糞便微生物叢移植はHIVにおける炎症のプロテオーム・ランドスケープを変化させる：細菌のドライバーを同定する

哉百名

2024年6月15日 17:36

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研究論文

糞便微生物叢移植はHIVにおける炎症のプロテオーム・ランドスケープを変化させる：細菌のドライバーを同定する

クラウディオ・ディアス＝ガルシア、エレナ・モレノ、アルバ・タラベラ、ルシア・マルティン＝フェルナンデス、他10名

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https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-4474258/v1

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ステータス
査読中

マイクロバイオーム

バージョン1
2024年06月09日掲載

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要旨
背景
有効な抗レトロウイルス療法にもかかわらず、HIV感染者（PWH）は全身性の炎症が持続し、罹患率と死亡率が増加している。糞便微生物叢移植（FMT）による腸内細菌叢の調節は、新規の治療戦略である。われわれは、低用量FMTとプラセボの反復投与後の炎症経路におけるプロテオミクス的変化を評価することを目的とした。

方法
この二重マスク、プラセボ対照パイロット研究では、安定した抗レトロウイルス療法（ART）を受けているPWH29人を対象に、8週間にわたって毎週FMTをプラセボと比較し、全身性炎症に対するプロテオミクス的影響を評価した。Faecalibacteriumおよび酪酸プロファイルの高い3人の便ドナーが選択された。血漿中の344の炎症性タンパク質のプロテオーム変化をProximity Extension Assayを用いて定量した。同時に、ショットガンメタゲノミクスにより、腸内細菌叢の組成の変化と機能のアノテーションを行った。一般化加法モデルを用いて、タンパク質の発現動態を評価した。最も関連性の高いタンパク質を選択し、線形混合モデルを用いて経時的なマイクロバイオーム組成および機能性との相関を探索した。

結果
FMTは、IL-6やTNFのような確立された死亡予測因子を含む45種類の炎症性タンパク質の血漿中濃度を有意に低下させた。その中にはCCL20やCD22のようなタンパク質も含まれていた。FT3LG、IL17A、IL6、IL10RBなどの変化を同定したが、これらは複数の細菌種と相関していた。ルミノコッカス科、サクシニブリオナ科、プレボテラ科、クロストリジウム属内の特定の細菌種と、それらに関連する遺伝子や機能が、炎症マーカーの変化と有意に相関していることがわかった。

結論
FMTによる腸内細菌叢の標的化調節は、PWHにおける全身性炎症を効果的に調節し、持続的な効果を示した。これらの知見は、この集団における炎症関連合併症を緩和する治療標的としてのマイクロバイオームの可能性を示唆しており、マイクロバイオームに基づく介入のさらなる研究と開発を促すものである。

HIV

全身性炎症

糞便微生物叢移植

プロテオミクス

ショットガンメタゲノミクス

マイクロバイオーム

図
図1
図1

図2
図2

図3
図3

図4
図4

図5
図5

図 6
図 6

図 7
図7

はじめに
抗レトロウイルス療法（ART）によって治療成績は著しく改善したが、HIV感染者（PWH）は依然として持続的に高値の炎症マーカーを示し、死亡リスクの上昇につながる要因となっている [1, 2]。さらに、PWHは腸内細菌叢の組成と機能に明らかな変化を示し、免疫機能障害を持続させているようである [3-6] 。このことから、PWHのマイクロバイオームを改変して炎症を抑えることはできるのかという疑問が生じる。

HIV/AIDSでは、CD4 + T細胞、特にIL-17を産生する細胞の著しい減少が腸管固有層で起こる。粘膜バリアの維持に重要なIL-17産生細胞が選択的に失われることで、「リーキーガット」となり、細菌の移動と全身性の炎症が引き起こされる [7] 。腸内細菌叢は、様々なメカニズムを介してこのプロセスに重要な役割を果たしている。例えば、ビフィズス菌のような特定の微生物は、粘膜の欠損を予防し、微生物の転移してくるのを抑え、免疫の回復をサポートする。対照的に、サクシニブリオナ科やエリシペロトリカ科のような他の微生物は、炎症性分子に対抗し、抗ウイルス化合物を蓄積する可能性がある [8, 9]。注目すべきは、腸細胞のバリア機能を維持し、免疫寛容を促進することで知られる重要な酪酸産生菌であるラクノスピラ科とルミノコックス科が、PWHではしばしば枯渇していることである [10] 。

しかし、このような集団ではマイクロバイオームが困難な治療標的であることが証明されている [11] 。食事療法 [12]、プレバイオティクス [13]、プロバイオティクス [13、14]、リファキシミンのような非吸収性抗生物質 [15、16] などのこれまでの介入は、マイクロバイオームの調節や炎症の軽減には限られた成功しか示しておらず、このような治療に対するマイクロバイオームの回復力を示している。そこで我々は、安定したARTを受けている30人のPWHを対象に、プラセボ対照パイロット試験を実施した。この二重盲検試験では、参加者を週1回の糞便微生物カプセルを投与する群とプラセボを8週間投与する群に無作為に割り付け、酪酸に富み、抗炎症性の微生物叢プロフィール（Faecalibacteriumの割合が高く、Prevotellaの割合が低い）を持つ便ドナーを選択した。その結果、糞便微生物叢移植（FMT）は、HIVに関連したディスバイオーシスに対抗し、腸内細菌叢αの多様性を増加させ、特に最近抗生物質を使用した人において、一過性のドナー微生物叢統合を達成できることが示唆された。FMTは、LachnospiraceaeとRuminococcaceaeのレベルを顕著に増加させ、腸内脂肪酸結合タンパク質レベルを改善した [17] 。

