ウイルスの研究における新たな技術

哉百名

カレント・オピニオン・イン・ウイルス
第54巻 2022年6月 101231号
ウイルスの研究における新たな技術
著者リンク open overlay panelSophie E Smith 1 2 *, Wanqi Huang 1 2 *, Kawtar Tiamani 1 2, Magdalena Unterer 1 2, Mohammadali Khan Mirzaei 1 2, Li Deng 1 2 # $。
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https://doi.org/10.1016/j.coviro.2022.101231
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ハイライト

新しい増幅法により、全ゲノム増幅で生じるバイアスが軽減された

ロングリードシーケンスにより、アセンブリーによるバイアスを回避することができる

新しい実験手法により、培養不可能なファージを宿主に割り当てることができる。

新しいダイレクト RNA-Seq 技術は、ビロームの研究に利用できる可能性がある

近年、マイクロバイオームへの関心が高まっていますが、その大部分を占めるバクテリオファージの研究は、細菌と比較して相対的に未発達な状態です。これは、16S rRNA遺伝子のような普遍的に保存されたマーカーがないことが一因である。このため、メタゲノム解析アプローチの開発は、マイクロバイオームまたはバイロームに含まれるウイルスの研究において大きなマイルストーンとなった。しかし、こうしたウェットラボの手法では、存在するすべてのウイルスを検出することはまだできず、ビロームの構成に関する理解は不完全なままであることが次第に明らかになってきている。近年、私たちの理解を深めるために、さまざまな新しい技術が開発されています。Direct RNA-Seq テクノロジーは、cDNA合成の必要性を回避できるため、このステップに起因するバイアスを回避でき、RNAウイルスに関する理解をさらに深めることができる。新世代の増幅法は、ほとんどのウイルスサンプルに関連する低バイオマス問題を解決し、全ゲノム増幅によって引き起こされるエラーレートとバイアスを低減することができます。また、ロングリードシーケンスの適用により、完全なウイルスゲノムの生成におけるショートリードシーケンスの欠点を解決し、アセンブリによってもたらされるバイアスを回避することができる。ウイルスの宿主範囲を測定するために開発された新しい実験方法は、多くのファージ、特に培養不可能なファージに宿主を割り当てるという難題を克服するのに役立つ可能性がある。

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カレント・オピニオン・イン・ウイルス学 2022, 54:101231

この総説は、The virome in health and diseaseというテーマで発行されたものである。

編集：Jelle Matthijnssens、Evelien Adriaenssens

セクションの概要については、"The virome in health and disease (2022) "を参照してください。

2022年5月25日オンライン公開

https://doi.org/10.1016/j.coviro.2022.101231

1879-6257/© 2022 The Author(s). Elsevier B.V.発行。この記事は、CC BY-NC-NDライセンス(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/)に基づくオープンアクセス論文です。

はじめに
ウイルスは、地球上に約1031個存在する豊富で広範な生物学的実体である[1]。それらは、細菌、古細菌、植物、節足動物、哺乳類、さらには他のウイルスなど、他のあらゆる生物体に感染する2, 3。これらのウイルスの大半はバクテリオファージ（ファージ）であり、細菌の存在量、多様性、代謝を調節することにより、地球上の生命の様々な側面に影響を与えている4, 5, 6。さらに、人体におけるその群集構造の変化は、複数のヒトの病気に関連しています7, 8, 9。細菌と異なり、ウイルスはアンプリコンベースのシーケンシングのための普遍的な系統学的マーカーを持たないため、ビロームの評価は細菌の場合よりも複雑である。高感度メタゲノムハイ・スループットシーケンスアプローチの開発により、環境および臨床サンプル内のウイルス群集（ビローム）の構成を調査する機会が得られ、ビロームと疾患との相関関係の研究、特に未培養ウイルスや新規ウイルスの検出を向上させることができます [10]（ 英語版のみ）。ビロームの研究分野では大きな前進を遂げたものの、一般的に使用されているメタゲノム解析法には、ssDNAやRNAウイルスを犠牲にしてdsDNAや環状ゲノムに偏る、あるいは増幅を必要とする抽出ゲノム材料の収量が低く、さらなる偏りが生じるなどの問題がしばしばあります[11]。また、次世代ショートリードシーケンスでは、繰り返し配列や複雑なゲノム領域の解析に問題がある場合があります。メタゲノムシーケンスで同定されたビロームのウイルスは、特定の宿主と容易に関連付けることができず、また、どの細菌に感染するかを特定することも困難です。ここでは、これらの問題を克服することを目的とした最新技術を紹介します。

