バルプロ酸に胎内曝露されたマウスは、多価不飽和脂肪酸強化食を与えても自閉症関連障害を示さない

2023年7月13日 09:20

オープンアクセス
出版：2023年7月11日
バルプロ酸に胎内曝露されたマウスは、多価不飽和脂肪酸強化食を与えても自閉症関連障害を示さない

https://www.nature.com/articles/s41598-023-38423-z

ヴァレンタイン・ターピン
モード・シャフハウザー
...
モハメド・ジャベール
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サイエンティフィック・リポーツ第13巻、論文番号：11235（2023）この記事を引用する
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指標詳細
要旨
自閉症スペクトラム障害（ASD）において、n-3系多価不飽和脂肪酸（PUFA）の食事補充が検討されているが、この疾患の主要症状の改善におけるその効率と可能性は依然として不明である。ここで我々は、バルプロ酸（VPA、E12.5で450 mg/kg）ASDモデルマウスにおいて、胚期から授乳期を経て成体になるまで、脂肪性魚類から得られるn-3系長鎖（LC）PUFA食事補充（n-3 supp）と植物油から得られるn-3系PUFA前駆体食（n-3 bal）を比較した。母子行動と、小脳プルキンエ細胞（PC）数、炎症マーカー、腸内細菌叢、末梢および脳内PUFA組成といったVPA誘発ASDの生物学的特徴を調査した。発達のマイルストーンは、男女ともにn-3サプル群ではn-3バル群に比べて遅れていた。どのような食事であっても、VPAに暴露された子どもは、社会的行動、定型、PC数、腸内細菌叢の異常においてASDに特徴的な変化を示さなかったが、一方で、全体的な活動、歩行、末梢および脳PUFAレベル、ならびに小脳TNF-αレベルは、食事および治療によって、性別によって異なる変化を示した。本研究は、LCPUFAを含まないものを含むn-3 PUFAベースの食事が、ASDに関連するいくつかの行動および細胞症状の予防に有益であるという証拠を提供するものである。
はじめに
自閉症スペクトラム障害（ASD）は、コミュニケーションや社会的相互作用における持続的な障害、および制限された反復行動、興味、または活動を特徴とする神経発達障害である1。ASD患者の画像診断および死後調査から、小脳は体積の減少やプルキンエ細胞（PC）数の減少を伴う主要な影響を受ける脳領域のひとつであることが明らかになっている2。同様の所見は、遺伝モデルでも環境モデルでも観察され、運動と認知機能に関わる小脳領域crus Iとcrus IIがPCの減少により最も影響を受け、性差があることが示された3,4,5。また、ASDには炎症、胃腸障害、摂食障害など多くの合併症がある6,7。現在のところ、対症療法以外の治療法や予防法はない。n-6系とn-3系の多価不飽和脂肪酸（PUFA）は脳細胞膜に大量に存在し、脳の機能と発達に不可欠である8,9。リノール酸（LA、n-6）とα-リノレン酸（ALA、n-3）は必須脂肪酸（FA）で、哺乳類では合成できないため、食事から摂取する必要がある。LAとALAは、それぞれアラキドン酸（AA、n-6）とエイコサペンタエン酸（EPA、n-3）-ドコサヘキサエン酸（DHA、n-3）の長鎖（LC）PUFAに代謝される。しかし、脳にn-3 LCPUFAを供給するにはALAだけでは不十分であるため、脂肪の多い魚類からさらに摂取する必要がある10。ASDと診断された患者の血液や脳では、n-3系PUFAが低レベルであることが報告されている11,12,13,14,15。母親の食事から摂取されるPUFAは周産期の発達中の脳にとって重要であるため9、この重要な時期にn-3 PUFAが十分に摂取されないと、脳の脂質組成、代謝、シグナル伝達経路に異常が生じる16,17。これはひいては、神経発達障害や精神疾患8,18,19と関連する可能性がある。そのため、ASDの予防のために周産期に、またASDの改善や予防のために成人期に、n-3 PUFAを食事から補充することが臨床や動物実験で検討されている20,21,22,23,24,25,26。
いくつかの研究は、周産期におけるn-3 PUFA補給の潜在的な有益性を指摘しているが、神経発達障害に対するn-3 PUFAsの種（すなわち、前駆体対長鎖）の正確な寄与はよく定義されていない。このことは、臨床ASD研究で得られた相反する結果とともに、我々は2つの食事について大規模かつ横並びの比較を行うことを促した。一つ目は、ALAを唯一の植物油からのn-3 PUFA源とするバランスのとれた食事（n-3 bal）である。もう1つは、脂肪分の多い魚からDHAとEPAを摂取したn-3 LCPUFA補給食（n-3 supp）である。どちらの食事も等カロリーで、脂肪酸組成が異なっていた。比較はASDのバルプロ酸（VPA）モデルマウスを用い、オスとメスを別々に分析した。実際、胎内で作用する環境因子がASDの病因に関与していることが疑われている27。中でも妊娠中のVPA曝露は、ASD発症リスクを高める発達障害に関連する主要因であることが一貫して示されている28。VPAモデルは、構成的妥当性、顔面妥当性、そして最近では予測妥当性が高いことが証明されている29,30,31。妊娠中のげっ歯類の雌にVPAを注射すると、社会的相互作用の障害32,33,34、反復行動34、運動発達の遅れ35などのASD関連症候群が系統的に誘発される（このテーマに関する総説2,36も参照）。本研究に先立ち、われわれは最近、このASDマウスモデルについて、生後早期から成人期までの分子的・細胞的相関を持つ幅広い行動についての本格的な解析を行った。特に、今回使用した餌（6.2）よりも同等のLA/ALA比（5.3）を含む標準的な餌の下での運動行動と小脳の影響に焦点を当てた3。我々は、VPA ASDマウスモデルにおいて、主要な社会性障害、定型行動、小脳の運動障害および歩行障害を示したが、これはcrus Iおよびcrus IIにおける小脳領域PCの消失と相関していた。これにより、ASDの表現型に対するn-3 LCPUFAサプリメントの効果を調査するための確かな出発点を得ることができた。ここでは、炎症と腸内細菌叢に分析を拡張し、堰および雌雄の子孫の行動、細胞、代謝反応に及ぼす影響を検討した。
