葉酸は ACE2 をメチル化することにより SARS-CoV-2 の侵入を抑制する
Front. Microbiol.、2022年8月17日
Sec. Virology
https://doi.org/10.3389/fmicb.2022.980903
葉酸は ACE2 をメチル化することにより SARS-CoV-2 の侵入を抑制する
Yuanzhou Zhang1† Yechun Pang1† Baiyin Xu2† Xingshi Chen1, Shunshun Liang1, Jingying Hu1 and Xiaoying Luo1*‡ （元州張†、益春潘†、白銀許†、暁星洛†、暁星洛†、暁星洛†）。
1上海交通大学医学部仁済病院上海癌研究所癌遺伝子および関連遺伝子国家重点実験室（中国・上海
2上海浦東新区人民病院（中国・上海市
現在、COVID-19が大流行していることから、SARS-CoV-2の侵入の分子機構を解明し、その感染力を低下させる方法を見いだすことが求められている。我々は、SARS-CoV-2がマウスのACE2のタンパク質レベルを増加させることを見出した。葉酸と5-10-methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）はACE2プロモーターのメチル化を促進し、ACE2の発現を阻害する可能性があった。葉酸処理は，スパイクタンパク質，偽ウイルスおよび不活化真正SARS-CoV-2の宿主細胞への結合能を低下させた．したがって、葉酸処理は、マウスにおけるSARS-CoV-2の侵入およびSARS-CoV-2-中和抗体産生を減少させることができた。これらのデータは、葉酸の摂取量の増加がACE2の発現を抑制し、SARS-CoV-2の透過性を低下させる可能性を示唆している。葉酸はSARS-CoV-2感染予防と制御に重要な役割を果たすと考えられる。
はじめに
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2（SARS-CoV-2）によるコロナウイルス病2019（COVID-19）パンデミックは、世界中の公衆衛生、教育、および経済に悲惨な結果をもたらした（Gaoら、2020；Chakrabortyら、2021；Sunら、2021b）。コロナウイルスは急速に変異し（Artese et al., 2020; Kadam et al., 2021）、新しい変異はある程度まで免疫逃避を引き起こすため、コロナウイルスの予防と制御には課題がある（Altmann et al., 2021; Chmielewska et al., 2021; Callaway, 2021b; Wang et al., 2021b; The Lancet Infectious Diseases, 2022）。数理モデル（Bushmanら、2021）によると、SARS-CoV-2亜種は、集団に免疫が蓄積されても、感染力の強化と部分的な免疫逃避で拡散を続け、ワクチン接種の効果を制限し、パンデミックを悪化させると考えられています。したがって、感染性と免疫逃避を低下させることが重要な課題である。
ウイルスの免疫逃避を防ぐには、ワクチン接種が有効です（Weisblumら, 2020; Zhangら, 2021）。中和抗体レベルは、症候性SARS-CoV-2感染からの免疫防御を高度に予測することができます（Bushmanら、2021年）。mRNAワクチン（ファイザー、モデナ）、不活化ウイルスワクチン（シノバック、シノファーム）、アデノウイルスベクターワクチン（アストラゼネカ、カンシノバイオロジクス、ガマレヤ研究所、J&J）などのCOVID-19ワクチンのリリースは、ウイルスの免疫逃避を減らすのに貢献しています（Chung et al.、2021; Soiza et al.、2021). しかし、ワクチンは新しい亜種に対する防御力が低い可能性があるという証拠が増え、免疫逃避の可能性が高まっている（Forni and Mantovani, 2021; Callaway, 2021a）。