メタゲノムサンプルのバイアスに対処する方法
メタゲノム研究では、まずゲノムを抽出し、シーケンシングの準備をする必要があります。ビロームの研究でよく知られているウイルスのほとんどはdsDNAウイルスであり、ssDNA、RNA、マルチパートゲノムを持つウイルス[12]はメタゲノム解析ではあまり見られません[13]が、これは少なくともdsDNAを好むゲノム抽出プロトコルに起因しています 14, 15, 16, 17. これらのゲノムを特異的に抽出するプロトコルが開発されている。ssDNAウイルスでは、円形ゲノムをターゲットにアルカリ抽出が行われ[18]、また二本鎖DNAを特異的に消化する二重鎖特異的ヌクレアーゼも用いられている[19]。さらにNetoVIRはDNAゲノムに加えてRNAゲノムを市販キットで効果的に抽出するために設計されたプロトコルである[20]。メタトランススクリプトミクスは、mRNA転写物と同じ方法で抽出・配列決定が可能な、新規ssRNAウイルスを同定するための興味深い新手段を提供します。最近の研究により、既知のssRNAファージゲノムの数は、わずか25[21]から数万に拡大した21, 22, 23. これらの研究の多くは、既存のRNA-seqデータを調べ、隠れマルコフモデルを用いて解析し、ウイルスの配列を同定したものです[21]。cDNAのステップを必要とせずにRNAの配列を決定する、新しく開発された直接RNA-Seq技術には、RNAウイルスについてわかっていることをさらに広げる可能性があります[24]。この技術はすでに、RNAウイルスによる感染症の診断に使用されており [25]、疾患組織から抽出した完全なRNAから新しい病原性RNAウイルスを特定することにも使用されています[26]。また、ウイルスのゲノムサイズが小さいため、ビロームの解析はバックグラウンドの汚染に影響されることがあります。そのため、バックグラウンドコンタミネーションを同定・除去するための複数の計算機によるアプローチが開発されています (Box 1)。

ボックス1
ビロームデータにおけるバックグラウンドコンタミネーションを検出する計算機的アプローチ

例えば、細菌のハウスキーピング遺伝子であるcpn60 chaperoninや微生物のrRNAのデータベースとシーケンシングリードをアライメントすることなどが挙げられる[75]。最近、M. Zolfoら（2019）は、16S/18S、23S/28S rRNA遺伝子と31の普遍的な細菌および古細菌マーカー遺伝子を統合して、ビロームデータにおける生のメタゲノムリードから微生物汚染物質の存在量を定量するソフトウェア、ViromeQCを開発しました[76]。別のウイルスメタゲノミクス解析プラットフォームであるMETAnnotatorXは、National Center of Biotechnology Information (NCBI) のマルチデータベース（真核生物用のViral RefSeq, Archaeal RefSeq, Bacterial Refseq, Whole RefSeq）や他の代替データベース、例えばGenBank、VirSorter、IMG/VRデータベースなどをオンデマンドで統合し、反復分類ステップによって配列データセットのリードやコンティグのウイルスや非ウイルスDNAを特定できます [77]．また、多くの研究者が VirSorter の Virome Decontamination モードを使用して、汚染の可能性があるものにフラグを立て、除去しています[78]。

低バイオマス・サンプルでは、抽出された遺伝物質の量がごくわずかであることを考えると、この制限を回避して十分な入力物質を生成するために、ライブラリー調製の前に追加の増幅ステップを行うことが有効である場合があります。ウイルスのゲノムサイズは細菌と比較して小さく短いため、このことは、ウイルスのゲノムについて議論する際に特に関連する27, 28。全ゲノム増幅法などの初期の手法は、より現代的な手法に取って代わられたが、ほとんどの増幅法の基本メカニズムは、等温増幅法かポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ベースのままである[29]。