結果
母体の行動はVPA処理および食餌のいずれにも影響されない
VPAを投与された幼若マウスは、隔離ストレスによって誘発される超音波発声のパターンに異常をきたす37。このことは、子孫の正常な社会性および運動発達の鍵となる母性行動に影響を及ぼす可能性がある38。ここでは、仔マウスの分離後の母性行動に関連するさまざまなパラメーターを、処置と食餌との関連で評価した（補図S1）。二元配置分散分析（ANOVA）により、母親の世話、巣作り、ストレスに関連する行動については、処置や食餌にかかわらず、実験群間に差はないことが示された。まとめると、母親がn-3 LCPUFAまたはその前駆体を摂取した場合、VPA投与は母親の行動に影響を与えないことが示された。
n-3 LCPUFAの補給により子供の発達マイルストーンが遅れる
我々は最近、出生前にVPAに曝露したマウスが出生後早期に著しい行動障害を示すことを示した3。ここで、我々はP9からP16までの直立反射と開眼時間帯を投与と食事との関連で調べた（図1）。SAL/n-3suppの雄はP9とP13において、SAL/n-3 bal群と比較し、またVPA/n-3 supp群と比較し、特にP13においてのみ異常な正視反射を示した。メスでも同様の違いがP11で見られたが、P13では見られなかった（図1a）。さらに、開眼は雌雄ともにSAL/n-3 suppマウスではSAL/n-3 balマウスに比べてP13で遅延し、雄のみP14で遅延した。開眼は、VPA/n-3 balの雌に比べてVPA/n-3 suppの雌でもP13およびP14で遅延した（図1b）。
図1
n-3 LCPUFAの補給により、子供の発達のマイルストーンが遅れる。(a) 雄（左）および雌（右）ともに、P9（上）、P11（中）およびP13（下）における右折反射時間。n = 27匹（SAL/n-3 bal雄）、24匹（VPA/n-3 bal雄）、34匹（SAL/n-3 supp雄）、24匹（VPA/n-3 supp雄）、38匹（SAL/n-3 bal雌）、25匹（VPA/n-3 bal雌）、26匹（SAL/n-3 supp雌）および24匹（VPA/n-3 supp雌）。(n＝29（SAL/n-3bal雄）、27（VPA/n-3bal雄）、36（SAL/n-3supp雄）、26（VPA/n-3supp雄）、39（SAL/n-3bal雌）、28（VPA/n-3bal雌）、27（SAL/n-3supp雌）、26（VPA/n-3supp雌）マウス。データは平均値±SEMで表され、二元配置分散分析（ANOVA）後、Tukeyポストホック多重分析により解析された。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。
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これらの結果は、n-3supp飼料が、VPA処理および動物の性別に依存した感覚運動発達に影響を与えたことを示している。
食餌介入にかかわらず、VPA投与後に行動や細胞に大きな変化は見られなかった
私たちのグループや他のグループによる以前のエビデンスでは、VPAに胎生期から曝露され、標準的な食餌を与えられたマウスは、3-CTテストにおいて一貫して社会的行動の低下を示すことが報告されている3,29,30。ここで、前回と同じ飼育条件下で同じ実験手順を用いて、雄および雌の若齢成体マウスにおいて、両食餌がVPAによる社会性障害を抑制したことを報告する（図2a）。三元配置分散分析（ANOVA）により、全群で非社会的チャンバーに比べ社会的チャンバーで過ごす時間が長いことが示された。VPA/n-3supp雄では、SAL/n-3supp群よりもわずかに社会的であった。また、このテスト中に新奇なマウスの近くにいた時間とチャンバー内の移動距離も調べたところ、同じ結果が得られ、全グループが正常な社会的能力を示した（データは示さず）。
図2
子孫の社会性、グルーミング行動は、両方のn-3 PUFA食餌後のVPAによって変化しない。(a) 雄（左）と雌（右の雌）の両方における3-CTからのフェーズII。n = 27（SAL/n-3 bal雄）、25（VPA/n-3 bal雄）、35（SAL/n-3 supp雄）、25（VPA/n-3 supp雄）、39（SAL/n-3 bal雌）、27（VPA/n-3 bal雌）、27（SAL/n-3 supp雌）および26（VPA/n-3 supp雌）マウス。データは平均値±SEMで表され、三元配置ANOVAとTukeyポストホック多重分析によって解析された。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。SC社会性チャンバー、NSC非社会性チャンバー。(b) 雄（左）と雌（右）のグルーミング・エピソード数とグルーミング累積時間。(n = 28匹（SAL/n-3 bal雄）、27匹（VPA/n-3 bal雄）、35匹（SAL/n-3 supp雄）、24匹（VPA/n-3 supp雄）、37匹（SAL/n-3 bal雌）、27匹（VPA/n-3 bal雌）、26匹（SAL/n-3 supp雌）、26匹（VPA/n-3 supp雌）。データは平均値±SEMで表し、3-CTについては三元配置分散分析、グルーミングと飼育行動については二元配置分散分析、その後Tukeyポストホック多重分析で分析した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。
