ヒトおよびマウスにおける神経性食欲不振症の発症に寄与する腸内細菌叢の研究

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発行：2023年4月17日
ヒトおよびマウスにおける神経性食欲不振症の発症に寄与する腸内細菌叢の研究

https://www.nature.com/articles/s41564-023-01355-5

The gut microbiota contributes to the pathogenesis of anorexia nervosa in humans and mice - Nature Microbiology

ヨンファン
レネ・クリンクビー・ストーヴィング
...
オルフ・ペデルセン
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アブストラクト
神経性食欲不振症（AN）は、死亡率の高い摂食障害である。症例の約95％が女性で、人口有病率は約1％であるが、エビデンスに基づく治療法は確立されていない。ANの病因には、おそらく遺伝学と様々な環境因子が関与しており、アンプリコンシークエンスと比較的小規模なコホートを用いて、AN患者において腸内細菌叢の変化が観察されています。ここでは、腸内細菌叢の乱れがAN発症に寄与しているかどうかを検討した。AN患者77名と健常者70名の女性コホートから採取した糞便および血清サンプルについて、それぞれショットガン・メタゲノミクスおよびメタボロミクスを実施した。ANでは複数の細菌分類群（例えば、クロストリジウム種）が変化し、食行動や精神的健康の推定値と相関があった。また、ANでは腸内ビロームも変化しており、ウイルスと細菌の相互作用が減少していることも分かりました。神経伝達物質の分解に関連する細菌の機能モジュールはANで濃縮され、細菌の様々な構造変異はANの代謝的特徴に関連していた。血清メタボロミクスでは、食事摂取量の減少に関連する代謝物（例えば、インドール-3-プロピオン酸）が増加していることが明らかになった。因果推論分析により、血清細菌代謝物が、腸内細菌叢の変化がAN行動に与える影響を媒介する可能性が示唆された。さらに、AN症例から無菌マウスに糞便微生物叢を移植し、エネルギー制限食下でANの食行動を再現しました。その結果、体重増加の減少や視床下部および脂肪組織の遺伝子発現の誘導が、エネルギー代謝や食行動の異常と関連していることを発見しました。オミックス研究およびメカニズム研究は、腸内細菌叢の乱れがAN発症に寄与している可能性を示唆しています。
主な内容
神経性食欲不振症（AN）は、歪んだ身体イメージ、食べ物に対する強迫観念、食事量の減少、体重の減少、身体活動の増加、感情の硬直などの儀式的行動パターンを特徴とする深刻な精神疾患および摂食障害である1。ANは、約95％の症例で主に女性に発症し、人口有病率は約1％である2。ANは、一般的な制限型（AN-RS）と、あまり一般的ではないむちゃ食いやパージ型（AN-BP）の2つのサブタイプに分類することができます1。治療に関するエビデンスは乏しく3、集学的な専門治療により死亡率は低下するものの4、完全寛解に至るのはAN症例の半数以下である5。総死亡率は10年当たり5.6％と推定され、一般人口よりはるかに高い6。
ANは、その病因を明らかにする研究にもかかわらず、依然として症候群、すなわち、明確な原因のない症状の集合体である。双子研究では、50-60％の遺伝率が報告されており7、ゲノムワイド関連研究では、精神疾患、身体活動、代謝および身体測定形質との相関を示す8つのゲノム遺伝子座が特定されています。これは、体格指数に関連する一般的なバリアントとは無関係である8,9。病態生理レベルでは、ANは複数の内分泌系の変化10と、脳の様々な部位における神経伝達物質のシグナル伝達の乱れ11によって特徴付けられる。
ヒトの消化管には、代謝産物やその他の経路を介して宿主の代謝、免疫、神経生物学に影響を与えることができる微生物の複雑な集合体が含まれています12。これには、食欲、行動、感情の調節を含む脳機能に影響を与える腸-微生物-脳軸が含まれる場合があります13。例えば、腸内細菌が主に産生する細菌代謝物カゼイン分解ペプチダーゼB（ClpB）は、α-メラノサイト刺激ホルモンを抗原的に模倣し、食欲不振作用を発揮することがある14,15。