最も一般的な増幅法のひとつで、ライブラリー調製の前に使用することができ、Multiple-Displacement Amplification (MDA) 27, 30と呼ばれている。サンプルは、ランダムホスホロチオエート修飾ヘキサマー、dNTPs、バッファー、DNAポリメラーゼとともにインキュベートされる（図1）[29]。DNAを溶かすために熱を使う代わりに、ポリメラーゼは鋳型鎖をコピーしている間に下流に結合したプライマーを変位させる。このポリメラーゼの高い処理能力により、平均12kbの長さの増幅断片が得られる[29]。MDAはそれ自身、小さな円形ゲノムを好むというバイアスを持ち、グアニン-シトシン（GC）含量の高い鋳型の増幅に苦労しているが [31] 、その技術は、このバイアスを減らすことを目的としたいくつかの適応の基礎になっている。最も広く用いられているのは、degenerate oligonucleotide primer PCR（DOP-PCR）、multiple annealing and looping-based amplification cycles（MALBAC）、そして非常に類似したPicoPLEXである。

図1
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図1. 増幅法の違いによる比較。(a) MDA [29]、ランダム6量体プライマーが変性した鋳型DNAと結合する。一般的なPhi29 DNAポリメラーゼがプライマーの伸長を開始する。増幅された逆鎖は、ポリメラーゼによって鋳型から離され、プライマーと結合して連続的に重合される。(b) DOP-PCR [33]では、プライマーは3′末端に6bpの縮退ランダム配列、5′末端に固定配列を持ち、低いアニーリング温度でテンプレートに均一にハイブリダイズすることができます。その後、耐熱性ポリメラーゼにより、より高い温度でプライマーを伸長させる。(c) MALBAC [32]プライマーは、5′-末端が27bpの共通配列、3′-末端が8bpのランダムヌクレオチド配列で設計されている。このプライマーは、増幅された鎖がDNAループの中で自己ハイブリダイズするのを助け、プライマーは元の鋳型に沿ってのみ伸長するように設計されている。(d) LIANTI：T7プロモーターとトランスポザーゼからなるトランスポゾームが使われる。トランスポゾームがランダムに結合して鋳型に組み込まれると、T7プロモーター領域からT7 RNAポリメラーゼによってゲノムDNAに沿って一本鎖のRNAが増幅される。その後、逆転写、RNAse消化、第二鎖合成を経て、二本鎖のバーコードDNAが作成され、シークエンスライブラリーとなる[34]。

DOP-PCRでは、変性プライマーは1回目は低いアニーリング温度で結合し、2回目は高い温度で固定された5′末端に結合する28, 32 (図1). しかし、DOP-PCRではゲノムカバレッジが低い[32]。MALBACやPicoPLEXはMDAに比べ、ゲノムカバレッジが向上し、増幅の均一性も向上する[32]。これらの方法は2つのステップを含む。DOP-PCRと比較して性能は向上するものの、1ステップのDOP-PCRと比較して多段階であるため労力がかかり、微生物DNAの混入やエラー率が高くなりやすいという問題がある[33]。

近年、新世代の増幅法が開発され、そのうちのいくつかはポリメラーゼ酵素を改良することにより、先行する方法を改善したものである。改良型DOP-PCR」という適切な名前を持つこの方法は、オリジナルの方法よりも強い鎖置換性を持つ新しい耐熱性DNAポリメラーゼと、調整されたプライマー設計を使用しています[34]。この増幅法は、DOP-PCRとPicoPLEXの両方と比較して、より質の高い増幅DNAを生成する[34]。最近開発されたもう一つの方法はWGA-Xで、これはMDAをベースにしているが、phi29ポリメラーゼの耐熱性変異体を用いている。この方法は、従来のMDAと比較して、特にGC含量の高い鋳型に対するゲノム回収率が向上する[35]。Linear Amplification via Transposon Insertion (LIANTI) は異なるアプローチをとり、トランスポゾンを用いてT7プロモーターを導入し、転写による増幅を行い、その後DNAに逆転写する(図1)。つまり、他の全ゲノム増幅（WGA）法で採用されている指数関数的な増幅とは対照的に、直線的な増幅を行うことができるのである。線形増幅の使用により、エラーレートとバイアスが減少し、この方法は、ゲノムカバレッジ、アレルドロップアウト、バイアスの点で、古い方法よりも優れた性能を発揮する[36]。