PWHにおける炎症に対するFMTの影響についての理解を深めるため、ここでは血漿中の344種類の炎症性タンパク質パネルに対するFMTの影響を分析した。また、炎症性タンパク質と腸内細菌叢の組成および機能との主な相関関係を同定し、宿主とマイクロバイオームとの相互作用についても検討した。

材料と方法
研究デザインと設定
本試験は、無作為二重盲検プラセボ対照パイロット試験（REpeated Fecal microbiota REStoration in Hiv -REFRESH-）の事後解析である。参加者は、2017年1月27日から6月29日の間に、スペイン・マドリードのHospital Universitario Ramón y CajalのHIVユニットから募集した。参加者は、少なくとも48週間の間、血漿HIV RNAが37コピー/mL未満であり、免疫活性化が進行している指標としてCD4/CD8比が1未満である安定したARTを受けているPWHであった[18]。除外基準は、年齢＜18歳、妊娠、化学療法または抗生物質の使用予定、好中球減少＜500cells/μLまたはCD4数＜350cells/μL、活動性感染症、または嚥下障害であった。オリジナルの研究発表では、データ収集、ドナーのスクリーニング、FMTの準備、無作為化、サンプル処理について詳述されている[17]。

循環炎症性タンパク質のプロテオミクスプロファイリング
80℃に保存しておいた合計116のEDTA血漿サンプルを解凍し、ボルテックスミキシングした後、プロテオミクス解析用にプレートをロードした。Olink inflammation panelを用いて368種類の炎症性タンパク質を測定し（Olink Proteomics, Uppsala, Sweden）、116検体中115検体が品質管理に合格し、368種類中344種類のタンパク質が50％以上の検体から検出された。FMT群、プラセボ群ともに50％以上のサンプルで発現が検出限界以下であった場合、タンパク質は検出されなかったとみなされた。必要な2回の実行におけるバッチ効果を軽減するため、各実行でプラセボ群とFMT群の両方からのサンプルが均等になるようにし、1人の参加者からのサンプルはすべて同じバッチ内で分析した。Proximity Extension Assay（PEA）技術を用いてタンパク質濃度を測定し、結果をlog2スケールでの相対的なタンパク質定量単位であるNormalized Protein Expression（NPX）値で表した[19]。

プロテオーム解析の機能予測
FMTにおける46の発現差のある炎症性タンパク質（DEIP）に関連する最も関連性の高いパスウェイを推定するために、Express Analysisモードを使用してリストをhttp://metascape.org [20]にアップロードした。このツールは、RNA-seqやプロテオミクス解析の異なるデータベースと比較して濃縮解析を行う。最も有意な結果が得られたCytoscapeネットワークを図4に示す。このネットワークでは、各用語は円のノードで表され、そのサイズはその機能に該当する入力タンパク質の数に比例し、その色はクラスタの同一性を表す（すなわち、同じ色のノードは同じクラスタに属する）。類似度スコアが0.3以上の用語はエッジでリンクされる（エッジの太さは類似度スコアを表す）。紫色の強さはエッジの束によるものである。Protein-Protein Interactionネットワークについては、過去に実証された相互作用のみを比較するソフトウェアです。より広範なタンパク質ネットワークから分子複合体を推論するには、MCODE（Molecular Complex Detection）アルゴリズム[21]を使用する。

ショットガンメタゲノミクス
サンプルの収集とDNA抽出。糞便サンプルは、Omnigene Gut kit（DNA Genotek社製）に保存した。Omnigene Gut kitには、（RNAlaterやTris-EDTAに比べて）糞便微生物群集構造DNAの組成をより良好に保存する安定化剤溶液が含まれており[22, 23]、マイクロバイオーム解析に利用できる。糞便サンプルは分注し、使用するまで-80℃で凍結保存した。

ライブラリーの調製と配列決定。糞便サンプルからのDNA抽出は、MagNA Pure LC Instrument、ロボットワークステーションを用いて行い、MagNA Pure LC DNA Isolation Kit III（Roche）を適用した。その後のDNAライブラリーの調製は、Illumina DNA Prep Reference Guide 1000000025416-10に概説されているプロトコルに準拠し、Illumina DNA Prep Kit（Illumina、参考文献20060059）を利用した。ライブラリー調製プロトコルを開始する前に、入力DNAを0.2 ng/µlの濃度に標準化した。マルチプレキシング段階では、Nextera DNA CD Indexes（イルミナ、参考文献20018708）を使用した。ライブラリーサイズは、イルミナのライブラリー調製プロトコルの規定に従って、調製キットに含まれるサンプル精製ビーズを用いて精製した。ライブラリーのサイズ分布は、HS NGS Fragment Kit（1-6000bp）（Agilent, reference DNF-474-0500）と共にFragment Analyzer 48-Capillary Arrayを用いて確認した。確定したライブラリーは、NextSeq 2x150bp paired-end reagent kit（NextSeq 500/550 High Output Kit v2.5、参考文献20024908）を用いてMiSeq Sequencerでシーケンスしました。このプロセスは、スペイン、バレンシアのFISABIO Sequencing and Bioinformatics Serviceで、メーカーの指示（Illumina MiSeq reference guide）に従って実施した。

前処理および品質管理。本解析で使用した配列はすべて品質管理に合格し、Trimomatic v0.33（ペアエンド法、最小長100、平均品質30）[24]を使用してリードの長さと品質をフィルターした。異常値はseqkit v0.10.1[25]を用いて同定した。

