低酸素でプログラムされたメガミトコンドリアがリソソームに接触し、ミトコンドリアの自己消化を仲介する

2023年7月14日 15:41

オープンアクセス
公開：2023年7月11日
低酸素でプログラムされたメガミトコンドリアがリソソームに接触し、ミトコンドリアの自己消化を仲介する

https://www.nature.com/articles/s41467-023-39811-9

ティエンシュウ・ハオ
ジアンロン・ユー
...
宋志銀
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ネイチャーコミュニケーションズ14巻、記事番号：4105（2023）この記事を引用する
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指標詳細
概要
ミトコンドリアは酸素を感知する重要な小器官であり、酸素は酸化的リン酸化によって消費され、ATPが生成される。リソソームには加水分解酵素が含まれ、細胞の恒常性を維持するために、誤って折り畳まれたタンパク質や損傷したオルガネラを分解する。ミトコンドリアは物理的、機能的にリソソームと相互作用し、細胞代謝を調節している。しかし、ミトコンドリアとリソソームの相互作用の様式や生物学的機能については、いまだ不明な点が多い。ここでは、低酸素症が、ミトコンドリア間の広範な接触とそれに続く融合を誘導することによって、正常な管状ミトコンドリアをメガミトコンドリアに再形成することを示す。重要なことは、低酸素下ではミトコンドリアとリソソームの接触が促進され、ある種のリソソームがメガミトコンドリアに飲み込まれることである。MMELにはメガミトコンドリアと成熟リソソームの両方が必要である。さらに、STX17-SNAP29-VAMP7複合体は、低酸素下でミトコンドリアとリソソームの接触とMMELに寄与している。興味深いことに、MMELはミトコンドリアの自己消化（MSD）と呼ばれる分解様式を媒介する。さらに、MSDはミトコンドリアの活性酸素産生を増加させる。この結果は、ミトコンドリアとリソソーム間のクロストーク様式を明らかにし、ミトコンドリア分解の新たな経路を明らかにするものである。
はじめに
ミトコンドリアは二重膜小器官であり、その主な機能は細胞内で酸化的リン酸化によってATPを生成することである1,2。ミトコンドリアは絶えず融合と分裂を繰り返し、そのサイズ、数、形態、機能を制御している。ミトフシン（MFN1とMFN2）とOPA1/mgm1は、それぞれミトコンドリアの外膜と内膜の融合に必要である3。一方、DRP1は重要なミトコンドリア分裂因子であり、MFF、FIS1、MID49/51によってミトコンドリア外膜にリクルートされ、ミトコンドリア分裂を媒介する3,4。ミトコンドリア融合が阻害されるとミトコンドリアは断片化し、ミトコンドリア分裂が阻害されるとミトコンドリアは伸長する4。また、MICOS複合体が枯渇すると、ミトコンドリアの分裂が停止し、ミトコンドリア内膜の構造が乱れるため、大きな球状のミトコンドリア（メガミトコンドリア）が形成される5,6。さらに、メガミトコンドリアは老化細胞や特定の病的細胞で頻繁に観察され、様々なヒト疾患と関連している7,8,9。しかしながら、メガミトコンドリアの生理学的機能はほとんど解明されていない。
リソソームは単一の膜結合小器官であり、栄養の利用可能性を感知し、ほとんどの高分子を消化することによって細胞の恒常性を維持するための適応反応を開始する。リソソームには60種類以上の加水分解酵素が存在し、タンパク質、炭水化物、核酸、脂質など、ほとんどすべての種類の生体高分子を消化することができる10。リソソームはまた、ミトコンドリアなどの様々な機能不全オルガネラの分解も担っている。損傷を受けたミトコンドリアや機能不全に陥ったミトコンドリアは、マイトファジーとして知られる過程で、オートファゴソームに選択的に取り込まれ、リソソームに運ばれて分解される11。
ミトコンドリアの品質管理は細胞代謝の中心である。オートファゴソーム-リソソームシステムによるマイトファジーに加えて、ミトコンドリアの質は多くのミトコンドリアプロテアーゼによっても制御されている。ミトコンドリアには、LONP1、PARL、Yme1L、AFG3L2、SPG7、OMA1、MPP、CLPP、CLPX、HTRA2など40種類以上のプロテアーゼが存在し、特定の条件下でミトコンドリアタンパク質の処理と分解を担っている12,13。ミトコンドリアのプロテアーゼはマイトファジーにも関与している。ミトコンドリアプロテアーゼの機能不全は、アンフォールデッドタンパク質や機能不全ミトコンドリアタンパク質の蓄積につながり、ミトコンドリアアンフォールデッドタンパク質応答（UPRmt）を引き起こし、マイトファジーを誘導する14。
ミトコンドリアとリソソームの活動は密接に関連しているようである。ミトコンドリアの機能障害は、リソソームの機能障害につながる15,16,17。一方、リソソームは鉄のホメオスタシスを調節することでミトコンドリアの代謝を支えている18,19。対照的に、機能不全に陥ったリソソームはミトコンドリアの機能を損ない、傷ついたミトコンドリアの蓄積を引き起こす11。この相互作用のさらなる証拠は、ミトコンドリアとリソソームが物理的・機能的に相互作用していることである20,21,22,23。酵母では、ミトコンドリアはvCLAMP24を介して液胞（酵母のリソソームコンパートメント）と物理的に接触している。哺乳類細胞では、リソソームはミトコンドリアに直接接触してミトコンドリアの分裂を促進することができる23。さらに、Syntaxin17（STX17）-SNAP29-VAMP7 SNARE複合体は、MDV（ミトコンドリア由来小胞）とエンドライソソームの結合と融合を仲介している25。ミトコンドリアとリソソームの相互作用は、細胞機能や関連する疾患の重要な決定因子として浮上している11,26,にもかかわらず、ミトコンドリアとリソソームの相互作用の根底にある分子メカニズムは、まだ解明されていない。
一般的な生理的ストレスである低酸素は、低酸素に対する細胞応答を制御する主要な転写因子である低酸素誘導因子-1（HIF-1）を直接活性化する。低酸素下では、ミトコンドリアは酸素センサーとして働き、HIF-1にシグナルを中継し、エネルギー代謝の再プログラミングに寄与する27。さらに、Higd-1aは低酸素下でOPA1と相互作用することにより、細胞の生存に役割を果たしている28。低酸素はマイトファジーの受容体であるFUNDC1、BNIP3、BNIP3Lを活性化し、オートファゴソーム-リソソーム経路を介してマイトファジーを誘導することができる29,30。しかし、短時間の低酸素症でも長時間の低酸素症でも、多数のミトコンドリアが依然として存在していることから、マイトファジーは低酸素症中に機能不全に陥ったミトコンドリアをすべて分解するわけではない（あるいは、分解するほど効率的ではない）ことが示唆される。さらに、低酸素下で残りのミトコンドリアがどのような機能を持つかは不明である。
ここでわれわれは、低酸素が正常な管状ミトコンドリアを、リソソームを飲み込むメガミトコンドリア（大きな球状ミトコンドリア）に再プログラムすることを示す。MMELと低酸素で活性化されたミトコンドリアプロテアーゼは、ミトコンドリアタンパク質の分解に寄与し、私たちはこれをミトコンドリア自己消化（MSD）と呼んでいる。MSDは低酸素下でミトコンドリアの活性酸素産生を促進する。このように、我々はミトコンドリアとリソソーム間の接触様式を明らかにし、ミトコンドリア分解の新たな経路を発見した。
研究結果
低酸素症は管状ミトコンドリアをメガミトコンドリアに再形成する
低酸素に応答して、ミトコンドリアの呼吸と動態は障害される31。ミトコンドリアの形態に対する低酸素の影響をさらに調べるため、TOMM20-mCherry（ミトコンドリア外膜マーカー）とmito-GFP（ミトコンドリアマトリックスマーカー）を共発現させたHeLa細胞を、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡で解析した。正常酸素下では、ほとんどのミトコンドリアは管状であった（図1aおよびb）。一方、低酸素下では、一部のミトコンドリアは断片化し、ほとんどのミトコンドリアはTOMM20-mCherry蛍光で観察されるようなドーナツ状のミトコンドリアではなく、大きな円形として表示される球状の大きなミトコンドリアになった（図1aおよびb）。これらのデータは、大きな球状のミトコンドリアの形成が、多数の小さなミトコンドリアのクラスターではないことを示唆しており、これまでの報告31,32と一致している。さらに、透過型電子顕微鏡（TEM）解析から、低酸素症によって大型球状ミトコンドリアが形成され、そのミトコンドリアは外ミトコンドリア膜、内ミトコンドリア膜、ミトコンドリアマトリックスを含み、正常ミトコンドリアと比較してミトコンドリアクリスタが少ないことが明らかになった（図1c-e）。このことから、大型球状ミトコンドリアはMDV33、MDC34、SPOT35のようなミトコンドリア由来の構造体ではないことが示唆された。そこで、「大型球状ミトコンドリア」を「メガミトコンドリア」と呼ぶことにする。これは、外ミトコンドリア膜、内ミトコンドリア膜、ミトコンドリアマトリックスを含む大きな球体（通常、幅と長さが2μm以上）で、その超微細構造は再形成されている（ミトコンドリアのクリステーが減少し、異常になっている）。
図1：低酸素は正常な管状ミトコンドリアをメガミトコンドリアに作り変える。