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定型行動は、ASDの様々な遺伝的・環境的動物モデルでしばしば報告されている2,3,4,5。この行動はASD患者の反復行動を彷彿とさせ、ASDの診断に用いられる主要な症状のひとつである1。我々は以前、出生前のVPA曝露が、雌雄ともに対照群と比較して定型行動を有意に増加させることを示した3。ここでは、グルーミングパラメーターに群間差は見られなかったと報告している（図2b）。また、VPA/n-3 bal雄雌マウスは、SAL/n-3 balおよびVPA/n-3 suppマウスと比較して、飼育行動の頻度と持続時間が増加した（図2c）。しかし、VPA/n-3supp群とSAL/n-3supp群、SAL/n-3 bal群とSAL/n-3supp群では差が観察されなかったことから、VPAは補充群における飼育行動に影響を及ぼさなかった。
歩行障害はASD患者と動物モデルの両方でしばしば報告されているが、ASDの診断基準としてはまだ考えられていない39,40。我々はこれまでに、VPAモデル2,3,4,5を含む遺伝的・環境的ASD動物モデルにおいて、顕著な歩行障害を示してきた。ここでは、SAL/n-3supp群に比べ、VPA/n-3supp雄群では中程度の歩行障害が観察された（図3）。例えば、歩幅や遊脚時間などの動的・時間的パラメータは、VPA投与群では影響を受けていた。肉球幅、肉球長、肉球面積のような形態学的パラメータも、処理と食餌の両方によって変化した。メスでは、運動学に関連する前肢および後肢の支持基底位など、わずかなパラメータのみが影響を受けた。VPA/n-3 balの雌はVPA/n-3 supp群と比較して、前肢と後肢の両方で支持基底面の減少を示し、さらにSAL/n-3 balの雌と比較して、前肢のみ支持基底面の減少を示した。
図3
子孫の歩行分析では、食餌との関連で性差が認められた。(a) 雄の前足幅。(b) 雄の前足の長さ。(c) 雄の肉球面積。(d) 雄の歩幅。(n = 27 (SAL/n-3 bal male), 26 (VPA/n-3 bal male), 36 (SAL/n-3 supp male), 24 (VPA/n-3 supp male) マウス。(n＝39（SAL/n-3bal雌）、28（VPA/n-3bal雌）、27（SAL/n-3supp雌）、26（VPA/n-3supp雌）マウス。データは平均値±SEMで表し、二元配置分散分析（ANOVA）後、Tukeyポストホック多重分析で解析した。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。
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これらの結果を総合すると、どちらの食事も、治療法、食事内容、性別にかかわらず、ASDに関連する社会的、運動的、歩行的症状を補うことはできないまでも、軽減させることができることが示された。
我々は以前、環境および遺伝的ASD動物モデルにおいて、crus Iまたはcrus IIの小脳領域でPC数が有意に減少していることを示した3,4,5。ここでは、すべての実験群において、頭蓋Iと頭蓋IIにおけるPC数を調べた（補図S2）。二元配置分散分析（ANOVA）により、オス・メスともに治療や食事による影響は見られなかった。この結果は、標準的な動物用飼料を与えたマウスにおけるこれまでの観察とは異なり、n-3 balとn-3 suppの両方の飼料が、オス・メスともにVPAによるPCの減少を防いだことを示している。
VPA処理ではなく、食事が肝臓のn-3およびn-6 LCPUFA濃度を変化させたが、小脳では変化させなかった。
我々は、肝臓と小脳のFAプロファイルを評価した。小脳はDHA濃度が高く、FA組成の変化に敏感であり、PC41の喪失を含むASDにおける多くの細胞的・分子的変化の岐路にある。解析は縦断的に行われ、母親と子供のFAプロファイルが比較された。n-3 LCPUFAの補給は食事を通して行われたので、特にn-3およびn-6 LCPUFA、DHA、EPAおよびAAのレベルを分析した（図4および補図S3）。EPA濃度は、小脳と肝臓の両方で、ダム、雄および雌の子孫において、予想通り有意に増加した。肝臓では、n-3 LCPUFAを補充したすべての群において、ダム、オス、メスの子孫のいずれにおいても、n-3バランス群と比較してDHAレベルの有意な増加（最大3倍）が認められた。小脳では、DHAレベルもVPA/n-3バランス動物と比較してVPA/n-3サプリメント群で増加したが、中程度（約25％増）であり、雌の子でのみ増加した。興味深いことに、DHA小脳レベルの群間差はダムと雄の子孫では見られなかった。SAL/n-3supp群とVPA/n-3supp群では、SAL/n-3 bal群とVPA/n-3 bal群に比べ、肝臓と小脳の両方で、またオスとメスでそれぞれAAレベルが減少した。しかし、VPA/n-3 bal群では、SAL/n-3 bal群およびVPA/n-3 supp群に比べ、肝臓のダムAA濃度が増加した。
図4
n-3およびn-6 LCPUFAプロファイルはともに、食餌との関係で肝臓で変化するが、小脳では変化しない。SAL/n-3supp雄のAAレベル4匹を除く各群5匹。小脳のDHAとAAのレベル（下）。SAL/n-3 bal雄とVPA/n-3 supp雌のAAレベルの4匹を除き、各群5匹。データは中央値および最小値から最大値で表され、二元配置分散分析（ANOVA）とTukeyポストホック多重分析によって解析された。p < 0.05、***p < 0.01、***p < 0.001。
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これらの結果は、n-3 LCPUFA補給が肝臓内のDHAおよびAAレベルに大きな影響を及ぼすことを示しているが、小脳内ではDHAレベルは同等（生理食塩水およびVPAオス）またはわずかに増加したのみ（VPAメス）であった。
