食物繊維は軟骨細胞の活性維持に役立つかもしれない

2024年5月14日 08:45

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オリジナル研究論文
フロント Cell. Infect. 2024年5月13日
Sec.腸内マイクロバイオーム
第14巻-2024年｜https://doi.org/10.3389/fcimb.2024.1401963
この論文は次の研究テーマの一部です
宿主-微生物相互作用の制御における食事介入の役割-第2巻

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食物繊維は軟骨細胞の活性維持に役立つかもしれない
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2024.1401963/full?utm_source=dlvr.it&utm_medium=twitter

Ying Wu1,2,3† XiangJie Li1,3† Hao Meng1 Ying Wang2,3 Peng Sheng2,3 YongNing Dong2,3 Ju Yang2* BingQian Chen4* XueSong Wang1,2,3* 1 整形外科学講座
1中国江蘇省無錫市江南大学附属病院整形外科
2中国江蘇省無錫市江南大学附属病院栄養科
3中国江蘇省無錫市、江南大学無錫医学院
4中国江蘇省常熟市第一人民病院スーチョー大学付属常熟病院整形外科
腸-骨軸の関連についての理解は年々深まっているが、そのメカニズムはまだ明らかではない。本研究では、腸-骨軸におけるセストリン2（SESN2）経路の役割を解析した。Sprague-Dawley（SD）ラットに前十字靭帯切断（ACLT）法を用いて変形性関節症（OA）モデルを確立し、その後食物繊維含有量を変化させた食事介入を8週間行った。腸内細菌叢の16S rRNA配列決定により、高食物繊維（HDF）摂取がBacillota優位の腸内細菌叢を有意に増加させることを見出した。一方、酵素結合免疫吸着法（ELISA）と組織学的解析から、HDFの介入により骨・関節病変と炎症の程度が軽減されることが示された。我々は、HDFがバチロタの優占細菌叢を増加させ、膝関節におけるSESN2の発現をアップレギュレートし、腸の透過性を低下させることで、全身の炎症反応と骨・関節病変の程度を軽減させたと仮説を立てた。したがって、本研究は、食物繊維の摂取量増加による腸内細菌叢の変化が、膝関節におけるSESN2発現のアップレギュレーションを促進し、軟骨細胞の活性を維持し、滑膜の炎症を抑制することにより、OA発症を遅延させることを確認した。

1 はじめに
変形性関節症（OA）は、軟骨の劣化、関節の炎症、関節機能の低下を特徴とする、蔓延性の退行性関節疾患である（Loeserら、2012；Yaoら、2023）。最近の研究の進歩は、主にOAにおける軟骨変性と滑膜炎症の解明に焦点を当てている（Kapoorら、2011；Paesaら、2023）。これまでの研究では、Wnt/β-カテニン（Wnt/β-catenin）、核因子-κB（NF-κB）、成長因子トランスフォーミング成長因子βおよび骨形態形成タンパク質（TGFβ/ΒΜP）、線維芽細胞成長因子（FGF）経路など、いくつかのシグナル伝達経路がOAの発症に関与していることが示唆されている（Yao et al.）これらの経路を総合的に検討した結果、アデノシン一リン酸（AMP）活性化プロテインキナーゼ（AMPK）、ラパマイシンキナーゼ（mTOR）、ラント関連転写因子2（RUNX2）といった主要な制御因子の重要性が浮き彫りになった。SESNファミリーの必須メンバーであるSESN2は、高度に保存されたストレス誘導性タンパク質であり、DNA損傷、ミトコンドリア機能不全、酸化ストレスの影響を受けやすい。多くの研究により、SESN2が上記の重要な制御経路において重要な役割を果たしていることが確認されている（Hou, 2015）。さらに、これまでの研究では、オートファジーを促進し（表1）、活性酸素の凝集を抑え、細胞増殖を遅らせ、細胞活性をアップレギュレートする上で、SESN2が重要な役割を果たしていることが実証されている（Budanov, 2010）。これに基づき、研究者らは、軟骨細胞の機能に影響を及ぼすmTOR活性の制御を主因として、OA存在下でSESN2の発現が有意に抑制されることを立証し、OAにおけるその本質的な役割を証明した（Shen et al.）

表1
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表1 大腸組織におけるタイトジャンクション分子のRT-PCRプライマー配列。

