ノルウェー海域で漁獲されたヨーロッパツノガレイ（Pleuronectes platessa）の筋肉中の微生物群集は光細菌が優勢であり、皮膚およびエラの微生物相、漁期および保存条件とは無関係であること

2023年4月27日 15:38

国際食品微生物学会誌（International Journal of Food Microbiology
第397巻、2023年7月16日、110222号
ノルウェー海域で漁獲されたヨーロッパツノガレイ（Pleuronectes platessa）の筋肉中の微生物群集は光細菌が優勢であり、皮膚およびエラの微生物相、漁期および保存条件とは無関係であること

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0168160523001381?via%3Dihub

著者リンクオープンオーバーレイパネルDionysios Tsoukalas、Sunniva Hoel、Jørgen Lerfall、Anita Nordeng Jakobsen
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ハイライト

皮膚/エラおよびプレイス筋の初期微生物群集は、季節によって変化した。

皮膚/鰓は、新鮮な筋肉や保存された筋肉よりも微生物多様性が高かった。

初期の筋肉微生物相のごく一部は、皮膚/エラからのものでした。

保存条件と時間により、新鮮な筋肉と比較して、多様で明確なコミュニティは形成されませんでした。

光合成細菌がプレイス筋の微生物群集を支配していた。
概要
本研究の目的は、ヨーロッパツノメドリ（Pleuronectes platessa）の皮膚・エラ外部粘膜組織（EMT）および筋肉における初期微生物群集の季節変動（9月、12月、4月）を調査することである。さらに、EMTと新鮮な筋肉微生物相との関係の可能性を検討した。また、漁期と保存条件の違いによる筋肉内の微生物群集の変化も調査した。保存実験のために選択した季節は9月と4月である。調査した保存条件は、真空または改良雰囲気（70 % CO2、20 % N2、10 % O2）で包装されたフィレと、冷蔵/冷凍条件（4℃）であった。氷上（0℃）で保存された全魚は、商業的な標準として選択された。EMTとプレイス筋の初期微生物群集に季節的な変動が検出された。4月に捕獲されたプレイスのEMTと筋肉で最も高い微生物多様性が認められ、次いで12月と9月に捕獲されたプレイスのEMTと筋肉の微生物群集の形成に環境因子が重要な役割を果たすことが示された。EMTの微生物群集は、新鮮な筋肉サンプルよりも多様であった。EMTと初期の筋肉微生物群集の間で共有される分類群の数が少ないことから、筋肉微生物相のごく一部がEMTから由来しているに過ぎないことが示された。EMTの微生物群集では、すべての季節でPsychrobacterとPhotobacteriumが優勢な属であった。Photobacteriumは、初期の筋肉微生物群集を支配していたが、9月から4月にかけてその存在量は季節的に徐々に減少した。保存期間と保存条件により、新鮮な筋肉と比較して、多様で明確なコミュニティは形成されなかった。しかし、保存期間の中盤と終盤では、群集の間に明確な分離は見られなかった。EMT微生物相、漁期、保存条件にかかわらず、保存筋サンプルの微生物群集はPhotobacteriumが支配的であった。特定腐敗生物（SSO）としてのPhotobacteriumの優勢は、筋肉の初期微生物相におけるその高い相対的存在量とCO2耐性に起因していると考えられる。本研究の結果は、プレイスの微生物腐敗にPhotobacteriumが大きく寄与していることを示すものである。したがって、Photobacteriumの急速な増殖に対応する革新的な保存技術を開発することは、高品質で保存性の高い便利な小売用プライス製品の生産に貢献する可能性がある。
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ヒラメ
外部粘膜組織
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特定の腐敗菌
便利なリテール商品

はじめに
世界の水産物消費量は、1960年代の一人当たり年間平均9.9kg（活魚換算）から、2020年には20.2kgに倍増した（FAO, 2022a）。世界人口の増加に伴い、海洋は増加する食料需要に対処する主要な貢献者の1つになると予測されている（OECD, 2016）。したがって、水産業界は、人気のない、あるいは利用されていない海洋種を利用することにもっと力を入れるべきでしょう。
ヨーロッパツノガレイ（Pleuronectes platessa）は、北海で最も広く分布するヒラメの一種であり（Madsen et al.、2013）、デンマークでは非常に消費量の多い魚介類である。しかし、タラやサバ（Scomber scombrus）のような消費者に好まれる魚種と比較すると、ほとんどのヨーロッパ諸国では市場での入手可能性と価値は低い（FAO、2022b）。ノルウェーは、過去30年間の総水揚げ量が230万トンから245万トン（全魚類換算）で、ヨーロッパ大陸の海洋捕獲生産量第2位であるにもかかわらず（FAO, 2022a）、2021年のプライスの総水揚げ量はわずか794トンである（漁業総局、2022）。さらに、ノルウェー海のプライス資源は、最新の魚類移動パターンに基づき、今後数年間は増加すると予想されている（EC, 2020）。したがって、ノルウェーの漁業にとって、プライスは十分に利用されていない海洋資源であり、より広い規模で商業利用できる可能性があると考えられています。また、養殖業者がノルウェーでプレイスの繁殖を始めたことから、プレイス養殖への関心も高まっている。このように、ノルウェーの経済にとって新たな収入源となり、海洋魚資源の持続可能な管理に貢献することが期待されます。
プレイスは栄養価の高い魚とされているが（Kendler et al., 2023）、その微生物組成や保存安定性については、あまり広く調査されていない。Dalgaardら(1997)は、低温で改良された大気圧プレイス切身における特定腐敗生物（SSOs）としてPhotobacterium phosphoreumを特定した。さらに、Zottaら（2019）は、大気チルド保存中の解凍したプレイス切身における微生物群集の動態を調査し、腐敗したプレイスの微生物相は主にPseudomonasによって支配されており、PhotobacteriumとShewanellaは新鮮な筋肉と腐敗した筋肉の微生物群集に存在しないかマイナー成分であると結論づけています。さらに、Tsoukalasら（2022）は、低温保存と適切な包装方法において、プレイスが満足のいく物理化学的および微生物的品質を示すことを発見した。
魚が生息する環境は、皮膚、エラ、腸に存在する、獲れたての魚の常在細菌叢を形成する。特に、魚の皮膚やエラの外部粘膜組織（EMT）は、環境に対する物理的な障壁であり（Minich et al., 2020）、侵入する魚の病原体に対する防御の第一線として機能する（Guivier et al., 2020）ため、最も重要である。しかし、EMTの微生物相は、切り身にする際に魚の筋肉に移行することがあるため、EMTは魚製品の微生物汚染の重要な原因となっている（Hauptmannら、2020年；Zhuangら、2021年）。EMTのいくつかの一般的なコロナイザーは、Photobacterium、Pseudoalteromonas、Psychrobacter、Flavobacterium、およびPseudomonas（Gilbertら、2012；Larsenら、2015；Taoら、2012；Wilsonら、2008）で、これらは鮮魚の肉にも見られる可能性があります（Boziaris and Parlapani, 2017；Zottaら、2019）。上記の属とは別に、鮮魚の筋肉の微生物群集は通常、Shewanella、Acinetobacter、Aliivibrio、Corynebacteriumなどのいくつかのグラム陰性およびグラム陽性菌で構成されている（Gram and Dalgaard、2002）。