a, b TOMM20-mCherry（赤）とmito-GFP（緑）を安定に発現しているHeLa細胞を、正常酸素濃度（21％O2）または低酸素濃度（1％O2）で12時間、24時間処理し、ミトコンドリアの形態を共焦点顕微鏡で可視化した（a）。右の画像は左の画像の枠で囲んだ部分を拡大したものである。ミトコンドリアの形態は、「方法」に詳述した基準に従って定量した（b）。データは平均値±SEMで示し、統計的有意性は二元配置分散分析（ANOVA）で評価した。 c-e HeLa細胞を正常酸素または低酸素に12時間または24時間暴露した後、高圧凍結し、透過型電子顕微鏡（TEM）で分析した。代表的なTEM画像を示す。赤矢印：ミトコンドリア（c）。相対的なミトコンドリアの大きさ（n = 40個のミトコンドリア）をImageJソフトウェアで解析した（d）。ミトコンドリア面積あたりのミトコンドリアクリスタが定量された（e）。N"：正常酸素、"H"：低酸素。f, g mito-GFP（緑）とTOMM20-mCherry（赤）を共発現させたHeLa細胞を正常酸素または低酸素で24時間処理し、ミトコンドリアの融合イベントを表示した（f）。白矢印はミトコンドリア-ミトコンドリア融合部位を示す。次に、タイムラプス共焦点画像におけるミトコンドリア融合イベントの持続時間をカウントした（g）。h-j mito-DsRedまたは光活性化GFP（mito-PA-GFP）を発現するHeLa細胞を正常酸素または低酸素で24時間処理し、代表的な画像を示した（h）。その後、20分以内のミトコンドリアの分裂および融合イベントの数を数え（i）、さらに分裂イベントに対するミトコンドリアの融合イベントの比率を計算した（j）。各実験で20個のミトコンドリアをカウントした。データは平均値±SEMで示し、統計的有意性は二元配置分散分析により評価した。P値は図中に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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次に、タイムラプス共焦点イメージングによって、生きたHeLa細胞におけるメガミトコンドリアの形成過程を特徴付けた。正常酸素下では、2つの管状ミトコンドリアの接触、融合、再形成を含むミトコンドリアの融合過程は12秒程度であったが、低酸素下では、2つの大きなミトコンドリアの融合過程は30秒以上かかり（図1fおよびg、補足動画1および補足動画2）、低酸素下ではミトコンドリアの融合過程が正常酸素下よりも遅いことが示された。さらに、ミトコンドリア間の接触に続いて、ミトコンドリアが融合した（図1f、gおよびS1a）。このことは、生きたHeLa細胞のHIS-SIM（高感度構造化照明顕微鏡）イメージングでも確認された（図S1a、補足動画3）。さらに、ウェスタンブロッティング解析から、低酸素下（6時間または12時間）では、ミトコンドリア分裂因子DRP1、リン酸化DRP1（p-DRP1）、FIS1およびミトコンドリア融合因子OPA1が顕著に減少し、ミトコンドリア融合因子MFN2がわずかに減少していることが示された（図S1bおよびS1c）ことから、低酸素下ではミトコンドリアの分裂と融合の両方が減少している可能性が示唆された。さらに、光活性化GFPアッセイにより、低酸素下ではミトコンドリアの融合と分裂の両方の速度が低下するが、ミトコンドリアの融合と分裂の比率は増加することが明らかになった（図1h-j）。さらに共焦点イメージングにより、MFN1/2 DKD（MFN1とMFN2のダブルノックダウン）細胞またはOPA1ノックダウン細胞は、正常酸素条件下および低酸素条件下の両方で、ミトコンドリアが完全に断片化されていることが示され（図S1d-g）、ミトコンドリアの融合がメガミトコンドリアの形成に必須であることが示唆された。ミトコンドリア膜透過性転移（MPT）孔が開くと、ミトコンドリアが膨張する36。共焦点イメージングにより、シクロスポリンA（MPT孔開口阻害剤）投与は低酸素下でのメガミトコンドリア形成を阻害しないことが示された（図S1hおよびS1i）。これらのデータは、低酸素下でメガミトコンドリアが形成されるのは、ミトコンドリア分裂に対するミトコンドリア融合の割合が増加するためであり、ミトコンドリアの膨潤やクラスター化によるものではないことを示唆している。興味深いことに、Zhouらも、Sel1L-/-褐色脂肪細胞において寒冷曝露によって誘導されたメガミトコンドリアは、ほとんどがミトコンドリアの融合の増加によるものであると報告している37。さらに、共焦点イメージングにより、24時間の低酸素状態後、再酸素化後2時間以内にごく少数（～8％）のメガミトコンドリアが正常／管状ミトコンドリアに回復することが示された（図S1j）。
全体として、低酸素はミトコンドリアの融合と分裂の比率を増加させることにより、管状ミトコンドリアをメガミトコンドリアに再プログラムする。
低酸素はミトコンドリア-リソソーム間の接触とメガミトコンドリア・エンフルージング・ライソソソーム（MMEL）を促進する。
リソソームと他のオルガネラとの接触は、ミトコンドリアの分裂を含む様々な生物学的機能を仲介する上で重要な役割を果たしている23。そこでわれわれは、低酸素がミトコンドリアとリソソームの接触に影響を及ぼすかどうかを調べた。予想外なことに、共焦点および三次元（3D）イメージングによって、低酸素がミトコンドリア-リソソーム間の接触を著しく増加させることが示された（図2a-c）。驚くべきことに、一部のリソソーム（LAMP1で示される）は、低酸素下ではメガミトコンドリア内に存在したが、正常酸素下では存在しなかった（図2a-c、補足動画4および補足動画5）。さらに、リソソームプロテアーゼであるカテプシンD（CTSD）抗体による免疫染色やリソソーム色素LysoTracker Redによる細胞染色によって、低酸素下のミトコンドリア内の小器官がリソソームまたはリソソーム関連小器官であることが確認された（図S2a-d）。さらに、共焦点Z-スタック解析により、低酸素状態の細胞では、リソソームが確かにメガミトコンドリア内に位置していることが示された（図S2e、補足動画6）。さらに、集束イオンビーム／走査型電子顕微鏡（FIB-SEM）、3Dトモグラフィ再構成、免疫電子顕微鏡による解析から、低酸素下では一部のリソソームがメガミトコンドリア内に完全に位置していることが示された（図2d-g、補足動画7、補足動画8）。これらの結果は、低酸素下ではリソソームがメガミトコンドリア内に入り込めることを示唆している。このことは、電子顕微鏡下でリソソームが単一膜、管腔内膜渦巻き、管腔内電子密集物質などの特異的特徴によって特徴づけられるという以前の報告と一致している38,39。
図2：低酸素はミトコンドリアとリソソームの接触を促進し、メガミトコンドリアへのリソソームの侵入を誘導する。
a LAMP1-mCherry、TOMM20-GFPおよびmito-BFPを発現するHeLa細胞を正常酸素または低酸素で24時間処理し、共焦点顕微鏡で解析した。b, c HeLa細胞を正常酸素または低酸素で24時間処理した後、抗LAMP1抗体および抗TOMM20抗体で免疫染色し、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡による3Dイメージングで解析した（b）。下の画像はミトコンドリア（緑）とリソソーム（赤）で、中央の画像の3D表面再構成を用いて表示した。次に、10個の細胞のミトコンドリア-リソソーム接触（M-L接触）とメガミトコンドリア内のリソソーム（L within M）の事象を、「方法」に詳述した基準に従って定量化し（c）、100個のリソソームあたりの「M-L接触」と「L within M」の数を表示した。d, e 低酸素処理（24時間）したHeLa細胞を集束イオンビーム/走査電子顕微鏡（FIB-SEM）で解析し、ミトコンドリア内のリソソームを示す代表的な画像を表示した（d）。FIB-SEMの3D再構成とセグメンテーション画像を示した（e）。M"：ミトコンドリア、"L"：リソソーム。白色はミトコンドリア外膜、シアンはミトコンドリア内境界膜、紫赤色はリソソーム。 f, g LAMP1-GFPを発現するHeLa細胞を正常酸素または低酸素で24時間処理した後、GFP免疫金染色と免疫電子顕微鏡解析のために固定した。赤矢印：免疫金粒子（f）。h, i LAMP1-mCherry（赤）とmito-GFP（緑）を発現するHeLa細胞を正常酸素（h）または低酸素（i）で24時間処理した後、共焦点顕微鏡によるタイムラプスイメージングで追跡した。生きたHeLa細胞における代表的なタイムラプス共焦点3D画像を表示した（21細胞から得られたn＝30例）。赤の "L "はリソソーム、紫の "M "はミトコンドリア。棒グラフはすべて平均値±SEMを表し、n = 3つの独立した実験、統計的有意性は二元配置分散分析により評価した。P値は図中に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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次に、低酸素下でのメガミトコンドリアへのリソソームの侵入過程を調べた。タイムラプス共焦点イメージングにより、ミトコンドリア（mito-GFP）が一過性にリソソーム（LAMP1-mCherry）と接触し、正常酸素下では特定のミトコンドリア-リソソーム接触がミトコンドリアの分裂につながることが示された（図2h）。しかし、低酸素下では、いくつかのリソソームがメガミトコンドリアと接触し、その中に入ることができた。全体として、低酸素はミトコンドリアとリソソームの接触を促進し、リソソームがメガミトコンドリア内に侵入するのを誘導する。