RNAウイルスであるSARS-CoV-2は、B型肝炎ウイルスなどのDNAウイルスよりも変異しやすい（Covid C. D. C. and R Team, 2021; Grint et al., 2021; Levine-Tiefenbrun et al., 2021; Rubin et al., 2021; Zhang et al., 2021）。さらに心配なのは、COVID-19の大流行がウイルスに変異の「温床」を提供しているという事実です。特定の必要性の新しい変種に対するワクチンの開発は、時間と資金、およびワクチン開発の課題のための高い頻度の突然変異をタイムリーに（ZhouとWang、2021）。したがって、既存のワクチンの中和抗体産生を安全かつ効果的に増加させる便利な方法が必要とされている可能性があります。
ACE2が人体に侵入するSARS-CoV-2の標的であることが明らかになり、SARS-CoV-2とACE2の結合を阻害することも治療の方向となった（Delorme-Axford and Klionsky, 2020; Tada et al, 2020; Vandelli et al, 2020; Oz et al, 2021; Wang et al, 2021a）。SARS-CoV-2の感染性は、主にSARS-CoV-2とACE2タンパク質の間の結合の強さに基づく（Huangら、2021年；Ozら、2021年）。科学者たちは、ACE2タンパク質とSARS-CoV-2との間の結合を減らすために多くの努力をしてきた：ポリ硫酸塩は、SARS-CoV-2のACE2結合部位付近の静電相互作用をブロックするために使用されてきた（Nie et al, 2021）、アプタマーはSARS-CoV-2の受容体結合ドメイン（RBD）と宿主ACE2の間の相互作用をブロックするように設計されており（Sunら、2021a）、ACE2修飾細胞外小胞は、SARS-CoV-2に結合するのに宿主細胞ACE2と競合するように設計されている（Kimら、2022）。しかし、ウイルスの感染性を低下させるために、上記の方法を臨床応用する前にやるべきことがたくさんある。ACE2タンパク質は、心血管疾患/腎症において重要な役割を果たします（Santosら、2018年；Evansら、2020年；Gheblawiら、2020年；Zhengら、2020年）。いくつかのACE2阻害剤が臨床的に使用されている。しかし、これらのACE2阻害剤は、健康な人には適用できません（Bavishiら、2020年；Caoら、2020年；Vaduganathanら、2020年；Southら、2020年b）。高血圧などの合併症は、患者の予後を決定する重要な因子であり、COVID-19（中国の症例報告。COVID-19流行時の患者1,099人のうち、高血圧が最も多い合併症で、推定有病率は15％でした；Xiong et al.、2020年）。ACE2のレベルを低下させると、ACE/AngII/AT1R軸とACE2/Ang1-7/MasR軸の間のバランスが崩れ、血管収縮と炎症作用が生じ、病気の進行に悪影響を及ぼす（Hatmalら、2020；Ozら、2021；Gintoniら、2022）。そのため、健常者にも安全で有効な方法を見つけることが重要である。
本研究では、MTHFRの過剰発現または葉酸投与により、ACE2プロモーターのメチル化によりACE2タンパク質量を減少させることができることを見出した。葉酸は、SARS-CoV-2の細胞への結合、SARS-CoV-2感染、中和抗体産生を減少させた。葉酸は食品添加物であり（Bae et al., 2021; Roche et al., 2021; Shulpekova et al., 2021）、SARS-CoV-2の感染性を低減する便利で安全かつ有効な方法となり得るが、一方で食品中の葉酸レベルが低下すると中和抗体産生が増加する可能性がある。この戦略は、ウイルスの感染性と免疫逃避を制御する安全かつ自律的に制御された手段を提供する可能性がある。
材料と方法
不活性化ウイルスの調製
生きたSARS-CoV-2を用いたすべての実験は、バイオセーフティレベル3（P3+）の強化された施設で実施された。SARS-CoV-2はSinovac Biotech (Beijing, China)から提供され、β-プロピオラクトンで24時間不活性化された。
In vivo実験
6週齢のBALB/cマウスを、不活化SARS-CoV-2群（3μg/dose）と生理食塩水対照群の2群に振り分け、尾静脈注射を行った。注射は週3回、3週間行った。接種21日後に心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳組織および血漿を採取し、血液学的分析およびSARS-CoV-2中和抗体検出を行った。葉酸投与実験動物は、葉酸（50 mg/kg）投与群と生理食塩水対照群の2群に分け、週2回、計5週間腹腔内注射を行った。葉酸前処理を2週間行った後、両群とも上記の尾静脈注射を行い、SARS-CoV-2を不活性化させた。5週間後に心臓、肝臓、脾臓、肺、腎臓、脳組織および血漿を採取し、血液学的分析およびSARS-CoV-2中和抗体検出を行った。