食事および治療と連動した炎症マーカーの変化は中程度から全くない
n-3 PUFAは抗炎症プロセスに関連しており、行動出力に影響を及ぼす可能性がある9。ここでは、小脳におけるいくつかの炎症マーカー（TNF-α、TGF-β、ARG）のmRNAレベルを調べた。TGF-βとARGについては、性別にかかわらずグループ間に差は見られなかった。しかし、TNF-αの発現は、SAL/n-3suppの雌で、SAL/n-3 balの雌に比べ、わずかではあるが有意に増加した。VPA投与は雄のTNF-αレベルを増加させたが、その後の群間差は認められなかった（図5）。
図5
食事と治療による炎症マーカーの変化は中等度から全く認められなかった。n＝5（SAL/n-3bal雄）、5（VPA/n-3bal雄）、4（SAL/n-3supp雄）、4（VPA/n-3supp雄）、4（SAL/n-3bal雌）、5（VPA/n-3bal雌）、5（SAL/n-3supp雌）、5（VPA/n-3supp雌）マウス。n＝5（SAL/n-3bal雄）、5（VPA/n-3bal雄）、5（SAL/n-3supp雄）、4（VPA/n-3supp雄）、5（SAL/n-3bal雌）、5（VPA/n-3bal雌）、5（SAL/n-3supp雌）、4（VPA/n-3supp雌）マウス。n＝5（SAL/n-3bal雄）、5（VPA/n-3bal雄）、5（SAL/n-3supp雄）、4（VPA/n-3supp雄）、5（SAL/n-3bal雌）、5（VPA/n-3bal雌）、5（SAL/n-3supp雌）、4（VPA/n-3supp雌）マウス。データは中央値および最小値から最大値で表され、二元配置分散分析（ANOVA）およびTukeyポストホック多重分析によって解析された。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
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微生物叢の多様性と相対的細菌量は食事の影響を受けない
微生物叢は、子に対する胎内VPA処理、およびn-3 PUFAの補充または欠乏によって影響を受けることが示されている42,43,44。n-3バランスまたはn-3 LCPUFA補充食を用いた場合、α-ダイバーシティにはダムと子孫のいずれにおいても差は見られなかった。興味深いことに、子孫のβダイバーシティはグループ間で差がなかったのに対し、ダムのβダイバーシティは、どのような食事であってもVPA処理によって増加し、VPA n-3サプリメントを摂取したダムが最も異なっていた（図6aおよび補足図S4-S6）。さらに、SAL/n-3supp群およびVPA/n-3 bal群に比べ、VPA/n-3supp群では、子実体ではなくダムにおいて、バクテロイデス属および放線菌の相対量が増加した（図6bおよび補足図S7）。しかし、雄性子孫のBray-Curtis非類似度分析によると、VPA/n-3 supp群はSAL/n-3 supp群に比べ、より多様な微生物組成を有していた（図6cおよび補足図S5）。これらの結果は、処理にかかわらず、子孫の微生物叢に関する飼料間の大きな違いはないことを示している。
図6
VPAは、両方のn-3 PUFA食餌下において、子孫の微生物叢の相互多様性および内部多様性および子孫の微生物叢の相対存在量を変化させない。微生物多様性：(a) ダム（左）、子孫のオス（中央）およびメス（右）におけるChao1指数（1行目）。(b) Bray-Curtis指数（3行目）ダム（左）、子孫のオス（中央）およびメス（右）。n = 10 (SAL/n-3 bal dam), 25 (VPA/n-3 bal dam), 25 (SAL/n-3 supp dam), 25 (VPA/n-3 supp dam), 10 (SAL/n-3 bal male), 25 (VPA/n-3 bal male), 20 (SAL/n-3 supp male), 25 (VPA/n-3 supp male), 10 (SAL/n-3 bal female), 25 (VPA/n-3 bal female), 25 (SAL/n-3 supp female) and 25 (VPA/n-3 supp female) mice. (c) フィラ数： SAL/n-3suppおよびVPA/n-3supp雄の4匹を除く各群5匹。SAL/n-3supp雄4匹およびSAL/n-3 bal雌4匹を除く各群5匹。データは中央値および最小値から最大値で表され、二元配置分散分析（ANOVA）とTukeyポストホック多重分析によって解析された。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001。
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考察
本研究では、ASDの雌雄両VPAモデルマウスにおいて、周産期から成体期に至るまで、LA（n-6）/ALA（n-3）比のバランスのとれた等カロリー食と比較して、n-3 LCPUFAを添加することが、社会的行動、運動行動、歩行行動、および小脳の細胞、分子、代謝相関の多様性に及ぼす潜在的な効果を検討した。その結果、VPAを投与した成体では、餌の種類にかかわらず、ASDの主要な特徴であり、標準的な餌を与えたVPAげっ歯類モデルで一貫して報告されている社会性障害、定型行動、小脳のPC喪失は認められなかった（このテーマに関する総説2,36を参照）。発達マイルストーン、歩行および炎症プロファイルは、VPA出生前曝露と組み合わせた食事によってわずかに影響を受けただけであった。腸内細菌叢の組成は、食事によっても治療によっても変化しなかった。さらに、小脳のDHA濃度は食事の影響を受けなかったが、肝臓のDHA濃度はn-3 LCPUFAを補充することで劇的に上昇した。ダムとその子孫を用いて、いくつかのパラメータについて縦断的な研究を行うこともできた。その結果、母体の行動には治療や食事による変化は見られなかったが、ダムはVPA投与に伴って微生物叢組成に変化を示し、n-3 LCPUFA肝レベルが上昇した。これらの結果を総合すると、植物油からのn-3 PUFA前駆体、または脂肪魚からのn-3 LCPUFAを追加した食餌のいずれもが、主要な行動、細胞、および分子的なVPA誘発ASD症状に対する保護を提供することが示された。