腸内細菌叢の異常がANの病態に関与している可能性があるとの仮説が唱えられている。ANにおいて、アンプリコンシークエンシングを用いて腸内細菌叢を属レベルで特徴付けた小規模な研究がいくつか発表されており、腸内細菌叢のディスバイオシスが示されている（補足注1参照）。さらに、拒食症モデルマウスにおいて、腸内細菌叢の変化が食行動の変化や視床下部神経ペプチドの発現と関連していることが示されています20。
ここでは、乱れた腸内細菌叢と血清メタボロームが、ANの複雑な病態に寄与しているという仮説を検討した。そのために、77名の女性AN患者と70名の年齢をマッチさせた女性対照者の糞便サンプルを用いてショットガン・メタゲノミクスを実施し、分類学的、機能的、遺伝学的レベルで腸内細菌と古細菌の微生物相を詳細に分析するとともに、ウイルス性腸内細菌相の分析も行いました。また、血清メタボロームの特徴も明らかにし、腸内メタゲノムデータとともに、食行動や心理行動の個人マーカーとの関連性を分析した。因果関係は、双方向性仲介分析を用いてシリコで、また、AN症例の腸内細菌叢を無菌の雌の同胞に移植する糞便微生物叢移植（FMT）を用いてin vivoで検討しました。その結果、AN症例の腸内細菌叢の乱れや関連する細菌代謝物がAN発症に寄与しているという仮説が支持されました（Extended Data Fig.1）。
結果
AN女性および対照者の表現型
登録された77名のAN女性および健康体重（HC）と考えられる年齢をマッチさせた70名の対照女性の臨床的特徴の要約統計は、補足表1に示されている。特定の食行動のレベルを推定するために、有効なEating Disorder Inventory-3（EDI-3）質問票を使用し21、EDI-3サブスケールの詳細な説明は補足注2に示すとおりである。予想通り、ANの女性はかなり痩せており、グルコースとインスリンの空腹時血清濃度が低く、インスリン抵抗性の恒常性モデル評価（HOMA-IR）で推定されるインスリン感受性が高く、血清C反応性タンパク質は低かった。試験参加者の詳細なベースライン特性は、補足表2に示されている。さらに、AN症例の中でもAN-RS型症例は、AN-BP症例よりも血清インスリンの値が高く、インスリン感受性が低いという特徴があった（補足表1）。ANとHCの便サンプルを比較すると、ANとHCの間、またはANのサブタイプ内で細菌細胞数に有意な差はなかった（PWilcoxon > 0.05, Supplementary Table 1）。
ANでは腸内細菌叢の組成が変化する
門レベルでは、AN微生物叢のサンプルはBacteroidotaとActinobacteriotaの減少が特徴的であった（Extended Data Fig.2a）．ファミリーレベルでは、両グループともBacteroidaceaeが優勢であった（Extended Data Fig.2b）。上位20科のうち、Christensenellales CAG-138の存在量はANで高く、このコホートでは新しい観察であったが、RuminococcaceaeとLachnospiraceaeの存在量はHCで高いことがわかった。89の細菌ファミリーのうち、ANではChristensenellaceaeが最も有意に濃縮されていた（Extended Data図2c）。ANマイクロバイオームのβ多様性は属レベルでより高いことが確認され（Extended Data Fig.2d）、Bacteroidesが両グループで支配的な系統であった（Extended Data Fig.2e）。上位30属のうち、Faecalibacterium、Agathobacter、Gemmiger、未分類のLachnospiraceae G、Ruminococcus 2、Roseburia、Dysosmobacter - Oscillibacter、Coprococcus、Oscillospirales 4 CAG-103およびEisenbergiellaはHCでより豊富であり、未分類のClistensenellales CAG-138はANでより豊富だった（Extended Data Fig.2e）．さらに、同定された225の細菌属のうち、ANではLactobacillusが最も有意に濃縮されていた（Extended Data Fig.2f）。ANとHCでは主要な属が異なるにもかかわらず、メタゲノム種パンゲノム（MSP、以下、種という）の豊かさは両群間で同様であることがわかった（Extended Data Fig.2g）。腸型解析22では、ANではHCと比較してRuminococcacea-腸型（R-腸型）の有病率が高く、AN-BPではAN-RSサブタイプよりも同じ腸型の有病率が高いことがわかった（拡張データ図2h）。