細胞培養と試薬
HEK293T、PANC02、HEPG2、Huh7ヒトCRC細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, United States)から購入した。HEK293T、PANC02、HEPG2およびHuh7細胞は、DMEM（Gibco, Grand Island, NY, United States）中で維持した。培地は10％ウシ胎児血清で補充し、細胞は95％空気と5％CO2の加湿雰囲気中、37℃でインキュベートした。
トランスフェクション
MTHFRまたは対照を含むレンチウイルスをGeneChem社（中国、上海）から購入し、CRC細胞へのレンチウイルスのトランスフェクションは製造元のプロトコルにしたがって実施した。レンチウイルス感染後、モノクローナル細胞を選択・培養し、qRT-PCRでMTHFRの発現を確認した。MTHFRのsiRNAはGenePharma社（中国、上海）で合成し、Lipofectamine™ 2000（Invitrogen、米国）を用いてメーカーのプロトコールに従って細胞にトランスフェクションした。
RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)
RNeasy Mini Kit（Qiagen）とPrimerScript RT Reagent Kit（TaKaRa）を用いて、臓器からTotal RNAを抽出した。RT-PCRに用いたSARS-CoV-2のエンベロープ（E）遺伝子を標的とするフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、それぞれ5′- TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3′および5′- GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3′であった。RT-PCRは、50℃30分、95℃15秒、94℃15秒、60℃45秒を40サイクル行う反応条件下で実施した。
DNA抽出とメチル化解析
ゲノムDNAは、DNA分離キット（Tiangen, Beijing, China）を用いてHuh-7細胞から製造元のプロトコルにしたがって分離した。ビスルファイト変換はEpiTect Bisulfite Kit (Qiagen)を用いて測定した。ACE2のメチル化レベルは、メチル化特異的PCRによって分析された。ACE2反復配列プライマー配列は以下の通りであった：フォワード：5′-TTAGTGAATTTTTAATGATTAGAGATATA-3′；リバース。5′-TTTATCACCCAAACTAAAATACAAC-3′である。バイサルファイトシーケンスPCRシステムは、10×PCRバッファと5.25μmのdNTP Mix、0.5μmの各プライマー、0.75UのホットスタートDNAポリメラーゼ、20ngのバイサルファイト修飾DNAで構成されていた。バイサルファイトPCR産物を2%アガロースゲルで分析し、QIAquickゲル抽出キット(Qiagen)を用いて精製した。精製した各産物をpMD 19-Tベクター（タカラ、東京、日本）にクローニングし、大腸菌DH5αコンピテントセル（Vazyme Biotech社、Piscataway、NJ、United States）にトランスフェクトした。各製品について、5つのクローンを配列決定した(Shanghai Xinren Molecular Biotechnology Co., Ltd.、中国)。
抗体およびウェスタンブロッティング