さらに、n-3系LCPUFAを補充した群では、妊娠中および授乳中に母親の食事からn-3系LCPUFAを補充または欠乏させると、出生後の発達に悪影響が出ることを報告した先行研究45,46,47,48と同様に、直立反射と開眼の両方にわずかな遅れが見られたことを報告している。n-3 LCPUFAsの高値は厳密に有益であるという一般的な誤解に反して、n-6/n-3 PUFA比の変化は、その方向に関係なく、動物モデル22,23によっては、成体時にいくつかの結果を伴う、発達中に有害であることが報告されている。実際、BTBRマウスとC57BL/6 Jマウスの両系統では、周産期の食事介入後に体重が減少したのに対し、Fmr1 KOマウスでは体重が増加した22,23。さらに、n-3系バランス栄養食は、VPA曝露動物における正視反射スコアと開眼スコアが生理食塩水群と同程度であったことから、我々が以前に標準食で報告したVPA誘発発達遅延3から保護されたことをここに報告する。この件に関する代謝研究は、この発達遅延の背後にあるメカニズムの解明に役立つ可能性がある。
社会的嗜好性や社会的新奇性の欠如、グルーミング行動の増加は、最近も報告したように、標準食下でのVPAモデルを含むASDのいくつかの動物モデルで繰り返し認められる3,4,5。今回我々は、n-3 PUFAバランス食とn-3 LCPUFA添加食の両方が、ASDに関連する2つの主要な症状である社会性障害と定位異常から保護されることを見出した。我々の知る限り、n-3 LCPUFAとその前駆体の社会的行動への影響を調査したのは本研究が初めてである。というのも、n-3 LCPUFAの補充と欠乏を比較した研究が大半であり、n-3 LCPUFAの補充は定位と社会的行動の障害を緩和することが示されていたからである49。
我々は以前、同じ実験環境において、VPA曝露動物に通常の動物施設用飼料を与えたところ、グローバルな活動を示す飼育行動が減少したことを示した3。ここで、n-3バランス飼料はコントロールと比較してVPA曝露動物の飼育行動を増加させ、これはn-3 LCPUFA補充飼料で正常化した。生理学的条件下では、離乳後3週間の高n-3 LCPUFA補給は飼育を減少させるが50、ASDの併存疾患であるうつ病や不安モデルでは逆の結果が見られる51。
通常の食事を与えたいくつかの環境および遺伝的ASDモデル動物に関する我々の以前の研究では、一貫して運動と歩行の障害が見られた3,4,5。ASD患者は小脳機能障害に関連した不規則な歩行やバランス障害を示すにもかかわらず、これらのモデルで歩行が検討されることはほとんどない52。ここで我々は、ASD VPA雄性マウスと雌性マウスで、食事が異なる影響を及ぼすことを示した。一方、n-3 LCPUFAを摂取したVPAマウスは、対照群と比較して動的、時間的、形態学的障害を示したが、その程度は通常の食事で観察されたものよりも低かった3。これらの結果は、n-3 LCPUFAの補給に伴う性差に依存した中等度の歩行障害を示唆しており、おそらくエストロゲンに関連すると仮定されるオスとメスの代謝の違いに起因している53。
Crus IとCrus IIの小脳領域は、認知機能と運動機能の両方に関与しており、ASDの生理学的病態のターゲットとして選択されている2,54。ASD患者においても、標準食を与えたVPAマウスモデルなどの動物モデルにおいても、PC数の減少が広く報告されている3,5,55,56,57,58。今回われわれは、これらの領域のPC細胞数は、治療、食事、性別にかかわらず、群間で変化しないことを示した。これらの知見は、n-3 PUFA前駆体を含む食事、またはn-3 LCPUFAを追加した食事のいずれもが、VPA誘発ASDの行動症状および細胞相関を予防するという我々の主要仮説に合致するものであった。
次に、肝臓と小脳のFAプロファイルを調査し、n-3 PUFA食事補充がこれらの領域におけるより高いn-3 PUFAレベルと関連しているかどうかを調べた。n-3 LCPUFA食はDHAとEPAを高度に補充していたのに対し、n-3バランス食はn-3前駆体（ALA）を含んでおり、2つの食餌のLA/ALA比は6.2であった。そこで、脂質分析はn-3およびn-6 LCPUFA、DHA、EPAおよびAAにそれぞれ焦点を当てた。予想通り、n-3系LCPUFAを食事から摂取させると、雌雄ともに肝臓と小脳のAA濃度が大きく減少し、肝臓と小脳のEPA濃度が有意に増加した。しかし、肝臓のDHA濃度はすべての群で増加した。小脳では、VPA雌性群でDHA濃度が増加する食餌効果が認められたが、雄性群では認められなかった。このことは、n-3 LCPUFAを補充しても、男性群では小脳のDHA濃度がそれ以上上昇しないことを示している。これらの知見は、ALAを唯一のn-3 PUFA源とするn-3 PUFAバランス食が、n-3欠乏食と比較して、成体および老齢のCD1マウス（2-5ヶ月および19-23ヶ月）において、大脳皮質のDHAレベルを増加させ、AAレベルを減少させ、情動行動の障害から保護したという別の研究と一致している59。これまでの研究では、炎症に対するn-3系LCPUFAの役割が検討され、DHAの脳内濃度が高いと抗炎症プロファイルに関連するのに対し、AAの脳内濃度が高いと炎症プロファイルに関連すると結論付けられている60,61,62。我々は、小脳のTNFα mRNAレベルがSAL/n-3suppの女性のみで増加していることを発見した。このサイトカインは最も研究されているサイトカインのひとつであり、AMPA受容体のレベルとシナプスの数を増加させ、興奮性シナプス後活性を高めることが知られている63。このメカニズムにより、TNFαはラットの学習と記憶を改善することが判明している64。これらを総合すると、PUFAの肝臓と小脳のプロファイル、そして小脳の炎症に関するこれらの結果は、n-3 LCPUFAサプリメントに対する性差と女性の感作性を浮き彫りにしている。