種レベルでは（補足表3）、AN腸内細菌叢はより高いβ多様性によって特徴づけられることが観察された（図1a）。ANサブグループ内では、AN-BPサブタイプはAN-RSサブタイプよりも種レベルでより不均一な細菌群集を有していた（図1b）。また、AN入院患者と外来患者の比較では、種レベルで入院患者のβ多様性が外来患者より高いことがわかった（補足図1およびデータ）。4週間以内の最近の体重変化は、腸内細菌組成と関連しなかった（補足表4）。複数の薬剤（選択的セロトニン再取り込み阻害薬、抗精神病薬、ベンゾジアゼピン、補足表2に明記）の干渉を除いた後、ANとHCで存在量分布に有意差があった種を図1cに示す。ANで枯渇した種の中には、Roseburia intestinalisとRoseburia inulinivoransという植物性多糖類を消化する能力が高く、健康に関わる腸内細菌叢の一部と考えられている種があった23。共分散無向性ネットワーク解析（Extended Data Fig.3）では、Eisenbergiella、酪酸産生菌SS3/4 - (Clostridium) sp. CAG:81, Faecalibacterium prausnitzii 3, (Oscillibacter) sp.からなる細菌群集を確認しました。ER4/Firmicutes bacterium CAG: 129_59_24, Oscillibacter sp. 57_20, (Clostridium) sp. 2789STDY5834924、分類不能のLachnospiraceae、分類不能のDysosmobacter - OscillibacterはHCでより豊富であった。ANでは、Erysipelatoclostridium ramosum、Enterocloster bolteae、（Clostridium）innocuum、Blautia sp. CAG:257からなるコミュニティが高濃度に存在した。
図1：健常対照と比較したAN症例の腸内細菌種の変化、および摂食障害スコアとの関連。
a,b AN（n=77）とHC（n=70）の腸内細菌叢（a）および2つのANサブタイプ（AN-RS n=56, AN-BP n=21）とHCの腸内細菌叢（b）の細菌種レベル（キャンベラ距離）でのβ多様性のボックスプロット（線、中央値、ボックス、四分位範囲（IQR）、ひげ、1.5×IQR）．2群間の差の統計的有意性は、Wilcoxon rank-sum検定（両側）で判定した。 c, ANとHCの間で有意に対照的な細菌種。存在量の差は、年齢、BMI、喫煙、多剤摂取などの共変量を補正したmetadeconfoundRパイプラインを使用して検出した。クリフデルタ値により、効果量の推定を行った。d、年齢、BMI、喫煙、多剤摂取を共変量として定義し調整した線形回帰モデルを用いて、腸内細菌種がAN症例の摂食障害スコアと関連していることを示すヒートマップである。特定の摂食障害尺度の変数は青で、一般心理尺度は赤で示した。ヒートマップへの右パネルは、各変数の方向性を示しています。各MSPについて、MSPの注釈の横にANにおける有病率を記載した。+Benjamini-Hochberg法によるPadj < 0.05（正確なP値についてはこちらを参照）。
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ANにおける細菌の絶対量と生物学的臨床変数の関連性
HCとANを合わせたコホートにおいて、属・種レベルの細菌の絶対量と生物臨床変数の間の数値的な共分散を調査した。年齢、喫煙、多剤摂取などの交絡因子を調整した線形回帰モデルを用いた（方法および補足注3、図2およびデータ）。
興味深いことに、年齢、体格指数（BMI）、喫煙歴、薬剤を含む複数の交絡因子を調整した後、いくつかの細菌分類が摂食障害スコアおよび心理状態に関連していた。種レベルでは、Clostridium種が摂食障害スコアと正の相関を示し（図1d）、食行動や神経精神症状の調節にこれらの種が関与している可能性があることが示された24。さらに、摂食障害スコアと逆相関のある細菌種のうち、うつ症状に関連するLactococcus acidophilus25とFaecalibacterium prausnitzii26の絶対量が対人疎外のスコアと関連していることがわかった（図1d）。さらに、Parasutterellaの絶対量は身体への不満と、Bifidobacteriumの絶対量は完璧主義のマーカーと正の相関があった。Brachyspiraの絶対量はANとHCで同程度であったにもかかわらず、この属はANで「やせ我慢」のマーカーと正の相関があった（Extended Data Fig.4）。Extended Data Fig.5に示すように、食欲不振のClpB14の循環レベルには、AN群とHC群との間に差は見られなかった（補足注4）。