SESN2の発現レベルは、生物の重要なシグナル伝達経路の方向性に影響を及ぼすが、その発現が腸内細菌叢の組成の変化に影響されやすいことも報告されている。運動が腸内細菌叢組成に及ぼす影響を調べた研究では、運動によって酪酸産生糞便細菌の増加が促進され、酪酸産生によって酪酸-SESN2/CRTC2経路が活性化され、その結果、脂質代謝が改善されることがわかった（Yu et al.）対照的に、SESN2の切除は、腸内細菌叢に対する運動の有益性を覆い隠した（Yuら、2023）。運動や加齢など腸内細菌叢の組成に影響を及ぼす因子は、OA発症にも影響を及ぼし、SESN2は、おそらく腸-骨軸をつなぐ中心的メディエーターとして、これらすべての因子に関与している（O'Toole and Jeffery, 2015; Cho et al.）

Ceylan Tanesらは、食物繊維が腸内細菌叢の構成に大きな影響を与えることを示し、異なる食事を比較した際に食物繊維が短鎖脂肪酸（SCFA）の主要な供給源であることを強調した（Tanesら、2021）。我々の研究により、食物繊維は腸内細菌叢の組成を変化させることで、OAに対する非侵襲的な治療法を提供できることが明らかになった。このアプローチは、従来の薬物や外科的介入に代わる安全で簡便な選択肢を提供するものである。さらに、腸-骨軸における低悪性度慢性炎症の重要な役割も明らかになった。Schottらは、肥満マウスにオリゴフラクトースを補充することで、腸内細菌叢がOAにおける炎症反応を調節できることを報告した（Schottら、2018）。K.H.コリンズらは、脂肪組成を変化させた食餌がSDラットのOA発症に及ぼす影響を調べた。注目すべきは、腸内細菌叢が、主に内臓脂肪を介した炎症反応を通じて、肥満に関連したOAを悪化させる可能性があることを発見したことである（Collinsら、2015）。さらに、Huangらは、OA重症度の低い無菌マウスやメタボリックシンドロームマウスにおいて、2ストライクモデルが手術誘発OAを悪化させることを示した（Huangら、2020）。このことは、OA治療における多因子相乗効果のための興味深いアプローチとして、腸内細菌叢の調節の可能性を浮き彫りにしている。OAの病態は、加齢や体重増加に伴う糖尿病や高血圧などの代謝障害と関連していることが多い。これらの病態は、慢性炎症、酸化ストレス、細胞アポトーシス、細胞機能障害を引き起こし、OAをさらに悪化させる（Musumeci et al.）

我々は、食物繊維の量を変化させた食餌を投与し、SESN2遺伝子の発現とOA重症度との関係を調べた。実験の結果、食物繊維の補給は腸内細菌叢の組成を改善し、バチロータ門が優占する花形組成を形成することが明らかになった。バチロタ門優位の腸内細菌叢組成は、全身性炎症の軽減と関節におけるSESN2の発現増加の促進を通じて軟骨細胞の活性維持に寄与し、OA病態の発症を遅延させた。これらの知見は、OAにおける腸内細菌叢とSESN2遺伝子発現制御を標的とした介入の可能性に理論的根拠を与えるものである。

2 材料と方法
2.1 実験動物と研究デザイン
本研究では、江南大学医学部動物センターで飼育された特定病原体不検出（SPF）の6週齢雄性ラットを用いた。動物は12時間の明暗サイクルで飼育された。8匹ずつ3群に分けた。糞便サンプルは定期的に採取し、細菌組成をモニターするために送付した。さらに、同じ施設内の特定の病原体フリー動物施設で、年齢をマッチさせたSDラットを繁殖、飼育、収容した。すべての実験動物は同じ明暗サイクルを経験し、同じ餌と水を摂取した。すべての動物実験は、江南大学動物飼育使用委員会の承認を受け、Chinese Association for Laboratory Animal Sciences Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animalsの勧告に従った。ACLT手術は、バリア環境で1週間馴化した後に行われた。すべてのラットは死亡することなく、無事にモデル化手術を受けた。その後、8週齢でさらに1週間観察した後、ラットを3群に分けた：普通食（NDF）群、中等度食物繊維（MDF）群、高食物繊維（HDF）群。各群には、徐州医科大学での腸脳軸に関する先行研究（Shiら、2021年）から確立された栄養学的割合を参照して決定された、あらかじめ指定された割合の食物繊維が投与された。専用飼料はシナジー・バイオ社が以下の仕様に従って製造した。HDF食は、20％の植物性多糖類と、トウモロコシ、大豆、小麦、オート麦を含む微生物性炭水化物の実質的な存在からなる組成を特徴とした。中等度繊維食はHDF食の組成を反映しているが、繊維含量は15％に減少している。逆に、NDF食は5％の食物繊維を含み、腸内微生物のアクセス性が低下していた。

手術によって誘発されたOAの発症と進行をモニターするために、介入後2、4、6、8週目に疼痛評価を行った。これらの評価は、江南大学医学部動物センターの制御されたバリア環境内で行われた。糞便サンプルは介入初期、中間、最終段階で採取された。その後、8週間の実験期間を経て、血液、大腸、肝臓、膝関節、その他の組織を含む生物学的サンプルを採取し、さらなる分析を行った。