いくつかの魚種において、常在細菌叢の組成の季節変動が報告されている（Larsen et al., 2013; Larsen et al., 2015; Minich et al., 2020; Wegner et al., 2012; Wilson et al., 2008）．また、海水温、体長、遺伝的背景、地理的起源、食事、宿主の健康状態、外部寄生虫の存在、飼育環境も、初期の常在細菌群を形成しうる（Chiarelloら、2019；Jayら、2005；Parlapaniら、2018；Rosadoら、2019）。さらに、魚は、魚の接触面、非魚の接触面、人員などに由来する外因性微生物叢によって死後汚染される可能性がある（Sheng and Wang, 2021）。
初期微生物叢の質的・量的組成と保存中の微生物継代は、水産物の品質と保存安定性に重要な役割を果たす。特に、野生捕獲魚のEMT微生物相を調査した研究はわずかであり（Larsen et al., 2013; Larsen et al., 2015; Lokesh and Kiron, 2016; Minich et al., 2020; Svanevik and Lunestad, 2011; Tarnecki et al., 2016; Wilson et al, 2008）、EMT微生物相はさらに調査が必要な研究領域であることが示されています。また、水産物の保存中にSSOを含む微生物群集を形成する上で、包装雰囲気や保存温度が大きく影響することがいくつかの研究で示されています（Anagnostopoulos et al., 2022; Gram and Dalgaard, 2002; Hovda et al., 2007a; Macé et al., 2012; Powell and Tamplin, 2012）。
以前の研究では、低温で保存された空気、真空、および改良された雰囲気のパッケージングされたプライスにおいて、好気性プレートカウントのラグフェーズと同様に、精神栄養型好気性プレートカウントとH2S生成バクテリアの進化における季節変動を示した（Tsoukalasら、2022年）。この観察から、微生物群集の組成の季節変動が、季節間の微生物数の違いに関連しているのではないかという疑問が生じた。さらに、EMTと新鮮な筋肉微生物群の間の微生物群集組成の動態と、それらが漁期によってどのように影響を受ける可能性があるかは、新鮮な筋肉の汚染源を調査する上で第一に重要であると考えられる。我々の知る限り、北欧で漁獲されたEMTとプレイスの初期微生物群集の季節変動と、それが異なる保存条件下での微生物継承にどのように影響するかを調査する研究は行われていない。微生物群集をモニタリングし、SSOを特定することは、付加価値の高い小売用プレイス製品の開発において、製品の品質安定化と保存期間延長に不可欠である。
そこで、本研究ではプレイスのEMTと筋肉初期微生物群集の季節変動（9月、12月、4月）を調査することを目的としました。さらに、EMTと新鮮な筋肉微生物相の間の潜在的な関連性を調査した。さらに、漁期と保存条件に影響されるプレイス筋肉中の微生物群集の組成を調査した。保存実験のために選択された季節は、9月と4月であった。プレイス切身は、真空または改良雰囲気（70 % CO2、20 % N2、10 % O2）のいずれかで包装され、4℃で保存された。氷上（0℃）で保存された丸魚は、ノルウェー市場で最も一般的なプレイス取引の形態であるため、商業的標準として選択された。
材料と方法
2.1. 原材料と実験計画
2020年9月（S）、2020年12月（D）、2021年4月（A）にノルウェー西海岸（約62.75°N、6.51°S）で地元漁師が巻き網で捕獲したプレイス（Plaice）を使用した。海水温はそれぞれ13℃、8.7℃、5.4℃であった。魚は即座に殺され、EMTサンプルが採取された。その後、魚は内臓を取り、氷スラリーを入れた発泡ポリスチレンボックスに包装し、12時間以内に実験室に運び、さらなる処理まで氷上で保管し、Tsoukalasら（2022）の説明に従って2日目（48±6時間）に包装した。
実験デザインは、3つの異なる季節（9月（S）、12月（D）、4月（A））における初期のEMTおよび筋肉（M）微生物群集を研究するように設定された（図1A）。このデザインにより、EMT-S、EMT-D、EMT-A、M-S、M-D、M-Aの6グループができた。さらに、漁期と保存条件がプライスマッスルの微生物群集の継承に及ぼす影響を調べるために、要因デザインを設定した（図1B）。調査した季節は、9月（S）および4月（A）である。プレイス切身は、真空（10mbar、VP-SおよびVP-A）および改良雰囲気（70％CO2、20％N2、10％O2、ガス：製品比1：2、MAP-SおよびMAP-A）に包装し、4℃で保存した。商業的標準（0℃）を表す対照群として、氷上の全魚（WI-SおよびWI-A）を選択した。
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図1. 初期微生物群集研究（A）、保存実験（B）、サンプリングタイムライン（C）のための実験セットアップ。外部粘膜組織-9月（EMT-S）；外部粘膜組織-12月（EMT-D）；外部粘膜組織-4月（EMT-A）；生鮮筋肉-9月（M-S）；生鮮筋肉-12月（M-D）；生鮮筋肉-4月（M-A）；Whole fish on ice-9月（WI-S）；真空包装フィレ-9月（VP-S）；大気圧包装フィレ-9月（MAP-S）；氷上全魚-4月（WI-A）；真空包装フィレ-4月（VP-A）；大気圧包装フィレ-4月（MAP-A）．0日目および2日目に、さらなる分析のために、それぞれ外部粘膜組織（n = 7）および新鮮な筋肉（n = 3）からサンプルを採取した。2日目（48±6時間）に、Tsoukalasら（2022）の記載に従って、魚をさらに処理し、パッケージングした。筋肉サンプル（n = 3）は、10日目、14日目、17日目および20日目にさらなる分析のために採取された。
VP-SおよびVP-Aは、20μmのポリアミド（PA）／70μmのポリエチレン（PE）バッグ（160×200mm、23℃で酸素透過率（OTR）50cm3／㎡×24時間×バー、スターパックプロダクト、ボワシー＝レイルリー、フランス）内に包装された。MAP-SとMAP-Aを230mLの半硬質結晶性ポリエチレンテレフタレート（CPET）トレー（C2125-1B、OTR 66-78cm3×25μm/m2×24h×bar at 23℃、Færch Plast、ホルステブロー、デンマーク）に入れた。トップフィルム（40μmのPE、エチレンビニルアルコール（EVOH）、PAおよびPET）（Topaz B-440 AF、OTR 2.5 cm3 × 40 μm/m2 × 24 h × atm at 23℃、Plastopil、Almere、The Netherlands）をトレーの密閉に使用した。
プレイス切身（MAP-SおよびMAP-A）の改質雰囲気包装の際、6個のダミー（製品を含まない密閉パッケージ）も使用した。ダミーのガス組成は、O2およびCO2分析装置（Checkmate 9900 analyser, Dansensor）を用いて測定し、すべてのプレイス切身の包装中に正しいガス混合設定が使用されていることを確認した。最初の包装ガス組成（2日目）は、MAP-S（CO2 = 70.3 ± 0.4 %、O2 = 10.3 ± 0.1 %、N2 = 19.4 ± 0.1 %）とMAP-A（CO2 = 70.3 ± 0.3 %、O2 = 10.0 ± 0.1 %、N2 = 19.7 ± 0.5 %）でした。また、4日目、7日目、10日目、14日目、17日目、20日目に、プレイス切身を入れた密閉トレーのガス組成を3連で測定した（n = 3）。
2.2. サンプリングおよび微生物学的分析
サンプリングタイムラインのグラフサマリーを図1Cに示す。シーズンごとに7尾（n = 7）を漁獲後30分以内に無作為に選択し、ウェットワイプクロス（4121C、Sodibox、La Forét-Fouesnant, France）を用いてそのEMTからサンプルを収集した。布はエラと側面の粘液層を拭き取るために使用された。サンプリング後、布を元のプラスチック袋に戻し、輸送のために密封し、4℃で保存し、24時間以内に分析した。布サンプルは、滅菌ペプトン水（1.0 g bacteriological peptone and 8.5 g/l NaCl）で1：10まで希釈し、Stomacher 400 Lab Blender (Seward Medical Ltd., 145 UK) で120秒間強力にホメジ化した。10倍連続希釈液をプレーティングの前に調製した。2日目（48±6時間）に、さらなる微生物分析のために、M-S、M-D、およびM-A（シーズンごとにn＝3）の筋肉試料を採取した。さらに、WI-S、WI-A、MAP-S、およびMAP-A処理（各処理につきn＝3）のサンプルは10日、14日、および20日に、VP-SおよびVP-A処理（各処理につきn＝3）は10日、14日、および17日に収集された。魚の筋肉の10gのサンプルを無菌ストマッカーバッグに移し、滅菌ペプトン水で1：10に希釈し、ストマッカーで120秒間マッシュした。10倍に連続希釈した試料から0.1 mlを、塩分を必要とするP. phosphoreum (NMKL No. 184, 2006)を含む精神栄養型好気性海洋細菌の増殖を支持する1 % NaClのLong and Hammer agar (LH) 上に撒いた。プレートは15℃で6日間インキュベートした。1%NaClを含むTryptic Soy Agar (TSA) (Oxoid)を用いて、単一コロニーを再増殖・分離した。プレートは15℃で3日間インキュベートした。
