があった（図7D）。生物多様性については、Chaleur湾と比較してLaurentian Channelの豊かさが低いことを除き、地域間で目立った差は見られなかった（図S9）。
図7
空間的な分析。血中マイクロバイオームのLEfSe解析により、（A）グリーンランドおよび（B）アトランティックオヒョウにおいて、局在性に応じて有意に異なる分類群を示す。(CおよびD)。グリーンランドとアトランティックオヒョウにおける差別的属の相対的存在量。() p < 0.05; () p < 0.01; (*) p < 0.00. グリーンランド産のオヒョウ： 河口-西湾，n = 22，シャルール湾，n = 19，北東湾，n = 22，ローレンシャン海峡，n = 34．大西洋のオヒョウ： 河口-西湾、n=14、南湾、n=11、北東湾、n=17、ローレンシャン海峡、n=44。
フルサイズ画像
ディスカッション
循環型マイクロバイオームは、予測的なバイオマーカーの創出や潜在的な病原体のスクリーニングの手段として、バイオメディカル分野で高い関心を集めている新しい概念である。本研究では、この概念を応用して、経済的・生態的に重要な2つの野生オヒョウの個体群の循環型マイクロバイオームシグネチャーを明らかにしました。さらに、マイクロバイオームのシグネチャーの構成と構造が、生理的および環境的な要因とどのように相関しているかを調査した。
一般的に、ヒトや魚類を含む他の種では、ほとんどのマイクロバイオーム研究は腸内細菌叢に焦点を当てています。本研究では、DFOの底質調査中に魚が安楽死させられ、視覚的特徴づけによって性別が評価されたにもかかわらず、血液サンプルによって個体の性別が遺伝的に決定される可能性があった55,56. 倫理的およびロジスティックな考慮事項に加え、ヒトおよび他の種における最近の研究により、1滴の血液を使用してコア血液マイクロバイオームを定義すると、疾患バイオマーカーとしてかなりの可能性を示すことが示されている16,20. 病原性細菌（および共生細菌）は腸内だけでなく、他の組織にも存在することから、循環マイクロバイオームを用いて病原体の検出を促進することができる。しかし、健康な血液中のマイクロバイオームの存在がますます認識されているように、血液中の細菌の存在が事実上、疾患状態と関連しているわけではないことに留意することが重要である16。実際、16S rRNA次世代シーケンス法の開発以来、血液は無菌区画であるというパラダイムは根本的に変化している。しかし、血液中のマイクロバイオームが、血液中に休眠状態で生息する細菌16を反映しているのか、それとも血液循環によってあるニッチから別のニッチへと移動する細菌（「atopobiosis」と呼ばれるプロセス）を反映しているのかは、現時点では明らかでない57。この仮説によると、細菌は血管を使ってある組織から別の組織へ移動するだけでなく、赤血球や白血球に感染することで身を守ることもできる。このような基本的な疑問はあるものの、血液中のマイクロバイオームの異常の定義は、臨床バイオマーカーを開発する上で有望な手段となっている58,59。セルロース紙上に室温で保存できる1滴の血液に基づく論理的に簡単な方法と組み合わせることで、本研究は、長期モニタリングプログラムに容易に組み込むことができる新しいタイプのバイオマーカー開発への扉を開くことになります。
基礎的な観点から、本研究により、グリーンランドオヒョウとアトランティックオヒョウの血液マイクロバイオームは、他の内温動物の血液21,22,23,24や、他の魚類や海洋種の腸や皮膚のマイクロバイオームでこれまでに報告されているものより予想外に豊かであることが明らかになった38,40,41,60,61,62,63,64,65,66,67,68．さらに、皮膚や腸のマイクロバイオームなど、他の種や臓器のコアとなる血液マイクロバイオームと、門（Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes and Actinobacteria）および属の点で密接な類似性を見出した12、41、69。しかし、この2種の血液マイクロバイオームを初めて見てみると、その核となる血液マイクロバイオームは多くの特徴を共有しており、特に門と属のレベルでは共通していることがわかった。全体として、両種のcmDNA内に30種類の門、63種類のクラス、685種類の属が同定された。門レベルでは、cmDNAのマイクロバイオームのシグネチャーは、プロテオバクテリア、ファーミキューテス、バクテロイデーテス、アクチノバクテリアで占められていたが、両種はその門における相対的な存在量が著しく異なっていることが示された。属レベルでは、集約されたコア属は、両魚ともPseudoalteromonas、Psychrobacter、Acinetobacterで占められていた。コアASV分析では、集約された属で見つかったコア細菌について、より詳細な情報を得ることができます。コア属は数百のASV（同じ属に属するASVを集約したもの）に基づいていましたが、それらのASVは互いに遺伝的に異なっていました。各ASVをより詳細に分析すると、マイクロバイオームの約30％（平均）は、合計3362および5023のASVのうち、それぞれ大西洋オヒョウでは5、グリーンランドオヒョウでは9のASVのみによって表現されていました（図S13）。例えば、Pseudoalteromonasは、Pseudoalteromonasとして特徴付けられた132個のASVすべてを考慮すると、グリーンランドオヒョウの循環マイクロバイオームの平均23.6％を占めた。しかし、平均相対存在量はこれらのASVの間で不平等であり、一方は平均18.2％を占め、他方は5.4％しか占めていないことがわかった。さらに、ASV分析では、有病率が低いにもかかわらず、VibrioとStaphylococcusのASVが目立つことはありませんでした。この結果は、VibrioとStaphylococcusは、Pseudoalteromonas、Psychrobacter、Acinetobacterよりも個体差がかなり大きいことを示しています。