25μgずつのタンパク質アリコートをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（Bio-Rad, Hercules, CA）により分離し、適切な抗体で検出した。電気泳動したタンパク質サンプルをポリビニリデン・ジフルオリド膜（Bio-Rad）に移した。3回洗浄した後、膜をブロッティンググレードブロッカー（Bio-Rad）中で室温で1時間、次にMTHFR（Cell Signaling Technology, Danvers, MA, United States）、ACE2（Abcam, Cambridge, MA, United States）およびβ-アクチン（CST）に対する一次抗体と4℃で一晩インキュベートした。膜を3回洗浄した後、HRP結合種特異的二次抗体と室温で1時間インキュベートした。免疫反応性バンドは、SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate Enhanced Chemiluminescent Substrate (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, United States)を用いて可視化した。各実験は独立して少なくとも3回行った。
共焦点顕微鏡を用いたSARS-CoV-2スパイクタンパク質、偽ウイルスおよび不活性化ウイルスの組み合わせの分析
HEK293T、PANC02、Huh7 細胞 (5 × 104) を 6 ウェルプレートのカバーガラスに播種した。24 時間後、細胞培養物を DMEM で補充し、Spike protein (Sinobiological, Beijing, China), pseudovirus (Sinobiological, Beijing, China) または不活性化ウイルスとともに、5% CO2インキュベーターで 37°C で 30 分間インキュベートした。細胞を4％パラホルムアルデヒドで固定し、続いて1％ウシ血清アルブミン（BSA）を含むTween-20入りリン酸緩衝生理食塩水（PBST）でブロッキングおよび透過処理を行った。スパイクタンパク質および偽ウイルスはHisタグを担ったので、培養物を抗His一次抗体と一晩インキュベートした。不活性化ウイルスはSpike-中和抗体と一晩インキュベートした。Alexa Fluor-488-conjugated streptavidin (Boster, Beijing, China) を加え、1時間培養した。その後、サンプルをPBSTで洗浄し、Hoechst 33258 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States) を加え、核を染色した。スライドは、TCS SP8 顕微鏡（Leica, Germany）を用いて共焦点顕微鏡で分析された。
50%有効濃度解析
HEK293T、PANC02、およびHuh7細胞（4×103）を96ウェルプレートに播種した。免疫蛍光染色の手順は、レーザー共焦点実験の手順と同じであった。Celigo イメージサイトメトリー（Nexcelom Bioscience、米国）を用いて、定量的な単一細胞蛍光検出を完了した。蛍光シグナルから、Spike protein、pseudovirus、不活性化ウイルスの濃度における宿主細胞の阻害率を算出した。Spike protein、pseudovirus、不活性化ウイルスの濃度を横軸、細胞の阻害率を縦軸とし、Graphpad 8.0 で細胞結合阻害率の用量依存性曲線を描き、回帰して50%有効濃度を算出した。
蛍光定量分析
免疫蛍光染色の手順は、レーザーコンフォーカル実験と同じである。96 ウェルプレートに細胞を播種し、Celigo イメージサイトメトリー（Nexcelom Bioscience, United States）を用いて定量的な単細胞蛍光検出を完了した。
酵素結合免疫吸着測定法（Enzyme-linked immunosorbent assay)
免疫したBALB/cマウスから採取した血清サンプルのSARS-CoV-2抗体価を間接ELISA法（Sinobiological、北京、中国）により測定した。希釈した血清（1,100）を説明書に従って、各ウェルに37℃で2時間塗布した。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて450nmの吸光値を読み取った。ACE2 マウス ELISA キットは Sangon Biotech (Shanghai, China) から購入し、血漿検体を説明書に従って添加した。反応ウェルサンプルの吸光度（OD）値を450nmで測定した。
結果
