軍事関連急性外傷性心理ストレスおよび外傷性脳損傷のげっ歯類モデルにおける食餌性オメガ-6脂肪酸強化の効果

Matthew R.Rusling1JamesC.DeMar1NabarunChakraborty1AllisonV.Hoke1StacyAnnMiller1JohnG.Rosenberger2AndrewB.Batuure2DonnaM.Wilder2VenkatasivasaiSujithSajja2JosephB.Long2RashaHammamieh1AartiGautam1*。

1米国メリーランド州シルバースプリング、ウォルター・リード陸軍研究所（WRAIR）、軍事精神医学・神経科学センター、医療準備システム生物学部門
2米国メリーランド州シルバースプリング、ウォルター・リード陸軍研究所（WRAIR）、軍事精神医学・神経科学センター、爆風誘発性神経外傷部門

はじめに 外傷性脳損傷（TBI）と心的外傷後ストレス障害（PTSD）の後遺症は、戦闘兵のキャリアを制限する大きな要因である。TBIとPTSDの症状の重複は、他の一般的な併存疾患とともに診断と治療を複雑にしている。基礎となる生体分子メカニズムを理解し、これらの病態を鑑別するためには、システムレベルのハイスループットなアプローチが鍵となる。

方法本研究では、確立された前臨床動物モデルとマルチオミクスアプローチを用いて、心理的ストレスとTBIの背後にある食事因子を同定し、そのメカニズムを提案した。ここでは、爆風誘発性TBIおよび水中外傷（UWT）誘発性心理的ストレスのシミュレーションに曝露したラットのマイクロバイオーム特性解析を用いた。さらに、オメガ6系多価不飽和脂肪酸とオメガ3系多価不飽和脂肪酸（n-6系、n-3系PUFA）の食餌濃縮が侮辱反応に及ぼす影響を検討した。過剰なn-6系PUFAを用いるのは、西洋の食事に多く含まれ、炎症促進作用があるためである。TBIまたはUWTの前に、動物は6週間維持され、その後、標準食またはオメガ3含有量のバランスを崩して減少させた2種類のカスタマイズドチャウのいずれかを摂取し続けた。すべての群に対応するシャムが実施された。16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を用いて、糞便中の細菌マイクロバイオーム集団を評価した。
結果生理学的アウトカムモデリングにより、食事状態はTBI後の乳酸脱水素酵素（LDH）およびトリグリセリド値に影響を及ぼし、n-3 PUFAはその影響を大きく減弱させることが同定された。UWTモデルでも同様の傾向がみられ、食事はLDH、終末コルチコステロン（曝露後14日）、恐怖行動感受性を有意に変化させた。糞便微生物叢のα多様性は、高レベルのn-3 PUFAによって有意に減少した。同様に、マイクロバイオームのβ多様性は、食事と時間の両方に有意に影響されたが、TBIやUWTへの曝露には影響されなかった。微生物叢の組成的には、時間的な影響は食事によってより観察されやすかった。最も影響を受けたのはプロテオバクテリア（Proteobacteria）門で、n-3 PUFA濃縮により、TBIモデルではアルファプロテオバクテリア（Alphaproteobacteria）が有意に減少し、UWTグループではガンマプロテオバクテリア（Gammaproteobacteria）が増加した。
考察： これらの観察結果はすべて、爆風によるTBIや急性心理的ストレスに対する戦闘員の脆弱性や回復力に影響を及ぼす可能性がある。マイクロバイオーム機構は、2つの傷害を識別するための知識主導型の偏りのないシグネチャーパネルを提供し、的確なケアマネジメントを設計するために不可欠なツールである。

1 はじめに

イラクの自由作戦と不朽の自由作戦の期間中、外傷性脳損傷（TBI）だけでなく、心的外傷後ストレス障害（PTSD）や大うつ病性障害などの精神障害による軍人の入院が大幅に増加した（Staff, 2018）。これらの障害の多くは併存している（Bryant, 2011;Weckle, 2013）。なぜなら、脳損傷は心理的外傷を伴う状況、特に戦闘作戦で直面する状況下で受けることが多いからである。各疾患に付随する症状には重複があり、2つの疾患によく併存する他のさまざまな問題が診断をさらに複雑にしている。知識主導型の偏りのないバイオマーカーシグネチャーのパネルを用いて心理的ストレスとTBIを識別することは、的確な医療管理を設計する上で極めて有用である。

TBIには、頭蓋骨の衝撃による脳震盪など、外力による脳への損傷が含まれ、TBIの重症度は通常、軽度、中等度、重度で表現される。戦闘作戦における兵士の閉鎖頭部TBIの主な原因は、爆弾爆発による爆風曝露であり、頭蓋骨への3つの基本的なタイプの打撃と脳への運動エネルギー力の伝播によって生じる、一次的には過圧波、例えば空気の急激な膨張、二次的には投石などの投射物、三次的には身体の変位、例えば硬い物体にぶつかったときの転倒である。これらの事象は主に、脳の神経細胞層に対する拡散性の軸索剪断と圧縮性挫滅を引き起こし、それに伴って血管が断裂し、深部の神経炎症プロセス、例えばマクロファージの浸潤やミクログリアやアストロサイトの過剰活性化（サイトカイン放出など）が誘発される。多くの爆弾爆発は極端に大きく、近接しているため、多くの犠牲者は、防護服（ゴーグルやヘルメットなど）を着用しているにもかかわらず、3つのタイプの爆風に関連した頭部への傷害をすべて経験することになる。したがって、動物モデルでは、最初の2つの被爆（すなわち、一次被爆と二次被爆）を組み合わせることにしました。同様に、複合的な被爆は、爆風や投射物（体重落下）だけの被爆と比較して、急性期と慢性期の両方に現れる顕著な病態生理学的・行動学的変化を伴い、容易に増強されたTBIを生じることがわかった（Arun et al, 2024）。しかし、このTBIモデルは、死亡率の低い軽度から中等度の重症度の範囲内で容易に調整でき（すなわち、爆風圧や体重落下の高さを減衰させることにより）、栄養介入や薬物治療薬の有効性を研究する際に、神経学的に完全に回復する可能性がある。
多くの症状の遅発性は、他の疾患との重複とともに、TBIに罹患した人々にとって診断上の問題につながる可能性がある（Bramlett and Dietrich, 2015）。従って、臨床および前臨床研究は、この分野の研究を前進させるために、疾患に関連する行動や分子の変化の程度を評価するために極めて重要である。今回の研究では、この分野の研究を進展させるために、ヒトの疾患状態を模倣した標準化げっ歯類モデルを使用することに焦点を当てた。これらの動物における模擬爆風曝露から生じるTBIは、現在、兵士が野戦に似た状況で受ける爆風関連傷害を模倣するために用いられている（Ramaら、2018；Sajjaら、2018）。爆風TBIは、高強度爆薬によって発生する一次爆風過圧（BOP）波がびまん性軸索脳損傷を引き起こす戦闘犠牲者の主な原因である（Yarnellら、2013；Zhouら、2018；Brydenら、2019）。発生する過圧エネルギーは、脳と頭蓋内の関連構造に脳震盪損傷（伝播せん断力など）を引き起こす。
一方、水中外傷（UWT）曝露として知られる動物モデルは、短時間ではあるが重大な心理的ストレス要因（Richter-Levin, 1998）であり、急性ストレス反応（ASR）を生じさせ、緩和されなかったり特に繰り返されたりすると、急性ストレス障害（ASD）やPTSD様状態に発展する可能性がある。ラットを用いた場合に主に適用されるUWTは、「不安様」行動(例えば、落ち着きのなさや体重減少)という急性かつ持続的な結果を引き起こす(Ardi et al., 2014;Ritov and Richter-Levin, 2014)。ヒトでは、ASRやASDの症状が1ヶ月以上続くと、PTSDを発症する可能性がある。PTSDは、類似の感覚入力を再体験することを特徴とする不安要素を呈し、回避行動や過警戒行動を引き起こす。
私たちの研究の第2部では、戦闘員におけるTBIとPTSD関連の衰弱を予防するための対策として、栄養学に基づいたアプローチに焦点を当てた。脳への外傷は、血管障害、虚血、興奮毒性、炎症、神経細胞喪失につながる複雑な内部事象のカスケードを開始することを理解している（Luら、2019）。食餌性n-3系多価不飽和脂肪酸（PUFA）は、神経細胞膜の重要な構成要素であり、強力な抗炎症代謝産物に変換することができる（Bazanら、2011；Mayurasakornら、2011；Dyall and Michael-Titus、2008）。n-3 PUFAの栄養的欠乏は、神経認知能力や神経精神疾患の危険因子として同定されている。n-6系とn-3系PUFAは、食事中のそれぞれの比率とレベルに基づいて、共有する生化学的経路において強く競合している（Landsら、1992；Blasbalgら、2011）。
これまでの研究によると、n-3系多価不飽和脂肪酸であるα-リノレン酸（ALA）、エイコサペンタエン酸（EPA）、ドコサペンタエン酸（DPA）、ドコサヘキサエン酸（DHA）は、現在の欧米人の食事では比較的不足している（例えば、魚介類の摂取不足から）、リノール酸（LA）のようなn-6系PUFA（種子油や赤身肉の過剰摂取など）が10-30:1（Blasbalg et al.） n-3系PUFAは強力な抗炎症作用、炎症解消作用、神経保護作用を持つのに対し、n-6系PUFA（例えばアラキドン酸）は主に炎症反応を刺激するため、このアンバランスは有害な結果を招く可能性がある。食事によって誘発されるPUFA組成の変化は、神経細胞膜の流動性やシグナル伝達にも影響を及ぼす可能性があり（Calder, 2011）、多価飽和度が最も高いDHAは、これらの神経細胞の状態に影響を及ぼす上で中心的な役割を果たしている。これらのメカニズムはすべて、TBIや外傷性ストレスに対する相対的な脆弱性や回復力に影響を及ぼす可能性がある。このような食事由来の感受性は、サプリメント（例えば、海洋魚油）によって容易かつ安全に改善できるはずである。ここでは、成体ラットにn-3およびn-6 PUFA強化食を与えると、腸内細菌叢の構成に影響を及ぼすことによって、TBIや外傷性ストレスに対する脆弱性が増加するかどうかを検討した。
さらに、TBIやPTSDなど、脳に対する物理的・心理的な傷害は、血流を循環するHPA軸主導型のストレスホルモン（グルココルチコイドなど）の放出を引き起こし、腸内組織の構造や機能に変化を引き起こす。その結果、腸管内腔-上皮バリアが失われ、腸内細菌叢の異常増殖と漏出が起こり、免疫細胞プロセスのカスケードが起動する（Georgeら、2021年）。これは、脳が上昇した循環炎症因子（サイトカインなど）にさらされるのを促進するだけでなく、正常な腸内微生物の活動によって促進される重要な代謝産物、すなわち栄養（短鎖脂肪酸：酢酸、プロピオン酸、酪酸など）や神経伝達物質（ドーパミンやセロトニンなど）の産生を奪う。食餌性n-3系PUFAは腸管内腔の完全性を高め、同様に腸の炎症を減少させることができる（Durkinら、2021年）。そこで我々は、PUFA栄養と腸内細菌叢の影響に重点を置きながら、これら2つの脳障害に関連する交差点や特異的な分子パターンをさらに明らかにすることを目指した。