分類学的アノテーションと細菌量の定量化。ショットガンデータは、マーカー遺伝子分類学的配列分類器mOTUs v2.1.1をデフォルトパラメータで用いて解析した[26]。ゲノム分類データベース（GTDB）を使用して、mOTUsのアノテーションを特定の細菌分類群にマッピングした[27]。

コンティグカバレッジのアセンブルと定量化 MetaSPAdes（SPAdesゲノムアセンブラv3.15.2、metaSPAdesモード）をトリミングリードのnovoアセンブルに使用した[28]。コンティグがアセンブルされると、CoverM v0.6.1（https://github.com/wwood/CoverM）が実行され、各フラグメントの存在量が計算された。各コンティグのカバレッジはRPKM（Reads Per Kilobase of transcript per Million reads mapped）として定量した。

機能アノテーション eggNOG-mapper v2.1.11を、eggNOG-mapperウェブサーバー(http://eggnog-mapper.embl.de/)で指定されたデフォルトパラメータで機能アノテーション[29]のために実行した： 0-001 e-value; 60 bit-score; 40 identity percentage; 20% coverage and 20% subject coverage. eggNOG-mapperの検索とアノテーションステップは、Prodigal v2.6.3 (--genepred prodigal) [31]によって予測されたタンパク質に対して、Diamond on blastx mode (-m diamond) [30]を用いて実行された。

機能プロファイリング。eggnog-mapperの結果を処理し、機能プロファイルとアバンダンスマトリックスを作成するスクリプトはすべてPython 3でde novoで実装した。KEGGオルソログ(KO)と新規遺伝子ファミリーのアノテーション[32]を含むeggnog-mapperの標準出力の両方をカバーする2つの異なる実行モードが実装された。

定量化と統計解析
各週のDEIPの解析は、FMT群とプラセボ群間の各アッセイについて個別のt検定を実行し、偽発見率（FDR）補正に基づいてp値を調整するolink_ttest関数を用いて実施した。本研究の縦断的実験デザインを十分に活用するために、Rパッケージmgcv [33]を用いて、FMTとPlacebo間のDEIPを総合的に検出するために一般化加法混合モデルも使用した。モデルは以下のように指定した：

NPX～group + s(week, k = 4) + s(week, k = 4, by = group) + s(patientid, bs = "re")

この方法は、タンパク質レベルが一定の割合（非線形）で変化せず、経時的にグループ間で変化する可能性を考慮するために選択された。

DEIPsと細菌量、または細菌遺伝子とアノテーションされた機能の経時的変化の間の相関を計算するために、lme4 [34]およびlmerTest [35]パッケージを用いて、治療群とタイムポイントを共変量として導入した線形混合効果モデルを使用した：

NPX ~ bacterial_feature + group + week + (1 | patientid)

この方法が選択された理由は、縦断的データの相関を効果的に管理し、炎症の潜在的な細菌ドライバーを特定するために必要な線形関係を捉えることができたからである。我々は、igraphパッケージ[36]を用いて、経時的な細菌量またはその遺伝子とDEIPsとの機能の間の有意な相互作用をネットワークで表現した。

研究承認
本研究プロジェクトは、倫理委員会（承認番号：165/16）により承認され、すべての参加者は研究手順を開始する前にインフォームドコンセントを行った。インフォームド・コンセントを提供できない被験者、または代理人からの同意書をもって口頭同意が文書化された被験者は、本研究に含まれなかった。臨床試験登録識別番号（clinicaltrials.gov）： NCT03008941。

結果
研究集団の一般的特徴
30名の参加者を募集し、無作為に治療（FMT）群とプラセボ群の2群に分けた。両群から0週、1週、8週、24週に検体を採取した。研究対象者の特徴を表S1にまとめた。要約すると、29人の参加者が評価を完了した。本試験の参加者は、男性と性交渉を持ち、HIV感染が十分にコントロールされている中年男性を代表する集団であった。本試験中の安全性および臨床事象については、既報[17]に記載されている。既報の通り、食物摂取量、エネルギーおよび栄養素の摂取量に群間で顕著な差はなかった。

糞便微生物叢移植（FMT）は血漿中の炎症性タンパク質の発現パターンに変化をもたらす
FMTは、PEAによって評価された血漿中の炎症性タンパク質の発現パターンに違いをもたらした。ヒートマップで可視化すると（図1）、FMT群ではプラセボ群と比較して、ベースライン（0週目）の炎症性の高い状態から、24週目まで持続する炎症性の低いプロファイルへと、複雑だが明瞭にシフトしていることが明らかになった。

評価された344のタンパク質（図1のヒートマップの線）の教師なし階層的クラスタリングにより、共制御タンパク質の2つの主要なクラスタが同定された。経時的な治療効果を理解するために、ヒートマップの列をグループごと、週ごとにクラスタリングした。FMTコホートでは、治療後に炎症マーカーの発現が顕著に減少し（赤のNPX値が高い状態から青のNPX値が低い状態へ）、1週目に最も顕著な減少が見られ、それはFMT中止後も持続した。一方、プラセボ群では、炎症性タンパク質の発現は経時的に減少しなかった（青で示されるNPX値が低い方から、赤で示されるNPX値が高い方へ）。このことは、FMT介入による抗炎症効果の持続を示唆している。

次に、ベースライン時と治療後（1週目、8週目、24週目）に、プラセボ群に対するFMT群のDEIP数を比較することで、タンパク質発現に対するFMTの影響を評価した。図2は、プラセボ群に対してFMT群で過剰発現した炎症性タンパク質の数が減少していることを示しており、0週目には250個あったタンパク質が、1週目には176個、8週目には126個、24週目には76個に減少している。FMT群とプラセボ群では、当初、発現量の異なるタンパク質の数は同じであった。しかし、24週目には、FMT群はプラセボ群と比較して、12個の発現低下蛋白があったのに対し、2個の発現過剰蛋白があった。このことは、FMTが時間とともに炎症を徐々に抑制する可能性を示唆している。