これらの方法の多くは、逆転写ステップの後にRNAウイルスゲノムを増幅するために用いられてきたが、RNAを増幅するために特別に設計・最適化された方法も存在する。Whole-transcriptome増幅法はWGAに類似しており、RNA転写物をcDNAに逆転写し、PCR増幅に使用するユニバーサルプライミング部位を加えることで機能する[37]。Ribo-Single Primer Isothermal Amplificationは、DNA-RNAキメラプライマーを用いて、1回の反応でcDNAを増幅・転移させます[38]。また、90年代初頭にDNA増幅用に開発されたSequence-Independent singleprimer amplificationが、RNA用に最適化されました[39]。

de novoアセンブリーの難しさを克服する方法
メタゲノム研究の大部分は、ハイスループットなショートリードシーケンス技術を用いて行われており、DNAはシーケンスの前に小さく消化され、通常約300bpの長さのリードが生成されます[40]。このシーケンシング方法の開発、および入手しやすくなったことと比較的安価であることは、ウィロミクス分野にとって革命的であった。ショートリードは、重複する領域を探しながら完全なゲノムに組み立てる必要があり、高度に反復する領域や複雑な領域を解決することが困難な場合があります[41]。アセンブリを成功させるためには、高いカバレッジが必要であり、これは、しばしば少量の遺伝物質しか回収できないビロームの場合に特に問題となることがある[42]。既に述べたように、増幅のステップは有用であるが、それ自身の偏りをもたらす可能性がある。多くの場合、アセンブルされたウイルスは不完全であり、短い断片化したウイルスコンティグは、in silicoのサイズ選択ステップでフィルタリングされて失われます[42]。ショートリード配列解析では、末端反復配列などの繰り返し領域の解析が困難なため、ウイルスゲノムが完全であるかどうかを知ることは難しく、不完全な円形ゲノムが線状ゲノムと誤って同定される可能性があります[43]。

これらの欠点を克服するために、ペアエンドリードやマテペアリードなど多くの技術が開発され、ここ10年ほどの間に、10kbを超えるリードを生成するロングリードシーケンスが開発されました[40]。この目的のために開発された技術は主に2つあります。1つはPacific Biosciences（PacBio）の1分子リアルタイムシーケンサーで、サーキュラーコンセンサスシーケンサーを使用するものである。小さなウェルの底に繋がれたポリメラーゼが、蛍光標識されたヌクレオチドを付加し、それを検出・同定することができる。このようにして、最大50kbのロングリードを生成することができる[40]（図2）。ロングリードシーケンスのもう一つの主要な方法は、ナノポアシーケンスで、DNA分子を孔に通し、イオン電流の揺らぎを測定します-各塩基は異なるパターンの電流揺らぎを生成します（図2）。ナノポアシーケンスでは、PacBioよりもさらに長いリードを生成することができ、記録は4.2 Mb [44]、ほとんどの平均的ライブラリーは10-30 kb [40]です。これらの技術によるロングリードシーケンスは、ショートリード技術よりも長いコンティグを生成することができるため、より多くの完全長ゲノムをアセンブルすることができます[45]。ロングリード法は、アセンブルを必要とせず、1回のリードでウイルスゲノム全体をシーケンスできるため、特にビロミクス研究に有効です[43]。また、末端リピートの配列決定にも成功し、ファージパッケージング戦略に関する新たな情報を得ることができます[43]。ロングリードはメタゲノム研究に単独で、あるいはショートリードシーケンスと並行して用いられ、ショートリードシーケンス単独では同定できなかった新規ウイルスを同定している[46]。しかし、ロングリードシーケンスはどちらの手法も精度が低いという評判があります[47]。どちらの手法も、リーディングフレームをずらすインデルエラーがしばしば発生し、偽のストップコドンを導入してしまうのです[42]。ウイルス遺伝子は一般的に細菌遺伝子よりも既に短いため、これはメタゲノムの他の部分よりもさらにバイロームにとって問題である[42]。また、ウイルス遺伝子の大半は機能未知であり、遺伝子予測の精度を評価することが困難である[42]。また、これらの方法は、しばしば多量の入力DNAを必要とする[42]。