2.2 結腸の組織学的解析
炎症細胞の浸潤を測定し、大腸組織の局所炎症を評価するために、ラットの遠位結腸を一様に保存し、ヘマトキシリン・エオジン（H&E）染色を行った。簡単に説明すると、遠位結腸を摘出し、4％パラホルムアルデヒドで固定した後、パラフィン包埋した。ここから4μmの切片を作成し、H&E染色を行った。染色後、光学顕微鏡に取り付けたデジタルカメラ（Zeiss, Oberkochen, Germany）で顕微鏡写真を撮影した。画像はその後、病理組織学的評価に供された。この評価では、2つのパラメータを中心に、確立されたスコアリングシステムを利用した：上皮スコア（E）は、0（形態学的に正常な上皮を示す）、1（カップ細胞の消失を示す）、2（カップ細胞の広範な消失を示す）、3（陰窩の消失を示す）、または4（陰窩の広範な消失を示す）を包含し、浸潤スコア（I）は、0（浸潤なしを示す）を包含する、 1（陰窩の基底部周囲への浸潤を示す）、2（粘膜の筋層に達する浸潤を示す）、3（粘膜肥厚の筋層に達する広範な浸潤を示し、豊富な浮腫を伴う）、または4（粘膜下層への浸潤を示す）を包含する。組織学的総スコアは、上皮細胞スコアと浸潤スコアの合計（総スコア＝E＋I）として計算され、0～8の範囲となった（Kimら、2017）。

2.3 タイトジャンクション分子の遺伝子発現解析
腸内細菌叢の構成と腸管透過性の関係は表裏一体である。腸管透過性を決定的に評価するため、RT-PCR解析のために近位結腸（肛門に近づく）を採取し、PCRプライマー配列は先行研究から入手した。簡単に説明すると、大腸組織からTrizol試薬（Invitrogen,Thermo Fisher,USA）を用いて、製造者の指示に従って全RNAを抽出した。ゲノムDNAはDNase I（TaKaRa、京都、日本）を用いて除去した。逆転写は、逆転写キット（Vazyme,NanJing,China）の説明書に従って行った。すべてのサンプルをcDNAに逆転写し、ND-2000（NanoDrop Technologies, Thermo Fisher,USA）を用いて定量した。OD260/280=1.8~2.2の高品質RNAサンプルを増幅用に選択した。HiScript-TS 5'/3' RACE Kitの説明書に従ってPCR混合物を調製し、PCR増幅反応を行った。増幅プロセスは、最初のホールドステップ（95℃、3分間）に続いて、3段階PCRプロセス（95℃、15秒間、60℃、15秒間、72℃、30秒間）を45サイクル行った。増幅反応はBIO-RAD社（米国）の蛍光定量PCR検出システムを用いて行った。また、各サンプルの蛍光強度を温度変化ごとに測定し、標的遺伝子が増幅されたかどうかをモニターした。データ解析は比較閾値サイクリング（Cq）法を用い、ハウスキーピング遺伝子であるβ-アクチンの発現に対して正規化し、キャリブレーター（2-;;Ct）に対する相対値で行った（Huang et al.）

2.4 16S rRNA遺伝子配列決定、バイオインフォマティクス、統計解析
本研究に関わるすべての16S rRNAシーケンシング結果は、Macro Sequence Biotechnology Ltd（中国・上海）のIlluminaシーケンシングプラットフォームで解析した。簡単に説明すると、E.Z.N.A.® Soil DNA Kit（Omega Bio-tek, Norcross, GA, U.S.）の指示に従ってラットの糞便から全DNAを抽出した。DNA濃度と純度はNanoDrop2000を用いてチェックし、その後、特異的プライマーを用いてV3-V4可変領域をPCR増幅した。PCR産物はAxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Kihara Bioscience, Union City, CA, USA)とQubit 4 (Thermo Fisher, U.S.)を用いて精製し、定量に用いた。精製したアンプリコンをIllumina MiSeq PE300プラットフォーム（米国カリフォルニア州サンディエゴ）で等モルおよび対側のシーケンスに供した。生リードはNCBI Sequence Read Archive（SRA）データベース（PRJNA1097012）に寄託した。類似度97%の配列をUPARSEアルゴリズムでクラスタリングし、キメラ配列を同定して除去した。各操作分類単位（OTU）代表配列は、参照データベースSILVA138に対してRDP分類器を用いて最小信頼値0.7で分類した。アルファ多様性はシンプソン指数（Simpson）らを用いて推定した。グループ間のベータ多様性の差は、並べ替え多変量分散分析（permanova）により決定された主座標分析（PCoA）を用いて評価した。異なる分類群の相対的な存在量を比較するために、LEfSe法を用いた。一方、グループ間のパスウェイの変化の差異については、P値<0.05、log LDAスコアのサイズ効果閾値2.0でKEGG解析を行った。相関分析は、スピアマン順位相関分析（Shi et al.、2021）を用いて行った。細菌種を同定するための具体的な方法は、オンライン補足方法のセクションに詳述されている。