魚類循環マイクロバイオーム間のもう一つの顕著な違いは、α-およびβ-多様性であり、個体あたりの豊かさはグリーンランドオヒョウでより高かった。このマイクロバイオームは、ASVの数（アトランティックオヒョウの3362 ASVに対して5023 ASV）に関しても、より多様であった。また、それぞれの種で異なる属を発見した（アトランティックオヒョウではEnhydrobacter、グリーンランドオヒョウではOleispira、BurkholderiaまたはShewanellaなど）。これらの違いはすべて、腸内細菌叢のケースで確認されたように、遺伝的要因や共進化の歴史を反映していると考えられる12,13,41。いくつかの属は、他の魚のマイクロバイオームで発見されている。例えば、Enhydrobacterは3種の淡水魚の粘液マイクロバイオームで同定され67、今回の研究では大西洋オヒョウの循環マイクロバイオームの少なくとも50%に存在した。Shewanellaは、大西洋サバの腸内マイクロバイオームで高濃度に検出された別の例であり12、魚食行動の指標として以前に記述されている41。環境は、循環マイクロバイオームの構造において役割を果たすもう一つの要因である。グリーンランドオヒョウは冷水性（1～4℃）の種であるのに対し、アトランティックオヒョウはより高い温度耐性（1～13℃）を持つという特徴を持つ。また、本研究では、グリーンランドオヒョウのサイズと温度によって、中核となる属とフィラの相対的な存在量が変化することが明らかになりました。調査した各環境因子に対して、VibrioとPseudoalteromonasが差別的な分類群として同定された。VibrioとPseudoalteromonasは、冷水と未熟な個体、特に魚食性の中型の餌料に多く存在した。さらに、Psychrobacterは両種とも未熟な魚に有意に多く、特に小さな餌を食べるグリーンランドオヒョウと大西洋オヒョウの雄に多く見られた。最後に、アシネトバクターは、アトランティックオヒョウでは性別によって、グリーンランドオヒョウではサイズクラスによって変化した。しかし、結論を出す前に交絡因子を考慮することが重要である。例えば、我々の場合、性的二型性は、両種とも同じ年齢では雄が雌より小さいことを意味する。全体として、我々の結果は、魚の腸内細菌叢と同様に、生物学的および生物学的要因が血液のコア微生物叢に影響を与えることを示している12、13、69。
興味深い発見は、オスとメスの血液コア微生物叢の違いであった。彼らのマイクロバイオームは、α-またはβ-多様性に差はなかった。しかし、LEfSe解析により、グリーンランドオヒョウのオスとメスを識別する属が指摘された。具体的には、相対存在量の変化で確認されたように、Shewanellaはオスのグリーンランドオヒョウでより多く見られた。この属は、他のクラスのLEfSeには現れなかった。ヒトや動物では、性別は腸内細菌叢を形成する最も重要な要因の一つである70。魚類では、腸内細菌叢について、オスとメスの間のそのような違いが報告されている。実際、Three-spined sticklebackとEurasian perchを用いた研究では、食事に関連するマイクロバイオータが性差に依存することが示された71。
コンディションクラス間で血液マイクロバイオームを比較した我々のLEfSe解析では、大西洋オヒョウにおいて、コンディションレベルの高い魚はコンディションレベルの低い個体よりも有意に多くのレンサ球菌を提示することが示された。対照的に、PhotobacteriumとVibrionaceaeは、低条件のアトランティックオヒョウの差別的な分類群として強調された。両属は他のヒラメの腸内細菌叢に共生していることが確認されているが72,73、よく知られた病原性種も含んでいる74,75。しかし、Fulton's Kは年齢、性別、季節などの複数の要因によって変化することを考慮する必要がある。
最後に、我々の結果は、循環マイクロバイオームのシグネチャーの空間的な差異を強調し、特に属レベルで顕著であった（図S14およびS15）。このような変動は、いくつかの地域でグリーンランドオヒョウの保育所があることなど、いくつかの要因で説明できる51。保育所と相関する属は、未熟な個体と相関する属、すなわちPsychrobacterとVibrioと一致した。しかし、これらの変動に関与する可能性のある交絡効果を考慮することは重要であり、特にBurkholderiaは、Laurentian Channelでより一般的な大型魚にも見出されたものである。これらの変異の背後にある理由はまだ不明であるが、我々のデータは、特定の生物学的および生物学的要因の役割と、これらの要因の変化がこれらの種の循環マイクロバイオームにどのように影響するかをさらに調査する根拠となる。