細胞傷害性、サイトカインの刺激、感染部位への免疫細胞のリクルートメントに関与する特定の炎症性タンパク質は、FMT後に経時的に異なる発現を示した。

介入によって顕著な影響を受けたタンパク質を特定するために、一般化加法モデル（GAM）モデルを用いた。このアプローチは、群間および経時的なタンパク質レベルの変動、非線形分布を柔軟にモデル化するために選択された。注目すべきことに、プラセボ群では、CTSCとF2Rの2つのタンパク質以外には、タンパク質の発現量に有意な変化は観察されなかった。逆にFMT群では、表S2および補足図1-3に詳述されているように、解析の結果46のDEIPが明らかになった。最も統計的有意性の高いものを図3に示し、経時的な動態を評価した。FMTは、炎症促進因子と制御因子を含む、調査した46のタンパク質のうち45の血清レベルの顕著な低下を誘導した。このことは、FMTの広範な免疫調節効果を示唆している。興味深いことに、主に特定の神経細胞集団の生存と分化を支援する神経栄養因子であるペルセフィン（PSPN）は、FMT後に増加を示した唯一のタンパク質であった。46のDEIPの主な機能の一般的な説明は、表S3に示されている。

次に、46のDEIPの生物学的機能を探索するために、METASCAPEを用いてネットワーク解析を行った（図4A）。ネットワーク内の中央のノードは、異なる色で描かれた類似した機能に関与するタンパク質を強調し、紫色のエッジでそれらのつながりを示した。ハイライトされた経路には、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用、IL-10シグナル伝達、IL-6シグナル伝達経路が含まれる。これらは免疫調節に極めて重要であり、FMTがHIV患者の自然免疫反応と適応免疫反応を調節する可能性を示唆している。膵臓がんにおけるT細胞調節や腫瘍壊死因子産生調節などの経路の存在は、FMTが消化管生理学を超える可能性のある、全身の免疫機能に大きな影響を及ぼすことを示している。中心的で高度に相互接続されたノード（サイトカイン相互作用、MAPKシグナル伝達など）は、これらの経路がFMTによって変化するネットワークの極めて重要なハブであることを示唆している。これらの中心的な役割は、FMTが炎症反応と免疫反応を広く調節する可能性を示しており、おそらく炎症性タンパク質の血清レベルの全体的な低下を説明するものであろう。

大規模なタンパク質相互作用ネットワークで密に結合した領域を見つけるMCODEアルゴリズムを用いてタンパク質間相互作用のクラスターを探索したところ、2つの機能的複合体が重要なものとして浮上した（図4B）。(図4B）：i）サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用複合体、TNF_251、IL6、ケモカイン（CCL20、CCL22）のような重要な炎症性メディエーターを含む。炎症反応を促進するこれらのタンパク質間の相互作用と、FMTによるそれらの調節は、観察された炎症性タンパク質の減少を説明しうる（図3および補足図1-3）。 ii) TNFとその受容体からなるNF-κBシグナル伝達経路クラスター。NF-κBは炎症関連遺伝子を制御する転写因子であることから、FMT後のその顕著性は、炎症性遺伝子発現の有意な調節を示唆している。

細菌種の存在量と炎症性タンパク質発現の相関ネットワーク
観察された炎症のシフトの背後にある微生物ドライバーを調査するために、我々は、菌種レベルでのマイクロバイオーム組成の変化と、血漿中の先に選択した46のDEIPsの変化との相関混合モデルを当てはめた。検出された2074の異なる細菌種から、便中細菌種の変化と血漿中DEIPsとの間に、調整P値閾値0.05で385の関連性が同定された。ファーミキューテス門、Ruminococcaceae、Succinivibrionaceae、Prevotellaceae、およびClostridium属内のいくつかの細菌種は、血漿中のDEIPsと最も強い関連を示した（表S5）。

Clostridiales（クロストリジウム目）は炎症に最も強い影響を及ぼし、少なくとも15種の血漿中DEIPsの変化と直接相関する変化を示したほとんどすべての生物種がこのグループに属していた（表S6）。具体的には、Clostridium属とRuminococcaceaeのメンバーが炎症性タンパク質レベルの変化と頻繁に関連していた。Clostridium属は、抗炎症作用を持つ酪酸のようなSCFAsを産生することで知られており、特に注目された[37]。具体的には、これらの菌種は、OSCAR、CLEC7A、SIRPB1、ADAM23、LAIR1、CKMT1A_CKMT1B、PLAUR、NCR1、IL10RB、CD79B、LGALS9、LTBR、CD48、FGF5、FCAR、CCL25、TNFRSF13B、IL1RNを含む広範囲の炎症性タンパク質と相関していた。さらに、SuccinivibrionaceaeとPrevotellaceaeの家族、およびFaecalibacterium、Erysipelotrichaceae、Roseburia LactobacillusとLactococcus属に含まれる機能的に関連するものとして以前に報告された他の種は、様々なDEIPと有意な関連を示した。

生物学的関連性をさらに精緻化し、偽陽性の関連性のリスクを軽減するために、DEIPsの変化と最も強い関連性を示す属の種が、受診者間でどの程度出現しているかを評価した。これは、有病率を計算し、来院期間中の存在量を要約することによって行った（図5および表S7）。具体的には、FMT群では、Butyricicoccus属、Clostridiales gen. incertae sedis属、Clostridium属、Bacillota gen. incertae sedis属、Ruminococcus属などの属が一貫して存在することが観察された。