2.5 炎症性バイオマーカーの血漿分析
血漿サンプルは、眼球除去法を用いて採取した。炎症マーカーの選択では、先行研究（Wang and He, 2018）においてOAによって引き起こされる炎症と密接に関連することが示されているものに焦点を当てた。軟骨損傷の特異的指標であるマトリックスメタロプロテアーゼ13（MMP-13）も含めた。IL-1β、IL-10、IL-17、TNF-α、MMP-13を含むこれらのマーカーの定量には、Huamei Bio（武漢）から購入したELISAキット（CUSABIO、武漢）を使用した。サンプルは1:10に希釈してから分析に供した。分析はLuminex 100 IS装置を用いて行った。結果の完全性を保証するため、すべてのサンプルとLPS標準希釈液はエンドトキシンフリーバイアル（EndoGrade® Glass Test Tubes）（Hyglos GmbH, Bernried, Germany）で再構成した。

2.6 軟骨および滑膜試料の組織学的評価
組織学的分析のために、各ラットの右膝関節を解剖し、4％ホルマリンで固定した後、19％EDTA（9％二ナトリウムおよび10％四ナトリウム、pH7.4）で2週間かけて脱灰した。膝関節を冠状面に置き、ライカの包埋装置を用いてパラフィンに包埋した。その後、ライカのミクロトームを用いて4μmの組織切片を30枚作成した。

切片は、サフラニンO/ファストグリーン染色、H&E染色、SESN2の免疫組織化学染色を含む一連の染色を受けた。簡単に説明すると、調製した切片を脱パラフィンし、再水和した後、ファストグリーン溶液に25分間浸し、次いで1％酢酸ですすぎ、サフランO溶液（1.5％）に30分間浸し、脱水した後、カバースリップした。残りの2つの染色法の手順は上記と同じで、確立されたプロトコールに従った（Shenら、2017；Huangら、2020）。軟骨病変と滑膜炎症を評価するために、ACSスコアリングシステムを利用した。すべての右膝は、実験群分けを盲検化した東南大学医学部病理学教室の同じ評価者（AFZ）によって評価された。

SESN2の免疫組織化学染色は、Proteintech社（中国、WuHan）から入手した抗体を用いて行った。SDラットの軟骨細胞数を定量化するために、40倍の倍率で3枚の顕微鏡写真を撮影し、大腿骨顆の中心を明確に包含し、大腿骨顆の前方および後方が適切に含まれるようにした。その後、各切片の細胞の総数とSESN2陽性細胞の数を測定した（Akasaki et al.）

2.7 ACLT手術
すべてのACLT手術は、無菌条件下で一人の外科専門医によって行われた。雄性SDラット（320～360g）を2％イソフルラン吸入により処置終了まで麻酔した。右膝関節を剃毛し、ポビドンヨード溶液で滅菌した。右膝内側顆に約1cmの垂直切開を加え、皮膚を動員し膝蓋腱を露出させた。膝は内側傍膝蓋骨アプローチで露出させた。膝蓋骨を半側方に脱臼させ、前十字靭帯を露出させた。マイクロシザーを用いて前十字靭帯を切断し、膝を完全に屈曲させた。周囲の軟骨や他の構造物を傷つけないように注意した。ACLが完全に切断されていることを確認するため、前方引き出しテストにより関節の前方弛緩を徒手的に確認した。その後、滅菌生理食塩水で関節を灌流した。その後、膝蓋周囲滑液包切開と皮膚切開を5-0 Vicryl pure braided absorbable sutures (Ethicon, UK)を用いて閉鎖した(Glasson et al., 2007)。

2.8 Von Frey試験
馴化のため、マウスを試験室内の高架ワイヤーグリッドに置き、そこで1時間馴化させた。感度試験は左後肢から開始し、0.6gのvon Freyフィラメントを用いた。フィラメントを足底に当て、フィラメントを曲げるのに十分な力をかけ、1～2秒間接触させた。次のフィラメントの大きさの選択は、直前のフィラメントに対する動物の反応に依存した。引き離し反応が観察されない場合は、次の重さのフィラメントを使用した。逆に、引き抜き反応が見られた場合は、より重量の軽いフィラメントを選択した。各刺激の間隔を最低2分空けながら、前足が5回のテストを受けるまでこのプロセスを繰り返した。この後、右後肢も同様の試験を行った（Deuis et al.）