結論として、本研究は、（1）オヒョウの両種間の基本的な違い、（2）両種の循環マイクロバイオームシグネチャーに影響を与える要因の特定に関する重要な研究課題に対する回答を提供します。さらに、環境ストレス要因に応答するディスバイオシスに関する今後の縦断的研究のために、ロジカルに使えるサンプリング方法を提供するものである。セルロース紙に固定した1滴の血液を使用することから、私たちが用いたロジカルフレンドリーな方法は、特に気候変動や海水温の上昇に対応した魚類集団の長期モニタリングに適していると考えている。しかしながら、結果の解釈における汚染物質の影響を最小限に抑えるためには、適切な無菌洗浄法、無菌器具の使用、コントロール（テンプレートなしコントロールやブランクFTAカードを含む）などの予防措置が不可欠であることに留意することが重要である。適切な無菌洗浄法、無菌機器の使用、テンプレートなしコントロール（コントロールFTAカードとサンプリングカードの隣接パンチを含む）、さらに必要なDNAの準備に特化したラボ、材料、機器の使用は、結果の解釈において重要であり続けるために必要です。こうした対策、セルロース紙上の血液DNAの安定性を考えると、このアプローチはバイオバンクの目的に完全に適応し、将来の時空間レトロスペクティブ研究を促進する。この研究により、魚類の循環型マイクロバイオームがどのようなものかを初めて垣間見ることができましたが、多くの疑問が残されています。腸内細菌叢との類似性は顕著であり、調査する必要がある。さらに、性別、成熟度、食事、健康指標がマイクロバイオーム、特にコアマイクロバイオームに影響を与えました。しかし、これらの観察結果を確認するためには、より細かい成熟度評価、健康状態、食事などを制御した環境での研究が必要である。このような研究により、生理的要因と循環型マイクロバイオームとの関係に対する環境の影響も明らかになると思われます。また、これら2種の血中マイクロバイオームを形成する主な駆動因子を明らかにするために、トランスクリプトミクスやメタボロミクスなどのマルチオミクス解析と組み合わせた、より細かい分類レベルでの今後の研究が必要である。
データの入手方法
本研究の成果を裏付ける配列データは、NCBIのウェブサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA853332）で公開されています。完全なデータセットはhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.21482325、Rstudioのコードはhttps://doi.org/10.6084/m9.figshare.21482355 にあります。
略号
R. hippoglossoides ：
ラインハルディウス・ヒッポグロソイデス（Reinhardtius hippoglossoides
ヒッポグロッサス ..：
ヒッポグロス（Hippoglossus hippoglossus
cmDNAのこと：
循環型マイクロバイオームDNA
PCoAです：
主座標分析
ASV：
アンプリコン配列バリアント
OTUのこと：
オペレーショナル・タクソン・ユニット
PERMANOVA：
並べ替えによる多変量分散分析
LEfSe：
線形判別分析効果量
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謝辞
この調査は、カナダ漁業海洋省（DFO）の後方支援を受けて実施された。著者らは、セントローレンス湾北部および南部での調査期間中、DFOの関係者の方々のご協力とご好意に感謝したい。また、Claire Plissonneau博士の専門的なアドバイスと技術サポートに感謝したい。また、Marlène FortierとClémence Del Valleの優れた技術的支援に感謝したい。本研究は、Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologie（YSP、RV、DR）の助成を受け、Canada Research Chair Programの支援を受けています。
著者情報
著者と所属
INRS-Centre Armand-Frappier Santé Technologie, 531 Boul. des Prairies, Laval, QC, H7V 1B7、カナダ
ファニー・フロントン、ソフィア・フェルキウ、フランス・カザ、リシャール・ヴィルミュール＆イヴ・サン＝ピエール
ケベック大学リムスキー校海洋科学研究所（310, allée des Ursulines, C.P. 3300, Rimouski, QC, G5L 3A1, Canada
ドミニク・ロバート
貢献度
D.R.、R.V.、F.F.およびY.S.P.が研究を考案した。すべての著者がデータの解釈と批判的評価に責任を負った。すべての著者が実験を実施し、実験計画および結果の分析に貢献した。F.F.とY.S.P.は、すべての段階ですべての著者の意見を取り入れながら、原稿を作成した。
筆頭著者
イヴ・サン＝ピエールに対応しています。
倫理に関する宣言
競合する利益
著者は、競合する利害関係を宣言していない。
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Fronton, F., Ferchiou, S., Caza, F. et al. Insights into circulating microbiome of Atlantic and Greenland halibut population: the role of species-specific and environmental factors. Sci Rep 13, 5971 (2023)。https://doi.org/10.1038/s41598-023-32690-6。
引用元：ダウンロード
2022年11月22日受理
2023年3月31日受理
2023年4月12日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41598-023-32690-6
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サイエンティフィック・リポーツ（Sci Rep） ISSN 2045-2322（オンライン版）
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