次に、低酸素下でリソソームがどのようにしてメガミトコンドリアに侵入するかを調べた。ライソゾームタンパク質は、Mieap-BNIP3L複合体によって形成されるミトコンドリア外膜孔を通ってミトコンドリアに移行することが報告されている40,41,42。我々は、BNIP3Lのノックダウンが低酸素下でのリソソームとメガミトコンドリアの接触やリソソームのメガミトコンドリアへの侵入に影響を及ぼさないことを見いだした（図S2h-j）。このことは、リソソームのメガミトコンドリアへの侵入がMieap-BNIP3L複合体によって形成されるミトコンドリア外膜孔に依存していないことを示唆している。そこで我々は、低酸素下ではリソソームがメガミトコンドリア内に取り込まれるのではないかと考えた。共焦点イメージングにより、ある種のリソソーム（LAMP1-mCherryで標識）がメガミトコンドリア（mito-BFPまたはTOMM20-GFPで標識）と密接に接触し、低酸素下で接触部位にミトコンドリア外膜（TOMM20-GFPで標識）の浸潤を引き起こした（図S2gおよびS2k）ことから、メガミトコンドリアがリソソームを飲み込んでいることが示唆された。さらにFIB-SEMと3Dトモグラフィーの再構成から、低酸素状態ではリソソームがメガミトコンドリアに飲み込まれることが確認された（図S3aとS3b、補足動画9と補足動画10）。さらに、Time-lapse共焦点イメージングにより、低酸素下の生きたHeLa細胞において、リソソームがメガミトコンドリアに入り込むことが示された（図S2g）。したがって、低酸素下ではリソソームがメガミトコンドリアに飲み込まれる可能性がある。このような現象を「メガミトコンドリアがリソソームを飲み込む（MMEL）」と名付けた。MMELのステップを探るため、MMELのイベントを示すTEM画像を解析した。その結果、メガミトコンドリアがリソソームに接触し、飲み込まれる、あるいは飲み込まれたリソソームと一緒に飲み込まれる事象がとらえられた（図2j）。興味深いことに、MMELの際、ミトコンドリア膜（外膜と内膜）は内側に折れ曲がり（invaginate）、リソソームで満たされる空洞を形成する（図2j、S3cとS3d）。その後、ミトコンドリア膜に囲まれたリソソームは、内側に折りたたまれたミトコンドリア膜の端が融合する際に、ミトコンドリア膜からつまみ出される（図2j）。MMELイベントは、リソソーム内在化のルートも示していることに注意すべきである。
したがって、低酸素によるMMELの過程には、ミトコンドリア-リソソームの接触、飲み込み、ミトコンドリア-リソソームの融合、ミトコンドリア膜の破裂が関与している可能性がある。
MMELにはミトコンドリアの融合とリソソームの成熟（活性化）が必要である
次に、ミトコンドリアの動態がMMELに影響を及ぼすかどうかを調べた。共焦点3Dイメージングにより、MFN1/2 DKDまたはOPA1 KDは、正常酸素下でのコントロールと比較して、ミトコンドリアの断片化を引き起こし、ミトコンドリア-リソソーム間の接触が増加することが示された（図S3eおよびS3f）。しかし、MFN1/2 DKDまたはOPA1 KDは、低酸素下でMMELの減少をもたらした（図S3eおよびS3f）。これらの結果は、サイズが小さく断片化したミトコンドリアは、MMELイベントをほとんど誘導できないことを示している。対照的に、DRP1の枯渇は、長い管状と大きな球状のミトコンドリアの形成を誘導し、その結果、メガミトコンドリアの数が増加し、ミトコンドリア-リゾソーム間の接触とMMELが正常酸素下または低酸素下で有意に増加した（図S3e、S3f、S3h）。MFN1/2 DKD、OPA1 KDまたはDRP1 KDは、細胞あたりのリソソーム数を増加させた（図S3g）。全体として、MMELにはミトコンドリアの融合を介したメガミトコンドリアが必要であることが示唆された。このことは、断片化したミトコンドリアや正常なミトコンドリアでさえ、無傷のリソソームを飲み込むことができない大きさであることから説明できる。
また、低酸素下でのMMELに対するリソソームの影響も調べた。リソソームは液胞ATPアーゼ（V-ATPアーゼ）によって生成・維持される高酸性化コンパートメントで、段階的な成熟過程を経て形成される43。共焦点イメージングとウェスタンブロッティングにより、低酸素に曝されたHeLa細胞ではリソソームが劇的に増加することが示された（図S4aおよびS4b）。Bafilomycin A（BafA1、V-ATPaseの特異的阻害剤）とクロロキン（CQ、リソソーム刺激剤）はリソソームの酸性化を阻害し、オートファゴソーム-リソソーム融合を障害するため、オートファジーを阻害することができることから44、次にBafA1またはCQが低酸素誘導MMELに影響するかどうかを調べた。コントロールと比較して、BafA1またはCQで処理するとGFP-LC3の点刻が顕著に増加したことから、BafA1またはCQはオートファジーを阻害する機能があることが示唆された（図S4c）。さらに、3D共焦点イメージングとTEM解析から、BafA1またはCQ処理により、低酸素下ではミトコンドリア-リソソーム間の接触は増加したが、MMELは減少したことが明らかになった（図3a-d）。また、BafA1またはCQ処理によって、正常酸素条件下でのミトコンドリアのサイズは変化せず、低酸素条件下でのメガミトコンドリアの形成にも影響しなかった（図3a、3c、S4d、S4e）ことから、リソソームの酸性化がMMELに必須であることが示唆された。さらに、LAMP1とLAMP2はリソソーム膜の完全性に必要な重要なリソソーム膜糖タンパク質である45。LAMP1またはLAMP2のKDは、低酸素誘発MMELを劇的に減少させたが、HeLa細胞におけるメガミトコンドリアの形成には影響を及ぼさなかったことから（図3e、3f、S4f-j）、リソソームの完全性がMMELに必要であることが示された。これらのデータは、リソソームの成熟（リソソームの酸性化と完全性を含む）がMMELに必須であることを示唆している。
図3：MMELには成熟したリソソームが必要である。
a, b mito-DsRed（ミトコンドリア）を安定に発現しているHeLa細胞を、DMSO、バフィロマイシンA1（BafA1）、またはクロロキン（CQ）存在下、正常酸素または低酸素で12時間処理した。その後、細胞を抗LAMP1（リソソーム）抗体で免疫染色し、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡による3Dイメージングで解析した。ミトコンドリア（赤）とリソソーム（緑）は、Imarisソフトウェアを用いてオリジナルデータに重ね合わせた3D表面再構成を用いて表示した（a）。下の画像は中央の画像の3D表面再構成。c、d HeLa細胞をDMSO、BafA1またはCQ存在下、正常酸素または低酸素で12時間処理した後、細胞サンプルをTEMで分析した。青 "M"：ミトコンドリア、赤 "L"：リソソームまたはリソソーム関連オルガネラ。その後、各実験で10細胞のミトコンドリア100個あたりのミトコンドリア-リソソーム接触（contacts）とMMEL（engulfment）を定量し、相対データを表示した（d）。e, f コントロールまたはLAMP2ノックダウン（shLAMP2）HeLa細胞でmito-DsRed（ミトコンドリア）を安定に発現させ、正常酸素または低酸素で24時間処理した。ミトコンドリア（赤）とリソソーム（緑）は、Imarisソフトウェアを用いてオリジナルデータに重ね合わせた3D表面再構成を用いて表示した（e）。下の画像は中央の画像の3D表面再構成。各実験で10個の細胞のミトコンドリア-リソソーム接触（contacts）とMMEL（engulfment）を定量し、100個のリソソームあたりのM-L接触とMMELの数を表示した（f）。棒グラフはすべて平均値±SEMを表し、n = 3つの独立した実験、統計的有意性は二元配置分散分析により評価した。P値は図中に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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全体として、低酸素誘導MMELはミトコンドリアの融合とリソソームの成熟を必要とする。
Syntaxin17-SNAP29-VAMP7複合体は低酸素下でのメガミトコンドリア-リソソーム接触とMMELに寄与する
シンタキシン17（STX17）は、SNAP29およびVAMP7（またはVAMP8）と協力してSTX17-SNAP29-VAMP7（またはVAMP8）複合体を形成し、オートファゴソーム-リソソーム融合を仲介している46。そこで我々は、MMELにおけるSTX17-SNAP29-VAMP7複合体の役割を調べた。共焦点イメージングにより、正常酸素下では、GFP-STX17（安定発現）または内因性STX17（免疫染色）の大部分がTOMM20（ミトコンドリアマーカー）と共局在し、GFP-STX17または内因性STX17はほとんどLAMP1（リソソームマーカー）と共局在または接触しないことが示された（図4a、4bおよびS5a）。驚くべきことに、低酸素下では、STX17の一部が集積し、多くの点刻を形成した；さらに、いくつかの点刻はミトコンドリア-リソソーム接触部位に位置していた（図4a-cおよびS5a）。STX17-SNAP29-VAMP7複合体は主にオートファゴソーム-リソソームの結合と融合を媒介することから46、オートファゴソーム形成が阻害されたATG5ノックダウン細胞（図S5b）におけるSTX17の局在を調べ、STX17の点着とSTX17-SNAP29-VAMP7複合体の形成がオートファゴソーム-リソソームの融合に依存しているかどうかを調べた。低酸素下のATG5ノックダウン細胞では、メガミトコンドリア-リゾソーム接触部位にSTX17の点在が見られた（図4a-c）。さらに、co-IPアッセイにより、低酸素下のコントロール細胞またはATG5ノックダウン細胞において、STX17がSNAP29およびVAMP7と相互作用することが示された（図4d）。これらのデータは、STX17-SNAP29-VAMP7複合体が低酸素下でのメガミトコンドリア-リソソーム接触およびMMELに関与していることを示唆している。さらに、低酸素下では、ATG5ノックダウン細胞においてVAMP7とSNAP29が正常酸素下と比較して有意に減少した（図S5cおよびS5d）。おそらく、低酸素誘導MMELの後、STX17-SNAP29-VAMP7複合体が分解されたためであろう。