2.9 統計分析
すべての統計分析は、特に断りのない限り、SPSS 22.5（SPSS, Chicago, IL, USA）を用いて行った。連続変数の記述統計量は、平均値±標準偏差（SD）として報告した。データ分布の正規性の評価にはコルモゴロフ・スミルノフ検定を用いた。複数群からの正規分布データには一元配置分散分析（ANOVA）を用い、その他のデータにはクラスカル・ワリス検定（Kruskal-Wallis）を用いた。10未満の多重比較ではp値の調整にボンフェローニ補正を用い、より広範な比較ではベンジャミン・ホッホベルグ手順に基づくFDR補正を用いてp値を調整した。属レベルのシャノン指数はQIIME（バージョン1.7.0）を用いて計算した。主成分分析（PCA）はRソフトウェア（Versuib 2.15.3）のFactoMineRパッケージとclusterSimパッケージを用いて行った。PLS-DAをSIMCA-Pソフトウェアで行い、異なるグループ間でサンプルプロットをクラスタリングした。仮説検定の有意水準αは0.05とし、p値＜αを統計的に有意とみなした。

3 結果
3.1 食物繊維の補給はSCFAs産生菌属数を増加させる
16S rRNA遺伝子の塩基配列決定を用いた糞便サンプルの分析では、MDFとHDFはNDFと比較してα多様性に有意差は認められなかったが、相対的な存在量はわずかに増加した。注目すべきは、門レベルで、HDF群はSCFAの一種である酪酸の生産で知られるBacillota門の存在量が有意に高かったことである（図1A）。さらに、線形判別分析の効果量（LEfSe）分析を用いると、属レベルでは、HDF群ではMonoglobus属、Muribaculaceae属、Clostridia属が多かった。一方、他の実験群では、バクテロイデス属、ムリバキュラ科、ラクノスピラ科が優勢であった（図1B）。KEGGアノテーションと機能的濃縮を用いて、実験グループ間で濃縮のレベルが異なる9つの異なる機能カテゴリーを同定した。特にHDF群では、ガラクトース代謝に関連する機能が顕著に増加した（図1C）。

図1
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図1 16S rRNA配列解析による微生物叢の研究。(A,B）A,Bは異なる分類群レベルでの相対存在量を表す。HDFグループはBacillota門が支配的であったのに対し、NDFグループはLefseを通して解析されたBacteriodota門が支配的であった。(C)KEGGパスウェイ解析の結果、HDFグループはガラクトース代謝経路でアップレギュレートされていた。

3.2 SCFAを産生する優勢な細菌属は腸透過性を有意に改善する
食物繊維摂取に関連した変化を調べるために、腸透過性を評価した。HDFはNDFと比較して、タイトジャンクションタンパク質のmRNAの発現が有意に促進された（図2A、B）。H&E染色による所見に基づくと、MDF群とHDF群では、NDFと対照的に、炎症細胞の浸潤が顕著でなかった（図2C）。これら2つのアプローチで得られた結果を組み合わせると、HDF群は比較的炎症が抑えられていることがわかった。

図2
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図2 腸管透過性の評価。定量的PCR法による大腸の異なるグループからのタイトジャンクションタンパク質分子のmRNA発現の解析。(A) HDFのマウスでは、タイトジャンクションタンパク質OccludinのmRNAレベルが有意に増加した。(B）HDFマウスではタイトジャンクションタンパク質ZO-1のmRNAレベルが有意に増加していた。(C)HDF群ではNDF群に比べ、粘膜層が厚く、カップ細胞が多かった（原倍率：4倍、スケールバー：100μm）。

3.3 腸内細菌叢の変化は全身の炎症に影響する可能性がある
OAの発症は通常、生体内での炎症反応の亢進を伴う。そこで、ELISA法を用いて炎症因子の血清レベルを調べた。その結果、興味深いことに、腸-骨軸研究におけるこれまでの観察結果とは異なっていた。8週間の介入後、MDFとHDF群におけるIL-1β、TNF-α、IL-17のような炎症性因子のレベルは、NDFより有意には低くないものの、低下傾向を示した（図3A-C）。しかし、抗炎症因子IL-10はHDF群で有意な増加を示した（図3D）。MMP-13は、関節軟骨のコラーゲンやその他のマトリックス分子を分解し、軟骨の損傷や関節腔の拡大に関与することで知られる、OA病態における重要な酵素である。そのため、MMP-13はOA病態における重要なバイオマーカーと考えられている。その結果、HDF群ではNDF群に比べてMMP-13の発現が有意に減少し、関節炎に関連した炎症が軽減していることが示された（図3E）。