2 方法

すべての動物実験は、動物福祉法（Animal Welfare Act）ならびに動物および動物を含む実験に関するその他の連邦法および規制に従い、実験動物の飼育と使用の手引き（Guide for the Care and Use of Laboratory Animals）（NRC出版2011年版）に記載された原則を遵守し、公衆衛生サービス動物福祉保証（Public Health Services Animal Welfare Assurance）を受けたAAALAC International認定施設において、施設動物飼育使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee：IACUC）承認のプロトコールのもとで実施した。体重270～290gの8～9週齢の雄性Sprague Dawley系若齢成体ラット（Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA）を20～22℃（12時間明暗サイクル）で飼育し、餌と水を自由に摂取できるようにした。

2.1 被験者と飼料

本研究では、72匹のラットを2つの介入群に等分割した（TBI群：n＝18偽薬、n＝18TBI曝露。UWT群：n=18偽薬、n=18強制水中潜水）。各群は3種類の食餌のいずれかに均等に割り付けられ、各食餌暴露群につき6匹のラットが割り付けられた。2つの実験食は等カロリーのげっ歯類の餌、すなわち、リノール酸（n-6 PUFA）由来のエネルギー（en%）を1％または8％含み、α-リノレン酸（n-3 PUFA）を1en％含み、その他のn-3 PUFAを含まないものであった。これらの飼料は試験用にカスタムメイドされたもので、AIN-93G製剤を出発基剤とし、げっ歯類の一般的な栄養要求量に関する米国国立衛生研究所のガイドラインに従った（修正処方番号：181161および181162、Dytes Inc.、米国ペンシルベニア州ベツレヘム）。両飼料の総タンパク質、炭水化物および脂肪含量は、製造業者によりそれぞれ18、46および35en%とされている。したがって、これらの飼料は中脂肪食である。別のグループのラットには、EPAとDHAを合わせて0.5 en%として含むすべてのPUFAをバランスよく含む標準的な動物施設提供飼料（ハウスチャウ）を与えた（Prolab RHM 3000、LabDiet、Purina/PMI Nutrition International、Richmond、IN、USA）。この飼料の総タンパク質、炭水化物、脂肪含量はそれぞれ25、49、15en%と記載されており、リノール酸とα-リノレン酸がそれぞれ4と0.5en%である。したがって、ハウス・チャウは他の2つの飼料と比較して、高タンパクで低脂肪、特にn-6 PUFAである。我々は、総脂質抽出法、メチルエステル誘導体法およびガスクロマトグラフィー法（DeMar et al. 同様に、偽動物を用いた予備実験では、2種類のn-3系PUFA欠乏食とハウスチャウ（n＝各6）を適度に長期間（1〜2ヶ月）摂取させると、PUFA貯蔵の主要臓器である肝臓において、n-6系PUFAとn-3系PUFAの著しい不均衡、および／またはDHA含量の減少（約2倍；p＜0.05）が起こることが確認された。

次に、腸の完全性に影響を与えうる軍事関連の病理学的変化を脳内に生じさせるために、動物を高忠実度の模擬爆風に加えて体重落下誘発性脳震盪（Marmarouら、1994；Sajjaら、2018）、すなわち外傷性脳損傷（TBI）、または水中外傷（UWT）心理的ストレッサー（Richter-Levin、1998；Mooreら、2012）に曝露する。TBIおよびUWTを受けた動物には、標準的なハウスチャウ（HC）およびリノール酸を1%または8%添加したチャウ（1%または8%LA飼料）の3種類の飼料を、被曝前6週間およびその後も継続して与えた。実験計画を図1に示す。

図1

図1. 研究デザイン全体を示す実験タイムライン。すなわち、ハウス・チャウ、リノール酸（LA）としてのエネルギー（en）％を1％濃縮した飼料、またはLAを8en％濃縮した飼料である。後者の2つの飼料は、n-6系PUFA（すなわちLA）の含有量が高いが、長鎖n-3系PUFA、例えばEPAやDHAは含まれていない。その後、動物はそれぞれのシャムとともに、爆風プラス体重減少誘発TBI（上の4つの矢印）またはUWT誘発急性ストレス（下の4つの矢印）にさらされた。ベースライン時および曝露後14日目まで、動物は行動検査を受け、血液および糞便中のマイクロバイオーム評価を受けた。

2.2 食事と介入の検証

モデル動物に対する食餌と曝露の影響を幅広く検証するため、採取した組織は新鮮なうちに急速冷凍し、脳、網膜、血漿内の遺伝子発現、存在量、タンパク質の活性（トランスクリプトミクス、プロテオミクス、メタボロミクス）の関連変化に関する今後の研究のために確保した。これは、特にオメガ3脂肪酸の栄養不足が悪化している状況下で、TBIと急性心理ストレスの新規バイオマーカーを同定するために実施された。本研究の計画の初期段階において、3種類の食餌が脳にどのような変化をもたらすかを検証するため、各食餌で爆風TBIを受けた4匹の動物の脳を、年齢をマッチさせたシャムと一緒に冠状切片とコロイド銀染色に供し、明視野光学顕微鏡で軸索変性を検出した。