2.3. シングルコロニーの単離と同定
LH寒天培地プレートの1/4を覆うセクターのコロニーをすべて摘出し、TSA上で最低5回再繁殖させた。分離したコロニーのDNAは、DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Oslo, Norway)のグラム陰性菌用プロトコルを用いて抽出した。ユニバーサル16S rRNAプライマー338f（5′CCTACGGGAGGCAGCAG 3′）（Muyzer et al., 1993）および1492r（5′GGTTACCTTGTTACGACTT 3′）（Turner et al., 1999）を用いて、16S rRNA遺伝子のV3-V9領域のサンガー配列決定をすべての分離株について実施した。PCR反応は、1×PCR緩衝液（1.5mM MgCl2）、各ヌクレオチド200μM、各プライマー0.4μM、2.5U Taq polymerase（Qiagen）および50〜100ngテンプレートDNAを含む25μlリアクションで行った。PCR増幅サイクルは以下の通りである： 95℃で15分間の初期変性、95℃で60秒間の変性、58℃で30秒間のアニーリング、72℃で60秒間の伸長を25サイクル行い、72℃で5分間の最終伸長を行った。増幅されたPCR産物の5μlの画分を、1×Tris-acetate-EDTA buffer (Sambrook and Russell, 2001)中の1.5 %アガロースゲル上で実行し、産物のサイズが正しいことを確認した。残りの20μlの産物をGeneJET PCR purification Kit (Thermo Scientific, Vilnius, Lithuania)を用いて精製した。DNA濃度は、PowerWaveXS, BioTek® (Winooski, USA)を用いた分光光度計で測定した。サンプルは、GATC Biotech社のLightRun Sanger sequencing用の説明書に従って調製した。配列の同定は、BLASTNを使用し、NCBIデータベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）で現在利用可能な配列と比較した。
2.4. 16S rRNAアンプリコンシーケンスによる微生物群集の解析
細菌群集分析用のDNAは、ホモジナイズしたサンプル（滅菌ペプトン水で1：10）から抽出した。1:10で希釈したEMTまたは魚の筋肉サンプルの各パラレル5mlを別々の滅菌遠心分離管に無菌的に移し、83×gで5分間、20℃で遠心分離して魚の粒子を除去した。上清を新しい滅菌遠沈管に移し、2061×gで15分間、20℃で遠心分離を行った。最後に、ペレットを1mlの滅菌ペプトン水に再懸濁し、滅菌エッペンドルフチューブに移し、6160×gで20℃、5分間遠心分離した。上清を慎重に捨て、ペレットは、PowerFood® DNA isolation kit (MoBio Laboratories Inc., Carlsbad, CA, USA) を用いて、供給者の指示に従ってDNA抽出に使用した。同一サンプルの各パラレルから抽出したDNAは、実験のばらつきを減らし、信頼性を高めるためにプールした（Parlapani et al.、2018）。プールされた抽出ゲノムDNAは、使用するまで-80℃で保存した。DNA濃度はPowerWaveXS, BioTek®を用いた分光光度計で測定し、その完全性は1 %アガロースゲルの電気泳動で評価した。次世代シーケンス（NGS）に基づくサンプルの分類学的解析には、Eurofins Genomics（Eurofins Genomics Germany GmbH、Ebersberg、ドイツ）のINVIEW Microbiome Profiling 3.0を選択し、同社の標準手順によるバイオインフォマティクス解析も含まれました。16S rRNA遺伝子のV3-V4超可変領域（約445 bp）を配列決定し（Illumina MiSeq）、細菌の運用分類単位（OTU）を特定しました。V3-V4領域の増幅には、プライマーペア16S_f（5′TACGGGAGCAGCAG 3′）と16S_r（5′CCAGGTATCTAATCC 3′）（Kisand et al., 2002; Turner et al., 1999）が用いられた。配列はデマルチプレックスされ、プライマーはクリップされ、フォワードリードとリバースリードがマージされ、マージされたリードはクオリティフィルタリングされた。微生物群集解析の第一段階として、塩基が曖昧なリード（"N"）をすべて除去した。キメラリードは、VSEARCHパッケージ（Rognes et al., 2016）に実装されているUCHIME（Edgar et al., 2011）のデノボアルゴリズムに基づいて識別および除去された。残りの高品質リードのセットは、最小エントロピー分解（Eren et al., 2013; Eren et al., 2015）を用いて処理された。最小エントロピー分解（MED）は、マーカー遺伝子データセットをOTUに分割する計算効率の良い手段を提供する。各OTUに分類学的情報を割り当てるために、クラスター代表配列の配列データベースへのDC-MEGABLASTアラインメントを行った（Altschul et al., 1990）。OTUと分類学的割り当てのさらなる処理は、QIIMEソフトウェアパッケージ（バージョン1.9.1、http://qiime.org/）を用いて行った（Caporaso et al., 2010）。細菌分類単位の存在量は、推定値を改善するために、関連するマーカー遺伝子の系統特異的なコピー数を用いて正規化した（Angly et al.、2014）。
2.5. 微生物多様性の指標と統計解析
微生物群集の構成は、属レベルで評価した。Goodのカバレッジとレアファクションカーブを計算することで、十分なシーケンス深度を推定した。α-多様性は、Chao1種富度推定器（Chao, 1984）とShannon指数（Shannon, 1948）により評価した。β多様性はBray-Curtis類似度（Bray and Curtis, 1957）で推定し、Bray-Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）による順序付けを行い、サンプル間の類似性／非類似性と微生物群集の発達を可視化することができた。シーケンスの深さ評価、属の豊かさおよび遺伝的多様性の推定は、Past 4.02ソフトウェア（Hammer et al.、2001）を用いて行った。ベングラフは、属レベルで共有および/または固有のOTUの対比較を描写するためにInteractiVennオンラインツール（Heberle et al.、2015）を用いて作成した。細菌群集の動態と構成をよりよく理解するために、サンプルの微生物群集プロファイルの類似性と不一致を表す階層的クラスタリングヒートマップを、Metaboanalyst 5.0 platform (Pang et al., 2021)を用いて構築しました。階層的クラスタリングの計算には、内蔵のWardの連鎖クラスタリング法を用い、行と列間の距離の計算にはユークリッド・アルゴリズムを用いた。すべての棒グラフは，各サンプル内の存在量推定値として100 %に正規化されているため，パーセントは各サンプルの真のバイオマス分率を反映していない。MAPグループのガス組成の統計分析は、IBM SPSS統計ソフトウェア（リリース28、IBM Corporation、米国）を用いて実施した。MAPグループ間の有意差は、Tukeyのペアワイズ比較テストと組み合わせた一元配置ANOVAによって分析された。有意水準は5 %（P < 0.05）に設定された。