図3
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図3 炎症性バイオマーカー分析。全身性炎症因子の発現をELISAキットで調べた。(A）IL-1β（B）TNF-α（C）IL-17（D）IL-10（E）MMP-13。(IL-1β＝インターロイキン1β；IL-10＝インターロイキン10；IL-17＝インターロイキン17；TNF-α＝腫瘍壊死因子α；MMP-13＝マトリックスメタロプロテアーゼ13）。

3.4 腸内細菌叢組成はOA重症度と関節におけるSESN2遺伝子発現に影響する
膝関節の病変を包括的に評価するために、我々の評価は3つの異なる方法、すなわち、H&E染色、サフラニン-O染色、免疫組織化学的な方法に及んだ。我々は、HDF群がNDF群に比べて滑膜炎のスコアが有意に低く、MDF群の結果と密接に一致していることを見出した（図4A、C）。軟骨損傷の評価では、NDF群はSafranin-OスコアとACSスコアの両方で高いスコアを示し、繊維の補給を受けた群と比較して、より広範な損傷を示した（図4B、D、E）。HDF群は、他の2群と比べてSESN2タンパク質の発現が有意に高く、NDFとの有意差を示した（図4F、G）。疼痛評価に関しては、6週間の介入期間後、MDF群とHDF群の禁断閾値は対照群の禁断閾値よりも有意に高くなり、8週間後には両群は同程度になった（図4H）。これらの観察結果は、HDF群の食事療法がOAの進行を遅らせるのに大きな役割を果たしたことを示唆しており、潜在的にSESN2の発現上昇と関連している可能性がある。

図4
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図4 膝関節の組織学的解析。(A）各群間のラット膝関節のH&E染色の代表画像。(元の倍率は5倍）。(B）各群間のラット膝関節のパンクロマチックソリッドグリーン染色切片の代表画像（原倍率：5倍）。(C）各群間の滑膜炎スコア。(D）群間のサフラニンOスコア。(E）群間のACSスコア。(F)異なる群のラットの膝関節におけるSESN2免疫組織化学の代表的な画像（元の倍率：20倍）。(G）群間の陽性細胞数。注：図中の茶色の粒子はSESN2陽性軟骨細胞である。(H）各時点におけるラットのVon Frey試験結果。各バーはグループ（x軸）を表し、平均値と95％信頼区間（y軸）を示す。黒い実線はラットの組織学的スコアの平均値を示す。

4 考察
OAとは、多くの人々のQOLに影響を及ぼす元凶の一つであり、その有病率は年々増加している。OAのメカニズムを探る過程で、加齢と体重増加が非常に重要な影響因子であることがわかった。そして、腸-骨軸に関する既存の研究では、生体の老化と肥満が腸内細菌叢の構成に大きな影響を与えることが示されている。食物繊維は見過ごされやすい栄養素であるが、ほとんどの研究で生体の健康に良い影響を与えることが示されている。一定量の食物繊維の摂取が老化を遅らせたり、肥満のリスクを軽減したりすることが研究で確認されている（Matt, 2018; Delzenne, 2020）。疫学調査によると、食物繊維の1日の摂取量は25～28gが望ましいとされているが、不規則な生活習慣により食物繊維の摂取量が不足している（Gill et al.）本研究は、食物繊維の健康効果を掘り下げ、食物繊維摂取の必要性を啓発する一助となるものである。

食物繊維が豊富な食事は、腸内細菌叢に有意な変化を引き起こすことが観察された。腸内細菌叢の多様性は2群間で統計的に有意な差は認められなかった。その代わりに、主な違いはそれぞれのグループ内の優勢属の存在量に現れた。具体的には、HDFの腸内細菌叢は主にバチロータ属で構成されていたのに対し、NDFの腸内細菌叢は主にバクテリオドータ属の多さが特徴であった。注目すべきは、1986年の時点で、これらの細菌群によって産生されるSCFAの種類に違いがあることが研究によって明らかにされていたことである（Macfarla, 1986）。Bacillotaは主に酪酸を生成し、Bacteriodotaは主に酢酸とプロピオン酸を生成することが観察された（Macfarlane and Macfarlane, 2003; Feng et al.）体内の優勢属の構成は、構築された腸管バリアの透過性や免疫能と同様に様々である。炎症性腸疾患（IBD）における最近の研究では、酪酸産生の増加が大腸上皮の完全性と粘膜の免疫機能をある程度改善し、とりわけ抗炎症作用をもたらす可能性を示唆する結果がある（Wu, 2021）。この結果は、SCFAの添加が腸の完全性の維持に関係することを確認する一助となる。