2.3 暴露

2.3.1 一次および二次爆風モデル

爆風過圧（BOP）波曝露（一次爆風傷害）と体重落下脳震盪（Marmarou法）（二次爆風傷害）からなる閉鎖性頭部TBIモデルを、成体雄性ラット群（各食餌n=8）に用いた。イソフルラン吸入(2-3%)で麻酔した動物を、圧縮空気によるキャンバス膜の急速な破裂後に衝撃波を発生させる先進爆風シミュレーター(ABS)内でBOP(18psi)に1回かけた。その直後、上空125cmから500gの金属錘を、ラットの頭蓋に固定したステンレス製円盤のラムダとブレグマの中間に落下させた。

2.3.2 水中外傷

並行して、一群のラットをUWTストレスモデル（Richter-Levin法）に供した。このモデルは、吸引による肺の炎症を防ぐため、室温の0.1%(w/v)生理食塩水で半分満たした20ガロン水槽で30秒間泳いで慣れさせた後、穴のあいたプランジャーで30秒間強制的に全身を浸すというものである。これにより、溺れそうになる感覚に伴う極度の恐怖反応が動物に誘発される。シャムス（SH）には1分間の自由遊泳を与えた。

2.3.3 銀染色および老化検出器染色による脳の病理組織学的検査

TBIまたはUWT曝露後14日目に、動物を5％イソフルラン吸入で6分間深く麻酔した後、生理的食塩水で経心的に重力線灌流し、血液を流出させ、次いでピクリン酸で飽和させたリン酸緩衝4％パラホルムアルデヒドで組織を固定した。生理食塩水灌流の前に、注射器による心臓穿刺で血液を採取し、冷やしたEDTAとヘパリンの真空採血管に入れた。一部の血液を3,000×gで10分間遠心分離し、血漿画分を得た。全血と血漿を、後述する血液検査評価に用いた。脳を取り出し、リン酸緩衝化4％パラホルムアルデヒドに最大6時間浸漬して後固定し、凍結保存の目的で、緩衝化20％ショ糖溶液に一晩交換し、その後新鮮なショ糖に1回交換した。FD Neurotechnologies社（米国メリーランド州エリコットシティ）に提出し、固定脳を切片化、染色し、顕微鏡用スライドにマウントした。脳を等間隔に11箇所（ブレグマ1.0mm～-8.3mm）の連続冠状切片（30～50μm）に切り出し、3枚ずつマウントした。これらの切片は、大脳皮質、海馬、視路、扁桃体、視床、視床下部、中脳、小脳の全領域をカバーしている。曝露された細胞タンパク質に対して高い反応性を示す銀染色をTBI曝露動物由来の切片に対して行い、神経細胞の変性した軸索線維路の存在を褐色から黒色として明らかにした（DeMar et al.）同様に、UWT被曝動物の浮遊脳切片を私たちに提供し、スライドマウントして染色し、製造者の指示に従って老化検出キット（BioVision, Mipitas, CA, USA）を用いて、早老化したニューロンの存在を青色として明らかにした（Arun et al.）老化検出染色は、β-ガラクトシダーゼという酵素を過剰発現している老化神経細胞に対して高い反応性を示すが、前駆細胞、休止期細胞、不死細胞に対しては反応しない。準備したすべてのスライドについて、Olympus BX61顕微鏡（Olympus Corporation, Center Valley, PA, USA）とStereo Investigator virtual image tool（MBF Biosciences, Williston, VT, USA）を用いて、異なる脳関心領域のモザイク（12×14）写真を撮影した。Image-Pro Premierソフトウェア（Media Cybernetics Inc. デンシトメトリーの測定では、強く染色された細胞は含まれ、最大染色強度の50％未満を示した細胞は除外された。各食餌、すなわちハウスチャウ、1en% LA、8en% LAについて、合計4匹のシャム、4匹のTBIまたは4匹のUWT被曝動物を評価した；しかしながら、TBI被曝群の対応するシャムにはそれぞれ3匹、2匹、3匹を用い、それらの値をバックグラウンドシグナル決定のための予想されるニュートラルコントロールとして合わせた。平均染色密度の群間比較は、Kruskal-Wallis一元配置解析とポストホックダン検定を用いて、偽薬群とTBI群またはUWT群について行った。

2.4 行動、血液、マイクロバイオーム評価

2.4.1 ロータロッド

ラットはロータロッド装置（Rotamex-5; Columbus Instruments, Columbus, OH, USA）で2日間予備訓練を受け、10rpmに設定された回転スピンドルの上を45秒間歩行した。転倒までの時間が報告されている。これは、バランスと協調における脳の障害（例えば、運動皮質）を検査するものである。

2.4.2 高架式十字迷路

高架式十字迷路（EPM）装置（モデル番号：LE840、Harvard Apparatus/Panlab、Holliston、MA、USA）の中央に動物を置き、UWT後8日目に5分間自由に探索させた。アームに費やした時間が報告されている。これは、落ち着き（恐怖制御）と探索における脳（例えば扁桃体）の障害を調べるものである。

2.4.3 血液マーカー

UWT曝露の7日後と14日後のみ、動物は2～3％のイソフルランを短時間吸入することにより軽く麻酔された。血液サンプル（約200μl）は、1ccシリンジと27Gバタフライ針カテーテルを用いて側尾静脈採血により採取され、抗凝固剤としてヘパリンナトリウムを含む氷冷マイクロフュージチューブに入れられた。血液は直ちに遠心分離して血漿を得、-80℃で保存した。動物は自宅のケージで麻酔から回復させた。あるいは、TBIおよび-UWT後14日目に、4～5％のイソフルランを長時間吸入することで動物を深く麻酔し、終末的な駆血の後、断頭することで安楽死させた。失血は、外科的に開胸した後、10ccシリンジと18G針による心臓穿刺で行った。採血した全血（約3ml）を、抗凝固剤、すなわちジカリウム（K2）EDTAまたはヘパリンナトリウムを含むチューブ（Vacutainer、Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、USA）に入れ、静かに手で混合し、氷上で冷やした。
UWT後7日目および14日目に採取した尾静脈血漿サンプルのコルチコステロン濃度（Cort；ng/ml）は、研究者の研究室（すなわち、BINT支部）内で、種特異的マルチプレックスイムノアッセイアレイ（MILLIPLEX MAP Rat Stress Hormone Magnetic Bead Panel、Millipore Sigma、Burlington、MA、USA）を用いて測定した。サンプルをロードし、アッセイを展開した後、アレイを多重イメージングプラットフォーム（LuminexMAGPIX-xPONENT®; Bio-Techne/R&D Systems, Minneapolis, MN, USA）で読み取り、標準曲線から結果を算出した。簡単に言えば、この装置は、タグ（例えば、蛍光ナノビーズ）抗体の特異的結合をスキャンし、コルチコステロンを登録・定量する。
TBIおよびUWT後14日目に採取された終末全血検体は、同日中にWRAIR臨床病理部に提出され、採取後24時間以内に処理された。乳酸脱水素酵素（LDH；U/L）およびトリグリセリド（TG；mg/dl）の化学検査（ヘパリン処理サンプル）は、臨床化学分析装置（VITROS 350 System; Ortho-Clinical Diagnostics/Quidel Ortho, San Diego, CA, USA）を用いて、血液遠心分離によって分離された血漿に対して行われた。簡単に言えば、この装置は比色反応を用いて2つの分析物を定量する。同様に、臨床血液学分析装置（XT-2000iV; Sysmex America, Lincolnshire, IL, USA）を用いて、全血について、全白血球（WBC）および単球分画のレベル（μlあたりの密度）についての全血球算定（ETDA処理サンプル）を行った。この装置では、蛍光色素を用いたフローサイトメトリーにより、免疫細胞集団の同定と計数を行う。