結果
3.1. 外粘膜組織の微生物組成
イルミナMiSeqシーケンスにより、合計296,024本の生シーケンスリードを生成した。品質管理処理（生リードのフィルタリング、ノイズ除去、キメラ除去）後、260,814リードが得られ、サンプルあたり71,744～101,506の範囲で、OTUに割り当てられました。希薄化曲線はすべてのサンプルで約1800配列でプラトーに達し、高いGood's coverage (>0.99) はすべてのサンプルで細菌OTUの高いカバー率を示しており、微生物多様性の評価は信頼できると考えられる。さらに、データセットで観測されたOTUの数とChao1指数には適合性があり、細菌の多様性のほとんどが我々の解析によって得られたことを示している（Hughes et al., 2001）。
EMT微生物群集のα多様性は漁期によって影響を受け（表1）、4月に最も高い多様性が観察され、次いで12月と9月のサンプルが観察された。EMT-AサンプルのOTUsリッチ度が最も高く、次いでEMT-S、EMT-Dだった（表1、図2A）。EMTサンプルでは、18属（18.4 %）のコアグループがすべての季節で共有されていた。9-12月、9-4月、12-4月で共有されるOTUの割合は低かった（8.2 %）。
表1. 異なる漁期で漁獲され、異なる保存条件および異なる保存時間で保存されたプレイスの外部粘膜組織（EMT）、新鮮筋肉組織（M）および保存筋肉組織（WI、VP、MAP）微生物群集の多様性指標。
組織名品質管理後の読み取り値属性の豊富さChao1Shannon外部粘膜組織Day 0 EMT-S82,20348492.101 EMT-D71,74442452.226 EMT-A101,50668712.918
新鮮な筋肉組織Day 2 M-S75,0609101.119 M-D77,10512131.293 M-A87,08217191.593
貯蔵筋組織Day10 WI-S14,412660.610 VP-S11,436440.177 MAP-S10,930550.265 WI-A11,978660.649 VP-A14,999330.182 MAP-A12,400330. 141Day 17/20a WI-S13,052660.529 VP-S11,676330.173 MAP-S19,368220.101 WI-A13,965440.460 VP-A13,546330.181 MAP-A12,215220.141
外部粘膜組織-9月 (EMT-S); 外部粘膜組織-12月 (EMT-D); 外部粘膜組織-4月 (EMT-A); 生筋肉-9月 (M-S); 生筋肉-12月 (M-D); 生筋肉-4月 (M-A); 丸ごと氷上魚-9月 (WI-S)；真空包装された切り身-9月（VP-S）；修正された大気包装された切り身-9月（MAP-S）；氷上の全魚-4月（WI-A）；真空包装された切り身-4月（VP-A）；修正された大気包装された切り身-4月（MAP-A）.
a
保存試験は、VPグループ17日、WIグループとMAPグループ20日で終了しました。
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図2. 異なる漁期で漁獲されたプレイスの外部粘膜組織（EMT）（A）および新鮮な筋肉組織（M）（B）のユニークおよび共有OTUの分布を示すベン図である。16S rRNAアンプリコンシーケンスによる微生物群集解析による。外部粘膜組織-9月（EMT-S）；外部粘膜組織-12月（EMT-D）；外部粘膜組織-4月（EMT-A）；新鮮筋-9月（M-S）；新鮮筋-12月（M-D）；新鮮筋-4月（M-A）．
漁期に関係なく、細菌門のプロテオバクテリアが最も多く、EMT-S、EMT-D、EMT-Aの微生物群集のそれぞれ83.5 %、69.8 %、61.3 %を占めた。Bacteroidetesは2番目に多い門（3.8-23.5 %）で、Firmicutes (1.9-2.3 %)、 Actinobacteria (0.7-1.8 %)、Fusobacteria (0.1-0.4 %)がいずれの季節でも続いている。属レベルでは、最も豊富な36の分類群（相対存在量1.0 %以上）に季節変動が見られた（図3A）。コア微生物群のうち、Photobacterium、Vibrio、Psychrobacter、Pseudoalteromonas、Alistipes、Chryseobacterium、Arthrobacterは最も変動が大きかった。EMT-Sの微生物群集は、主にPhotobacterium（42.4 %）、Psychrobacter（18.3 %）、Vibrio（12.0 %）、Pseudoalteromonas（4.8%）で構成されています。また、ShewanellaとArthrobacterの相対存在量は、他の2つの季節よりも9月に高かった。PhotobacteriumとVibrioは、Psychrobacterが優勢な他の季節では、かなり少ない量であった。EMT-Dサンプルでは、Psychrobacter（40.1%）以外に、Photobacterium（8.9%）、Alistipes（5.7%）、Parabacteroides（4.7%）、 Psychromonas（3.4%）、Pseudoalteromonas （3.0%）、 Flavobacterium（3.0%）、 Janthinobacterium（2.8%）、 Paracoccus（2.7%）がよく知られている分類群である。EMT-Aの微生物相を構成する68の最も豊富な属のうち、Psychrobacter（21.4%）とJanthinobacterium（16.9%）が優勢であり、Photobacteriumの存在量はわずか2.1%であった。さらに、EMT-Aサンプルでは、EMT-DおよびEMT-Sと比較して、Pseudomonas (6.0 %)、Flavobacterium (6.0 %)、Psychromonas (4.0 %)、Chryseobacterium (2.6 %)の相対存在度が高かった。
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図3. 異なる漁期で漁獲され、異なる保存条件および異なる保存時間で保存されたプレイスの外部粘膜組織（EMT）（A）、生鮮筋肉組織（M）（B）および保存筋肉組織（WI、VP、MAP）（C）における上位36属レベルの分類群の相対存在量（相対存在量1.0 %以上）のコミュニティ・バープロット・ググラフを示す。結果は、16S rRNAアンプリコンシーケンスによる微生物群集解析による。外部粘膜組織-9月（EMT-S）；外部粘膜組織-12月（EMT-D）；外部粘膜組織-4月（EMT-A）；新鮮筋肉-9月（M-S）；新鮮筋肉-12月（M-D）；新鮮筋肉-4月（M-A）；Whole fish on ice-September (WI-S)；真空包装フィレ-9月（VP-S）、真空包装フィレ-9月（MAP-S）、氷上フィレ-4月（WI-A）、真空包装フィレ-4月（VP-A）、大気包装フィレ-4月（MAP-A）。
*保存試験は、VP群では17日間、WI群およびMAP群では20日間で終了した。
階層型クラスタリングヒートマップは、EMTサンプルのすべての細菌属が、季節によって相対量がダイナミックに変化し、季節ごとに異なる微生物群集を形成していることを明確に示しています（図4）。さらに、Bray-Curtis類似度に基づくPCoAオーディネーションを行い、3つの異なる季節のEMTと新鮮な筋肉を表す異なるサンプルの細菌群集を比較し、2つの釣り季節の筋肉サンプルと様々な雰囲気下で保存したものを比較しました（図5）。第1主座標と第2主座標では、属レベルでの累積分散割合がそれぞれ50.2 %と31.3 %を占めた。EMTの微生物群集は、季節に関係なく、新鮮な筋肉や貯蔵された筋肉の微生物群集とは明らかに異なっていることがわかった。さらに、EMT-SおよびEMT-Dサンプルは、EMT-Aサンプルよりも高い微生物群集の類似性を示した（図4）。