さらに、食物繊維の大量摂取は、滑膜炎症の初期段階にプラスの影響を与え、軟骨の損傷を緩和し、軟骨細胞の活性を高め、膝関節痛の知覚を緩和した。8週間の試験が終了した時点で、HDF群の膝関節ではSESN2遺伝子発現の顕著な増加が観察されたが、これは主に腸内細菌叢の優占属の違いによるものであった。この所見は、正常関節、高齢関節、変形性関節症の関節におけるSESN2の発現を比較した先行研究と一致しており、高齢の変形性関節症の関節では、正常な状態に比べてSESN2の発現が有意に低いことが明らかになった。SESN2タンパク質は、細胞のストレス応答と酸化還元恒常性の維持において極めて重要な役割を果たしている。その影響は、細胞の生存、増殖、機能を含む細胞生物学の重要な側面にまで及んでいる。注目すべきは、腸内細菌叢組成の変化がSESN2遺伝子の発現を調節する可能性があることである。スクリプス研究所で行われた2018年の研究では、SESN2がオートファジーを介してmTOR経路を活性化し、それによって軟骨細胞の活性維持に寄与することが実証された（Shen et al.、2017）。このように、腸内細菌叢の組成がOAの発症と重症度に大きな影響を及ぼすことが明らかになった。我々の知見は、さらなる研究のための理論的基礎を提供するだけでなく、関節炎の文脈におけるSESN2の機能と腸内細菌叢との相互作用の探求に大きな関心を呼び起こすものである。私たちの関節分析から注目すべきことが明らかになった。バチロータ門が豊富なHDF群は、SESN2の発現を有意に上昇させ、OA関節の炎症を抑制し、軟骨損傷の程度も低かった。これはNDF群とは対照的で、NDF群は逆の傾向を示した。これまでの研究で、腸内細菌叢の発酵産物である酪酸が肝臓におけるSESN2の発現を増強することは示されていたが、関節炎の進行に対するその影響については検討されていなかった。我々の研究は、バチロータ優位の微生物叢プロファイルが膝関節におけるSESN2発現の増加と関連することを証明することによって、このギャップを埋めるものである。重要なことは、このSESN2発現の増加が滑膜の炎症と軟骨細胞損傷の抑制と相関していることであり、OAの進行と管理における保護的かつ治療的な役割の可能性を示唆している。

初期の食物繊維介入研究では、体内のSCFAsレベルを上昇させ、炎症性ケモカインであるMCP-1、IL-18、IL-33の発現を低下させ、SCFAsの直接的な補給が可能であることが判明した。SCFAsは、GPCRsとHDACsという2つのシグナル伝達経路を通じて炎症と代謝を制御することが示されている（Durholz et al.）さらに、関節リウマチにおいては、SCFAがFFA2受容体を介してB細胞の分化を制御し、関節リウマチを緩和することが示されている（Yaoら、2022）。食物繊維の添加によって体内の炎症がある程度改善されることは、数多くの研究で実証されているが、食物繊維の量の違いによって炎症がどのように改善されるかについては、方向性に隔たりがある。これまでの研究とは異なり、本研究では、食物繊維のレベルの違いによって産生される有益微生物のレベルとOAの改善度合いの違いを比較した。このことは、食物繊維の補充後の腸内細菌叢の組成とOAの変化に関するさらなる研究のデータ的裏付けとなる。食物繊維に関するコホート研究も、異なる観点からOA改善における食物繊維の重要性を示している。Dai博士らは、8年間の臨床調査において、食物繊維の高摂取とOA疼痛の程度の違いとの間に強い相関があることを示した（Dai et al.）カナダの縦断研究でも、OAの発症対策に有益な、より良い体組成を構築するためには、一定レベルの高繊維摂取が必要であることが示されている（Chopp-Hurleyら、2022年）。異なる食事パターンにおけるOAの変化の解析は、ターゲットとして身体の炎症性サイトカインの重要性をさらに示している（Zengら、2023）。食物繊維摂取の有益性を理解することは重要であるが、食物繊維不足による健康への影響も無視できない。例えば2016年には、無菌マウスで微生物群集を人工的に作り、食物繊維がない場合、マウスの大腸粘液バリアが著しく破壊され、外来病原体の侵入を助長することが明らかになった（Desai et al.）これに基づき、プレバイオティクス食物繊維の欠乏は、高テンシン原性腸内細菌叢を素因とし、その組成がSCFAの産生を低下させ、GPR43/109Aシグナル伝達経路を阻害することで、心血管疾患の進行に寄与することを見出した（Kay, 2020）。同様に、神経変性疾患においても、食物繊維の欠乏は腸内細菌叢の組成を変化させることにより疾患の進行を促進することが示されている（Shiら、2020）。