並行して、ある種のタンパク質は細菌種と繰り返し関連していた。例えば、FLT3LG、IL12B、IL17A、OSCAR、SIRPB1の変化は、少なくとも15の異なる細菌種と相関していた。このタンパク質のサブセットは、宿主における微生物駆動性の炎症反応のバイオマーカーとして機能するかもしれない（表S8）。糞便中の細菌種と血漿中の46のDEIPとの間のこれらの関係は、図6のネットワーク解析に示されている。

糞便中の細菌からアノテーションされた機能の変化は、FMT後の血漿中の炎症性タンパク質の発現の変化と相関する。

最後に、FMT後に観察された炎症性タンパク質の発現の変化に関与している可能性のある細菌機能を解明することを目的とした。そのために、細菌遺伝子数と46の有意なDEIPsの変化との相関を確立するために混合モデルを当てはめた。調整P値閾値0.05で、細菌遺伝子数の変動とDEIPsの間に637の有意な関連を同定した（表S9）。細菌遺伝子とDEIPsの間の正の関連と負の関連のバランスのとれた割合は、これらの遺伝子が血漿中のDEIPsのアップレギュレーションとダウンレギュレーションに役割を果たしている可能性が高いことを示している。

細菌遺伝子のサブセット、yhcR、ectB、grdI、wzm、XK27_00670、およびyulBは、表S10に詳述されているように、それらの変化が46の選択されたDEIPsのうち20以上の変化と強く相関していたことから、特に重要であることが判明した。EctBはエクトインの生合成に関与し、ヒト細胞を保護し、炎症反応を緩和する可能性があり、grdlとwzmはそれぞれ糖転移酵素とABCトランスポーターをコードし、免疫認識と抗原負荷を調節し、抗炎症環境に貢献する可能性がある。さらに、代謝過程におけるXK27_00670と胞子形成におけるyubLの役割は、微生物群集の動態と安定性に影響を与え、宿主の炎症経路にさらに影響を与え、腸管バリア機能を改善する可能性がある[38]。

表S8に詳述した少なくとも15種の細菌と相関するDEIPのうち、FLT3LG、IL17A、およびOSCARも少なくとも15種の細菌遺伝子と相関しており、これらのタンパク質に対する腸内細菌叢の潜在的影響が強調されている（表S11）。細菌遺伝子数の変化と46のDEIPsタンパク質との間のこれらの関係は、図7Aのネットワーク解析に示されている。

最後に、細菌ゲノムからの機能的注釈の変化を、先に選択した46の血漿DEIPsの動態と相関させた混合モデルを当てはめた。調整後のP値＜0.05の場合、機能的アノテーション数の変化とDEIPsの間に730の有意な関連を同定したが、より厳しい閾値（P値＜0.01）を適用した場合は272の関連が残った（表S11）。表S12に示すように、少なくとも2つのDEIPのシフトと相関する160の機能的アノテーションを同定した。最も影響力のある機能は、少なくとも14のDEIPと有意な関連を示し（表S13）、ArsRファミリー転写制御因子、塩基性エンドキチナーゼB[EC:3.2.1.14]、N-アセチルグルコサミン結合タンパク質A、ポリガラクツロナーゼ[EC:3.2.1.15]、フルクトース輸送系ペルミアーゼタンパク質、およびテイクロ酸エクスポーターが含まれた。これらの機能的変化は、PWHにおけるFMT後の炎症抑制の複数のメカニズムを示唆している。ArsRファミリーの転写制御因子は、解毒とストレス応答を増強し、炎症性刺激を軽減する可能性がある [39]。塩基性エンドキチナーゼBとN-アセチルグルコサミン結合タンパク質Aは、真菌や細菌の成分を分解し、抗原負荷と免疫活性化を低下させる可能性がある [40]。ポリガラクツロナーゼはペクチン分解を改善し、抗炎症性短鎖脂肪酸の産生を増加させる。フルクトース輸送系ペルミアーゼタンパク質は、フルクトースの効率的な利用を通じて細菌の有益な増殖を促進し [42]、一方、テイキュロン酸エクスポーターは細菌の細胞壁の完全性を強化する [43]。

最後に、IL1RN、IL17A、IL6の3つの血漿DEIPの変化は、注釈付けされた細菌機能の変化と最も明確に相関し、少なくとも24の機能がこれらの血漿タンパク質と関連していた（表S14）。IL6およびIL17AとHIVの免疫病態との間に確立された関連性を考えると [44, 45]、これらの知見は、炎症経路を調節し、炎症に関連した転帰の進行と管理に影響を及ぼす可能性のある腸内細菌叢の関連した役割を支持するものである。細菌の注釈付き機能の変化と46の血漿DEIPsタンパク質との間のこれらの関係は、図7Bのネットワーク解析に示されている。

考察
ART施行中のPWHにおける全身性炎症に対するFMTの反復経口投与の効果を検討するこの試験的ランダム化比較試験において、我々は幅広い炎症性蛋白質にわたって有意な減少を観察した。注目すべきことに、これらの効果は介入後16週間の最終診察まで持続しており、全身性炎症の持続的な調節が示唆された。プレバイオティクス、プロバイオティクス、シンバイオティクスを用いて腸内細菌叢を標的としたこれまでの介入（[11]に総説あり）とは異なり、本研究では炎症性タンパク質の包括的なパネルを評価することによって炎症の変化を直接測定した。さらに、以前のパイロット研究では、3つの異なる方法のFMT後のドナーの微生物叢の生着は限定的であったのに対し [17, 46, 47]、今回の研究では、その変化が炎症マーカーレベルの長期にわたる変動と有意に相関する潜在的な主要微生物種を同定しており、これによりマイクロバイオーム治療薬分野における標的介入の可能性を強調している。