ASD患者は、腸内細菌叢の異常、すなわち微生物組成の不均衡に起因すると仮定される胃腸障害（GI）に苦しんでいる65,66。標準的な食事を与えたVPA ASDマウスモデルにおいて、αとβの多様性の違い、バクテロイデーテスとファーミキューテスの不均衡が一貫して報告されている42,67。n-3 LCPUFAの補給は、微生物叢の多様性と恒常性に寄与することが示されている44,68が、ALAの効果に関する研究は不足している。ここでは、性別、治療法、食餌の違いにかかわらず、オスまたはメスの子孫のα-多様性、β-多様性、フィラ存在量に差は見られなかった。このことは、VPA誘発ASD動物モデルにおいて、n-3系LCPUFAを含む、または含まない両方の食事が行動学的および生物学的利益をもたらすという我々の命題をさらに強固なものにしている。
本研究の長所のひとつは、雄と雌の子供を別々に分析したことに加え、仔犬の母親の行動、肝臓と小脳のFAプロファイル、微生物叢組成に対する治療と食事の影響も調査した、グローバルで縦断的なアプローチである。生後数週間の間に仔マウスが受けた母親のケアは、成体になってからの行動に影響する可能性がある69,70が、我々の手では、治療や食餌にかかわらず、母性行動におけるダム群間の差は見られなかった。これらの知見は、VPA投与が母親の行動に影響を与えなかった別の研究結果と一致している71。しかし、母体のFAプロファイルと腸内細菌叢組成に関しては、子動物よりもダムの方が、処理と食餌の相互作用による劇的な違いを見出した。実際、n-3バランス食を与えたVPA曝露ダムはAA肝レベルの上昇を示したが、これはn-3 LCUPFA補充食で正常化した。加えて、VPA/n-3バランス飼料を摂取したダムでは、バクテロイデーテス（Bacteroidetes）とアクチノバクテリア（Actinobacteria）の割合が増加し、β-ダイバーシティも増加した。ダムは妊娠前から通常食を与えられていたため、食餌の変化に対してより敏感である可能性がある。一方、子供は胚の段階から成体になって犠牲になるまで、バランス食であれサプリメント食であれ、同じ食餌を与えられていた。
この研究には、強調すべき限界がいくつかある。(i)、補足図S8とS9に示すように、SAL/n-3サプル群はSAL/n-3バル群より体重が高い傾向がある。(ii), 標準食またはn-3欠乏食下でのマウスにおけるVPA効果を直接比較するさらなる研究が必要である。(本研究で使用した飼料は、主にLCPUFAの有無によって異なっており、そのため、脂肪酸組成や由来（植物油または脂肪性魚由来）も異なっており、生物学的影響もある可能性がある。
以上の結果から、LCPUFAを含むか含まないかにかかわらず、n-3系PUFAを食事から補充することで、VPAマウスモデルにおけるASD関連障害を予防できることが示された。これらの有益な効果は、雌雄ともに行動、細胞、分子レベルで証明されたが、雌の方がn-3 LCPUFAの補充に対してやや感受性が高いようである。ASD症状に対する食事効果の根本的な生物学的メカニズムの解明を目指した、さらなる研究が必要である。また、性差と年齢差を考慮する必要がある。この2つのパラメータは、少なくとも前臨床実験ではほとんど研究されていない。
方法
動物と治療
動物の飼育および実験手順は、欧州連合指令（2010/63/EU）に従い、倫理委員会（承認番号202002051628899）によって検証された。C57BL/6Jマウス（Charles River Laboratories）を換気ケージに収容し、餌と水を自由に摂取できるようにした。室温は23℃、12時間明暗サイクル（08:00-20:00）で維持した。
本研究では合計337匹のマウスを使用した：交配には雌55匹、雄44匹を用い、雌120匹、雄118匹の子を得た。最初の妊娠日（E0）から妊娠・哺育期間中、妊娠した雌にはn-3 LCPUFA（DHAとEPA）を添加した等カロリー食（n-3 supp）、または添加しない飼料（n-3 bal）を子マウスの離乳まで与えた（SAFE, Augy, France）。どちらの飼料もLA/ALA比は6.2であり、n-3およびn-6前駆体の量は同じであった。そのため、n-3サプル群ではn-3 LCPUFA、DHAおよびEPAの有無によって飼料が大きく異なっていた（飼料の詳細な説明は補足表S1およびS2に記載）。n-3系サプリメントを摂取した動物は、約481.12 DHAおよび703.99 EPA（mg/kg体重/日）を摂取した。妊娠中の雌には、既述のように妊娠日E12.5にVPA（450 mg/kg、Sigma-Aldrich、P4543）または生理食塩水（NaCl 0.9%）のいずれかを1回i.p.注射した3,30。出産後、ダムは出生前処置と食餌によって4つの実験群に振り分けられた： SALはn-3 bal食（SAL/n-3 bal）、VPAはn-3 bal食（VPA/n-3 bal）、SALはn-3 supp食（SAL/n-3 supp）、VPA n-3はn-3 supp食（VPA/n-3 supp）である（時系列と実験手順は付録図S10に詳述）。オスとメスの子どもは離乳時（生後28日目、P28）に分離され、1ケージあたり2～5匹のグループで飼育され、水への自由なアクセスと、それぞれのダムと同じ飼料への制御されたアクセスを受けた。ダムの体重（生後14日目、P14）およびオスとメスの子供の体重（4週目、5週目、6週目、7週目、8週目）を補足図S8に示す。オスとメスの子供の食物摂取量を補足図S9に示す。雄および雌の子孫は行動解析のために以下の8群のいずれかに影響された：SAL/n-3 bal雄29頭および雌39頭、SAL/n-3 supp雄36頭および雌27頭、VPA/n-3 bal雄27頭および雌28頭、VPA/n-3 supp雄26頭および雌26頭。腸内細菌叢、FAプロファイル、炎症マーカーについても同じ動物を用いた。このために、1群につき5匹のマウスを無作為に選択し、同腹・同性の動物は2匹までとした。