AN群では予測される細菌の増殖速度が変化する
50種の細菌についてピーク・ツー・トラフ比（PTR）27を算出し、メタゲノムデータから腸内細菌叢の成長ダイナミクスを推定した。このうち35種は20サンプル以上に存在した。PTRの中央値はANとHCで著しく異なり（PWilcoxon = 2.0 × 10-4, Extended Data Fig.6）、これはAN患者における食事摂取量の著しい減少に関連しているのかもしれない。ANでは6つの細菌が有意に増殖率を下げると予測された（PWilcoxon < 0.05, Extended Data Fig.6）。これらは、Akkermansia muciniphila、Alistipes finegoldii、Coprococcus catus、Eubacterium siraeum、Odoribacter splanchnicus、酪酸産生菌SS3/4だった。
ラクトコッカス・ファージとANにおける王国を超えた相互作用の弱体化
AN糞便サンプルでは、HCと比較して、ウイルスの豊富さ（Chao1、図2a）および多様性（Shannon、図2b）が高いことが確認された。4週間以内の体重変化は、腸内ウイルス組成と関連しなかった（補足表4）。共変量（年齢、喫煙、薬物摂取）でデコンファウンドした後、ANで濃縮または減少した31種のウイルスを同定した（図2c）。特に興味深いのは、ANで増加した30種のウイルス種のうち25種が、発酵食品の製造に広く使用されているLactococcus lactisを宿主とするLactococcus phageであったことである。
図2：ウイルス性腸内細菌叢はAN症例とコントロールで異なる。
a,b, AN症例（n = 77）とHC症例（n = 70）のウイルス腸内細菌叢のChao1リッチネス（a）およびシャノン多様性（b）の変化をウイルス種レベルでボックスプロット（線：中央値、枠：IQR、ひげ：1.5×IQR）したもの。c、ANとHCの間で対照的な腸内ウイルス種のクリフデルタ値で、Benjamini-Hochberg補正によりPadj < 0.05とした（ウイルス注釈の横に記載）。d、SparCCアルゴリズムを用いた、AN（n = 77）とHC（n = 70）、および2つのAN亜型（AN-RS n = 56, AN-BP n = 21）におけるウイルスと細菌の腸内細菌叢間のトランスキングダム生態相関の数の差。
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ANとHCの腸内細菌叢におけるウイルスと細菌の相関関係を解析したところ、ANではウイルスと細菌の相互作用の数が著しく減少していた（HCでは219、ANでは84、PFisherの正確検定 = 8.8×10-15, 図2d）。これは主に、ウイルス種とRoseburia inulinivorans、Faecalibacterium prausnitzii、Roseburia hominisなどの短鎖脂肪酸細菌生産者との間の相互作用が弱まったことに起因する（補足図3およびデータ）。ラクトコッカス・ファージとラクトコッカス菌の間の相互作用は、領域横断的な解析では観察されなかった（補足図3、4、データ）。
ANサブグループの解析では、キャンベラ距離での主座標分析（PCoA）により、腸内ウイルス組成に顕著な変化は見られなかった（PPERMANOVA = 0.571, Supplementary Fig.5 and Data）。しかし、AN-RSとAN-BPの腸内細菌叢におけるウイルス-細菌相関の数を比較すると、AN-RSでは数が減少し、正相関の比率もかなり低いことがわかった（AN-BP164対AN-RS44、PFisherの正確検定< 2.2×10-16 ）（図2d、Supplementary Figure 4）．このことから、AN-RSの腸内細菌叢は、腸内ウイルスと細菌の相互作用が弱まっていることが示唆された。
予測される腸内細菌叢の機能は、食行動や代謝と相関がある