SARS-CoV-2曝露により、ACE2が上昇した。
まず、BALB/cマウスにおけるSARS-CoV-2の浸潤効率を検証した。BALB/cマウスに不活化SARS-CoV-2を尾静脈から投与したところ、左上葉を除くすべての肺領域でSARS-CoV-2 RNA量が増加し（図1A）、マウス血漿中のSARS-CoV-2特異的中和抗体量も増加することがわかった（図1B）。
図1
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図1. SARS-CoV-2曝露により、ACE2が上昇した。(A）不活化ウイルス処理により、マウス肺（左上部分を除く）においてSARS-CoV-2 RNAレベルが上昇した。(B）SARS-CoV-2特異的中和抗体量は、不活性化ウイルス処理したBALB/cマウスにおいて、ELISA法により検出され、増加した。(C）不活化ウイルス処理により、BALB/c血漿中のACE2タンパク質レベルは、ELISAにより検出されるように増加した。(D）不活化SARS-CoV-2処理により、左肺中上部を除く主要臓器において、ACE2タンパク質の発現が有意に上昇した。
同時に、血漿中のACE2の上昇も検出された（図1C）。次に、マウスの主要臓器におけるACE2の発現を確認した。ACE2 mRNAレベルの変化は一貫していなかった。ACE2 mRNAレベルは脾臓、左下肺、右上肺、右上肺で有意に増加した(補足図1A)。しかし、ACE2タンパク質量は、不活化SARS-CoV-2投与マウスの主要臓器で一貫して増加し（左上肺、中肺では変化なし）、中和抗体が作られる脾臓でも増加した(図1D)。
葉酸系はACE2のプロモーター領域のメチル化を制御することでACE2の発現に影響を与える
MTHFRを安定的に過剰発現させたHuh7細胞では、Human Cytokine Array Q440で検出されたACE2タンパク質レベルが低下していることを見出した（図2A）。さらに、GTEXデータベースの正常肝組織とTCGAデータベースの肝癌組織におけるACE2とMTHFRの相関を解析した結果、ACE2とMTHFRは負の相関を示した（図2C；補足図1B）。また、MTHFRを過剰発現させたHuh7細胞やHepG2細胞では、ACE2タンパク質レベルが有意に減少していた（補足図1C-F）。
図2
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図2. 葉酸系はACE2のプロモーター領域のメチル化を制御することにより、ACE2の発現に影響を与える。(A）MTHFR過剰発現Huh7細胞では、抗体マイクロアレイアッセイによりACE2タンパク質レベルが低下していることが検出された。(B）葉酸はHEK293T、PANC02、Huh7細胞において、用量依存的にACE2タンパク質の発現を抑制した。(C）MTHFR発現はACE2発現と負の相関があった（GTEXデータベースでは肝臓、TCGAデータベースでは肝癌）。(D）Huh7細胞ではMTHFR過剰発現がACE2プロモーターDNAのメチル化を促進した。葉酸はHuh7細胞においてACE2プロモーターDNAのメチル化を促進した。
次に、HEK293T、PANC02、Huh7細胞株において、葉酸の濃度勾配で処理した後のACE2タンパク質レベルの変化を検出した。これらの結果、葉酸は用量依存的にACE2の発現を低下させることがわかった（図2B）。また、不活化SARS-CoV-2投与マウスの主要臓器において、MTHFRタンパク質レベルが減少し続けることも明らかにした（補足図1G）。
さらに、葉酸はMTHFR-DNAメチル化調節機構を介してACE2のタンパク質レベルを低下させると推測された。そこで、MTHFRを過剰発現させた細胞と葉酸を投与した細胞で、ACE2プロモーターのDNAメチル化レベルを検出した。その結果、MTHFRの過剰発現と葉酸処理により、ACE2プロモーターのDNAメチル化レベルが上昇することが示された（図2D）。
葉酸処理によるスパイクタンパク質結合能の低下
葉酸またはMTHFRがACE2プロモーターをメチル化することにより、ACE2タンパク質の発現を抑制することを検証した。次に、葉酸処理がSpikeタンパク質の50%有効濃度に与える影響を検出した。葉酸処理後、HEK293T/PANC02/Huh7細胞におけるSPIKEタンパク質の50%有効濃度は、それぞれ61.6%、98.2%、72.1%増加した（図3A）。これに対応して、偽ウイルスの50％有効濃度は93.2、15.3および93.1％増加し（図3B）、不活性化真正SARS-CoV-2の50％有効濃度は17.6、65.3および70.8％増加した（図3C）。