2.4.4 糞便微生物群

糞便ペレットは、爆風＋体重減少または水中外傷曝露の1～2日前と14日後の朝に、新鮮な便サンプル（1～2回分の糞便）が付着するまで新しい吸収性のアンダーパッドの上に被験体を保持することにより、動物から直接採取した。排便を促すために動物をマッサージした。アンダーパッドは毎回新しい部分を使用し、ピンセットは動物の間にイソプロピルアルコールで拭き取り洗浄した。細菌DNAは細菌核酸抽出キット（QIAamp PowerFecal Pro DNA, Qiagen, Germantown, MD, USA）を用いて糞便ペレットから単離した。調製したDNAの質と量は、UVスペクトロメトリー（NanoDrop 8000, Thermo Fisher Scientific）、色素蛍光測定（Qubit 4, Invitrogen/Thermo Fisher Scientific）、キャピラリーゲル電気泳動（2200 TapeStation, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA）でチェックした。DNAを断片化した後、細菌の種類によって変動し、哺乳類宿主細胞には存在しない原核生物偏在性の16S rRNA遺伝子のV3およびV4領域のプライマーを用いて増幅し、メタゲノム配列決定装置（MiSeq、Illumina、San Diego、CA、USA）で解析した（Karlら、2023）。簡単に説明すると、増幅されたDNAの塩基配列が決定され、300 bpのペアエンドリードが一度に得られた。ペアはq2-vsearchでマージされ、品質チェックされ、キメラが除去され、QIIME2 v.2020.82 (Bolyen et al., 2019)を用いてq2-demuxおよびDADA2 (Callahan et al., 2016)を用いて多重化解除された。アンプリコン配列バリアント（ASV）はq2-alignmentを介してMAFFT（Katoh and Standley, 2013）でアライメントし、q2-phylogeny（Price et al., 2010）を介してFastTree2で系統樹を構築するために使用した。分類を割り当てるために、特定のプライマーを用いた16S rRNA V3-V4領域と、Classify-Sklearnを介してq2-feature-classifierを用いた参照配列のGreengenes v13.8 (McDonald et al., 2012) 99%運用分類単位データベースでナイーブベイズ分類器を学習させた。

2.5 データ解析

2.5.1 生理学的結果

アウトカム測定は、偽薬曝露後または実験曝露後にサンプリングした。各実験における結果は、Outcome~ [ALA] + [LA] +Condition の連続食組成の線形モデリングを用いて解析した。表はstargazer(Hlavac, 2022)でフォーマットした。t検定によるカテゴリー比較は、偽薬と治療薬を比較した飼料内、および治療薬曝露モデルを比較した飼料間で行った。pwr（Champely、2020）およびR（Torchiano、2020）のeffsizeパッケージを使用して、α＝0.05、n＝36で効果量を定量化するためにCohenのDを使用して、各有意な結果について検出力分析を行った。

2.5.2 準備

16S OTUの表はQIIMEで作成した。相対存在量表は下流解析のためにRにエクスポートした。サンプルの半分以下で観察されたフィーチャーは削除され、この分類レベルの OTU はそれ以上分類できないため、データはファミリーレベル以下では解釈されなかった。相対存在量データは付録Aにある。

2.5.3 アルファ多様性

アルファ多様性は、平均化されたサンプル内の細菌分類群の数または相対存在量を反映するものとして定義される。シャノン多様性、チャオ多様性、シンプソン多様性はQIIMEを用いて算出し、Rにエクスポートして解析と可視化を行った。多様性指標～[ALA]+[LA]+時間+処置の線形モデリングを用いて食事の影響を評価し、結果に対する食事成分の連続的影響を特徴付けた。食餌群間差はt検定とANOVAを用いて食餌内および食餌間で比較した。飼料内では、α多様性を暴露前後で比較した。食餌間で、治療（偽薬ではない）曝露モデルを他の食餌のα多様性と比較した。

2.5.4 ベータ多様性

β多様性は、個々のサンプル間の細菌分類群の同一性のばらつきを反映するものとして定義される。β多様性は、veganパッケージ（Oksanen et al., 2022）を用いてRで計算した。距離行列はファミリーレベルの相対存在量表から作成した。Bray距離は相対存在量を用いて計算し、Jaccard距離は二値変換したデータセットを用いて計算した。β多様性の比較はすべてADONIS検定を用いて行ったが、脳障害条件下（TBI vs. UWT）では実験間に有意な距離が見られたため、各実験を独立に解析した。実験内分析は、距離～[ALA]+[LA]+時間+Jaccard距離とBray距離の両方で暴露された処置の検定によって行われた。

2.5.5 構成

スケール（存在量）～［ALA］＋［LA］＋時間＋曝露された処置の線形モデリングを用いて、糞便中マイクロバイオーム組成に対する実験処置の影響を、測定された分類学的レベルにわたって評価した。モデル化における非正規の特徴分布の影響を軽減し、異なる存在量の特徴間の結果の解釈を可能にするため、マイクロバイオーム存在量を中央揃えにしてスケーリングした。食事群内および食事群間のカテゴリー比較は、上記のα多様性で概説したのと同じ戦略に従って行ったが、マイクロバイオーム量の非正規分布のため、クラスカル・ウォリスを選択した。

2.5.6 マイクロバイオーム特徴の選択

2.4.1で説明したプロセスにより、実験暴露または食事状態のいずれかに有意に影響される結果を特定した。少なくとも中程度のエフェクトサイズ（調整済みR2で0.2以上）を持つモデルを持つアウトカムは、ステップワイズ微生物叢モデルを構築するために用いられた。網羅的特徴選択（Exhaustive Feature Selection）とは、モデルの適合度と誤差率のバランスをとる予測因子を合理的に特定し、ターゲットに対する正負両方の影響のバランスをとりながら、可能性のある予測因子のどの組み合わせがターゲットの結果を最もよく説明するかを結論づける方法である（Chowdhury and Turin, 2020）。ステップワイズ選択は、食事＋暴露モデルと同じ予測変数の数（3）に制限された。leapsパッケージは，網羅的予測変数の選択を実行するために使用された(Miller, 2020)．予測変数が同定されると、予測変数間の相対的存在量の大きさに大きな差があることから、解釈の助けとなるように、それらを中心化し、スケーリングした。最終モデルはRの基本パッケージlm()関数を用いてステップワイズ予測子を用いて実行した。残差の分布は、lmtest(Achim and Torsten, 2002)を用いてホモ分散性をチェックした。すべてのアウトカム測定モデルは、ホモ分散的であった。

3 結果

3.1 食事療法と介入の検証

我々は、シャム以上の爆風-TBI被曝動物において、特に白質に富む視路において、変性した軸索が有意に存在することを観察し、その傾向はLAを1en%含むオメガ3欠乏食を与えた動物で最も高かった。しかし、3つの食餌の間に有意差は認められなかったため、このモデルが強固な脳損傷を生じていることの検証にとどまった（補足図S1）。UWT曝露動物については、このモデルが主にHPA軸に駆動される脳内の神経化学的／ホルモン的不均衡を生じさせることが知られており、急性曝露の段階では、神経細胞への物理的変化は容易に観察されない。しかし、急性および特に慢性心理的ストレスの他の動物モデルでは、ミクログリアの過剰活性化が報告されている（Enomoto and Kato, 2021）。同様に、各食餌でUWTに曝露したパイロット動物（n＝6）から得た脳切片を、老化／老化した神経細胞を検出するための高感度免疫染色（すなわち、β-ガラクトシダーゼ発現）で見てみたが、一次恐怖記憶中枢の海馬と扁桃体内の機能不全細胞のシャムより有意な増加は認められなかった。UWT暴露とは無関係に、興味深いことに、両方のオメガ3欠損食において、早期老化ニューロンが軒並み有意に多かった（補足図S2）。

UWTモデル（付録B）およびTBIモデル（付録C）について2.5.1で説明した検出力解析の結果、今後の研究はより大きなサンプルサイズによって改善される可能性があることがわかった。UWTモデルの検出力は、7-dコルチコステロンで0.052、14-dコルチコステロンで0.63、LDHで0.48、オープンアームEPMで0.53、クローズドアームEPMで0.31と算出された。TBIモデルの検出力は、LDHで0.59、6日間ロータロッドで0.75、14日間ロータロッドで0.38であった。

3.2 UWTの生理学的効果

結果指標～[LA]＋[ALA]＋条件の線形回帰を用いてUWTの効果を線形モデル化したところ、これらの予測因子は結果指標の10～30％しか説明できないことがわかった（表1）。血液サンプルが曝露後にのみ採取されたことを考慮し、条件時間は因子として含めなかった。LDH、EPMクローズドアームでの時間、および14-dコルチコステロンのみが中程度のエフェクトサイズを有していた。アウトカム全体において、[ALA]は[LA]よりも効果量が大きかった。特に、[ALA]はEPMクローズドアームとLDHに対してより大きな負の効果を示した。UWTは、曝露後14日目において、老化検出染色を用いた病理組織学的評価により、恐怖記憶関連行動（例えば、高架式十字迷路の障害）の形成を制御する脳領域、すなわち海馬および扁桃体において、有意な神経細胞障害を引き起こさないことが判明した。

表1

表1. UWTの結果のLM結果。

偽薬とUWTの間の食餌内カテゴリー差を評価するためにt検定を用いたところ、WBC数、LDH、TG、およびコルチコステロンは、暴露14日後にUWTと偽薬の間で有意差が認められた（図2）。WBC数はUWT群（HC）で有意に多かったが、LDHはUWT群（HCおよび8％LA）で有意に減少した。コルチコステロンはUWTモデルにおいて、HCおよび1％LA食餌中、7日および14日目に有意に減少した（図2）。

図2

図2. UWT曝露の生理学的結果。t検定を用いてシャムとマッチさせたUWT曝露モデルを比較（各群n=6）。LDH、乳酸脱水素酵素；TG、トリグリセリド；WBC、白血球；EPM、高架式十字迷路；HC、ハウス・チャウ、1%LA、1%en LA食；8%LA、8%en LA食；SH、シャム；UWT、水中試験。NS =p>0.05,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001.