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図4. 異なる漁期で漁獲され、異なる保存条件および保存期間で保存されたプライスの外部粘膜組織（EMT）、新鮮筋組織（M）および保存筋組織（WI、VP、MAP）間の微生物群集プロファイルの類似性と不一致を表す階層的クラスタリングヒートマップです。ヒートマップは、外部粘膜組織、新鮮筋組織、貯蔵筋組織に存在するすべての属レベルの分類群に基づいて作成されたが、上位45属レベルの分類群（相対存在度1.0％以上）のみが図に含まれている。結果は、16S rRNAアンプリコンシーケンスによる微生物群集の解析に基づくものです。外部粘膜組織-9月（EMT-S）；外部粘膜組織-12月（EMT-D）；外部粘膜組織-4月（EMT-A）；新鮮筋肉-9月（M-S）；新鮮筋肉-12月（M-D）；新鮮筋肉-4月（M-A）；Whole fish on ice-September (WI-S)；真空包装フィレ-9月(VP-S)、大気圧包装フィレ-9月(MAP-S)、氷上フィレ-4月(WI-A)、真空包装フィレ-4月(VP-A)、大気圧包装フィレ-4月(MAP-A). 保存試験は、VPグループは17日、WIとMAPグループは20日で終了した。
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図5. 異なる漁期で漁獲され、異なる保存条件および異なる保存時間で保存されたプレイスの外部粘膜組織（EMT）、新鮮筋肉組織（M）および保存筋肉組織（WI、VP、MAP）に存在する微生物群集の主座標分析（PCoA）。結果は、16S rRNAアンプリコンシーケンスによる微生物群集の分析による。外部粘膜組織-9月（EMT-S）；外部粘膜組織-12月（EMT-D）；外部粘膜組織-4月（EMT-A）；新鮮筋肉-9月（M-S）；新鮮筋肉-12月（M-D）；新鮮筋肉-4月（M-A）；Whole fish on ice-September (WI-S)；真空包装フィレ-9月(VP-S)、大気圧包装フィレ-9月(MAP-S)、氷上フィレ-4月(WI-A)、真空包装フィレ-4月(VP-A)、大気圧包装フィレ-4月(MAP-A). 保存試験は、VP群では17日間、WI群およびMAP群では20日間で終了した。
EMTの最初の精神栄養学的プレートカウント分析から、合計270の分離株が回収・同定された。動物門レベルでは、動物門の豊富さと相対的な存在量に関して、サンプル間でわずかな季節変動が観察されただけであった。ほとんどの分離株はプロテオバクテリア門に分類され、9月（95.0%）から4月（82.0%）にかけて相対存在量が減少することが確認された。バクテロイデーテス門に属する細菌はすべての季節で分離されたが、その相対量は年間を通じて主要な門に比べ低かった（5.0-16.0 %）。さらに、4月のEMTサンプルでは、少数のActinobacteria（2.0 %）が検出された。属レベルでは、9月（5属）から4月（8属）にかけて豊富さが増加した（図6A）。EMT-Sサンプルの分離コロニーではビブリオ属が圧倒的に多かったが（分離株の57.0 %）、他の2シーズンでは検出されなかった。EMT-D（50.0%）とEMT-A（47.0%）では、配列に基づく群集組成と同様にPsychrobacterが最も豊富であった。さらに、フラボバクテリウムはEMT-D（8.0%）よりもEMT-A（15.0%）で相対的に多く、EMT-Sサンプルでは検出されなかった。PseudomonasとArthrobacterの分離株は、EMT-Aの微生物叢にのみ検出された。
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図6. 異なる漁期で漁獲され、異なる保存条件で保存されたプライスの外部粘膜組織（60 EMT-S; 60 EMT-D; 150 EMT-A）（A）、新鮮筋肉組織（30 M-S; 30 M-D; 60 M-A）（B）および14日間保存筋肉組織（各処理につき30）（C）から分離したシングルコロニーの相対存在度。外部粘膜組織-9月（EMT-S）；外部粘膜組織-12月（EMT-D）；外部粘膜組織-4月（EMT-A）；新鮮筋肉-9月（M-S）；新鮮筋肉-12月（M-D）；新鮮筋肉-4月（M-A）；氷上の全魚-9月（WI-S）；真空包装された切り身-9月（VP-S）、大気圧で包装された切り身-9月（MAP-S）、氷上の全魚-4月（WI-A）、真空包装された切り身-4月（VP-A）、大気圧で包装された切り身-4月（MAP-A）。
3.2. 新鮮な筋肉組織の微生物組成
イルミナMiSeqシーケンスは、合計282,700の生シーケンスリードを生成し、そのうち233,886が品質管理を通過してOTUに割り当てられました。希釈曲線、Good's coverage（>99.8 %）、観察されたOTU数、Chao1（表1）に基づき、シーケンスされたサンプルの微生物多様性の特徴付けは満足できるものであったと推測されます。新鮮な筋肉の微生物相に季節変動が見られ、EMTサンプル（3.1）と同様に、4月に最も高い多様性が観察された（表1）。
16S rRNAアンプリコンシーケンスによる微生物群集分析では、3つの季節で群集組成が高度に重複し、8属のコアグループ（44.4 %）が季節間で共有されていた（図2Bおよび図4）。新鮮な筋肉に存在する微生物は3つの異なる門に属し、季節間の相対的な存在量に目立った季節変動はなかった。すべての季節で最も優勢な門はプロテオバクテリアで、微生物相全体の83.0-85.0 %を占めた。次に多いのはバクテロイデーテス門（8.6-12.7 %）、次いでアクチノバクテリア門（3.4-6.0 %）で、すべての季節において、この門が最も多く存在した。
属レベルでは、Photobacterium、Arthrobacter、Corynebacterium、Flavobacterium、Chryseobacterium、Shewanella、Psychrobacter、Aliivibrioがコアグループを構成している。光細菌は、すべての季節で筋肉微生物相の支配的な分類群であり、その相対量はM-S、M-D、M-Aサンプルでそれぞれ73.2 %、68.0 %、56.4 %であった（図3B）。また、Psychrobacterの相対量は、M-Sで4.2 %、M-Dで9.2 %、M-Aで13.2 %の範囲であった。Aliivibrio、Vibrio、Arthrobacter、Chryseobacterium、CorynebacteriumはM-Sで他の季節より高い相対存在度を示した。また、Shewanellaの相対量は、12月の筋肉サンプルで最も高かった。M-Aの初期微生物相では、PsychrobacterとFlavobacteriumがM-SとM-Dより高い割合を占めていた。キュルビバクター、シェゲレラ、リゾバクターはM-DとM-Aでは低濃度であったが、ビブリオがM-SとM-Aで検出された。
EMTサンプルと同様に、M-SとM-Dの微生物群集は、M-Aから分離して一緒になっていた（図4）。各シーズンのEMTサンプルと新鮮筋サンプルの間で共有されるOTU（5-7属）の数が比較的少ないため（データは示さず）、微生物群集は2種類の組織の間で大きく異なっていた（図5）。新鮮筋と貯蔵筋の組織サンプル間では、EMTサンプルよりも高い微生物群集の類似性が認められたにもかかわらず、新鮮筋と貯蔵筋の間の群集構造は明らかに異なっていた（図4）。
新鮮な筋肉の最初の精神栄養学的プレートカウント分析から、合計120の分離株が検索され、同定されました。すべての季節において、Bacteroidetesが優勢であり（44.0-56.0 %）、次いでProteobacteria（28.0-36.0 %）、Actinobacteria（8.0-20.0 %）が続いた。属レベルでは、Photobacterium、Aliivibrio、Flavobacterium、Chryseobacterium、Arthrobacterがいずれの季節でも鮮魚筋肉微生物叢に存在した（図6B）。しかし、各属の相対的な存在量は季節によって異なっていた。Chryseobacteriumは9月から4月にかけて減少し（M-S 44.0 % vs M-A 8.3 %）、Flavobacteriumは9月から4月にかけて増加した（M-S 12.0 % vs M-A 46.7 % ）。M-Aの微生物相は6.7%のPhotobacteriumで構成されていたが、M-SとM-Dの両サンプルではその割合は12.0%であった。また、初期の筋肉微生物相には、すべての季節に存在しないいくつかの属が含まれていました。LuteimonasとRhodococcusはM-SとM-Dの微生物相にのみ含まれ、SalinibacteriumとPsychrobacterはM-DとM-Aにのみ存在した。注目すべきは、M-AではPsychrobacterが2番目に多い属（16.7 %）であったことである。また、M-S（4.0 %）とM-A（3.3 %）のサンプルでは、Shewanellaと同定された株が少数存在した。