図4：ミトコンドリア-リゾソーム間の接触とMMELにおけるSTX17-SNAP29-VAMP7複合体の役割。
a-c GFP-STX17（緑）を安定に発現しているWTまたはATG5ノックダウン（shATG5）HeLa細胞を正常酸素または低酸素に24時間曝露し、TOMM20（ミトコンドリア、赤）またはLAMP1（リソソーム、青）に対する抗体で免疫染色し、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡で解析した（a）。A "のGFP-STX17の局在様式を描いた（b）、緑： GFP-STX17、赤： TOMM20、青： LAMP1（リソソーム）。d コントロールまたはATG5ノックダウンHeLa細胞にFlag-STX17を導入または非導入し、細胞溶解液を抗Flag M2アフィニティーゲルで免疫沈降（IP）した後、抗SNAP29抗体、抗VAMP7抗体、または抗Flag抗体を用いてウェスタンブロッティングを行った。e,fコントロール、Mito-DsRed（ミトコンドリア）を安定に発現するシンタキシン-17ノックダウン（shSTX17）HeLa細胞を正常酸素または低酸素に24時間曝露し、LAMP1（リソソーム）に対する抗体で免疫染色し、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡で解析・画像化した。ミトコンドリア（赤）とリソソーム（緑）は、Imarisソフトウェアを用いてオリジナルデータに重ね合わせた3D表面再構成を用いて表示した（e）。下の画像は中央の画像（e）の3D表面再構成。コントロール、STX17ノックダウン（f）（各実験10細胞）におけるミトコンドリア-リソソーム接触（contacts）とMMEL（engulfment）を定量化し、100リソソームあたりのM-L接触とMMELの数を表示した。棒グラフはすべて平均値±SEMを表し、n = 3つの独立した実験、統計的有意性は二元配置分散分析により評価した。P値は図中に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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次に、MMELに対するSTX17-SNAP29-VAMP7複合体の効果を調べた。STX17のノックダウン（図S5e）は、ミトコンドリア-リソソーム間の接触とMMELを劇的に減少させた（図4eおよびf）；対照的に、GFP-STX17の過剰発現は、ミトコンドリア-リソソーム間の接触とMMELを有意に増加させた（図S5fおよびS5g）。これらの結果は、STX17がメガミトコンドリア-リゾソーム接触と低酸素誘導MMELを制御していることを示唆している。さらに、GFP-STX17の過剰発現は、MFN1/2 DKD細胞およびWT（コントロール）細胞の両方でミトコンドリア-リゾソーム間の接触を有意に増加させたが、MFN1/2 DKD細胞では低酸素誘導MMELをレスキューできなかった（図S5fおよびS5g）。さらに、SNAP29またはVAMP7をノックダウンすると、低酸素下でのミトコンドリア-リゾソーム間の接触とMMELが有意に阻害された（図S6a-d）。さらに、STX17、SNAP29またはVAMP7のノックダウンは、低酸素下でのメガミトコンドリアの形成には影響を及ぼさなかった（図S6e）。これらのデータは、STX17-SNAP29-VAMP7複合体が低酸素下でメガミトコンドリア-リゾソーム接触とMMELを制御していることを示唆している。低酸素下のSTX17ノックダウン細胞における一部のメガミトコンドリアは、メガミトコンドリアを異なる形態にリモデリングするミトコンドリア融合・分裂過程を経る可能性もあるが、大部分のメガミトコンドリアは変化しないことに留意すべきである（図S6f）。
加えて、TEMイメージングでは、MMELの間、リソソーム膜とミトコンドリア膜の密接な接触と融合が見られたことから［図2j（6番目のパネル）、S7a］、ミトコンドリア-リソソーム膜融合がMMELに関連している可能性が示唆された。次に、二分子蛍光相補性（BiFC）アッセイ（細胞内のタンパク質間相互作用を直接可視化する）を用いて、ミトコンドリア-リゾソームの接触または融合におけるSTX17-SNAP29-VAMP7複合体の役割を調べた。STX17-VNとSNAP29-VCを共発現させたコントロール細胞またはATG5ノックダウン細胞では、正常酸素下では蛍光はほとんど検出されなかったが、低酸素下では顕著な蛍光が見られた（図S7b）。このことから、STX17-SNAP29相互作用は低酸素下で劇的に増加し、STX17-SNAP29-VAMP7複合体が低酸素下で増加することで、メガミトコンドリア-リソソーム膜接触や融合が促進される可能性が示唆された。さらに、STX1747のN末端膜貫通ドメインを欠損したドミナントネガティブ変異体であるSTX17-ΔNTDは、依然としてメガミトコンドリア-リソソーム接触部位に局在することができ、MMELを有意に阻害したが、低酸素下でのメガミトコンドリア-リソソーム接触には影響を与えなかったことから（図S7c-e）、STX17がメガミトコンドリア-リソソーム膜融合に関与していることが示唆された。したがって、メガミトコンドリア-リゾソーム膜融合は、低酸素下でのMMELの過程に関与している可能性がある。
全体として、STX17-SNAP29-VAMP7複合体はメガミトコンドリア-リソソーム接触部位に蓄積し、低酸素下でのミトコンドリア-リソソーム膜接触とMMELに寄与している。
MMEL後、リソソーム膜は破れ、リソソームプロテアーゼがメガミトコンドリアに放出される
次に、低酸素下でのMMEL後に、ミトコンドリア内のリソソームの膜の完全性が損なわれるかどうかを調べた。リソソーム膜透過性のマーカーであるガレクチン-3を用いて、リソソーム膜の完全性を検出した48。メガミトコンドリアと接触しているか、メガミトコンドリアに飲み込まれているGFP-ガレクチン-3の点刻の数は、低酸素下で有意に増加した（図5aおよびb）ことから、低酸素下でのMMEL中／後に、一部のリソソームの膜の完全性が損なわれていることが示唆された。さらに、GFP-LAMP1を発現させたHeLa細胞を免疫電子顕微鏡で解析した。低酸素下では、リソソーム構造が無傷のメガミトコンドリアに免疫金粒子（GFP-LAMP1を示す）が観察されたが、正常酸素下では観察されなかったことから（図5c）、低酸素下でのMMEL後にリソソーム膜が破裂している可能性が示唆された。次に、MMEL後にリソソームプロテアーゼがメガミトコンドリアに放出されるかどうかを調べた。細胞内分画アッセイとその後のウェスタンブロッティング解析から、低酸素下ではミトコンドリア画分中のカテプシンD（CTSD、主要なリソソームプロテアーゼ）のレベルが上昇することが示された（図5dとe）。さらに、カテプシンB（CTSB、もう一つの主要なリソソームプロテアーゼ）の一部はミトコンドリア内に存在し、拡散した（図5e）。さらに、タイムラプス共焦点イメージングにより、CTSB-mCherryで標識されたリソソームがメガミトコンドリアに接触して入り込み、その後メガミトコンドリア内でCTSB-mCherryが放出・拡散することが示された（図5f、補足動画11）。なお、放出されたリソソームプロテアーゼCTSBはミトコンドリア内に長く留まることはなく、ミトコンドリア内で分解される（図5fおよびg）。さらに、低酸素細胞ではGFP-LAMP1（リソソーム膜タンパク質）も減少している（図S8aおよびS8b）。これらのデータは、低酸素下でのMMEL後、リソソームプロテアーゼがメガミトコンドリアに放出される可能性を示している。
図5：MMEL後、リソソーム膜は破れ、リソソームプロテアーゼはメガミトコンドリア内に放出される。