食餌間の比較では、UWT暴露食餌群では、LA濃縮食餌はHC食餌に比べ、高架式十字迷路（EPM）開閉アームでの滞在時間が有意に長かった。また、偽薬とUWTを比較すると、UWT曝露モデルでは、どの食餌においてもEPM閉群での滞在時間が有意に減少した。線形モデリングにより、これらの食餌間差のカテゴリー別観察結果は、食餌中の[LA]ではなく、[ALA]に最も起因することが判明した。

3.3 TBIの生理学的影響

TBIの結果に関する線形モデルは、[LA]と[ALA]が単球とTGレベルには有意なプラス効果を示したが、LDHにはマイナス効果を示した。これらの結果については、[ALA]がより大きな効果を示した（表2）。TBI曝露は単球とLDHを有意に増加させ、TGと6日目のロータロッド行動（バランスと協調性）を減少させた。これらのTBIモデルにおいて、[ALA]は[LA]よりも大きな効果量を示した。TBIモデルとUWTモデルで測定された結果のうち、効果の大きさはほぼ同じであった。調整後R2値では、LDHとTGのみが中等度の効果量を示した。

表2

表2. TBIアウトカムのLM結果。

TBI群と偽薬群の食餌内でのt検定比較では、TBI群では単球（HC）、LDH（8％LA）、TGs（HC）のレベルが有意に高かったが、1％LA食ではTGsのレベルが低かった（図3）。6日目のロータロッド試験では、飼料間の差はみられなかったが、TBIでは8％LAでのみバランス時間が有意に短かった。14日目のバランス時間は、TBI群ではHCおよび8％LAで有意に低かったが、1％LAでは高かった。

図3

図3. TBI被曝の生理学的転帰を、t検定を用いてシャムとマッチさせたTBI被曝モデルと比較した（各群n=6）。LDH、乳酸脱水素酵素；TG、トリグリセリド；WBC、白血球；HC、ハウス・チャウ、1%LA、1%en LA食；8%LA、8%en LA食；SH、シャム；TBI、外傷性脳損傷。NS =p>0.05、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。

TBIモデルにおける食餌間の比較では、終末LDHはHCと比較してLA強化食で有意に低下した。終末TGはLA強化食で上昇した。ロータロッドの落下までの時間は、飼料間で有意差はなかった。

3.4 マイクロバイオームα多様性

シンプソンの多様性は、UWTモデルにおいて、食事[LA]および[ALA]によって有意に減少した（表3）。いずれのモデルでも処理暴露は有意ではなかった。UWTモデルのシャノン多様性で有意であったのは時間のみであった。UWTモデルとTBIモデルの効果量は小から中程度であった。

表3

表3. シャノン多様性とシンプソン・アルファ多様性に対する食餌と条件の影響。

カテゴリー別に見ると、TBI食群では、1%LAモデルにおいて、偽被曝によってアルファ多様性が有意に減少した（図4）。UWT群では、アルファ多様性は8％LA群では偽薬曝露によって、1％LA UWT群ではUWT曝露によって有意に減少した。アルファ多様性は、LAを補充したモデルでのみ破壊された。

図4

図4. UWT（A）とTBI（B）モデルのアルファ多様性の3つの尺度（Shannon、Simpson、Chao1）に対する食事と脳障害曝露の影響。HCはハウス・チャウ、1%LAは1%en LA食、8%LAは8%en LA食、SHは偽薬、UWTは水中試験、TBIは外傷性脳損傷。NS =p>0.05、*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。

3.5 マイクロバイオームベータの多様性

Bray（ADONIS: p<0.01、R2=0.09、Residual=0.91）およびJaccard（ADONIS: p<0.001、R2=0.08、Residual=0.92）の両方で全サンプルを比較したところ、TBIとUWTの間に有意差が認められた。

食事の影響はUWTモデルでは観察されなかったが（表4）、TBIでは観察された（表5）。実験内距離は、ADONISをHC食、ベースライン条件、SH条件に対してβ～食＋時間＋処理で制御して検定した（図5）。

表4

表4. UWTモデル内のADONISベータ多様性の結果。

表5

表5. TBIモデルにおけるADONISのベータ多様性の結果。

図5

図5. TBIモデル（左のパネル）とUWTモデル（右のパネル）における、食事と脳障害曝露がベータ多様性に及ぼす影響。パネルの上段はBray-Curtis距離で測定したベータ多様性を示し、下段はJaccard距離で測定したベータ多様性を示す。各パネルは、食事と脳梗塞が微生物群集に与える影響を比較し、群集組成（Bray-Curtis）と分類群の有無（Jaccard）の違いを強調している。

TBIモデルでは、時間のみが有意であった（Bray ADONIS, P<0.01, R2 = 0.09, 残差 = 0.8; Jaccard P<0.001, R2 = 0.8, 残差 = 0.84）。8％LA食はほぼ有意であった（Jaccard ADONIS, P=0.08, R2 = 0.03, Residuals = 0.84）。TBI曝露は有意ではなかった（表5）。
対照的に、UWTモデル（表4）では、食事は8％LA（Bray ADONIS、P＜0.01、R2＝0.06、残差＝0.83）と1％LA（Bray ADONIS、P＝0.01、R2＝0.06）で非常に有意であった。いずれのモデルでも、脳梗塞への曝露はマイクロバイオームのβ多様性に有意な影響を及ぼさなかった。

3.6 食事と時間の組成効果

3.6.1 フィラレベル

線形モデリングにより、実験グループ間でLA濃縮食の効果が異なることがわかった。各菌群レベルでは、[ALA]と[LA]は UWT モデルにおいてのみProteobacteria の存在量に影響を及ぼし、[ALA]は[LA]よりも大きな効果量を示した。暴露はどの門においても有意ではなかった（図 6）。

図6

図 6. scale(abundance)~[ALA]+[LA]+Time+Treatment exposedyes/noの系統レベル線形モデルの推定値。TBIモデル（上段）とUWTモデル（下段）の推定値を示す。開いている円は有意でない予測因子を表す。塗りつぶされた円は有意なモデル予測因子を示す。モデルR2とp値は凡例に示す。ALA、αリノレン酸、LA、リノール酸、TBI、外傷性脳損傷、UWT、水中テスト。

TBI群内の前後Kruskal-Wallisでは、Proteobacteria（1％LA）とBacteroidetes（HC）はTBI曝露により有意に増加したが、Firmicutes（HC）は有意に減少した。これらの所見は偽モデルでは観察されなかった。UWTモデルでは、Actinobacteria（1％LA）、Firmicutes（HC）、Tenericutes（HC）が有意に増加し、Bacteroidetes（HC）が減少した。これらの影響は、偽コントロールでは観察されなかった。

3.6.2 クラスレベル

線形モデリングにより、[ALA]と[LA]は 2 つのProteobacteriaサブクラスに有意な影響を及ぼすことがわかった。TBIモデル（図7、上段）では、Alphaproteobacteriaは[ALA]により有意に減少し、[LA]による影響はわずかであった。UWTモデル（図7、下パネル）では、Gammaproteobacteriaは[ALA]によって有意に増加したが、[LA]の効果はかなり小さかった（図7）。