Gut Metabolic Modules（GMM）28とGut Brain Modules（GBM）29を用いて腸内細菌の機能ポテンシャルを予測し、159の機能モジュールを特定しました。特に、気分や食欲に影響を与える代謝物であるセロトニン生合成やドーパミン、グルタミン酸、トリプトファンの分解に関するGBMの存在量は、ANで濃縮されていた（図3a）。逆に、グルタミン酸合成II経路とビタミンK2経路の存在量はHCで高かった（図3a）30。さらに、セロトニン合成経路とグルタミン酸分解経路は、グルコースやインスリンの循環濃度、あるいはインスリン感受性と逆相関することがわかった（図3b）。GBMでは違いが認められたが、GMMではANとHCの違いは確認されなかった（補足表5）。
図3：AN症例と健常対照者における細菌性腸内細菌叢の予測される機能的可能性。
a、年齢、BMI、喫煙、多剤摂取などの共変量からの干渉を補正したmetadeconfoundRパイプラインを用いたAN（n = 77）とHC（n = 70）間の対照的な機能モジュールのクリフのデルタ効果サイズ。金色の棒はANでより多く存在する機能モジュール、青色の棒はHCでより多く存在する機能モジュール。各モジュールについて、Benjamini-Hochberg補正後のP値をモジュール注釈の横に記載。 b, 年齢、喫煙、多剤摂取などの共変量の影響を除いた線形回帰モデルによる臨床変数と腸内細菌叢の機能潜在能力との関連性を示すヒートマップです。+ はBenjamini-Hochberg補正によるP < 0.05を示す（正確なP値についてはこちらを参照）。
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細菌ゲノムには、微生物と宿主の相互作用に影響を与える機能性遺伝子を阻害する可能性のある構造変異体（SV）が存在する可能性がある31。そのため、同じ細菌株であっても、SVの存在や存在量の違いが、重要な表現型や機能の違いの背景にある可能性があります31,32。そこで、全サンプルのSVをプロファイリングし、56の細菌種で5,056個の欠失型SVと2,423個の可変型SVを同定した（図4a、b）。いくつかの細菌種では、コピー数の変動に顕著な違いが観察された。134人のBacteroides uniformisでは87個の欠失SVと18個の可変SV、124人のFaecalibacterium prausnitziiでは78個の欠失と15個の可変SV、121人のParabacteroides distasonisでは110個の欠失SVと55個の可変SVが確認されました。古細菌微生物群については、13人の個体でMethanobrevibacter smithiiのSVのみが確認されました（図4a、および補足図6とデータ）。細菌遺伝学の潜在的な違いを探るため、さらに全147サンプル間の細菌SVプロファイルのキャンベラ距離を計算した（図4c）。ANサンプルとHCサンプルは、SV組成のβ多様性において有意に異なっていた（PWilcoxon < 2.2 × 10-16）。これらの結果を総合すると、細菌SVの組成が両グループ間で異なることが示唆された。
図4：AN症例と健常対照者における細菌および古細菌の腸内細菌叢の構造的変異。
a, 147名（症例77名、対照70名）の研究参加者の各細菌種または古細菌種のSVの数。各菌種について、欠失型SVと可変型SVの数を示す。 b, 同定された全SV数を示す円グラフ。 c, AN（n＝77）およびHC（n＝70）バクテリオームにおけるSVベースの遺伝子組成のβ多様性（キャンベラ距離）のボックスプロット（線、中央値；ボックス、IQR；ウィスカー、1.5×IQR）。d, 年齢、BMI、喫煙、多剤摂取を調整した後の摂食障害スコアと細菌SVとの有意な関連を示すコード図。 e, 年齢、BMI、喫煙、多剤摂取の影響を除いた線形回帰モデルによるBacteroides uniformis のSVとEDI-3スコアとの関連を示すヒートマップ。+ はBenjamini-Hochbergで補正したP < 0.05を示す（正確なP値についてはこちらを参照）。dとeでは、摂食障害尺度の変数を青、一般心理尺度を赤、細菌性SVを黒で色分けしている。uniformisゲノムの10kbp欠失SVの欠失率。 g, 10kbp欠失を有する（n = 49）および有さない（n = 28）拒食症患者のEDI-3スコアを示すボックスプロット（線：中央値、ボックス：IQR、ウィスカー：1.5× IQR）。有意性はウィルコクソン順位和検定（両側）により判定した。