a, b mito-DsRed（ミトコンドリア）とGFP-Gal3を共発現させたHeLa細胞を正常酸素下または低酸素下で24時間処理した後、細胞を固定し、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡による3Dイメージングで解析し、3D表面再構成の画像を示した（a）。各実験で10個の細胞からミトコンドリア（mito-DsRed）に接触し、GFP-Gal3パンクチャを含むミトコンドリアを定量し、その割合を表示した（b）。エラーバーは実験の平均±SDを示し、n＝3独立実験、統計的有意性は両側t検定で評価した。 c LAMP1-GFP細胞を発現するHeLa細胞を正常酸素または低酸素で24時間処理した後、GFP免疫金染色と免疫電子顕微鏡解析のために固定した。d HeLa細胞を正常酸素または低酸素に24時間暴露した後、細胞内分画アッセイ用に抽出した。細胞質画分とミトコンドリア画分を、抗カテプシンD、抗GAPDH、抗HSP60抗体を用いたウェスタンブロッティングで分析した。e CTSB-mCherry（赤）およびmito-GFP（緑）を発現するHeLa細胞を正常酸素または低酸素で24時間処理し、生きたHeLa細胞におけるミトコンドリア-リソソーム接触またはメガミトコンドリア内のリソソームの3D画像を表示した。f, g CTSB-mCherry（赤）およびmito-GFP（緑）を発現する生きたHeLa細胞を24時間低酸素処理した後、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡で追跡して画像化した。生細胞の3D画像が表示された（f）。I "のメガミトコンドリア内のリソソーム酵素の蛍光強度をimage Jソフトウェアで解析した（g）。h, i コントロール、MFN1/2、ATG5またはSTX17ノックダウン（shMFN1/2、shSTX17またはshATG5）mito-GFP（緑）を安定に発現するHeLa細胞を、正常酸素または低酸素で24時間処理した後、マジックレッドで1時間インキュベートし、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡で解析・画像化した（h）。その後、10個の細胞から1000個のミトコンドリアあたりのマジックレッド蛍光を含むミトコンドリアの数を定量し、その割合を表示した（i）。データは平均値±SEMで示し、統計的有意性は二元配置分散分析（ANOVA）で評価した。P値は図中に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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次に、放出されたリソソームプロテアーゼがミトコンドリアで活性を示すかどうかを調べた。マジックレッドアッセイ（このアッセイのマジックレッド基質は活性型カテプシン酵素による切断時に赤く蛍光を発する）を用いて、mito-GFPを発現している培養細胞のカテプシンB活性をモニターした。正常酸素下では、コントロール、shMFN1/2、shATG5、またはshSTX17-HeLa細胞において、赤色蛍光（活性カテプシンBインジケーター）は緑色蛍光（ミトコンドリアインジケーター）と共局在しなかった（図5hおよびi）ことから、活性カテプシンは主にリソソームに存在するが、ミトコンドリアには存在しないことが示唆された。対照的に、低酸素下では、コントロールHeLa細胞のミトコンドリアの～12％（そのほとんどがメガミトコンドリア）が拡散したマジックレッド蛍光を示した（図5hおよびi）。これは、MMEL後にリソソームプロテアーゼがミトコンドリアで活性化することを示唆し、また低酸素が細胞内でMMELを誘導することを示している。しかし、MFN1/2 DKDまたはSTX17 KDは、ATG5 KDではなく、低酸素下でマジックレッドの蛍光を発するミトコンドリアの数を劇的に減少させた（図5hおよびi）ことから、マジックレッドの蛍光を発するミトコンドリアはMMELによるものであり、マイトファジーによるものではないことが示唆された。ミトコンドリアにおけるリソソームプロテアーゼの活性は、おそらく高くないか、長く続かないことに注意すべきである。したがって、これらのデータは、ミトコンドリアにおいて、飲み込まれたリソソームがミトコンドリアのタンパク質を消化するために（少なくとも部分的に）活性を持つことを示唆している。
したがって、MMEL後にリソソームプロテアーゼをメガミトコンドリアに放出するためには、リソソーム膜の完全性が損なわれている。
MMELはミトコンドリアプロテアーゼと協力して、低酸素下でミトコンドリアの自己消化（MSD）を媒介する
MMEL後、リソソームプロテアーゼがミトコンドリア内に放出され、活性化する可能性があることから、ミトコンドリアタンパク質の分解におけるMMELの役割を調べた。正常酸素HeLa細胞と低酸素HeLa細胞からミトコンドリア画分を分離・精製したところ、ミトコンドリアタンパク質の総量は低酸素では正常酸素の75％（24時間）、43％（48時間）まで減少していた（図6a）。また、TOMM20（ミトコンドリア外膜タンパク質）、TIMM23（ミトコンドリア内膜空間タンパク質）、COX2（ミトコンドリアDNAにコードされるミトコンドリア内膜タンパク質）、COX4（核DNAにコードされるミトコンドリア内膜タンパク質）に対する抗体を用いて、精製ミトコンドリアのウェスタンブロッティング解析を行った。ミトコンドリアタンパク質は、HeLa、HCT116、またはMCF7細胞において、長時間の低酸素条件下（24時間または48時間）で有意に減少した（図6b、c、およびS8c-S8f）ことから、低酸素はミトコンドリアタンパク質の分解を誘導することが示唆された。次に、低酸素によるミトコンドリアタンパク質の分解が、従来のオートファゴソームを介したマイトファジーに依存しているかどうかを調べた。ATG5 KDは、低酸素下でmito-Keimaアッセイによって検出されたオートファゴソームを介するマイトファジーを顕著に阻害した（図S8gおよびS8h）。また、mito-Keimaアッセイと共焦点イメージングにより、低酸素下の細胞では、約29.47％のミトコンドリアがマイトファジーを受けており（赤い点刻で示される）、約49.61％のミトコンドリアがメガミトコンドリアであることが示された（Fig. 低酸素下の細胞では、ミトコンドリアの約49.61％がメガミトコンドリアであった（図S8iおよびS8j）；しかし、ミトコンドリア全体の面積に対するマイトファジーを起こしているミトコンドリアまたはメガミトコンドリアの面積の比は、それぞれ0.11または0.67であった（図S8iおよびS8j）。さらに、ATG5のKDまたはノックアウト（KO）は低酸素下でミトコンドリアタンパク質の分解を阻害せず、むしろコントロールと比較してわずかに促進した（図6d、6e、S8kおよびS8l）。さらに、TEM分析により、低酸素下のATG5 KDミトコンドリアの電子密度は、コントロールのミトコンドリアの電子密度よりも有意に低いことが示され（図S8mおよびS8n）、ATG5 KDは低酸素誘導性ミトコンドリア分解を阻害しないことがさらに示された。さらに、ATG5 KDは低酸素下でのMMELに影響を与えなかった（図S9aおよびS9b）。さらに、Dhingraらは、Ulk1/Rab949を介する別のマイトファジー経路を報告している。我々は、Rab9 KDがMMELに影響を与えず、低酸素下でのミトコンドリアタンパク質の分解を阻害しないことを見いだした（図6f、gおよびS9c-S9e）。これらのデータは、オートファゴソーム依存性およびRab9を介したマイトファジー以外の経路（MMELなど）が、低酸素下でのミトコンドリア分解に関与していることを示唆している。
図6：MMELとミトコンドリアプロテアーゼがミトコンドリアタンパク質の分解に寄与している。
a HeLa細胞を低酸素で0時間（正常酸素）、24時間、48時間処理した後、ミトコンドリア精製に用いた。b, c HeLa細胞を0時間（正常酸素）、24時間、48時間低酸素処理した後、全細胞溶解液を指示した抗体を用いてウェスタンブロッティングで解析した（b）。d, e WTまたはATG5ノックアウト（KO）MEFを低酸素で0時間（正常酸素）、24時間、48時間処理した。f-iコントロールまたはRab9ノックダウン（shRab9）HeLa細胞を0時間（正常酸素）、12時間、24時間低酸素に暴露した。j-n コントロール、カテプシンDとカテプシンBのダブルノックダウン（shCTSB+shCTSD）HCT116細胞を0時間（正常酸素）、12時間、24時間低酸素に暴露した。コントロール（空ベクター）、OMA1-Yme1Lダブルノックアウト（DKO）＋LONP1ノックダウン（shLONP1）HCT116細胞を0時間（正常酸素）、12時間、24時間低酸素に曝露した。相対的なタンパク質レベルは、ImageJソフトウェアを用いたデンシトメトリー解析によってさらに評価された（k, n）。CTSB mRNAの相対レベルは定量的RT-PCRで解析した（l）。(a,c,l)の棒グラフは平均値±SDを表し、n = 3つの独立した実験、統計的有意性は一元配置分散分析により評価した。(e、g、i、kおよびn)のバーは平均±SDを表し、n = 3つの独立した実験、統計的有意性は両側t検定で評価した。P値は図中に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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次に、ミトコンドリア分解におけるMMELの役割を調べた。MMELを制御するSTX17（図4eとf）のミトコンドリア分解への影響を評価した。STX17 KDは、低酸素下でTOMM20、TIMM23、COX2、COX4を含むミトコンドリアタンパク質の分解を著しく阻害した（図6hおよびi）。このことは、MMELが低酸素下でのミトコンドリア分解に寄与していることを示唆し、メガミトコンドリア内のリソソームがMMELを介したミトコンドリア分解に関与していることを示している。次に、MMEL中の低酸素誘導性ミトコンドリア分解にリソソーム活性が必要かどうかを調べた。BafA1を用いてリソソームの酸性化と活性を阻害した。ウェスタンブロッティング解析から、BafA1処理によって低酸素誘導性のミトコンドリアタンパク質の分解が強く阻害されることが示された（図S9fおよびS9g）。さらに、TEMアッセイにより、低酸素症はミトコンドリアのクリステアとミトコンドリア質量の減少（低酸素ミトコンドリアの電子密度の減少に反映される）をもたらしたが（図S10a-c）、BafA1処理はその減少を有意に阻止した（図S10a-c）。さらに、HIS-SIMイメージングにより、低酸素下ではリソソーム（LAMP1-mCherryで標識）が飲み込まれた後、ミトコンドリアのクリスタ（ミトコンドリア内膜とクリスタ膜を染色するPKMDRで標識）が減少し、再形成されることが示された（図S10d）。さらに、リソソームプロテアーゼ（カテプシンDとカテプシンB）の枯渇は、低酸素下でのミトコンドリアタンパク質の分解を著しく阻害した（図6j-l）。したがって、低酸素誘導MMELは、メガミトコンドリア内でのリソソームへの取り込みとリソソームプロテアーゼに依存するプロセスで、ミトコンドリアの分解に寄与している。