図2
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図2. 新しいシーケンサー技術。(a) PacBioシーケンス[36]。アダプターは鋳型鎖を環状化するために使用される。プライマーはアダプターに結合し、DNAポリメラーゼはプライマーに結合する。ポリメラーゼは蛍光塩基を1つずつ結合し、その蛍光シグナルの順番で配列が決まる。(b) ナノポアシーケンス[36]。DNA分子は、イオン電流の変動を引き起こす細孔を通過する。塩基ごとに電流の大きさが異なるため、電流の変化から塩基配列を同定することができる。(c)合成ロングリード法[40]。長い転写産物を物理的に分離し、小さなセグメントに分解し、バーコード化する。その後、イルミナなどのショートリード技術で塩基配列を決定し、バーコードを使って元のロングリードを組み立てる。(d) クロモソームコンフォメーションキャプチャー[41]。ゲノムを架橋するためにホルムアルデヒドを添加し、消化されて小さな断片になる前に架橋する。架橋された断片は互いにライゲーションされ、キメラを形成し、配列決定される。(e) 光ゲノムマッピング[42]。ゲノムを固定モチーフの酵素で消化し、蛍光標識する。酵素が結合した箇所を顕微鏡で可視化し、コンセンサスゲノムマップを作成することができます。(f）Linked-read sequencing 40-, 43, 44 合成ロングリード配列決定と同様に、長いDNA断片を物理的に分離し、消化し、多くの場合マイクロビーズに結合したバーコードを使ってバーコード化する。その後、フラグメントはショートリード技術を使って配列決定され、ロングリードのアセンブル工程を必要とせずにアセンブルされます。

最近の進歩により、この2つの方法の精度は向上しているが[40]、一部の用途では依然として精度が低すぎる。また、エラーを修正し、リードを研磨するバイオインフォマティクス手法もありますが、これは時間のかかる集中的な作業となります[48]。また、ロングリードのシーケンスはショートリードよりも高価であることに変わりはありません[40]。そのため、安価なショートリードのシーケンス技術の精度と使いやすさに、ロングリードの利点を組み合わせた手法が開発されています。これらの方法は、ショートリードの範囲内で長距離データを維持する方法を見つけなければならないため、ショートリード配列の精度、低コスト、その他の利点を維持したまま、合成ロングリード（SLR）を構築することができるのである。これらの方法は、SLRと、リンクドリードシーケンスに分けられる。いずれの場合も、長いDNA断片を空間的に分離してから消化・バーコード化します。その後、通常のショートリードシーケンスと同様にライブラリー調製を行います。このバーコーディングのステップを追加することで、追加のアセンブルの前に元の長い断片を再集合することができます[49]。2つのアプローチの違いは、バーコードのカバレッジにあります。SLRシーケンスでは、フラグメント全体を完全に再構成することができますが、リンクリードシーケンスでは、フラグメントを完全に再構成できないように、少ないリードをバーコード化しますが、長距離データは保持され、アセンブリにバイオインフォマティクス的に使用することができます [49] (図2)。DNA断片の最初の分離には、さまざまな方法が開発されてきた。10x Genomics社が採用しているGemCodeプラットフォームのように、マイクロ流体工学を使って断片を区画に分離する方法もある。断片は個々の液滴（ジェム）に分離され、そこで消化され、バーコードが付けられる。その後、フラグメントは増幅されてからドロップレットから放出され、ライブラリー調製とショートリードシーケンスを受けることができる[50]。このプラットフォームは1 ngの入力DNAしか必要としないが、マイクロフルイディクスを実行できる高価な機械を使用する必要がある[49]。CPT-Seq [51], stLFR [52], TELL-Seq [49] など、最近開発された手法では、高価なマイクロ流路を必要とせず、ほとんどの研究室にあるような装置を使って分子を分割する方法の開発に焦点が当てられている。これらの方法では、マイクロビーズがそれぞれ単一のバーコードでコーティングされているため、分割の必要性が全くない。トランスポゾンは、断片化と同時にビーズからDNA分子にバーコードを転写するため、1本のPCRチューブで反応が可能である[49]。これらの方法は、必要な集中作業の量を減らし、標準的な消耗品以上の装置を必要とせず、イルミナシーケンス装置45, 47, 48のような容易に入手できるシーケンス技術を使用することができる。