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腸内細菌のSVと摂食行動のマーカーとの関係を探ったところ、AN例では、複数の共変量でデコンファウンドした後、細菌のSVが摂食障害のスコアと有意に関連していることがわかった（図4d）。注目すべき例として、B. uniformisゲノムのSVと宿主の摂食スコアとの関連解析では、10kbpの欠失が過食症や自己否定のマーカーと直接関連していることがわかり、この欠失SVがANにおける摂食障害や心理形質の制御に関与している可能性を示唆しました（図4e）。実際、遺伝子解析の結果、B. uniformisのこの特定のゲノム領域の先頭には、チアミン（ビタミンB1）生合成経路に関わる遠位酵素であるチアミン一リン酸キナーゼ（図4fおよび補足表6）がコードされていることが判明した。チアミン欠乏は、記憶力の低下、不安、抑うつ、イライラ、不眠などの精神的な健康だけでなく、食欲不振や胃腸の不定愁訴とも関連があるとされています33。AN症例の約3分の1は、チアミン欠乏症に罹患している可能性があります34。この細菌ゲノム領域を欠くAN症例では、過食症（AN-BPサブタイプの主要な特徴）と自己否定感のスコアが高いことがわかりました（図4g）。このパターンは、相関分析（図4e）でも示唆されています。細菌遺伝学と代謝に関連する生体臨床変数との関連を示すもう一つの例が、（拡張データ図7）および補足説明5で示されている。
血清代謝物は、食欲および食物摂取調節のマーカーと関連している
AN症例とコントロールの血清について、アンターゲットメタボロミクスプロファイリングを実施しました。その結果、28種類の極性代謝物と35種類の微生物関連代謝物からなる血清メタボロームプロファイルが明らかになり、ANとHCの間で有意に異なる一方（図5a）、2つのANサブタイプの間ではわずかに変化するだけでした（Extended Data図8a）。交絡因子を調整した後、症例と対照の間で濃度差がある25の血清代謝物を同定した（調整P値（Padj）＜0.05）（図5b）。
図5：血清代謝物はAN症例と対照の間で異なり、腸内微生物の特徴が摂食障害特性に与える影響を媒介する可能性がある。
a, AN症例とHC参加者の血清メタボロームプロファイルの主成分分析（PCA） b, 年齢、BMI、喫煙、多剤摂取を調整した後のAN（n = 77）とHC（n = 70）間の対照代謝物のクリフのデルタ値. 金色のロリポップはANに濃縮された代謝物、青色のロリポップはHCに濃縮された血清代謝物を示す。 c, 腸内微生物の特徴、血清代謝物、宿主表現型に関する双方向調停解析のためのワークフロー。d, 細菌種、腸脳・代謝モジュール、細菌遺伝学を含む腸内微生物の特徴を因果因子、代謝物を媒介因子、EDI-3スコアを結果とした方向1の推定因果関係ネットワークを示すサンケイ図。 e, 微生物特徴、代謝物、EDI-3スコア間の推定因果関係例。方向1は、微生物の特徴→代謝物を媒介とする摂食障害スコアを意味し、黒線で図示、方向2は、微生物の特徴→代謝物を媒介とするEDI-3スコアを意味し、赤破線で図示した。仲介効果の割合は、リングチャートの中央に示されている。FFA、遊離脂肪酸。
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一次胆汁酸（コール酸（CA）、グリココール酸（GCA））と二次胆汁酸（グリコヒオコール酸（GHCA）、7-オキソヒオコール酸（7-オキソHCA）、グリコヒデオキシコール酸（GHDCA）、7-オキソデオキシコール酸（7-オキソDCA）の両方の血清濃度は、 ω/α-ムリコール酸（ω/α-MCA）、ウルソデオキシコール酸（UDCA））はANで高く、二次胆汁酸合成と代謝、満腹感の調節におけるAN関連の変化における腸内細菌叢の役割の可能性を示している35。さらに、トリプトファンの代謝産物であるインドール-3-酢酸とインドール-3-プロピオン酸（IPA）の血清濃度は、HCと比較してANで高かった。興味深いことに、IPAは、満腹感を刺激し胃排出を遅らせることができるグルカゴン様ペプチド1の分泌に関連している36,37。バリン、飽和脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸の調節異常もAN群で観察された（図5b、補注6）。