ミトコンドリア自体には約40種類のミトコンドリア・プロテアーゼが存在するため、低酸素症時にミトコンドリア・プロテアーゼも活性化され、ミトコンドリアの分解に関与しているかどうかを調べた。qRT-PCR解析の結果、低酸素症はLONP1のmRNAレベルを有意に増加させたが、他のミトコンドリアプロテアーゼ（AFG3L2、SPG7、Yme1L、OMA1、PARL、HTRA2、CLPP、CLPX、IMMP1LおよびIMMP2L）および他のミトコンドリアタンパク質（MFN1、MFN2、HSPD1、COX4L1、COX2、TOMM20およびTIMM23）のmRNAレベルには変化がなかった（Fig. S11a）。ウェスタンブロッティング解析によると、低酸素に6時間または12時間暴露した細胞では、ミトコンドリアプロテアーゼLONP1、AFG3L2、PARLのタンパク質レベルが増加したが、Yme1L、OMA1、HTRA2のタンパク質レベルは増加しなかった（図S11b-k）。さらに、OPA1は低酸素下で顕著に切断され（図S11dおよびS11f）、OPA1がOPA1およびYme1Lの基質として知られていることから、低酸素がミトコンドリアのプロテアーゼであるOPA1およびYme1Lを活性化することを示している50,51,52。同様に、低酸素はHAX1（HTRA2の基質）の分解とPGAM5（PARLの基質）の切断を引き起こし（図S11g-k）、低酸素下ではPARLとHTRA2の活性も上昇することが示された。重要なことに、様々なミトコンドリアプロテアーゼ（LONP1、Yme1L、さらにOMA1）を枯渇させると、低酸素下でのミトコンドリアタンパク質の分解が著しく阻害された（図6mおよびn）。総じて、低酸素は多くのミトコンドリアプロテアーゼを活性化し、ミトコンドリアタンパク質の分解を引き起こす。また、LONP1ノックダウン細胞では、低酸素誘導MMELイベントの数が有意に減少しており（図S12a-c）、低酸素によって活性化されたミトコンドリアプロテアーゼがMMELを促進していることが示唆された。
全体として、低酸素は従来のオートファゴソーム依存性マイトファジーだけでなく、MMEL、ミトコンドリア内でのリソソームの取り込みと活性化、ミトコンドリアプロテアーゼの活性化も誘導する。この一連の現象は、MMELを媒介し、ミトコンドリア内では起こるがオートファゴソーム内では起こらない（ミトコンドリアは飲み込まれる）タイプのミトコンドリア分解を開始する。我々は、低酸素によるMSDの活性化が、取り込まれたリソソームプロテアーゼとミトコンドリアプロテアーゼを活性化することによって、ミトコンドリア内のミトコンドリアタンパク質やその他の分子の消化につながることを示している。このように、従来のマイトファジーとは異なり、MSD（あるいはマイトセルフファジー）はオートファゴソーム形成や古典的なマイトファジー経路とは無関係である。
また、質量分析から、異なるミトコンドリアコンパートメントに位置するほとんどのミトコンドリアタンパク質が、低酸素症後に程度の差こそあれ減少していることが示された（図S12d-g）。OPA1、COX2、MIC19、VDAC、TIMM13、GRPEL1、GRPEL2、NDUFS4、およびAPOOのようないくつかのミトコンドリアタンパク質は、低酸素条件下で大きく減少した（図S12d-g）。しかし、HIF-1αによって転写制御されるBNIP3やBNIP3Lのような特定のタンパク質は、低酸素下で増加した（図S12d）。さらに、TOMM70、TOMM22、APOE、MIC27、CHCHD2、POLG2、NDUFA2、COX5A、およびCOA3などのいくつかのミトコンドリアタンパク質は、低酸素負荷後もほとんど変化しなかった（図S12d-g）。これらのデータは、従来のマイトファジーはミトコンドリア全体を分解するのに対し、MSDは異なるミトコンドリアタンパク質を異なる程度まで分解することを示している。
このように、MMELはミトコンドリアプロテアーゼと協力して、低酸素下でMSDを媒介する。
MMELが介在するMSDはミトコンドリアの活性酸素産生を促進する
活性酸素種（ROS）は主にミトコンドリアで産生され、細胞内で多くの役割を果たしている。低酸素下では、電子伝達鎖のバランスが崩れるため、ミトコンドリアは大量の活性酸素を発生する27。そこで、MMELを介したMSDがミトコンドリアの活性酸素（mtROS）産生に及ぼす影響を調べた。MitoSOXTM Red染色アッセイにより、メガミトコンドリア（MMEL可）のmtROSレベルは、断片化ミトコンドリア（MMELなし）および管状ミトコンドリア（MMELなし）のそれよりも有意に高いことが示された（図7aおよびb）。さらに、MMELを減少させるSTX17をノックダウンすると（図4eおよびf）、低酸素下でのmtROSはコントロールと比較して減少した（図7c）。これらのデータは、MMELを介したMSDが低酸素下でmtROS産生を促進することを示している。さらに、リソソームを含むメガミトコンドリアは、mitoSOX（mitoROSの検出）蛍光強度の増加またはTMRM（ミトコンドリア膜電位の検出）蛍光強度の減少を示し（図S13a-c）、MMELの標的となったミトコンドリアがより損傷を受けていることが示唆された。しかし、ほとんどのシトクロムcはメガミトコンドリアにとどまり、低酸素下でのMMEL中に細胞質へ放出されたシトクロムc（管状ミトコンドリアからかもしれない）はわずかであった（図S13dおよびS13e）ことから、MMELによって誘導されたミトコンドリアの損傷は細胞死につながらないことが示唆された。さらに、ミトコンドリア膜透過性転移（MPT）孔の開口は、膜電位の散逸、膨潤、シトクロムc36の放出につながる。そこで、MMELとMPT孔の関係を調べた。共焦点イメージングにより、シクロスポリンA（MPT孔開口阻害剤）処理では低酸素下でのMMELが阻害されないことが示され（図S13fおよびS13g）、MMELがMPT孔開口に依存していないことが示された。
図7：MMELは低酸素下でミトコンドリアの活性酸素産生を促進する。
a-c コントロールまたはSTX17ノックダウン（shSTX17）HeLa細胞にmito-GFPを発現させ、正常酸素または低酸素で24時間培養した後、mitoSOXで染色した（a）。(a)の細胞における断片化、管状、または大きな球状のミトコンドリア（メガミトコンドリア、）の相対的なmitoSOX蛍光強度（mito-GFP蛍光強度に対する比）をさらに解析した。正常酸素下または低酸素下で30個の細胞から300個のミトコンドリアを定量した（b）。 d, e DMSOまたはN-アセチル-L-システイン（NAC）で処理したHeLa細胞を、0時間（正常酸素下）、24時間、48時間低酸素下で培養した。相対的なタンパク質量はデンシトメトリー分析で評価した（e）。エラーバーは実験の平均±SDを示し、n = 3つの独立した実験、統計的有意性は両側t検定で評価した。f-hコントロールまたはSTX17ノックダウン（shSTX17）HeLa細胞をDMSO（コントロール）またはN-アセチル-L-システイン（NAC）で処理したmitoGFP（ミトコンドリア）を安定に発現させた細胞を、0時間（正常酸素）、24時間低酸素で培養した後、抗LAMP1抗体で免疫染色し、Airyscanを用いた共焦点顕微鏡による3Dイメージングで解析した。ミトコンドリア（緑）とリソソーム（赤）は、3D表面再構成を用いて表示された（f）。各実験で10個の細胞からのミトコンドリア-リソソーム接触およびメガミトコンドリアがリソソームを飲み込む（MMEL）事象を定量化し、100個のリソソームあたりのM-L接触およびMMELの数を表示した（g）。f "に記載したメガミトコンドリアの数も、"Methods "に詳述した基準に従って定量した（h）。 i 常酸素下（a）では、ミトコンドリア-リソソーム間の接触がミトコンドリアの分裂に寄与している。低酸素下では（b）、多くの正常なミトコンドリアが接触し（ミトコンドリア-ミトコンドリア接触、M-M接触）、融合してメガミトコンドリアを形成し、STX17-SNAP29-VAMP7複合体の助けを借りてリソソームと接触し、飲み込まれる。その後、リソソームはいくつかのヒドロラーゼを放出し、ミトコンドリアのタンパク質やその他の分子を分解する。さらに、低酸素状態ではミトコンドリアプロテアーゼ（MP）が活性化され、MMELと協力して逆ミトファジーを仲介する。(b、c、g、h)の棒グラフは平均値±SEMを表し、n = 3つの独立実験、統計的有意性は二元配置分散分析により評価した。P値は図中に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