母子行動実験
母体行動実験は、SAL/n-3 bal（n = 15）、SAL/n-3 supp（n = 14）、VPA/n-3 bal（n = 13）、およびVPA/n-3 supp（n = 12）群で行った。仔犬の回収に関する堰の性能は P9 で評価された。このため、仔ウシと牝ウシをホームケージから5分間離し、再びケージに戻した。仔馬や環境に対する堰の行動を15分間記録し、Solomon Coder（András Péter, Keele, UK）で解析した。
P9、P11、P13の右旋回反射、P12からP16の開眼を測定することにより、子供の発達のマイルストーンを評価した。シリンダー内の自発的活動はP48で記録し、グルーミングと飼育のスコアリングのために、前述3,72と同様にSolomon Coder (András Péter, Keele, UK)を用いた。自動歩行分析システム（Gaitlab, Viewpoint, France）を用いて、P49で自発歩行中の空間的、時間的、運動学的歩行パラメータを分析した。社会的相互作用は、前述3,73と同様に3室試験（3-CT）を用いてP50からP60の間で評価した。
組織処理、免疫組織化学および立体計測
行動実験終了後、組織処理のためにマウスをペントバルビタール（120mg/kg）で深く麻酔した。動物の灌流、脳の回収、組織の切片化、クレシルバイオレット/ニュートラルレッド染色は、既述の方法で行った4。crus IおよびIIの小脳領域内のPC数の立体学的推定は、optical fractionator法（Mercator Software, Explora Nova, France）を用い、系統的ランダムサンプリングを行い、以下のグループで行った： [Crus I： Crus I: SAL/n-3 bal（男性 n = 11、女性 n = 13）、SAL/n-3 supp（男性 n = 11、女性 n = 7）、VPA/n-3 bal（男性 n = 10、女性 n = 11）、VPA/n-3 supp（男性 n = 10、女性 n = 9）］および［Crus II： SAL/n-3 bal（男性n＝11、女性n＝12）、SAL/n-3 supp（男性n＝12、女性n＝9）、VPA/n-3 bal（男性n＝10、女性n＝11）、VPA/n-3 supp（男性n＝10、女性n＝9）］。
糞便マイクロバイオーム解析
糞便サンプルは、泌乳期（P15、P20、P22）および離乳後の子牛（P36、P41、P43）の両方から採取した。サンプルはDNA抽出（RNA Protect, Qiagen, Venlo, The Netherlands）まで核酸保存バッファー中-80℃で保存した。ウェットラボおよびバイオインフォマティクス解析は、既述の通り行った74,75。希少化曲線で検証した後、α多様性指標（Chao1′sおよびShannonの指標）およびβ多様性指標（Bray-Curtis非類似度および加重UniFrac76）を決定する前に、希少化（1サンプルあたり5000配列にサブサンプリング）を行った。ANCOMを使用して、グループ間で発現量の異なる属を同定した77。
qPCRによる炎症メーカーの解析
炎症過程に関与する遺伝子のRNA発現は、以前に記載された方法で調べた78。簡単に説明すると、TRIzol抽出キット（Invitrogen, Life Technologies, Saint-Quentin-Fallavier,France）を用いて、ダムおよび雌雄の子孫の半小脳からRNAを抽出した。RNAの純度と濃度は、Nanodrop 1000 spectrophotometer（Nanodrop technologies, Wilmington, DE, USA）とバイオアナライザー（Agilent, Les Ulis, France）を用いて測定した。逆転写は、Superscript IV（Invitrogen, Life Technologies, Saint Aubin, France）を用いて1～2マイクログラムのRNAに対して行った。腫瘍壊死因子α（TNF-α、Mm00443258_m1）、トランスフォーミング増殖因子β1（TGF-β1、Mm01178820_m1）、アルギナーゼ1（Arg1、Mm00475988_m1）を中心に、前述78のようにTaqMan®特異的プライマーを用いて目的の遺伝子を増幅した。ハウスキーピング遺伝子はβ2ミクログロブリン（B2M、Mm00437762_m1）であった。蛍光はLightCycler® 480 instrument II (Roche, La Rochelle, France)で測定した。データは比較閾値サイクル（Ct）法を用いて解析し、結果はコントロール標的mRNA発現に対する相対的な倍数変化として表した。
小脳と肝臓の脂肪酸の分析
肝臓および小脳の脂肪酸は、既述の方法で分析した79,80,81。簡単に述べると、肝臓と小脳の脂質はFolchの方法82に従って抽出し、FAはMorrisonとSmithの方法83に従ってトランスメチル化し、FAメチルエステル（FAME）はスプリットインジェクターと炎イオン化検出器、CPSil88-シリカキャピラリーカラム（100 m×0.25 mm i.d.、膜厚0.20 μm、Varian、Les Ulis、フランス）を備えたFOCUS GCガスクロマトグラフ（Thermo Electron Corporation）で分析した。インジェクターは250℃、検出器は280℃に保った。キャリアガスには水素を使用した（入口圧力210kPa）。オーブン温度は60 °Cで5分間固定し、15 °C/分の速度で165 °Cまで、さらに2 °C/分の速度で225 °Cまで昇温し、この温度で17分間維持した。FAMEは市販の標準品と比較することで同定した。FA組成は、全FAに占める割合で表した。