3.3. 様々な保存条件下における保存筋肉組織の微生物組成
漁期（9月と4月）および保存条件（WI、VP、MAP）の関数として、プレイス筋の微生物群集の継承を調査した。すべてのサンプリング日において、CO2、O2、N2濃度にMAP-SとMAP-Aフィレの間に有意差は認められなかった（P＞0.05）。初期ガス組成（MAP-S：CO2 = 70.3 ± 0.4 %，O2 = 10.3 ± 0.1 %，N2 = 19.4 ± 0.1 %，MAP-A: CO2 = 70.3 ± 0.3 %，O2 = 10.0 ± 0.1 %，N2 = 19.7 ± 0.5 %）は両シーズンの2日目と4日目で著しく変化した（p ＜ 0.05 ）（補足表 1）。その後、保存試験10日目までガス濃度の平衡が得られた（P > 0.05）。10日目のCO2、O2、N2濃度は以下の通りであった： 48.9±0.7%、13.4±0.4%、37.7±0.3%（MAP-S）、46.9±1.2%、12.3±0.4%、40.8±0.9%（MAP-A）。10日目から保存期間終了まで、O2濃度は減少（P < 0.05）し、CO2とN2濃度は増加（P < 0.05）しました。20日目には、MAP-Sの切り身は54.0 ± 0.4 %、4.6 ± 0.4 %、41.4 ± 0.3 %（CO2：O2：N2）、MAP-Aの切り身は52.7 ± 1.7 %、3.7 ± 0.4 %、43.6 ± 1.9 %（CO2：O2：N2）だった。
Illumina MiSeqシーケンスにより、合計198,965の生シーケンスリードが生成された。品質管理（159,977）後に得られたリードは、サンプルあたり10,930～19,368の間で、OTUに割り当てられました。配列深度は十分で、OTU数、Chao1（表1）、Good's coverage（100 %）の観測値から、細菌の多様性を得ることに成功した。
一般に、微生物多様性は、両漁期において、VPおよびMAP群よりもWI群でわずかに高かったが（表1）、季節や保存雰囲気にかかわらず、保存終了時には群集構造は同様の構造へと収束していた。新鮮な筋肉では、Photobacteriumが最も豊富な属であり（56-73 %）（図3B）、その存在量は異なる包装雰囲気と季節を表すすべてのサンプルで増加し（図3C）、89-98 %の相対存在量で終了した。
さらに、Psychrobacter、Pseudomonas、Shewanella、Flavobacterium、Vibrioは、両シーズンともWIサンプルのごく一部であった。季節や保存条件とは無関係に、新鮮な筋肉の微生物群集は、保存試験の中間（10日目）と終了（17/20日目）において、WI、VP、MAPグループと明確に分離していた（図4、図5）。
異なる条件（WI、VP、MAP）で14日間保存したプレイス切身の精神栄養学的プレートカウント分析から、異なる漁期（9月と4月）に漁獲された魚について180の分離株が収集された。塩基配列に基づく群集解析の結果、分離株の大部分（82 %）がPhotobacterium属に分類された（図6C）。Photobacteriumは、すべての保存条件と季節のサンプルで優勢な属であり、MAPサンプルで最も高い相対存在率（> 90 %）が確認された。Photobacteriumのほか、Aliivibrio属がMAPとVPのサンプルから少数ながら分離された。Psychrobacter、Shewanella、Flavobacterium、Pseudoalteromonasは、両シーズンのWIサンプルで検出されました。
考察
本研究では、細菌組成と生物多様性の代表的な画像を得るために、培養依存法と独立法を組み合わせて、異なる保存条件下におけるプレイスとその後継の初期EMTおよび筋肉微生物群集の季節変動を調べることに焦点を当てた（Kuuliala et al, 2018; Parlapani et al, 2018; Zotta et al, 2019）. いずれかの方法の落とし穴と限界のために、いくつかの属の相対的な存在量を評価する方法間の不一致が観察されました（Cardinali et al., 2017; Ercolini, 2013; Mayo et al., 2014）。特に、多くの細菌が培養不可能である一方、他の細菌が培養液中でよりよく適応し、他の細菌属を凌駕するため、培養依存法を用いて分離・同定された属は少なかった（Mayo et al.、2014）。MAP群におけるガス組成の進化は、筋肉組織の水相へのCO2の高い溶解度（Sivertsvik et al., 2004）だけでなく、細菌および酵素活性（Debevere and Boskou, 1996; Torrieri et al., 2006）により予想されていた。
その結果、EMTの微生物群集は、9月から4月にかけて微生物多様性が増加し、時間の経過とともに弾力的かつダイナミックに変化することが示された。季節の変わり目に核となる分類群が存在することは、EMT微生物群集の弾力性を示している。しかし、属の相対的な存在量の季節変動とユニークなOTUの存在は、微生物群集が季節的な動的変化にさらされていることを示す。EMTの微生物多様性の季節変動は、これまでにも北海で捕獲されたプレイス（Wegner et al.、2012）や大西洋のタラ（Wilson et al.、2008）において報告されている。皮膚とエラは、外部の生物学的および生物学的な構成要素に直接さらされているため、それらに関連する微生物群集は、おそらく周囲の水の細菌学的組成の一部を反映している（Pratte et al.、2018；Uren Webster et al.、2018年）。自由生活型の海洋細菌群集の組成は、海水温の季節変動、栄養の利用可能性、天候パターン、陸上流出、日長、大気沈着、藻類の発生、成層などの物理的および化学的要因によって影響を受ける（Fuhrman et al.、2015）。
野生捕獲の海洋魚種のEMTに関連する最も頻繁に報告されるフィラは、Proteobacteria、Bacteroidetes、Actinobacteria、Firmicutesです（Lokesh and Kiron, 2016; Merrifield and Rodiles, 2015; Mohammed and Arias, 2015）。今回のEMTの結果と比較すると、Proteobacteriaが優勢で、FirmicutesとActinobacteriaの相対存在量が同レベルであることが、いくつかの魚種のEMT微生物群集に報告されています（Ghotbi et al., 2022; Larsen et al., 2013; Larsen et al., 2015; Lokesh and Kiron, 2016; Reverter et al., 2017; Tarnecki et al., 2016; Wegner et al., 2012）．
Photobacterium属は、海洋環境から自由生活者として一般的に分離され（Eilersら、2000；Heidelbergら、2002）、魚（野生捕獲のプレイスを含む）の皮膚やエラから分離される（Gadoinら、2022；Ghotbiら、2022；Larsenら、2015；Minichら、2020；Smithら、2007；SvanevikとLunestad、2011；Wegnerら、2012；Wilsonら、2008）。興味深いことに、本研究では、培養依存法を用いた場合、どのEMTサンプルからもPhotobacteriumは検出されなかったが、培養非依存法ではその存在を検出した。同様に、培養に依存しない方法では、筋肉サンプルにおいて光細菌の相対的な存在量が高いことも明らかになりました。特に、P. phosphoreumは熱に弱く、NaClを必要とし、栄養学的に潔癖であるため（Dalgaard et al., 1997）、その検出（Macé et al., 2013）や定量（Olofsson et al., 2007）は困難です。Van Spreekens (1974) は、0.5 %のNaClを含むLH寒天を用い、15℃で7日間培養することでP. phosphoreumを定量的に検出した。さらに、P. phosphoreumは、15℃で7日間培養したスプレッドプレーティングLH寒天と鉄寒天（いずれも1 % NaCl含有）でも定量できる（Dalgaardら、1997；López-Caballeroら、2002年）。他のいくつかの研究では、1～3 %のNaCl濃度がPhotobacteriumの増殖に有利であると言及している（Emborg et al., 2002; Farmer and Hickman-Brenner, 2006; Moi et al., 2017）。しかし、Shewanella、Vibrio、Aliivibrio、Pseudoalteromonasを含む他の海洋グラム陰性細菌もNaCl含有培地で増殖し、Photobacteriumの増殖を上回るかもしれない（Broekaert et al., 2011）. さらに、コンダクタンスに基づく培養法（Dalgaard et al., 1996）やPCRに基づく検出法（Macé et al., 2013）を用いて、P. phosphoreumの定量的な算出が行われている。