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次に、活性酸素の阻害がMMELを介したMSDを阻害するかどうかを調べた。抗酸化剤N-アセチル-L-システイン（NAC）を用いて活性酸素を阻害したところ、NAC処理は低酸素下でミトコンドリアタンパク質の分解を有意に阻害した（図7dおよびe）ことから、mtROSの阻害がMSDを減少させることが示唆された。さらに、NAC処理は低酸素下でMMELを有意に減少させたが、メガミトコンドリア-リゾソーム間の接触やメガミトコンドリアの数は減少させなかった（図7f-h）ことから、mtROSの増加は低酸素下でMMELを促進することが示唆された。さらに、NAC処理は、低酸素下のコントロール細胞またはSTX17ノックダウン細胞のMMELを顕著に阻害した（図7f-h）ことから、NAC処理はSTX17ノックダウン細胞のMMEL形成を阻害できることが示唆された。これはおそらく、STX17ノックダウンがメガミトコンドリア-リゾソーム間の接触に影響するのに対し、NACがメガミトコンドリアの活性酸素レベルに影響するためであろう。低酸素-再酸素化もまた、mtROSの生成を劇的に増加させることに留意すべきである53。私たちは今後の研究で、MMELとMSDに対する低酸素-再酸素化の影響を調べる予定である。
全体として、MMELが介在するMSDはmtROS産生を促進し、それが低酸素条件下でのMMELを促進する。
考察
ミトコンドリアとリソソームはどちらも細胞の恒常性維持に重要である。ミトコンドリアとリソソームは機能的に相互依存しており、ミトコンドリアとリソソームの相互作用は細胞代謝とシグナル伝達において重要な役割を果たしている。今回我々は、哺乳動物細胞において、低酸素がメガミトコンドリアの形成を誘導し、ミトコンドリアとリソソームの接触を促進し、メガミトコンドリアがリソソームを飲み込む（MMEL）ことを見出した。さらに、低酸素は多くのミトコンドリアプロテアーゼを活性化し、MMELと協力してオートファゴソーム非依存的にMSD（あるいはミトセルファジー）を開始する。MSDはミトコンドリアの分解に寄与し、mtROSの産生を促進する（図7i）。
ミトコンドリアの分裂はマイトファジーを促進する。なぜなら、小さく断片化されたミトコンドリアはオートファゴソームによって容易に隔離され、分解のためにリソソームに送られるからである54。対照的に、ミトコンドリアの融合は、オートファゴソームに飲み込まれにくい長い管状またはメガミトコンドリアの形成を促進し、マイトファジーを阻害する。興味深いことに、低酸素下では断片化したミトコンドリアとメガミトコンドリアの両方の形成が誘導され（図1a-d）、ミトケイマアッセイでは、断片化したミトコンドリアのほとんどがマイトファジーを受けるのに対し、メガミトコンドリアは低酸素下ではマイトファジーに抵抗することが示された（図S8g）。また、低酸素下のメガミトコンドリアは、リソソームに運ばれて分解されるのではなく、リソソームそのものを取り込むことができる（図2および図S2）。興味深いことに、Wanらは、プロアポトーシスBH3シグナルと薬理学的MOMP（ミトコンドリア外膜透過）誘導により、エンドライソソームはますますミトコンドリアに接触し、その後急速にミトコンドリア全体に蓄積することを報告している55。さらに奥山らは、低酸素下でのMieapがミトコンドリアへのリソソームの蓄積を誘導することを報告している41。したがって、MMELに関する今回の結果は、これまでの報告と一致している。
また、STX17-SNAP29-VAMP7複合体が、ミトコンドリアとリソソームの接触およびMMELに寄与していることも明らかになった（図4およびS6）。エンドソームがミトコンドリアを取り込み、ミトコンドリアをリソソームに送り込んでクリアランスすることが報告されている56。一方、直径～70～150 nmのミトコンドリア由来小胞（MDV）は、リソソーム／後期エンドソームに直接送り込むことができる25,33。酵母では、ミトコンドリアは液胞・ミトコンドリアパッチ（vCLAMP）を介して液胞（リソソーム）と物理的に接触している57。陳研究室は、ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）において、ミトコンドリア関連タンパク質Dosmitがミトコンドリアの肥大化を引き起こし、肥大化したミトコンドリア（メガミトコンドリア）内で二重膜小胞の形成を仲介することを報告している58。最近、中村研究室は、ミトコンドリアの中に入ってミトコンドリアのリサイクルを行うマイトリソソームも報告した59。このように、ミトコンドリアには他のオルガネラと接触する方法がいくつもある。われわれの結果は、MMELがミトコンドリア-リゾソーム接触とミトコンドリアプロセッシングの一様式であることを示しており、ミトコンドリアの機能とミトコンドリア-リゾソームのクロストークを理解するための洞察を与えてくれる。
ミトコンドリア-リソソームのクロストークは、細胞の恒常性維持に重要な役割を果たしている20,21,22,23。しかしながら、ミトコンドリア-リソソームクロスストークの根底にある分子機構はまだ不明である。われわれは、低酸素下ではミトコンドリア-リゾソーム間の接触が有意に増加し、MMELも誘導されることを見いだした（図2）。さらに、STX17-SNAP29-VAMP7複合体は、低酸素下でメガミトコンドリア・リソソーム間の接触とそれに続くMMELを仲介している可能性がある（図4）。さらに、MFN1/2 DKD細胞やOPA1ノックダウン細胞では、低酸素によりミトコンドリア-リゾソーム間の接触は著しく増加したが、MMELは増加しなかった（図S3eおよびS3f）ことから、ミトコンドリア融合はミトコンドリア-リゾソーム間の接触に影響しないことが示唆された。これらのデータは、ミトコンドリア融合がSTX17-SNAP29-VAMP7複合体と協力してMMELを媒介することを示唆している。したがって、低酸素下ではミトコンドリア-リゾソーム接触のみがMMELを直接誘導することはできない。まずメガミトコンドリアが形成され、次にリソソームがメガミトコンドリアに接触しなければならない。ライソゾームとミトコンドリアの接触力は、メガミトコンドリアの侵入を引き起こし、MMELを引き起こす可能性がある（図7i-b）。ミトコンドリアとリソソームの接触とメガミトコンドリアの形成の両方がMMELに寄与していることになる。オルガネラとオルガネラの接触の分子機構は複雑であり、低酸素下でのメガミトコンドリア・リソソームの接触、融合、MMELの過程には、さらなるタンパク質が関係しているはずである。
低酸素は、マイトファジー受容体であるFUNDC1、BNIP3、BNIP3L29,30,60の活性化を通して、オートファゴソーム依存的なマイトファジーを誘導する。さらに、Ulk1/Rab9を介する別のマイトファジー経路は、虚血から心臓を保護する49。興味深いことに、ATG5またはRab9を欠失させた細胞では、低酸素下でミトコンドリアタンパク質が依然として有意に減少していた（図6d-g、およびS9c-e）。これらの所見は、マイトファジーに加えて、ミトコンドリアの分解を担う他の経路が存在する可能性を示唆している。この枠組みにおいて、低酸素がMMELプロセスを誘導し、MMEL後にリソソームプロテアーゼがメガミトコンドリアに放出されることを見出した（図2および5）。さらに、低酸素はほとんどのミトコンドリアプロテアーゼを活性化し、ミトコンドリアタンパク質を分解する（図S11b-k）。まとめると、低酸素下でのMMELと活性化されたミトコンドリアプロテアーゼの両方が、ミトコンドリアの分解様式であるMSD（またはミトセルフファジー）に寄与している。MSDを受けている）メガミトコンドリアの面積は、マイトファジーを受けているミトコンドリアよりも大きいが（図S8g-j）、メガミトコンドリアはミトコンドリアの内容物を部分的に分解しているだけであり、メガミトコンドリアがミトコンドリア分裂を起こしてマイトファジーのための小さなミトコンドリアを生成する可能性も否定できない。したがって、低酸素下でのミトコンドリアの分解には、MSDとマイトファジーが複合的に寄与している。
我々はここで、MSDと呼ぶミトコンドリア分解のメカニズムについて述べる。MSDは低酸素下で起こり、ミトコンドリアの部分的分解を引き起こす。マイトファジーとは異なり、オートファジー機構には依存しない。MSDにはリソソームプロテアーゼとミトコンドリアプロテアーゼの両方が必要である。われわれは、MSDは低酸素下でミトコンドリアの質を制御する重要な経路であり、さらなる条件下でヒトの疾患に関与する可能性があることを提唱する。
方法
免疫染色、共焦点顕微鏡解析、画像処理
細胞はガラスカバースリップ上で増殖させ、4％パラホルムアルデヒドで20分間RT固定し、0.1％Triton-X-100で10分間透過処理した。細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)を含むリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で4℃で1時間ブロックし、FBS中の一次抗体とRTで1時間インキュベートした。洗浄後、Alexa-488(1:400)、Cy3(1:800)、Alexa-647にコンジュゲートした二次抗体存在下、RTで1時間インキュベートした。洗浄後、カバースリップをCytifluor（Amersham Biosciences）でマウントした。細胞はLeica L8またはZeiss LSM880顕微鏡（Airyscan付き）を用いて分析・画像化した。レーザー励起は488 nm、561 nm、または638 nmのレーザーで行った。