これまでのところ、プレバイオティクス [48、49]、プロバイオティクス [14、50]、シンバイオティクス [13]、リファキシミン [15]など、ARTを受けているPWHの微生物叢を標的とした介入で、炎症を抑えたり、免疫回復を促進したりすることが説得力を持って証明されたものはない。多様な炎症性サイトカインに対する混合効果を報告した研究もあるが、炎症の評価は通常、限られた分子群に限定されている [17, 46]。われわれが以前に報告した研究では、経口FMTを繰り返すことで、腸内細菌叢構造に緩やかではあるが持続的な変化が生じることが示された。これは特に、PWH [10] でよく減少し、主要な酪酸産生菌であるRuminococcaceae科とLachnospiraceae科で顕著であった。同時に、腸管バリアの完全性のバイオマーカーであり、PWHにおける独立した死亡予測因子であるIFABPの減少がみられた [17]。ここで我々は、炎症に対するFMTの影響をさらに解明し、より広範な解決を達成した。

FMT後に解析された46のDEIPのうち、45は炎症促進領域と制御領域にわたってダウンレギュレーションを示した。特に、サイトカイン-サイトカイン受容体相互作用とIL-10経路を介したシグナル伝達の亢進は、FMTを受けた患者における抗炎症性プロファイルへの移行を示唆している。しかし、このような広範な調節は、単なる抗炎症作用にとどまらない広範な全身的影響を示唆しており、免疫応答の単純化された解釈を覆すものである。このような広範な調節低下は、慢性HIV感染 [1, 2, 18] において、ARTによる効果的なウイルス抑制にもかかわらず、しばしば亢進した活性化状態にある免疫系のリセットを反映しているのかもしれない。炎症マーカーの全般的な減少は、FMTが免疫反応を効率的に調節できることを示しており、炎症に関連する合併症のリスクを低減できる可能性があるが、炎症性タンパク質と調節タンパク質の両方の減少は、活性化した免疫系における恒常性への移行を反映している可能性がある。したがって、これらの知見は、より大規模な介入研究で再現される必要がある。この一般的な傾向とは対照的に、ペルセフィン（PSPN）レベルはFMT後に増加した。PSPNが神経細胞の生存と分化に重要な役割を担っていることを考えると、FMT後のPSPNの発現増加は、腸-脳軸に対する腸内細菌叢の影響に関する興味深い可能性を提起し、腸-免疫-神経軸の回復の特異的な経路、あるいはマイクロバイオーム改変に対する特異的な代償反応を示唆している［51］。

これらのタンパク質の機構的洞察をさらに調べるために、46のDEIPsのリストを用いて生物学的機能の濃縮解析を行った。同定されたタンパク質のほとんどは、急性炎症の中心的メディエーターであるTNF、発熱や急性期反応に関与するサイトカインであるIL1BやIL6、免疫細胞の走化性に関与するケモカインであるCCL20やCCL22などの炎症性サイトカインやケモカインを含む機能に関連していた。さらに、いくつかのタンパク質は第二のクラスターに分類され、リンパ組織の組織化やB細胞の機能に関与していることから、適応免疫応答の調節における役割が示唆された。例えば、TNFRSF13CはB細胞の発生に必須であり、TNFSF11（RANKL）はT細胞と樹状細胞の制御と骨代謝に関与し、LTBRはリンパ組織の発生に重要である。このように、これら46のDEIPは、HIVの免疫反応と臨床的進行において重要な役割を果たしており、炎症促進経路と抗炎症経路の両方に影響を及ぼしている。例えば、IL-6はARTを受けているPWHでしばしば上昇することが報告されており、この集団における死亡率の独立した予測因子となっている [1, 52]。TNFは、部分的にはシグナル伝達を介して、ART中の炎症とHIVの持続に関連している [53, 54]。CCL20（マクロファージ炎症性タンパク質-3αまたはMIP-3α）は、炎症部位への細胞のリクルートに関与するタンパク質であり、HIVでは一般的に上昇する [55] 。逆に、IL-10受容体であるIL10RAやIL-1受容体アンタゴニストであるIL1RNのようなIL-1経路の主要なタンパク質は、炎症に関連した心血管イベントの発症に特に関係している可能性がある [56, 57]。興味深いことに、微生物由来のシグナルは、上皮におけるこれらのタンパク質の発現に影響を与える可能性がある [58-60]。

ネットワーク解析により、FMT後のタンパク質発現変化の微妙な状況が明らかになり、すべてのDEIPがマイクロバイオームの変化によって一様に影響を受けるわけではないことが示唆された。我々は、FLT3LG、CCL20、IL17A、CLEC7A、ADAM23、OSCAR、SIRPB1、LAIR1、AMBN、CKMT1A_CKMT1Bを含むタンパク質のサブセットを同定し、それぞれ少なくとも20の異なる細菌種と有意な相関を示した。このことは、おそらく特定の微生物の代謝活性や免疫調節機構を介した、マイクロバイオームによる標的化された調節を示唆している。例えば、PWHでは、プレボテラ属菌によって腸の樹状細胞が活性化され、我々の研究でIL17-Aの変化と正の相関がみられた。これは樹状細胞の成熟と活性化を促進し、それによって抗原を提示しT細胞を活性化する能力を高める [61, 62]。