ショートリード配列決定において長距離情報を維持する別の方法として、物理的に近接しているDNAを配列決定前に何らかの方法で連結する近接ライゲーションがある。メタゲノム解析の文脈では、連結されたDNAは同じ細胞から来たものであり、したがって同じ生物に由来すると仮定され、この情報はメタゲノムを正しく組み立てるために使用することができる。また、このレビューで後述する、マイクロバイオームにおけるウイルスとその宿主である細菌との相互作用に関する情報を与えるために使用することもできる。メタゲノム研究において最もよく用いられる近接ライゲーション法は、クロマチンをホルムアルデヒドで架橋した後、消化し、配列を決定する染色体コンフォメーションキャプチャー（3C）技術である。ライゲーションされた配列は、消化される前に物理的に互いに接近していたはずで、ゲノムの配列だけでなく、ゲノムの3次元組織に関する情報も得られる[53]（図2）。メタゲノム解析のための3Cアプローチは、meta3Cと呼ばれ、2014年と古くから開発されており[54]、この方法の使用により、近縁の株を含む複雑なコミュニティに対してメタゲノム解析が可能になった55、56、57、58. しかし、近接ライゲーションは大量の入力DNAを必要とし、偽反転やスキャフォールドの誤配置など、アセンブリに問題が生じる可能性がある[59]。

シーケンシングに代わる方法として、ゲノムマッピングがある56, 57。歴史的には、制限酵素を使って未知のDNAを消化し、制限部位のユニークな「フィンガープリント」を作成することで行われていた61。より現代的な方法では、酵素を使用して蛍光を取り込み、光学顕微鏡を使ってマッピングすることができる。制限酵素マッピングと比較して、蛍光光学マッピングを用いる大きな利点は、制限酵素マッピングでは不可能な、制限部位の順番を維持できることである[62]。光学マッピングは、ロングリードシーケンスよりもかなり長いシーケンスリードを生成でき、マイクロフルイディクスの導入により、かつてよりもハイスループットになった[59]。しかし、種の同定には、既知の配列から生成された予想されるマップと照合する必要があるため、それ自体では新規種の同定には適さない[60]。しかし、ショートリード配列を用いたアセンブリの足場として使用することは可能である[59]。

バイロミクスデータに含まれる宿主情報の不足を補う方法
メタゲノム解析で得られない情報の1つに、ビロームの中に同定されたファージの宿主に関するものがあります。ファージはビロームの大部分を占めているにもかかわらず、ファージと宿主の相互作用は十分に解明されていません。ファージゲノムに宿主を割り当てることを試みる様々なバイオインフォマティクス手法があるが、いずれも欠点がある。例えば、あるファージは宿主のCRISPR-casシステムのスペーサーにマッチさせることが可能である。しかし、CRISPRシステムを持たない細菌に対してはうまくいかない 63, 64-. 近年、この問題を解決するために、様々な実験手法が開発されている。それらは、宿主細菌内のファージマーカー遺伝子をPCRで同定するもの、空間的に共局在するウイルスと宿主を同定するもの、そして最後に宿主に吸着したウイルスの同定を目的とするものの3種類に分けることができる。