図7

図7. クラスレベル線形モデルの推定値scale(abundance) ~ [ALA]+[LA]+Time+Treatmentexposedyes/no. TBIモデル（上段）とUWTモデル（下段）の推定値を示す。開いている円は有意でない予測因子を表す。塗りつぶされた円は有意なモデル予測因子を示す。モデルR2とp値は凡例に示す。ALA、αリノレン酸；LA、リノール酸；TBI、外傷性脳損傷；UWT、水中テスト。

Kruskal-Wallis検定によると、TBIモデルでは[LA](n-6 PUFA)強化食でクラスレベルの変化が起こりやすかったが、UWTモデルではその逆であった。TBIモデルでは、Bacilli（1％LA）、Bacteroidia（HC）、およびBetaproteobacteria（HCおよび1％LA）が有意に増加し、Clostridia（1％LAおよび8％LA）とErysipelotrichi（HC）が減少した。これらの効果のうち1つ（Clostridia）だけが、マッチさせた偽コントロールとも共通していた。UWTモデルでは、暴露に関連して、Actinobacteria（8％LA）、Clostridia（HC）、Mollicutes（HC）が増加し、Bacteroidales（HC）が減少した。

3.6.3 目のレベル

モデル化の結果、次数レベルでは、[ALA]と[LA]は腸内細菌類の存在量にのみ有意な影響を及ぼした。TBIまたはUWTへの暴露は、どの目においても有意ではなかった（図8）。

図8

図8. 次数レベル線形モデルの推定値scale(abundance) ~ [ALA]+[LA]+Time+Treatmentexposedyes/no. TBIモデル（上段）とUWTモデル（下段）の推定値を示す。開いている円は有意でない予測因子を表す。塗りつぶされた円は有意なモデル予測因子を示す。モデルR2とp値は凡例に示す。ALA、αリノレン酸、LA、リノール酸、TBI、外傷性脳損傷、UWT、水中テスト。

UWTおよびTBIモデルにおいて、アルファタンパク質細菌の変化はRF32の順序に起因していた。TBIに関連したβプロテオバクテリアの増加はBurkholderialesに起因するもので、1％LA食ではTBI後に有意に増加し、8％LA食ではほぼ有意であったが（p=0.07）、HCでは増加しなかった。Bacilli属のTBI効果は、Lactobacillales属と Turicibacterales属の有意でない曝露後の増加の間にこの傾向が分かれているように見えたが、そのクラスのどのサブアサインメントでも有意ではなかった。さらに、TBI飼料では、バクテロイデス目（HC）とRF32（8％LA、1％LAではほぼ有意 p=0.07）が暴露前と暴露後で有意に増加し、クロストリジウム目（1％LAと8％LA）、エリシペロトリキア目（HC）、RF39（1％LA）が減少した。UWT飼料では、放線菌（1% LA）、Clostridiales（HC）、RF39（HC）が有意に増加し、Bacteroidales（HC）が減少した。特に、Verrucomicrobialesは、偽薬（p=0.053）とUWT（p=0.07）の両HC群でほぼ有意に増加した。

3.7 アウトカム指標に対するマイクロバイオーム組成の影響

3.7.1 フィラレベル

フィラレベルでは、放線菌はEPM閉鎖臥位での滞在時間と14日目のコルチコステロン値に負の影響を及ぼした（表6）。疣贅小胞菌は、UWTモデル内のLDHレベルとEPMクローズドアームでの滞在時間を減少させた。バクテロイデーテス（Bacteroidetes）属はTBIモデルにおいてLDHの上昇と関連していた。腸炎菌は14-dコルチコステロン濃度の有意な低下と関連していた。シアノバクテリアはTBIモデルにおいてのみLDHの上昇と関連していた。UWTモデルとTBIモデルでは、同じ転帰の間で異なる予測因子が選択された。マイクロバイオームに関するエフェクトサイズは小～中程度であり、R2値は食事＋条件モデルのようであった。

表6

表6. 転帰指標のマイクロバイオーム予測因子のステップワイズ特徴選択。

4 考察

4.1 生理学的アウトカム

実験間のWBC、単球、LDH、TG血中濃度の分析から、食事はアウトカム指標に小さいながらも有意な影響を及ぼしたが、治療曝露は影響を及ぼさなかった。有意になった実験変数を検定した回帰モデルのうち、食餌と暴露の効果の大きさは小から中程度であった。3つの実験食は、WBC、LDH、コルチコステロンの上昇、バランスと協調性におけるロータロッド行動の障害に対して高い感受性を示した。両実験におけるこれらの所見から、n-6系PUFAが濃縮されると、脳梗塞への曝露とは無関係に、細胞および免疫学的機能障害に対する感受性が高まる可能性が示唆された。UWTモデルにおいて、食餌性n-6 PUFA濃縮の最大の行動学的効果は、高架式十字迷路の閉鎖armで過ごした時間の増加であった。このことは、これらの動物で認められたように、恐怖行動、要するに不安様行動は、この食餌の特徴に特に敏感である可能性を示唆している。生物学的には、暴露後14日目のコルチコステロンもまた、食餌性n-6 PUFA摂取に有意に影響された。ヒトに存在するコルチコステロンの類似物質であるコルチゾールの縦断的変化は、PTSDでは複雑である。古典的には、ヒト被験者の最初のトラウマの直後、コルチゾールは急上昇し、時間の経過とともに下降する；低コルチゾール血症の程度は、症状の重症度やPTSDの発症と関連している可能性がある（Heimら、2000）。エビデンスのレビューでは、外傷性曝露後の低コルチゾール状態の発現が、少なくともいくつかのPTSDのバイオタイプにおいて重要な因子である可能性が強調されている（Meewisseら、2007年）。コルチゾールとコルチコステロンの産生を調節するコルチコトロピン放出ホルモン受容体（CRH-R）は、非常に感作されやすい。通常、強いCRHネガティブフィードバックシグナルは受容体の感作を解除するが、ある状況が満たされると、受容体はコルチゾール（またはコルチコステロン）の存在に感作されるようになり、その結果、トラウマ障害を患う患者ではコルチゾールの基礎レベルが慢性的に低くなる。このことは、小児期のトラウマが持続的な表現型の変化を引き起こす要因として示唆されており(Toth et al., 2015)、さらなる研究により、CRH-Rsの変異体がトラウマ障害に対する感受性と関連している可能性が示されている(White et al., 2013)。n-6 PUFA実験食が14日目のコルチコステロン濃度を有意に低下させたという我々の知見は、PTSDの危険因子である低コルチゾール血症に寄与する修正可能な食事因子を同定するものであり、臨床的に重要であろう。我々は、n-6 PUFAは、コルチゾールまたはCRH-R感作機序を介して、潜在的にPTSD発症リスクを増加させる可能性のある食事因子であるという仮説を立てた。7-dコルチコステロンの測定値は、UWT曝露モデルにおいて偽泳動ラットよりも有意に低かったことから、この仮説はさらに検討される可能性がある。外傷後のコルチコステロンの増加を捕らえるには、外傷後7日以内に消失している可能性があるため、より高頻度のサンプリングが重要かもしれない。

TBIや外傷は予測不可能に発生し、発生から医療処置までの時間はまちまちである（Mohamadpour et al.）このような曝露後に生じる生物学的カスケードを鈍らせるのに効果的な急性期の受傷後介入を開発することは困難であった（Bramlett and Dietrich, 2015）。これまでの研究で、急性期は長期傷害の重症度を決定する上で生物学的に極めて重要であることが明らかにされている（Prins et al.）曝露直後の生物学的反応の速さを考慮すると、曝露から治療時点までの遅延は、曝露後の治療の有効性を低下させる可能性がある。TBIや心理的外傷の発生率が高い集団（特に軍人）は、予防的介入から最も恩恵を受ける可能性がある。
本研究で用いた群サイズが比較的小さい（n＝8）ため、2つの脳障害条件、すなわち爆風TBIとUWTのもとで、3種類の飼料を摂取した動物の行動障害を一貫して検出することは困難であった。同様に、本試験で用いたTBIモデルは、強度とその影響期間が軽度から中等度である。したがって、ロータロッドにおける有意な行動障害が被爆後6日目にみられなかったことは驚くべきことではない。通常、我々の他の行動研究では、ロータロッドにおける動物の固有能力の個体差を克服するために、1群につき少なくとも16匹の動物を必要とする。同様に、10匹の動物を使った別の研究では、TBI後2日目に、ハウス・チャウ食を与えた動物はロータロッドの待ち時間が30％減少し（p<0.05）、これは6日目までに解消した。従って、2日後のロータロッドのデータを再分析し、ベースラインの成績に正規化することも可能である。UWT曝露動物に対する高架式十字迷路試験もパワー不足であった可能性が高く、オープンアームに代表されるハイリスク環境の回避によって特徴づけられるような、誇張された恐怖反応（「不安」）の増大における行動障害を検出できなかった。しかし、他の研究では、急性心理的ストレス下にある動物は、高架式十字迷路の全アームで探索亢進の徴候（すなわち移動距離）が増加しやすいことを指摘してきた。開腕時間の非同時的な増加は、動物が迷路の中央ゾーン（すなわち、腕の交差点）にいる間、移動することを頻繁にためらうため、部分的に説明することができる。迷路のアーム間の移動の複雑さを反映したこのような問題を排除するために、他の研究者により以下の「不安」指数式を用いてデータが処理されることが多い(Mazor et al., 2009)： 1 - [((open arm time/300-s) + (open arm entries/total entries))/2]. 残念ながら、私たちの研究では、アーム時間のみを記録し、アーム進入イベントの数は記録していない。