図3
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図3. 葉酸は、宿主細胞への50％スパイクタンパク質またはSARS-CoV-2の結合を減少させた。(A）HEK293T/PANC02/Huh7細胞において、Spikeタンパク質の50％有効濃度は61.6、98.2および72.1％増加した。(B）HEK293T/PANC02/Huh7細胞では、偽ウイルスの50％有効濃度が93.2、15.3および93.1％増加した。(C）不活化真正SARS-CoV-2の50％有効濃度は、HEK293T/PANC02/Huh7細胞で17.6、65.3および70.8%増加した。
20μmの葉酸で48時間処理した後、異なる濃度のSpikeタンパク質を培地に添加した。Spikeタンパク質濃度15,000 pg./μLでは、HEK293T/PANC02/Huh7細胞においてSpikeタンパク質結合能は47.5/53.8/50.7％に減少した（図4A；補足図2）。1.5 × 106 コピー/ml の濃度では、HEK293T/PANC02/Huh7 細胞において、疑似ウイルス結合能は 52.2%/39.2%/29.8% に減少した（図 4B; 補足図 3）。不活性化SARS-CoV-2濃度が10μg/μlの場合、不活性化真正SARS-CoV-2結合能はHEK293T/PANC02/Huh7細胞で52.2%/29.3%/54.5%に減少した（図4C)。代表的な画像は、不活性化した本物のSARS-CoV-2のHEK293T（図4D）/PANC02（図4E）/Huh7（図4F）細胞への結合能力が、葉酸処理により減少していることを示したものである。したがって、SARS-CoV-2の細胞への結合は、葉酸処理により有意に減少した。
図4
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図4. SARS-CoV-2の細胞への結合能は、葉酸処理により低下した。(A）HEK293T/PANC02/Huh7細胞において、Spikeタンパク質濃度15,000 pg./μLで細胞への結合能は47.5％/53.8％/50.7％に減少した。(B）SARS-CoV-2偽ウイルスの細胞への結合能は、1.5×106偽ウイルスコピー/mlのHEK293T/PANC02/Huh7細胞で52.2%/39.2%/29.8%に減少した。(C）不活化真正SARS-CoV-2の細胞への結合能は、10μg/μlの不活化SARS-CoV-2でHEK293T/PANC02/Huh7細胞では52.2％/29.3％/54.5％に低下した。代表画像は、HEK293T（D）PANC02（E）およびHuh7（F）細胞において共焦点顕微鏡で検出された、不活化真正SARS-CoV-2の細胞への結合能力が葉酸処理により低下したことを示す。細胞を20μmの葉酸で48時間処理し、異なる濃度の真正SARS-CoV-2を培地に添加して1時間結合させ、結合能の定量化をCeligoアッセイで検出した。細胞膜はDiR（赤）、スパイクタンパク質と偽ウイルス／真正SARS-CoV-2は抗スパイク抗体（緑）、細胞核はHoechst（青）で標識された。葉酸処理によるウイルス結合（細胞上のSpikeタンパク質の蛍光強度、内部コントロールとしてHoechstを使用）差の統計解析は、二元配置分散分析により行った。
葉酸処理はin vivoでのSARS-CoV-2の侵入と中和抗体産生を抑制した
次に、葉酸がSARS-CoV-2の浸潤に影響を与えるかどうかを確認した。葉酸で2週間前処理した後、不活化した本物のSARS-CoV-2を処理し、さらに2週間葉酸で処理した後、SARS-CoV-2の浸潤と中和抗体産生を確認した。その結果、葉酸投与BALB/cマウスの中和抗体が産生される脾臓を含む主要臓器（図5A、肺の左上部分を除く）と血漿中（図5C）でACE2タンパク質量が減少していることがわかった。また、主要臓器においてACE2 mRNAレベルが低下した（図5B、肺の左上および中央部を除く）。そして、肺へのウイルス侵入は葉酸処理によりほぼ消失し（図5D）、中和抗体産生は36.7%に減少した（葉酸未処理対照との比較、図5E）。