最初に紹介するのは、プライマーを使ってファージマーカー遺伝子を増幅し、さまざまな方法で宿主と結びつける方法である（図3）。これらの方法のすべてにおいて、まず個々の細菌細胞を分離しなければなりません。マイクロ流体PCRや液滴デジタルPCR（ddPCR）のようにマイクロ流体チャンバー内で分離したり［65］、イポロニー法のようにポリアクリルアミドゲル内で空間的に分離したり［66］、乳化対分離濃縮PCR（epicPCR）［67］のように乳化液滴内で分離したりしています。次に、PCR により標的遺伝子を増幅する。ddPCRでは、各チャンバーで2つのPCR反応が行われる。1つはファージ遺伝子をターゲットとし、もう1つは宿主遺伝子をターゲットとするものである。両方の反応で標的遺伝子が増幅されれば、そのチャンバー内のファージがそのチャンバー内の宿主に感染していると結論づけることができる[68]。イポロニー法では、ウイルス遺伝子を標的としたプライマーをファージ感染菌と一緒にゲル内に埋め込む。増幅球、すなわちPCRコロニー（polony）が見られれば、ファージ感染菌が存在することがわかる[66]。 epicPCRでは、融合PCR反応により、ファージ感染細胞内のウイルスと宿主マーカー遺伝子を結合し増幅させる。これらの融合アンプリコンは、その後、宿主とウイルスの両方を識別するために配列決定することができます[67]。ファージ特異的なプローブを少し違った方法で使用するもう一つの方法は、phageFISHです。これは、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）の概念を用いて、ファージと宿主のDNAの共局在を視覚化するものである。ここでは、プローブに蛍光標識された抗体と結合して活性化する分子を標識している。さらに、ファージ特異的な遺伝子に対するdegenerate primersに、細菌のrRNA遺伝子に対するprimerを用いて、宿主細胞を可視化する-これにより、感染細胞内のファージと宿主DNAの両方を共焦点化し、ファージが細菌に感染していることを示唆することができる[69]。これらの手法に用いられる縮退プライマーは、できるだけ広範囲のファージを増幅できるように、メタゲノムのデータに基づいて設計されている。しかし、これらのプライマーの設計と最適化には時間と手間がかかり[67]、既知の遺伝子しか標的にできないため限界がある。ウイルスには普遍的に保存された配列はなく、既知の配列に偏ることは避けられない[70]。

図3
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図3. ファージホストの同定方法。(a)プライマーを用いた方法。digital-droplet PCR 60, 61 (ddPCR)では、細菌細胞をマイクロ流体チャンバー内で分離してから、ファージマーカー遺伝子と細菌マーカー遺伝子の両方をターゲットにPCRを実行する。両方のマーカー遺伝子が増幅された場合、そのチャンバーにはファージとその細菌宿主の両方が存在することになる。iPolony [62]では、ファージに感染した細菌をポリアクリルアミドゲルに埋め込み、ウイルスマーカー遺伝子を標的としたプライマーを用いて、細菌がファージに感染した「ポロニー」を作成することが可能である。phageFISH [63]では、ファージと細菌マーカー遺伝子を標的とした蛍光プローブにより、ファージと細菌のDNAの共局在を可視化する。(b) 共焦点化ベースの手法。XRM-Seq [64]では、リボソームをそのmRNA転写物と架橋し、ライゲーションしてrRNA-mRNAキメラを形成し、それを配列決定します。これらのキメラにおいて、宿主のrRNAと一緒にウイルスのmRNAが存在することで、ファージ-宿主のペアが特定されます。(c)吸着ベースの方法。VT65、66では、蛍光染色されたファージを標的細菌集団に添加する。蛍光を発するファージ-宿主ペアは、その後FACSを用いて分離され、配列決定により同定されることができる。adsorp-seq [59]では、遊離ファージがアガロースゲル内を自由に移動し、宿主と結合したファージだけがウェルに残されます。そして、これらを配列決定し、同定することができる。