4.2 アルファ多様性

アルファ多様性の崩壊は、両研究を通じて実験食でのみ観察された。このことは、食事中のn-6系PUFAの存在がマイクロバイオームの多様性に悪影響を及ぼす可能性を示唆している。このような影響は、偽食群と脳侮辱曝露実験食群の両方で観察されたことから、介入前に6週間の食事馴化期間があったにもかかわらず、交絡変数として時間的影響が残っていたことが示唆された。これまでの研究では、TBI後のマイクロバイオームの状態がTBI後遺症の発症に寄与することが示唆されている（Simonら、2020年）。αの多様性と外傷やTBIの転帰を関連付ける研究はほとんど行われていない。外傷やTBI関連障害発症の危険因子として、発症前のn-6 PUFAの食事状態をさらに評価すべきである。

4.3 ベータ多様性

TBI群とUWT群は独立して解析された。すべての介入を考慮すると、残留変動性が大きかった。実験全体を通じて、8%のLA食と時間がβ多様性に最大の効果を示し、条件は両実験のADONISにおいて有意ではなかった。このことは、偽薬と実験暴露の両方によって群間差が有意に達したが、どちらの実験条件自体もベータ距離に有意な影響を及ぼさなかったことを示唆している。8％LA食で観察された高レベルのn-6系PUFA摂取は、UWTとTBIの暴露にそれぞれ有意かつほぼ有意な影響を及ぼした。このことは、高n-6系PUFA食が、標準的な家畜の餌とは組成的に異なるマイクロバイオームをサポートし、n-3系PUFAとn-6系PUFAのバランスがより良いことを示唆している。これらのベータ多様性効果を総合すると、測定群間、特に食餌間でマイクロバイオーム組成に有意なばらつきがあることがわかる。

4.4 構成と生理学的結果への影響

TBI、UWT、および食事に関連した多くの影響が見られた。観察された主な組成変化はバクテロイデーテス（Bacteroidetes）とプロテオバクテリア（Proteobacteria）であり、UWT曝露によって両者とも減少した。TBI群では、プロテオバクテリアは経時的に増加した。外傷性曝露に関する他の研究では、TBI後にプロテオバクテリアとファーミキューテスが顕著に増加することが見出されている（Nicholson et al.）系統の存在量がTBIの転帰にどのように影響するかを評価する研究は、病変の大きさなど臨床的に関連するいくつかの観察結果がマイクロバイオーム組成によって有意に予測される可能性があることを示唆している。プロテオバクテリア（Proteobacteria）の存在量は、TBI患者の磁気共鳴画像（MRI）病変サイズと正の相関があることが示唆されているが、一方、ファーミキューテス（Firmicutes）は、単一特徴門レベルの線形モデルを用いて逆相関があることが示されている（Nicholson et al. このことはさらに、n-6 PUFA濃縮の観察が、潜在的にモデルをProteobacteriaのアップレギュレーションにさらす可能性があり、TBI後のProteobacteriaの変化の増加を減衰させることが、転帰を改善する可能性があることを示唆している。