統計分析
挙動に関する実験では、データは平均値±平均値の標準誤差で表し、細胞および代謝データは中央値±最小～最大値で表した。データはGraphPad Prism-9 software (La Jolla, California, USA)を用いて解析した。外れ値はGrubbsの検定により同定し、その後の統計解析から除外した（1つの結果につき最大1つの外れ値を除外）。二元配置または三元配置の分散分析（ANOVA）を行い、必要に応じてTukeyポストホック多重比較検定を行った。すべての解析において、p値＜0.05を有意とした。全群に関する詳細な統計解析は、補足表S3-S15に掲載されている。その他の詳細な統計解析および生データは、合理的な要求があれば入手可能である。
ARRIVEガイドライン
本研究はARRIVEガイドラインに準拠している。
データの入手可能性
腸内細菌叢解析の生データは以下のサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/PRJNA854167）で入手できる。Accession SRA#はSRR19906240からSRR19906299まで。詳細な統計解析は補足資料（Suppl. Tables S3-S15）に含まれている。その他の実験の詳細および生データは、著者らに問い合わせれば入手できる。
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謝辞
この原稿で詳述した結果につながる研究は、医学研究財団（MJ）およびCPER-FEDERプログラム（MJ）、FRC CONNECT（SL）、Région Nouvelle Aquitaine（SLおよびMJ、2019-1R3M08）から資金提供を受けた。VTはヌーヴェル・アキテーヌ地域圏/医学研究財団の共同博士研究員。MTはNouvelle-Aquitaine Region/Insermより共同博士研究奨学金を授与された。本研究は、PREBIOSプラットフォーム（Université de Poitiers）の設備と専門知識の恩恵を受けている。著者らは、リピドミクス解析のために眼と栄養研究グループ（UMR1324 INRAE、ディジョン、フランス）の研究スタッフに感謝する。また、Jeffrey ArshamとNathaniel L. Ritzの丁寧な校正に感謝する。これらの結果の一部は、最近パリで開催されたFENS会議でポスター形式で発表された（2022年7月）。
著者情報
著者および所属
ポワチエ大学、Inserm、実験・臨床神経科学研究所、ポワチエ、フランス
ヴァランティーヌ・ターパン、モード・シャフハウザー、マチュー・タボー、エリック・バラド、ジャン・エマニュエル・ロングヴィル、モーリーン・フランシュトー、モハメド・ジャベール
ポワチエ大学、Inserm、PHAR2、ポワチエ、フランス
クリストフ・ビュルコア & マキシム・ピション
フランス、ポワチエCHU
クリストフ・ビュルコア、マキシム・ピション、モハメド・ジャベール
ボルドー大学、INRAE、ボルドーINP、NutriNeurO、UMR 1286、ボルドー、フランス
アニエス・オーベール、コリーヌ・ジョフレ、ソフィー・レイエ
貢献
方法論、データ収集、調査、執筆、編集：方法論、データ収集：V.T：方法論、データ取得：M.S.、E.B.、M.T：方法論、データ収集、調査、編集：J.E.L.、A.A.、M.F.、C.B：コンセプト立案、プロジェクト管理、検証、編集：M.P： S.L.、C.J. 構想立案、資金獲得、検証、原案作成、執筆・編集、プロジェクト管理、監督： M.J.投稿前に全著者が投稿原稿を承認した。すべての著者は、自分自身の貢献に対して個人的に責任を持つこと、また、たとえ自分が個人的に関与していないものであっても、研究のいかなる部分の正確性や完全性に関する疑問が、適切に調査、解決され、文献に記録されることを保証することに同意する。
筆者
Mohamed Jaberまで。
倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
追加情報
出版社からのコメント
シュプリンガー・ネイチャーは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っている。
補足情報
補足情報。
権利と許可
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Turpin, V., Schaffhauser, M., Thabault, M. et al. バルプロ酸に胎内暴露されたマウスは、多価不飽和脂肪酸強化食を与えても自閉症関連障害を示さない。Sci Rep 13, 11235 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38423-z
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受理2023年03月03日
受理2023年7月07日
2023年7月11日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41598-023-38423-z
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自閉症スペクトラム
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サイエンティフィック・リポーツ (Sci Rep) ISSN 2045-2322 (online)
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