三次元（3D）共焦点イメージングを、Airyscan付きZEISS LSM880顕微鏡を用い、63×油浸対物レンズを用いて行った。細胞の共焦点zスライスを0.25μmごとに、合計5.0μm取得した。画像はZENを用いて取り込まれ、3Dスライス再構成を用いて再構成された。さらに、Imarisソフトウェアを用いて、オリジナルデータに重ねた3D表面再構成を解析・作成した。
タイムラプスイメージングでは、mito-GFPとLAMP1-mCherryを安定発現させた生細胞の光学z切片を、37℃に設定した環境チャンバーを備えたAiryscan付きZeiss LSM880顕微鏡を用いて取得した。タイムラプス画像はZENを用いて取得し、ZENのAiryscan自動処理アルゴリズムを用いて処理した。
ミトコンドリアの形態と構造の測定
ミトコンドリアの形態と構造は、まず共焦点顕微鏡または透過型電子顕微鏡（TEM）を用いて画像化し、ImageJソフトウェアで解析した。ミトコンドリアの形態は、以前に記載された方法5に従って決定した。簡単に説明すると、ミトコンドリアの形態を決定するために、定量分析のために少なくとも300個の細胞（細胞あたり10個のミトコンドリア）を無作為に選び、目視で4つの分類にスコアリングした：管状」、「短い管状」、「断片化」、「大きな球状（メガミトコンドリア）」である。ミトコンドリアの大きさを決定するために、TEM画像をImageJソフトウェアで解析し、ミトコンドリアの面積を測定し、ミトコンドリアの相対的な大きさを提供した。
ミトコンドリア-リゾソーム接触およびMMELの測定
細胞を正常酸素または低酸素で指示された時間インキュベートした後、固定し、免疫染色した。Airyscan付き顕微鏡ZEISS LSM880を用いて3D共焦点イメージングを行った。3D画像を解析し、ミトコンドリア-リソソーム接触またはMMELの定量に使用した［各実験において、10個の細胞から得られたすべてのリソソーム（500個以上）を定量に使用し、少なくとも3回の独立した実験を行った］。次にデータを解析し、100個のリソソームあたりのミトコンドリア-リソソーム接触数またはMMEL数を示した（低酸素状態ではリソソーム数が著しく増加し、各細胞のミトコンドリア形態が劇的に変化するため、「10細胞あたり」または「100ミトコンドリアあたり」は用いなかった）。ライソゾームとミトコンドリアの共局在をImageJソフトウェアで解析した。>ミトコンドリアと共局在するリソソームの5％以上50％未満を「ミトコンドリア-リソソーム接触」とし、ミトコンドリアと共局在するリソソームの50％以上を「MMEL」とした。MMELを定量するために、少なくとも3回の独立した実験を行った。統計解析はPrism 8（GraphPad Software）を用いて行った。
透過型電子顕微鏡（TEM）分析
100mmディッシュで増殖した細胞をPBSで2回洗浄し、3% PFA、0.5% グルタルアルデヒド、0.25% ショ糖、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）中、1時間、常温で固定した。その後、0.25%スクロースを含む0.1M PB（pH 7.4）で洗浄した。その後、細胞をスクラッチし、収集し、勾配遠心で圧縮した。サンプルを0.1M PB中2%四酸化オスミウムで4℃、1時間、2%酢酸ウラニルで4℃、一晩後固定した。サンプルを異なる濃度のエタノールで脱水し、812's樹脂に室温で4時間包埋し、60℃で2日間重合した。このブロックをウルトラミクロトーム（Leica）を用いてダイヤモンドナイフで70 nmの超薄切片を作成した。切片を銅グリッド上に置き、2％クエン酸鉛で15分間、2％酢酸ウラニルで10分間染色した。最後に、切片を標準的な電子顕微鏡の手順に従って処理した。画像は、JEM-1400Plus（日本電子）透過型電子顕微鏡を用い、加速電圧 100 kV で取得した。
定量および統計解析
定量データは、Zeiss LSM 880 の画像から Airyscan を用いて取得し、ImageJ ソフトウェアを用いて解析した。データは Microsoft Excel を用いて集計・処理した。デンシトメトリーは、ウェスタンブロッティングおよびTEM上のバンドの定量分析のためにImageJソフトウェアを用いて行った。統計解析はPrism 8（GraphPad software）を用いて行った。データは平均値±SDまたはSEMで示し、統計的有意性は片側または両側ANOVAまたは両側t検定で決定した。P値は図中に示した。ソースデータはSource Dataファイルとして提供される。
統計と再現性
ほとんどのin vitro実験では、各実験グループに対して少なくとも3つの生物学的に独立したサンプルを使用した。解析から除外したデータはない。目的の統計対象は実験によって異なり、主要な知見は異なる時期に再現された。解析から除外されたデータはなく、データ分布は正規と仮定された。
報告概要
研究デザインに関する詳細は、この論文にリンクされているNature Portfolio Reporting Summaryを参照されたい。
データの入手可能性
論文に含まれる結論を裏付ける全てのデータは、論文およびその補足情報内で入手可能である。本研究で得られたすべてのプロテオミクスデータはPRIDEデータベースにアクセッションコードPXD034375で寄託されている。ソースデータは論文とともに提供される。ソースデータは本論文とともに提供される。
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ミトコンドリアの分裂と選択的融合は、オートファジーによるミトコンドリアの分離と除去を支配している。このような研究成果は、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）、日本学術振興会特別研究員（PD）の各氏が発表した。
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Wang、T. S., Coppens、I., Saorin、A., Brady、N. R. & Hamacher-Brady, A. ミトコンドリアのエンドリソソーム標的化は、アポトーシスのシグナル伝達におけるBAXを介したミトコンドリアの透過に不可欠である。Dev. 細胞 53, 627-645.e627 (2020).
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謝辞
また、Gal3プラスミドを提供してくれたXiaochen Wangに感謝する。本研究は、中国国家自然科学基金会（31970711, 32125011, 91854107）、中華人民共和国科学技術部（2018YFA0800700）、中央大学基礎研究費の支援を受けている。
著者情報
著者メモ
これらの著者は同等に貢献した： Tianshu Hao, Jianglong Yu.
著者および所属
中国湖北省武漢市武漢大学武漢大学人民病院麻酔科、生命科学大学、太康生命医科学センター、免疫代謝フロンティア科学センター、武漢大学、430072
Tianshu Hao、Jianglong Yu、Zhida Wu、Jie Jiang、Longlong Gong、Bingjun Wang、Hanze Guo、Huabin Zhao、He He & Zhiyin Song
中国湖南省衡陽市衡陽421001 中国華南大学衡陽医学院基礎医学学院生化学分子生物学科
ビン・ルー
イスラエル、ハイファ、テクニオン-イスラエル工科大学ラパポート医学部生化学科
シモーネ・エンゲレンダー
貢献
Z.S.とH.H.は、このプロジェクトを発案し、指揮した。T.H.とJ.Y.はほとんどの実験とデータ解析を行った。Z.W.、J.J.、L.G.、B.W.、H.G.は実験の一部を手伝った。T.H.、J.Y.、H.H.、Z.S.が論文を執筆。H.Z.、B.L.、S.E.、H.H.は論文を編集し、実験デザインと解釈について指導を行った。すべての著者が一緒に議論し、データを解釈した。
共著者
He HeまたはZhiyin Songまで。
倫理申告
競合利益
著者らは、競合する利益はないと宣言している。
査読
査読情報
Nature Communications誌は、Lena Pernas氏、Paolo Ronchi氏、および本論文の査読に貢献した匿名の他の査読者に感謝する。
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出版社注：Springer Natureは、出版された地図の管轄権の主張および所属機関に関して中立を保っています。
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Hao, T., Yu, J., Wu, Z. et al. 低酸素でプログラムされたメガミトコンドリアがリソソームと接触し、ミトコンドリアの自己消化を仲介する。Nat Commun 14, 4105 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39811-9
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2022年5月23日受領
2023年6月29日受理
2023年7月11日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41467-023-39811-9
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