n-6 PUFA濃縮食による細菌分類群の増加は、出生前のn-6 PUFA摂取がこの変化に寄与している可能性を示唆している。同様に、抗生物質によるマイクロバイオーム抑制は、亜急性期に投与された場合、TBI後遺症を改善することが判明していることから（Uckun et al.、2015）、分類群（おそらくプロテオバクテリア）の増加は、TBIによって減少する分類群よりもTBI後遺症に寄与する可能性が高いかもしれないが、この仮説にはさらなるエビデンスが必要である。
より詳細な分類分析によると、食餌全体にわたるTBI-曝露モデルにおいて、プロテオバクテリアがベータプロテオバクテリアに強化された。ベータプロテオバクテリアの生物学的関連性には、硫酸塩への硫黄酸化と水素イオン産生を介した環境の酸性化（Watanabe et al.、2019）、および環境硝化が含まれ、環境サンプルにおいてベータプロテオバクテリアの個体数レベルとアンモニアおよびリン濃度との間にR290％を超える関連性があることが研究で見出されている（Martínez-García et al.、2022）。TBIが神経細胞のアンモニア濃度にどのような影響を及ぼすかは不明である。しかし、他の臓器系から得られた証拠によると、循環アンモニアの排泄が阻害されると脳濃度が上昇し、脳浮腫の程度、発作の発生、脳症状が強くなることが示されている（Sharmaら、2024）。これは非常に解釈しやすい結論ではあるが、βプロテオバクテリアがTBIの後遺症に関与している可能性を強く示唆している。このことは、血中アンモニア濃度とTBIとの関係をより明確に理解するために、さらに研究を進める価値があるかもしれない。
UWTモデルでは、線形モデリングにより、曝露によりアルファプロテオバクテリア（Alphaproteobacteria）とアクチノバクテリア（Actinobacteria）が有意に増加した。特にAlphaproteobacteriaは、16S rRNA解析のみで、他の特徴的な細菌遺伝子を調べていないという制約から、この分類をさらに細分化することができなかったため、生態学的機能は不明であった。プロテオバクテリアのサブグループは保存された生態学的役割である程度分類されたが、アクチノバクテリアはそうではなかった。この門は二次代謝産物の強力な調節因子であり、ほとんどメタゲノム制御プロモーターとして働くことが示唆されている（Hoskisson and Fernández-Martínez, 2018）。
結果として得られたモデルには、食事（n-6とn-3 PUFAのバランスを3段階として扱った）と脳梗塞の状態が転帰にどのように影響するかについての最初の評価と同じ数の変数が含まれていた。モデルの顕著な違いは、マイクロバイオーム組成の変動が、食事と脳の状態のみの影響と同等かそれ以上のR2値を示したことである。特徴選択によりモデルが最も適した変数を見つけることができるため、結果が生物学的関連性を示すのか、オーバーフィッティングを示すのかは不明である。
しかし、この方法で同定された特徴は、これまでの研究とほぼ一致している。我々は、Verrucomicrobiaと、LDHの低下および閉腕高位滞在時間の短縮との関連を強調したい。Verrucomicrobiaは粘膜で増殖するムチン依存性の嫌気性菌である。これまでの研究で、Verrucomicrobiaは代謝性疾患の重症度、リポ多糖の循環への移行、炎症の状態と逆相関があることが示されている（Derrienら、2004）。Verrucomicrobiaは、宿主の回復力を向上させる可能性のある微生物叢の候補として、様々な研究によって提示されてきた。免疫調節作用があることが示されており、炎症プロセスを顕著に抑制することが知られているサイトカインである腸内のIL-10発現の増加と関連している（Lindenbergら、2019年）。この微生物群が有益であるという一貫した知見を考えると、この標的を特異的にアップレギュレートすることに関する今後の介入研究が正当化される。この微生物の培養は、その特異的なムチンと嫌気性要件を考えると困難である。したがって、Verrucomicrobiaの存在量を増加させるには、グルコース吸収を低下させる薬剤であるメトホルミン（Pavloら、2023）のようなプレバイオティクスがより効果的かもしれない。
Tenericutes（RF39と RF32にサブ分類される）は、本研究において14日後のコルチコステロン濃度の低下と強い関連があることが示された。一般的に、Tenericutesはマイクロバイオーム中に低レベルで存在するが、生態学的役割は非常に大きい。生物学的には、Tenericutesは酪酸産生菌であり（Vital et al.、2014）、酢酸産生遺伝子の発現が高いが、他の微生物種ではやや一般的な、グリセロールから粘膜刺激物質である過酸化水素を合成する能力はない（Wang et al.、2020）。RF39と RF32は、カルジオリピン産生をコードする遺伝子を持つことでも注目される（Wang et al., 2020）。この代謝産物（ジ-ホスファチジルグリセロール脂質）は、特にグルタミン酸作動性ストレス下で、ミトコンドリア内の酸化プロセスを促進することが示されている（Głombik et al.）コルチコステロンレベルに対するテネリクテスの効果が大きいことを考えると、カルジオリピンなどの既知の代謝産物に対するテネリクテスの効果をさらに調べる必要がある。当然のことながら、TBIモデルとUWTモデルに関連するマイクロバイオームの特徴にはほとんど重複が見られなかった。UWTモデルは神経内分泌機能障害を誘発するようにデザインされたのに対し、TBIモデルは脳の物理的軸索および炎症性傷害を誘発するようにデザインされた。これらの結果を総合すると、軍事に関連した2つのモデルにおいて、n-3からn-6 PUFAの摂取が外傷性後遺症に（たとえわずかであっても）影響を及ぼす可能性があることを示している。
最後に、マイクロバイオームの構成と転帰指標を関連付けるために段階的特徴選択を適用することは、どの分類群の組み合わせが表現型を最もよく説明するかを理解する上で重要な役割を果たす可能性もある。本研究の重要な限界は、検証のためのテストデータセットが利用できなかったことである。今後、他の研究者がラットを用いて、別の確立された外傷性ストレッサー（例えば、逃避不能な足衝撃）または閉鎖性頭部TBI（例えば、側方体液打撲損傷）の方法を用いたマイクロバイオーム研究を行うことで、我々のステップワイズモデルをそれらの方法と比較検証することにより、我々の結果を明らかにできる可能性がある。本研究のもう一つの限界は、1群あたりのサンプルサイズが小さいこと（n=6）と、女性はしばしば性特異的なマイクロバイオーム反応を示すため、男性モデルのみを評価したことである。この研究を繰り返せば、コホート間のベースライン組成のばらつきにより、分類学的に異なる変化が生じる可能性が高い。しかし、食事性PUFAがαおよびβの多様性に有意な影響を及ぼすという同様の結果が得られると予想される。同様に、爆風-TBIおよび急性外傷性ストレス暴露は、フェレットまたはミニブタ（構造的に高次脳、すなわち脳回盲部（折り畳まれた大脳皮質）を有し、より優れた行動能力を持つ）をモデルとして実施すれば、ヒトで発生する暴露と比較し、より良い結果が得られたであろう。また、ラットの腸内細菌叢の組成はヒトのそれとよく一致しないことが知られており、マウスはこの種の研究にとってより優れたげっ歯類モデルと考えられている（Nagpal et al.）従って、我々の研究の興味深い拡張は、神経学的にあまり高度でないマウスを使用するのとは対照的に、モデルとしてラットを使用し続け、2つの脳障害の前に、ヒトに常在し腸の健康を維持することが知られているプロバイオティクス細菌株を経口投与することであろう。
我々は現在、この研究で使われたのと同じ動物から採取した組織を利用した2つのプロジェクトを進めている。最初のプロジェクトは、神経感覚（視覚系）障害の指標として、網膜全体に生じたトランスクリプトーム（遺伝子発現）変化を調べるもので、網膜ニューロン、例えば視細胞やエンドカンナビノイドシグナル伝達などに特異的な数多くのタンパク質や関連するシグナル伝達経路が、TBIとUWTの両方の被爆によって有意に変化し、LAを8en％含むオメガ3欠乏食を与えた動物で最も高い抑制が認められた。同様に、我々は現在、同じ動物から採取した全脳と血漿サンプルのトランスクリプトーム解析を進めており、中枢神経系と全身の変化を調べている。最終的には、腸内細菌叢の変化と、脳、網膜、血漿中のトランスクリプトームとの相関分析を行い、TBIやUWT曝露の発生や行動障害の重症度と密接に関連するバイオマーカー（タンパク質や細菌）を特定したいと考えている。また、将来的には、LC/MS-MS法を用いて、発現タンパク質およびその酵素産物（例えば、エネルギー代謝）の存在量の変化を同定する手段として、これらの組織のトータルプロテオームおよびメタボローム評価を実施し、タンパク質の機能や病理学的状態を引き起こす能力（例えば、リン酸化パターン）を大きく修飾しうる翻訳後修飾における部位特異的アミノ酸シフトを含めて、これらのデータをサポートしたいと考えている。
このプロジェクトでは、PTSD発症の危険因子である副腎皮質機能低下症に、発症前の食事組成が影響を及ぼす可能性があることを明らかにした。現在までのところ、コルチゾールレベルに影響を及ぼす方法として、軍の展開において合理的に使用できるものは限られている。食事のn-6系PUFAを減らすことは有望な方法かもしれない。腸内細菌叢は、TBIやUWTへの曝露よりも食事の状態によって有意に破壊されるようであり、食事がマイクロバイオームシグナル伝達の調節に大きな影響を及ぼすことを強調している。したがって、TBIおよびPTSDの良好な転帰に関連するマイクロバイオームの特徴を同定するためには、さらなる研究が必要である。

データの利用可能性

正規化されたデータファイルは補足資料としてアップロードされている。本論文の結論を裏付ける生データは、著者らにより過度な留保なく入手可能である。

倫理声明

動物実験はWalter Reed Army Institute of Researchの承認を得た。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。

著者貢献

MR：形式分析、原案執筆。JD：概念化、調査、執筆-校閲・編集。NC：調査、執筆-校閲・編集。AH：方法論、執筆-校閲・編集。SM: 方法論、執筆-校閲・編集。JR：方法論、執筆-校閲・編集。AB: データキュレーション、方法論、執筆-校閲・編集。DW: 方法論、執筆-校閲・編集。VS: データキュレーション、執筆-校閲・編集。JL：資金獲得、プロジェクト管理、リソース、執筆-校閲・編集。RH：資金獲得、プロジェクト管理、リソース、執筆-校閲・編集。AG：データ管理、プロジェクト管理、監督、執筆-校閲・編集。

資金提供

著者は、本論文の研究、執筆、および/または発表のために金銭的支援を受けたことを表明する。本研究は、US Army Medical Research Development Command (USAMRDC)/Military Operational Medicine Research Program (MOMRP)からの国防総省補助金（例：プロジェクト番号：19250）の支援を受けた。

謝辞

Marti Jett、Bintu Sowe、Ross J. Campbell、Raina Kumar、William B. Rittase、Micheal J. Covell、Arshiya Dutta。

利益相反

著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない中で実施されたことを宣言する。

発行者注

本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、あるいはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

著者免責事項

本資料はWalter Reed Army Institute of Researchの査読を受けたものである。その発表および/または公表に異論はない。ここに含まれる意見や主張は著者の個人的見解であり、公式なものとして解釈されるものではなく、また米国陸軍省または米国国防総省の真の見解を反映するものでもない。研究は、AAALAC Internationalの認定を受け、Public Health Services Animal Welfare Assuranceを取得した施設において、IACUCの承認を受けた動物使用プロトコールのもと、動物福祉法および実験動物に関するその他の連邦法令を遵守して実施された。

補足資料

本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1430340/full#supplementary-material。

参考文献

Achim Z., Torsten H. (2002). 回帰関係における診断チェック. R News2, 7-10. https://CRAN.R-project.org/doc/Rnews/。

Google Scholar

Alvheim A. R., Malde M. K., Osei-Hyiaman D., Lin Y. H., Pawlosky R. J., Madsen L., et al. 食餌性リノール酸は内因性2-AGとアナンダミドを上昇させ、肥満を誘導する。肥満（シルバースプリング）。20 (10), 1984-1994. doi: 10.1038/oby.2012.38

軍事関連急性外傷性心理ストレスおよび外傷性脳損傷のげっ歯類モデルにおける食餌性オメガ-6脂肪酸強化の効果

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