EMT-DやEMT-Aと比較してEMT-Sで光細菌の相対存在量が高いのは、海水温や栄養分の季節変動に起因しているのかもしれない。Wegnerら（2012）は、海水温が高いほどPhotobacteriumの相対存在度が高くなることを報告している。さらに、Photobacterium damselaeは寒冷海域の魚類の微生物相ではあまり報告されていないが、魚の皮膚に付着して増殖することができるため、その存在を否定することはできない（Finlay and McFadden, 2006）。しかし、EMTに存在するPhotobacteriumのどの種が、異なる環境条件下でどのような影響を受けるかを確認するためには、さらなる研究が必要である。
海水温の季節変動は、いくつかの魚種におけるVibrio、Pseudoalteromonas、Flavobacterium、Pseudomonasの相対存在量に影響を与えることが報告されている（Gilbertら、2012；Larsenら、2015；Martin-Plateroら、2018；Taoら、2012；Wilsonら、2008）。EMT-Sと比較して、EMT-AおよびEMT-DにおけるPsychrobacter、PsychromonasおよびJanthinobacteriumの相対存在量の増加は、これらの属の高度親水性（Bozalら、2003；Hosoyaら、2008）および耐精神性（Logan、1989）に起因し得る。
魚の筋肉の微生物品質は、EMTの微生物群集の構成によって影響を受ける可能性がある。フィレやデシニングの際にEMTから肉が汚染されることは避けられないからである。すべての良好な衛生習慣が守られ、新鮮な筋肉組織サンプルの収集のために無菌環境が確保された実験室規模であっても、EMTと最初の魚の筋肉微生物群集の間に低い共有分類群が見つかり、筋肉微生物相のごく一部がおそらくEMTから来たことを示す。しかし、新鮮な魚の筋肉とEMTにおけるそれらの相対的な存在量の観察された不一致は、他のソースも魚の筋肉の微生物汚染に責任があることを示しています。
健康な魚の肉はほぼ無菌であり、死後の微生物汚染の程度は、いくつかの環境要因（水温、漁期、漁法、水の微生物学的品質など）、魚固有の要因および捕獲後の処理に依存します（Broekaert et al., 2017）。捕獲後の処理の微生物汚染リスクを評価する場合、捕獲から処理までの時間軸は極めて重要である。処理の遅れは、EMTの微生物数を増加させ、結果として筋肉への交差汚染を引き起こす可能性があります。多くの魚種（プレイスも含む）は氷上で丸ごと取引されるため、EMTからの汚染リスクを認識する必要がある。しかし、無傷の皮膚は微生物の侵入を防ぐバリアとなり、二次汚染から筋肉を守ることができる（Poli et al., 2006）。
海洋種の腸は、様々な魚種の腸の正常な微生物叢に存在することから、Photobacteriumの最も一般的な生息地と考えられる（Dalgaard et al., 2006; Dalgaard et al., 1997; Figge et al., 2014; Haygood, 1993; Thyssen and Ollevier, 2015; Van Spreekens, 1974）. さらに、いくつかの研究では、野生捕獲された海洋魚種の腸内微生物群集にPhotobacteriumを発見している（Bjornsdottir-Butler et al., 2016; Gonçalves et al., 2022; Le Doujet et al., 2019; Makemson and Hermosa, 1999）。Photobacteriumがプレイス筋の初期微生物群集を優勢にすることを考えると、腸と腸は新鮮な筋組織の汚染の最も可能性の高い原因である可能性がある。しかし、肉類の汚染源となりうる場所を特定するためには、さらなる研究が必要である。
予想通り、漁期の影響は、新鮮な筋肉組織よりもEMTの微生物相に顕著であった。EMTサンプルのように、相対存在量の少ない属が多く含まれる多様性の高い微生物群では、季節的な環境変動が微生物の多様性に顕著な変化をもたらすと考えられる。新鮮な筋肉組織については、M-A細菌群集はM-SおよびM-D試料よりも多様であり、EMT微生物群集の観察と一致する。すべての季節において、新鮮な筋肉における分類群数の少なさとそれに続く微生物の多様性の低さは、プレイスが健康であり、取り扱い後の大規模な汚染が回避されたことを示す。
北大西洋や北海の冷温帯水域の魚の筋肉の初期微生物相は、通常、プロテオバクテリア（Pseudomonas、Acinetobacter）に属する様々な親精神的および親栄養的グラム陰性細菌で構成されています、 Moraxella、Psychrobacter、Shewanella、Photobacterium、VibrioおよびAliivibrio）およびBacteroidetes門（Flavobacterium）ならびにActinobacteria門（ArthrobacterおよびCorynebacterium）を含むグラム陽性細菌（Boziaris and Parlapani, 2017； Gram and Dalgaard, 2002）。本研究では、すべての季節の筋肉の初期微生物群集においてPhotobacteriumが優勢であったことは、冷たい海で捕獲された魚にこの属が多く存在するという報告（Jääskeläinenら、2019；Skírnisdóttirら、2021）に一致する。しかし、Photobacteriumは通常、本研究で報告された相対的な存在量よりも、冷水魚種の筋肉の初期微生物相のより小さな割合を構成する（Antunes-Rohlingら、2019; Kuulialaら、2018）。Zottaら（2019）も、解凍したプレイス切身におけるPhotobacteriumの低存在率（≦0.7 %）を報告した。しかし、Photobacteriumは凍結に対して明らかに敏感であり（Guldager et al.、1998）、したがって、解凍した切り身ではより低い有病率が予想される。また、9月から4月にかけての鮮魚の筋肉におけるPhotobacteriumの優勢度の減少は、EMTと同じ季節パターンを示し、海水温が低いとPhotobacteriumは優勢でなくなることが示された。
本研究結果と同様に、Chryseobacterium、Flavobacterium、Psychrobacter、Shewanella、Arthrobacterも、野生および養殖の大西洋タラ（Hovda et al., 2007a; Kuuliala et al., 2018; Skírnisdóttir et al, 2021）、プレイス（Zotta et al, 2019）およびハドック（Reynisson et al, 2010）などの冷たい海で獲られた魚の初期の微生物群集に含まれると報告されてきた。また、VibrioはEMTの微生物叢の一部であったため、皮膚由来である可能性がある。しかし、魚の筋肉は、内臓除去時に糞便由来のビブリオで汚染される可能性がある（Svanevik and Lunestad, 2011）。
漁獲されたばかりのプレイスの初期微生物群集には季節的な変動が見られたものの、漁期は保存中の微生物群集組成やWI、VP、MAP群の継代に大きな影響を与えなかった。新鮮なプライスの筋肉に含まれるPhotobacteriumの高い相対的存在量は、すべての保存条件においてこの細菌分類群の急速な成長と優位性の決定的な重要な要因であった。