FMT群で減少したFLT3LGは、樹状細胞の発生と成熟に重要な役割を果たしており [63]、ヒト腸の優占的常在菌で主要な酪酸産生菌であるFaecalibacterium prausnitziiの変化と相関している [64]。他のDEIPは、病原体特異的防御機構の形成におけるFMTの潜在的役割を強調している。これらには、プレボテラ属のような特定の細菌によって直接制御される粘膜免疫に必須のCCL20 [65]、発現がマイクロバイオーム構成を調節するIL17A [66]、抗真菌免疫と自然免疫応答に関連するCLEC7A [67]が含まれる。これらのタンパク質と幅広い細菌種との関連は、FMTの有効性を評価し、生物学的調節効果を理解するためのバイオマーカーとしての可能性を強調している。

我々は、FMT後の血漿DEIPの変化と有意に関連する特定の細菌種を同定した。Clostridium属やRuminococcus属を含むClostridiales目の細菌種は、OSCAR、CLEC7A、IL17A、FLT3LGなどのタンパク質と頻繁に相関していた。これらの所見は、酪酸とフェーカリバクテリウムの含有量の高さに基づいて便ドナーを選択したことと一致しており、免疫応答の調節における酪酸産生菌の役割を強調している。我々の以前の解析では、Lachnospiraceae科とRuminococcaceae科で顕著な生着が確認され、48週間後もその量は増加したままであった[17]。酪酸はNF-κBシグナル伝達を阻害することができ [32]、その一因はヒトのヒストン脱アセチル化酵素を阻害することである [29, 48]。この阻害により、Foxp3のような制御性T細胞機能に関与する遺伝子の転写が促進される [68]。その結果、酪酸はヒト樹状細胞に寛容反応を誘導する。タンパク質間相互作用のネットワーク解析から、FMT後にNF-kBシグナル伝達経路が有意に制御されていることが同定され、この経路がFMT後のマイクロバイオームの変化に影響される重要な経路であることが示唆された。

少なくとも15種の細菌と関連したDEIPsのリストの中で、FLT3LG、IL17A、OSCARも少なくとも15種の細菌遺伝子と相関しており、腸内細菌叢がこれらのタンパク質に影響を及ぼす可能性を強調している。その結果、これらの蛋白質は微生物が駆動する炎症反応の指標となる可能性がある。また、血漿プロテオームの変化と相関する細菌機能の変化も見いだされた。同定された主な細菌機能には、転写制御（ArsRファミリー）、糖質代謝（塩基性エンドキチナーゼB、N-アセチルグルコサミン結合タンパク質A、β-グルコシドキナーゼ、シュウ酸脱炭酸酵素、ポリガラクツロナーゼ）、タンパク質分泌系（VI型分泌系分泌タンパク質Hcp）などがあった。さらに、細胞内輸送に関与するタンパク質（フルクトース輸送系パーミアーゼタンパク質、テイコ酸エクスポーター）や代謝過程に関与するタンパク質（3,4-ジヒドロキシフェニル酢酸2,3-ジオキシゲナーゼ、3-ヒドロキシプロピオニル-コエンザイムAデヒドラターゼ、セリン/スレオニンプロテインホスファターゼ6調節アンキリンサブユニット、GTPシクロヒドロラーゼIV）にも変化が見られた。

これらの細菌の機能は、FMTがPWHの炎症を抑えるメカニズムを示唆している。炭水化物の代謝と分解（エンドキチナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、シュウ酸デカルボキシラーゼなど）が促進されると、抗炎症作用と腸管バリア強化作用で知られる酪酸などのSCFAsの産生が増加する可能性がある [39, 41]。転写制御や分泌系に関与するタンパク質の存在は、細菌の病原性や宿主と微生物の相互作用を調節し、病原性細菌の負荷や関連する炎症を軽減する可能性があることを示している。細胞内輸送タンパク質の変化は、栄養吸収と微生物叢の安定性を改善し、より健康的な腸内環境に寄与する可能性がある [39, 42]。最後に、GTPシクロヒドロラーゼIVやセリン/スレオニンプロテインホスファターゼなどの酵素の変化は、宿主の免疫応答やシグナル伝達経路に影響を与え、観察された抗炎症作用にさらに寄与する可能性がある。

我々の結果を解釈する際には、いくつかの要因を考慮しなければならない。第一に、我々の以前の解析では、11回の研究訪問で16S rRNAシーケンスを利用したため、時間分解能は高かったが、分類学的な詳細には限界があった [17]。対照的に、今回の解析では4回の調査訪問にわたってショットガンメタゲノミクスを用いたため、サンプリングの頻度は低いものの、種レベルの解像度を達成することができた。この方法論の違いにより、今回の研究では分類学的な洞察はより詳細になったが、時間的な解像度は低くなった。ここでは、mOTUs2を用いてマイクロバイオーム構成を種レベルでプロファイリングした。サンプル数が限られているため、役割分担の精度を高めるためにこの方法を選択し、他のツールと比較して感度が低いにもかかわらず、誤発見のリスクを軽減した [69]。本研究では、重要な細菌遺伝子を機能またはタンパク質に割り当てることで、マイクロバイオームの機能を間接的に測定した。しかし、直接的な評価を行うには、トランスクリプトーム、プロテオーム、メタボロームなど、マイクロバイオームのより高い機能レベルを分析する必要があり、次回の研究で検討する必要がある。