食物繊維とOAとの関連は強く、両者の分子メカニズムの解明は特に急務である。本研究の特筆すべき長所は、様々なレベルの食物繊維に反応して、腸内細菌叢内の優占細菌分類群の変化を比較するという先駆的なアプローチにある。このアプローチは、特に他の健康食品による人工的な補給を伴うアプローチと対比すると、健康中心で実用的である点で際立っている。我々の研究は、重要な洞察を提供する一方で、まだ一定の限界がある。ラットをはじめとする動物は、研究目的のモデル動物としてしばしば使用されるが、これらの動物データのヒトへの適用性については、未解決の疑問が残る。SESN2のアップレギュレーションを促進するSCFAの具体的な種類をさらに特定するために、既存の研究を基に研究を進める予定である。今後の研究では、様々なSCFAが軟骨細胞の活性にどのような影響を与えるかを明らかにするために、細胞メカニズムを探求することを目指すべきである。そうすることで、臨床医が患者を治療する際に、より正確で実用的な情報を提供することができる。

5 結論
我々の研究は、食物繊維の補給が腸内細菌叢の組成を変化させ、OAの進行を遅らせる可能性があることを示した。腸内細菌叢におけるバチロタ門の存在量とOA重症度の間には強い相関が認められ、これはSESN2の発現変化とも関連していた。これらの観察結果は、おそらくSESN2を介した、OA改善におけるバチロタ門の役割の可能性を示している。この結果は、食事介入による腸内細菌叢の調節が、OAに対する有望な治療アプローチであるという概念を支持するものである。今後の研究努力は、SESN2の基礎となるメカニズムを解明し、これらの知見をどのように効果的に臨床に反映させることができるかを探求することである。

データの利用可能性に関する声明
本研究で発表されたデータセットは、オンラインリポジトリにある。リポジトリ名とアクセッション番号は以下の通り： NCBI, PRJNA1097012.

倫理声明
動物実験は江南大学動物飼育使用委員会の承認を得た。本研究は、現地の法律および施設要件に従って実施された。

著者貢献
YWu： YWu：概念化、データ管理、調査、方法論、プロジェクト管理、資源、ソフトウェア、監督、検証、執筆（原案）、執筆（校閲・編集）。XL：概念化、データキュレーション、調査、方法論、リソース、検証、執筆（原案）、プロジェクト管理。HM: 概念化、調査、方法論、監督、検証、執筆（原案）、データ管理。YWa：概念化、調査、方法論、プロジェクト管理、監督、執筆 - 原案。PS: 概念化、データキュレーション、調査、監督、検証、執筆 - 原案。YD：構想、調査、監修、検証、執筆 - 原案。JY：構想、データキュレーション、調査、監修、検証、執筆 - 原案。BC：概念化、データキュレーション、調査、方法論、プロジェクト管理、リソース、監督、検証、執筆 - レビューと編集。XW：概念化、データキュレーション、調査、検証、執筆-原案、執筆-校閲・編集、資金獲得、方法論、プロジェクト管理。

資金提供
著者は、本論文の研究、執筆、および/または発表のために金銭的支援を受けたことを表明する。本研究は、江蘇省自然科学基金会一般プロジェクト（BK20221204）および無錫市衛生委員会青年・中年トップ人材支援プログラム（BJ2023052）の支援を受けた。

謝辞
組織切片の病理学的解析を行った東南大学病理研究室のAifeng Zhangおよび武漢Edexcel英語編集部に感謝する。

利益相反
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈されるような商業的または金銭的関係がない状態で実施されたことを宣言する。

発行者注
本論文で表明された主張はすべて著者個人のものであり、必ずしも所属団体や出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本論文で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のある主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcimb.2024.1401963/full#supplementary-material に掲載されている。

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キーワード：変形性関節症、腸内細菌叢、SESN2、SCFA、食物繊維

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受理：2024年3月16日 2024年3月16日；受理された： 2024年4月15日；
発行：2024年5月13日

編集者

ティンタオ・チェン、南昌大学、中国
査読者

チェン・ワン（中国・西南大学
エンリケタ・ガルシア・グティエレス（スペイン、カルタヘナ工科大学
Copyright © 2024 Wu, Li, Meng, Wang, Sheng, Dong, Yang, Chen and Wang. これはクリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを明記し、学術的に認められている慣行に従って本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。これらの条件に従わない使用、配布、複製は許可されない。

*文責 XueSong Wang, victorwxs@jiangnan.edu.cn; BingQian Chen, cbq0433@suda.edu.cn; Ju Yang, yangju0909@163.com.

これらの著者は筆頭著者である。

免責事項：本論文で表明されたすべての主張は、あくまでも著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者の主張を代表するものではない。本記事で評価される可能性のあるいかなる製品、またはその製造元が主張する可能性のあるいかなる主張も、出版社によって保証または支持されるものではない。

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