図5
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図5. 葉酸処理によりACE2の発現が低下し、in vivoでのSARS-CoV-2の浸潤およびSARS-CoV-2中和抗体産生が抑制された。(A）葉酸処理により、BALB/cマウスの主要臓器におけるACE2タンパク質の発現が低下した。(B）葉酸投与BALB/cマウスの主要臓器におけるACE2 mRNAレベルは、qRT-PCRアッセイで調べたところ、減少した。(C）血漿中ACE2タンパク質濃度は、ELISA法により検出されたように、葉酸投与BALB/cマウスで減少した。(D）葉酸投与によりSARS-CoV-2の侵入が減少し、BALB/cマウス肺の各部位でSARS-CoV-2 RNAレベルが減少した。 E）葉酸投与BALB/cマウスでSARS-CoV-2特異的中和抗体レベルが減少し、ELISAにより検出された。
考察
本研究では、SARS-CoV-2曝露により、ACE2が上昇することを見出した。葉酸投与後、組織中のACE2のタンパク質レベルは低下し、その結果、肺組織中の本物のSARS-CoV2が除去され、それに伴いsars-cov-2中和抗体のレベルも低下した。
ACE2は、血圧の調節においてバランスのとれた役割を担っている。Guillaume Paréのチームは、血漿ACE2濃度の増加が主要な心血管イベントのリスク増加と有意に関連することを報告した（Narulaら、2020年）。また、血漿ACE2濃度の上昇は、心不全、心筋梗塞、脳卒中、糖尿病のリスク上昇と有意に関連しています（Aleksovaら、2020年、Jiaら、2020年、Southら、2020a）。我々の結果は、マウスの様々な臓器でACE2 mRNAのレベルが異なるものの、タンパク質レベルは有意に上昇しており、SARS-CoV-2刺激後の心血管合併症の高い発生率と関連するACE2の高い発現を説明できる可能性がある。
MTHFRは、葉酸循環系の重要な酵素です（Christensenら、2015；MollおよびVarga、2015；Romanら、2019；Weileら、2021）。葉酸の循環を促進することは、MTHFRの活性を高めるか、直接的に葉酸を濃縮することができ、葉酸の補充がACE2の発現を調節する可能性が示唆される。MTHFRの発現不足は、ホモシステインレベルの上昇を引き起こし、血栓症のリスク上昇につながり、心血管疾患の高いリスクと関連する（Raghubeer and Matsha, 2021）。このことは、基礎的な心血管疾患を持つ人が呼吸器系ウイルスに感染した後、より体調を崩す傾向があることを説明するものと思われます。新型コロナウイルス肺炎の初期の症例報告では、患者の最大50％が基礎疾患を有し、その40％が心血管疾患または脳血管疾患を有していた（Xiong et al.、2020年）。ベクターベースのChAdOx1 COVID-19ワクチン注射後に、MTHFR変異を有する患者が脳洞静脈血栓症と新たに診断された事例を報告した臨床研究がある（Fousseら、2022年）。
葉酸は、血漿ホモシステイン濃度を最小化し、それによって血管疾患の危険因子を減少させることができます。我々の研究において、葉酸はウイルス中和抗体を減少させ、ある程度ウイルス結合の確率を下げることができます。葉酸のACE2の発現に対する効果から、心血管疾患に対する良性利益を増加させる可能性がある。したがって、本研究では、葉酸の意義は、ACE2の発現を抑えてSARS-CoV-2の侵入を抑えるだけでなく、SARS-CoV-2に起因する心血管疾患の合併症に有益な影響を与えることであると考えられる。つまり、FDAが認可した健康食品添加物として、葉酸はウイルス感染と中和抗体の産生をある程度抑えることができ、流行予防に重要な役割を担っていることが示唆された。
まとめ
以上、SARS-CoV-2がMTHFRの発現を低下させ、ACE2の発現を増加させること、MTHFRがプロモーターのメチル化レベルを変化させることでACE2の発現を制御すること、葉酸がSARS-CoV-2の感染性／中和抗体産生を変化させることを示した（Fig.6）。
図6