このパイロット研究の長所としては、（i）ランダム化比較試験デザインにより、観察された変化を自然な微生物の変動ではなく、FMT介入に直接起因させることができること、（ii）新規プロテオミクスアッセイの使用により、先行研究［17、46、47］よりも詳細で効率的かつ正確な炎症性バイオマーカーの測定が可能であること； (v)経時的な変化を理解するのに役立つ包括的な縦断的解析、(vi)Faecalibacterium spp. と酪酸を多く含み、抗炎症作用をターゲットとしている。

ランダム化比較試験は因果関係を立証するために不可欠であるが、われわれの便中細菌と血漿タンパク質の縦断的相関分析は予備的なものと考えるべきである。免疫系は複雑に制御されており、介入に対して非線形な反応パターンを示すことが多い。このことは、FMTがどのように炎症を調節するのかを解明するための、さらなるメカニズム研究の動機付けとなる。さらに、今後の研究では、メタトランスクリプトミクス、メタプロテオミクス、あるいはメタボロミクスによってマイクロバイオームの機能を直接測定する必要がある。また、ドナーの選択、ベースラインのマイクロバイオーム組成、炎症プロファイル、抗生物質による前処理レジメンの必要性など、FMTの効果を高める可能性のある因子を探索することも引き続き重要である。

結論
本研究では、PWHにおける経口FMTによる炎症抑制の可能性を検討した。FMTは、IL-6やTNF［52, 70］のような確立された死亡率の独立した予測因子を含め、血漿中の炎症性蛋白レベルをプラセボと比較して低下させた。炎症の変化は、最終的なFMT処置の16週間後まで持続した。FT3LG、IL17A、IL6、IL10RBなどの変化が確認され、これらは複数の細菌種と相関していた。このタンパク質のサブセットは、宿主における微生物駆動性炎症反応のバイオマーカーとして機能する可能性がある。

さらに、Ruminococcaceae、Succinivibrionaceae、Prevotellaceae、Clostridium属内の特定の細菌種と、それらに関連する遺伝子や機能が、炎症マーカーの変化と有意に相関していることがわかった。これらの結果は、腸内細菌叢がPWHの炎症を緩和する治療標的となりうることを支持するものである。FMTやその他のマイクロバイオームに基づく介入の可能性を探るため、さらなる研究が必要である。

略語
HIV感染者（PWH）、糞便微生物叢移植（FMT）、抗レトロウイルス療法（ART）、一般化加法モデル（GAM）、差次的に発現した炎症性タンパク質（DEIPs）、近接拡張アッセイ（PEA）、正規化タンパク質発現レベル（NPX）、MCODE（分子複合体検出）、ジーンオントロジー（GO）

宣言
倫理承認と参加同意

本研究は倫理委員会（承認番号：165/16）により承認され、研究手順の開始前に参加者全員がインフォームド・コンセントに署名した。臨床試験登録識別番号（clinicaltrials.gov）： NCT03008941。

論文発表の同意

該当なし

データおよび資料の入手可能性

これらの解析に使用したデータは補助資料として入手可能であり、結果を再現するために必要なコードは我々のGitHubリポジトリ（https://github.com/einlabryc）にある。すべての配列は、European Nucleotide Archiveデータベースにアクセッション番号PRJEB75958で公開するために提出した。

利害関係

S.S.V.は、提出された研究以外では、Gilead Sciences社およびMikrobiomik社から教育的プレゼンテーションの開発に関する個人的な報酬を受け、MSD社およびGilead Sciences社から研究助成金を受けたことを報告している。S.M.は、ViiV Healthcare社からの助成金、個人的報酬、非金銭的支援、Janssen社からの個人的報酬、非金銭的支援、MSD社からの助成金、個人的報酬、非金銭的支援、Gilead社からの助成金、個人的報酬、非金銭的支援を報告している。

資金提供

本研究は、Instituto de Salud Carlos IIIおよびFEDER, Acción Estratégica en Salud (PI18/00154, ICI20/00058 and PI21/00041)から資金提供を受け、European Development Regional Fund 'A way to achieve Europe'(ERDF)から共同出資を受けた、 Gilead Fellowship (GLD16-00030)、Fundación Española para la Ciencia y la Tecnología (FECYT)のprecipitaプラットフォームからのクラウドファンディングプロジェクト、Finch Therapeuticsからの制限付き助成金。SEIMC-GESIDA財団は、本研究の安全性とデータモニタリング（GESIDA 9116）を支援した。本試験の資金提供者は、試験デザイン、データ収集、データ解析、データ解釈、報告書の執筆には関与していない。

著者らの貢献

コンセプト立案： SSV；方法論：方法論：SSV、EM、CDG、AT、MJG、SGBP、JHC；患者募集：患者募集：SSV、JPM、FD、MJV、SM；検査室測定：EM、LMP、LL、SM：検査測定：EM、LMP、LL、MJG；バイオインフォマティック解析：バイオインフォマティクス解析：CD、AT、SGB；バイオインフォマティクス解析の監督： SSV、EM、JHC。資金獲得： SSV；プロジェクト監督：原案執筆：SSV、EM、CDG：執筆-原案：SSV、EM、CDG；執筆-校閲・編集：全著者。

謝辞

本研究に参加したすべての患者と医療従事者に感謝する。本研究はInstituto de Salud Carlos III (PI18/00154, COV20/00349, ICI20/00058, PI21/00141)およびGilead Fellowships (GLD16/00030)の支援を受けた。SEIMC-GESIDA財団は本試験の安全性とデータモニタリング（GESIDA 9116）を支援した。本研究の資金提供者は、試験デザイン、データ収集、データ解析、データ解釈、報告書の執筆には関与していない。

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