他にも、プライマーを使用せずに、ファージDNAと宿主DNAの共局在を同定する方法が開発されています（図3）。これを行うための一つのアプローチは、Hi-Cによるものである。先に述べたように、これには物理的に近い位置にあるDNAを一緒にライゲーションすることが必要である。もしファージと宿主のDNAが一緒にライゲーションされているのが見つかったら、ファージのDNAは宿主細胞の中にあったことになり、その宿主に感染することができると考えなければなりません。ファージゲノムは、物理的な近接性に基づいて宿主ゲノムに割り当てられる[71]。コロカライゼーションに基づくもう一つの類似の手法として、XRM-Seqがあります。この方法では、Hi-Cと同様にリボソームを架橋しますが、この段階でリボソームとトータルRNAを抽出し、架橋されたRNAのみをターゲットとする酵素で消化します。そして、消化されたRNAは環状化され、非環状RNAは分解され、架橋された転写物のみが残される。その後、RNAはcDNAに変換され、塩基配列が決定される。宿主／ウイルスのキメラは、ウイルスが宿主細胞内にいたこと、したがってその宿主に感染することができるに違いないことを再び示唆している[72]。

ファージの宿主を特定する別のアプローチは、ファージが感染の準備のために宿主に吸着した、ファージ-宿主ペアを特定して配列決定することである（図3）。これを行う方法の1つがウイルスタギング（VT）である。VTでは、ファージを蛍光DNA株で染色し、標的宿主集団[73]、または異なる可能性のある宿主の混合集団を含む混合集団[74]のいずれかと混合される。蛍光ファージは宿主に結合し、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を用いて、ファージが結合し蛍光シグナルを持つ細菌とそうでない細菌を分離する。シングルセルソーティングは、個々のファージ-宿主ペアの配列を決定し、その配列から両者を識別することができることを意味する[73]。最近開発されたもう一つの方法は、adsorp-Seqです。これは、ファージが結合した細菌が、遊離ファージと比較してアガロースゲル内で異なる動きをすることを利用したものである。ファージは宿主と混合され、ゲル上で培養されます。宿主に結合していないファージはウェルから自由に逃げ出しますが、ファージと宿主のペアはウェルに残り、そこで抽出され配列決定されます[64]。

結論
ハイスループットなシーケンサー技術の開発は、ウイルス研究にとって革命的であった。近年、ショートリードシーケンスに関連する問題を克服し、これらのギャップを埋めることを目的とした様々な技術が開発されています。これらの技術の多くはまだ新しいものであり、ウイルス学分野におけるこれらの技術の可能性はまだ見えていないかもしれない。

著者による貢献
すべての著者は、この研究に多大な貢献をし、出版を承認しています。

利益相反に関する声明
申告すべき利害関係はありません。

謝辞
この研究は、ドイツ研究財団（DFG Emmy Noetherプログラム、プロジェクト番号273124240、SFB 1371、プロジェクト番号395357507）から資金提供を受けています。395357507）、および欧州研究会議スターティンググラント（ERC StG 803077）によりL.D.に授与された。

参考文献と推薦図書
レビュー期間内に発表された特に興味深い論文は、以下のようにハイライトされている。

特に注目すべき論文

1
A.R. Mushegian
地球上のウイルス粒子は10 31個か、それ以上か、それ以下か？
J Bacteriol, 202 (2020), pp.e00052-20
ScopusGoogle Scholarで見る
2
Y.Z. Zhang、M. Shi、E.C. Holmes
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エディトリアル エマージング・ブタ・ウイルス 第2巻
2022年、フロンティアズ・イン・ヴェテリナリーサイエンス
在来種に関連するウイルスの全国カタログにより、在来種ウイルス発見の原動力としてのハイスループット配列決定が明らかになった
2022年、ウイルス
ブラジルのバイオームに生息するコウモリのウイルス：知識のギャップと人獣共通感染症のウイルスに対する偏り
2022年、バイオRxiv
ファージ-宿主間相互作用の日報
2022年、フロンティアーズ・イン・マイクロバイオロジー


ORCID: 0000-0003-0225-0663

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研究ID A-7233-2015

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