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図6 SARS-CoV-2の侵入に対する葉酸の効果を示す模式図。MTHFRはプロモーターのメチル化レベルを変化させることでACE2の発現を制御しており、葉酸はSARS-CoV-2の透過性とSARS-CoV-2中和抗体産生を変化させることが可能である。
FDA認可の食品添加物（Field and Stover, 2018）として、葉酸の摂取量を増やすとACE2の発現が抑制されSARS-CoV-2の透過性が低下し、ワクチン接種前にACE2発現を増やすために葉酸摂取を制限すると中和抗体産生が増加すると考えられます。これらのデータから、葉酸はSARS-CoV-2感染予防・制御の一翼を担っている可能性が示唆された。
データの利用可能性に関する声明
本研究で発表された原著は、論文/補足資料に含まれています。さらなるお問い合わせは、対応する著者にお願いします。
倫理に関する記述
本動物実験は、上海癌研究院モデル動物研究センター動物愛護使用委員会の審査・承認を得た。
著者の貢献
XL：原稿の編集、レビュー、データ解析。YZ、YP、BX：データ収集と実験。XC、SL、JH：図表作成。すべての著者が論文に貢献し、提出されたバージョンを承認した。
資金提供
本研究は，国家重点研究開発計画（2022YFE0110100）および中国自然科学基金（81572454）の支援を受けて実施した。
謝辞
この研究に関わったすべての個人とグループに感謝します。
利益相反について
著者らは、本研究が利益相反の可能性があると解釈される商業的または金銭的関係のない状態で実施されたことを宣言する。
出版社からのコメント
本論文で述べられたすべての主張は、著者個人のものであり、必ずしも所属団体、出版社、編集者、査読者のものを代表するものではありません。本論文で評価される可能性のある製品，あるいはそのメーカーが行う可能性のある主張は，出版社によって保証または承認されたものではない．
補足資料
本論文の補足資料は、https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.2022.980903/full#supplementary-material に掲載されています。
参考文献
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キーワード SARS-CoV-2、メチル化、ACE2、MTHFR、葉酸
引用元 Zhang Y, Pang Y, Xu B, Chen X, Liang S, Hu J and Luo X (2022) Folic acid restricts SARS-CoV-2 invasion by methylating ACE2. Front. Microbiol. 13:980903. doi: 10.3389/fmicb.2022.980903
Received: 2022年06月29日; Accepted: 2022年8月04日。
公開：2022年8月17日
編集者
復旦大学、中国、Chenjian Gu。
Reviewed by:
中国復旦大学Yili Fang, Shanghai General Hospital, China Xiaoxian Cui, Fudan University, China
Copyright © 2022 Zhang, Pang, Xu, Chen, Liang, Hu and Luo. これは、クリエイティブ・コモンズ表示ライセンス（CC BY）の条件の下で配布されるオープンアクセス論文です。原著者および著作権者のクレジットを表示し、本誌の原著を引用することを条件に、他のフォーラムでの使用、配布、複製を許可する。本規定に従わない使用・配布・複製は認めない。
*Correspondence: Xiaoying Luo, luoxy@shsci.org
これらの著者は、この研究に等しく貢献し、筆頭著者を共有しています。
‡ORCID: Xiaoying Luo https://orcid.org/0000-0001-7031-9349
免責事項：本論文で表明されたすべての主張は，あくまでも著者のものであり，必ずしも所属機関のもの，あるいは出版社，編集者，査読者のものを代表するものではありません。この記事で評価される可能性のある製品、またはそのメーカーが行う可能性のある主張は、出版社によって保証または是認されていません。
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