一方、保存期間は、多様性の低い群集の形成に寄与し、群集組成は、保存期間の中間日（10日）と最終日（17/20日）で非常に似ていた。SSOが他の属を駆逐し、腐敗した魚介類の微生物群集を支配するため、鮮魚に比べて腐敗した魚の属の豊かさが減少することはよく知られています（Anagnostopoulos et al., 2022; Chaillou et al., 2015）。本研究では、すべての保存条件において、Photobacteriumが支配的な細菌分類群であった。
寒冷な温帯海域を原産とする空気貯蔵魚は、溶けた氷の上での貯蔵中に主にShewanellaによって、二次的にPseudomonas種によって腐敗する（Dalgaard、2003；GramとHuss、1996）。P. phosphoreum は、腸詰めのセイスやプレイスなど、好気的に保存されたすべての海産魚種から検出された (Dalgaard et al., 1997)。しかし、P. phosphoreum は、14 日間の空気保存後、腸詰めのプレイスでは、全生存数のごく一部であったため、SSOs として考慮しなかった（Dalgaard et al., 1997）。一方、Van Spreekens (1974) は、好気性腐敗したタラやプライスに P. phosphoreum が優勢であることを報告している。さらに、Photobacterium は、冷蔵保存中の空気保存された養殖オヒョウ（Hovda et al.、2007b）および大西洋タラ（Hovda et al.、2007a）において支配的分類群として言及されている。空気保存された魚介類におけるPhotobacteriumの優勢な要因に関する文書はないが、Photobacteriumは通性好気性細菌であり、好気性呼吸の高いエネルギー変換率を示し、代謝プロセスに酸素を使用する（Hauschild et al.、2021）。また、Photobacteriumは、その初期相対量が高い場合、他の細菌分類群に勝り、好気性冷凍保存魚の微生物群集を支配することができると考えることもできる。しかし、Photobacteriumの初期レベルと、空気保存されたチルド魚のSSOとしての役割との関連性を確立するためには、さらなる研究が必要である。
さらに、北の海の真空またはMAP魚は、通常、P. phosphoreum、様々な乳酸菌（LAB）およびBrocothrix thermosphactaによって優勢になる（Boziaris and Parlapani、2017）。Devlieghere and Debevere（2000）は、食品マトリックス中の溶存CO2濃度とP. phosphoreumの最大比増殖速度の低下との間に線形関係を報告したが、Dalgaard（1995a）は、グラム陽性細菌に匹敵し得る魚製品上でのその高いCO2耐性を述べた。CO2の溶解度は高温で低下することから（Sivertsvik et al., 2004）、P. phosphoreumは高温で保存された魚介類のSSOsとなる可能性もある（Dalgaard et al., 1997）。さらに、Dalgaardら（1997）は、様々なMAP海産魚種を低温で保存した場合の腐敗微生物相において、P. phosphoreumが優勢であることを報告した。特に、MAP（45 % CO2、5 % O2、50 % N2）中で0℃で保存されたプレイス切身では、P. phosphoreumカウントが6.3 log cfu/g以上であった。本研究でVP群とMAP群で観察されたPhotobacterium優勢は、真空包装されたタラのフィレ（Dalgaard et al、 1993）、およびサイテ（Dalgaardら、1997）、オヒョウ（Hovdaら、2007b）、タラ（Dalgaardら、1993；Guldagerら、1998；Hovdaら、2007a）、コアフィッシュ（Rudiら、2004）およびヘイク（Antunes-Rohlingら、2019）などのMAP貯蔵魚がある。
4月（WI-A、VP-A、MAP-A）の心理栄養型好気性プレート数（PC）は、9月のグループ（WI-S、VP-S、MAP-S）よりも有意に高いことがわかった（Tsoukalas et al.、2022）。また、VP群の平均PCおよび好気性プレート数（APC）は、WI群およびMAP群よりも短期間でピーク値に達した（VP：10日目 vs WI/MAP： 20日目）。本研究の結果と我々の過去の結果（Tsoukalas et al., 2022）を組み合わせると、光細菌がPCの主要な部分を構成していると考えるのが妥当である。さらに、漁期や保存条件にかかわらず、APCではH2S産生菌が優勢であった（Tsoukalas et al.、2022）。しかし、H2S産生菌数は、一般的に考えられているH2S産生菌Shewanella株と関連付けることはできなかった。この属は、本研究のすべての保存条件において、保存筋肉組織の微生物群集に存在しないか、相対量が少ない状態で見出されたからである。Dalgaard (1995b) は、腐敗したパックドタラに含まれる少量の硫黄化合物の生産に P. phosphoreum が寄与していることを述べている。様々な雰囲気下で保存されたサンプルの微生物群集はPhotobacteriumが優勢であったことから、PhotobacteriumのH2S生産能力の可能性は否定できず、さらなる調査が必要であると考えられる。
P. phosphoreumは、Shewanella putrefaciensに比べて細胞あたり10-100倍の量でトリメチルアミンN-オキシド（TMAO）をTMAに還元できることから、効率的なトリメチルアミン（TMA）生産者である（Dalgaard et al., 1996）。PhotobacteriumがH2S生成に寄与する可能性があると仮定すると、その優勢はさらにプレイスの官能特性に影響を与える可能性がある。本研究および以前の研究（Tsoukalas et al.、2022）の結果から、プレイスは9月よりも4月の方が微生物の質が低いことが提唱されている。すべての包装雰囲気で光細菌がSSOであったことを考慮すると、MAP（70 % CO2、20 % N2、10 % O2）と低温保存（4℃）の組み合わせ、または氷上（0℃）の魚全体のいずれかが、真空包装のプレイス切り身よりも長い時間、より良い微生物品質となる可能性があると考えられます。しかし、MAPフィレの製造は、利便性の高い使用と物流の面で、氷上での魚全体よりも比較優位性がある（Tsoukalasら、2022年）。
我々の結果は、初期の微生物群集組成が、獲れたての魚の微生物品質の主要な指標となり、水産物を優勢にして腐敗させる可能性のあるSSOを大きく決定し得ることを実証した。本研究の結果は、冷水性海洋魚種におけるSSOとしてのPhotobacteriumの重要性を確認するものである。したがって、Photobacteriumの急速な増殖を防ぐための革新的な保存方法を開発することは、便利な小売プレイス製品の賞味期限延長のための貴重な知見を与えることになる。
結論
漁期はEMTと初期筋の微生物相に大きな影響を与え、9月と12月よりも4月に高い微生物多様性が観察された。新鮮な筋肉は、すべての季節において、EMTよりも多様な微生物群集が少なかった。EMTと新鮮筋の微生物群集を比較すると、エラや皮膚の微生物相は新鮮筋の汚染の主な原因ではないことがわかった。新鮮な筋肉の微生物群集におけるPhotobacteriumの優位性と保存された筋肉におけるその継承は、便利な小売プレイス製品の微生物腐敗にPhotobacteriumが重要な貢献をすることを示す。したがって、様々な条件下でのPhotobacterium分離株の増殖速度や腐敗の可能性を詳細に調査することで、細菌の代謝活動やプレイスの官能特性に関する理解を深めることができると考えられる。
以下は、この論文に関連する補足データである。
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補足表1. 異なる漁期で漁獲された改良型大気圧包装プレイス（70 % CO2, 10 % O2, 20 % N2）のヘッドスペース濃度（%）（平均±標準偏差）の変化。
利益相反の宣言
著者らは、本論文で報告された研究に影響を及ぼすと思われる競合する金銭的利益や個人的な関係がないことを宣言するものである。
謝辞
本研究は、ノルウェー科学技術大学（NTNU）（ノルウェー、トロンハイム）のOPTiMATプロジェクトの助成を受けた。プレイスのEMTからサンプルを採取してくれたSophie Kendler、技術支援をしてくれたNTNUの食品科学部門の技術スタッフ、漁船で専門知識と手助けをしてくれた漁師に感謝したい。
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