血清代謝物、腸内細菌叢、食欲とメンタルヘルスのマーカーとの関連性
腸内細菌叢と宿主表現型の相互作用における血清代謝物の役割を探るため、双方向の媒介モデルを構築した。方向性1では、血清代謝物（微生物関連代謝物を含む）を変数として、腸内微生物の特徴（細菌種、腸内ブレインモジュール、細菌遺伝学）が宿主表現型（Eating Disorder Inventory-3（EDI-3）スコア、代謝特性）に及ぼす因果関係を媒介すると仮定した。方向性2については、表現型をメディエーターとして扱い、代謝物の変化を微生物特徴の変化の結果としました（図5c）。このインシリコ双方向解析により、ある原因（微生物特性）とその結果（宿主の表現型特性）の相互作用に、仮説上のメディエーター（代謝物）がどの程度関与しているのかを定量的に把握することができました。
まず、AN症例のEDI-3質問紙スコアに対する細菌の特徴の因果推論を行った（Extended Data Fig. 8b）。推論された方向1の因果関係は、13の微生物の特徴がイニシエーター、11の代謝物がメディエーター、7つのEDI-3スコアがアウトカムとして構成されている（図5d）。注目すべき例として、AN群に濃縮された細菌種C. paraputrificum（図1c）の成果として「やせ願望」を同定し、同じくAN群に濃縮された血清IPA値の変化と関連づけました。C. paraputrificumは、IPA、インドールアクリル酸、インドール酢酸、トリプタミンを含む複数のトリプトファン異化物の生産者で、これらはすべて食欲や精神状態の調節に関与しています24（図5e）。
別の例では、AN患者に濃縮されたインドキシル硫酸が、AN濃縮（Clostridium）属CAG：269の身体不満足度スコアにおけるメディエーターとして同定された（図5e）。インドキシル硫酸は心・尿毒症毒素であり、ヒトや動物モデルで不安やうつ病に似た行動を誘発することが示されている38,39。クロストリジウムはインドール産生菌の属で、トリプトファンをインドール、ピルビン酸、アンモニアに変換する重要な酵素であるトリプトファナーゼ40をコードすることができる41。
次に、コホート全体にわたって、微生物の特徴と宿主の代謝形質との間の因果推論を分析した（Extended Data Fig.8c）。方向1の因果ネットワークは、14の微生物特徴、10の代謝物、5の代謝形質がそれぞれ原因処理、媒介物、結果となっていた（拡張データ図8d）。特に、セロトニン合成モジュールは、セロトニンによって発現が上昇する二次胆汁酸グリコールソデオキシコール酸を介して宿主BMIに因果関係を及ぼすことがわかった42（拡張データ図8e）。最後に、我々の以前の知見と一致して、血清ロイシンはB. vulgatusのグルコースホメオスタシスへの影響を媒介した43 (Extended Data Fig. 8e). 食行動の変化と心理状態、腸内細菌の特徴、代謝物の間に一方向の因果関係は認められなかった（補足表7）。
腸内細菌叢はマウスの体重増加の抑制とエネルギー代謝の変化を誘導する
ANにおける腸内細菌叢の変化と関連する表現型との間の潜在的な因果関係を調べるため、無作為に選んだ3例のAN-RS（AN-BPはAN-RSサブタイプよりも表現型が不均一なため、均一性を保つため）および3例の年齢に合ったHC参加者から糞便微生物相を、雌の無菌（GF）マウスの3つの独立した仔に移植した（拡張データ図9a）。遺伝的背景のばらつきを最小化するため、対照マウスとして同腹子を含めた。各産卵試験において、それぞれ8匹、6匹および6匹の同腹子を、ANまたはHCの糞便微生物叢のレシピエントとしてランダムに割り当てた。便移植後、レシピエントマウスを単独飼育し、ヒトANにおける摂食量の減少を模倣するため、3週間30％のカロリー制限食を与えた（Extended Data Fig.9b）。GFマウスでは、自由行動食を与えても表現型に変化はなく44、これはクワシオルコールに関する以前の報告45と一致する観察結果であった（拡張データFig.10a）。
21日後、AN症例の便を移植したGFマウスは、HC FMTを受けたマウスと比較して、初期の体重減少が大きく、時間の経過とともに体重増加が緩やかになった（図6aおよび拡張データ図10b；考察については補足注7参照）。
図6：ANドナーからのサンプルを用いたFMTは、GFマウスにおいてANに関連する表現型を誘導する。
a、エネルギー制限食後0日目の体重と比較した体重（BW）変化（AN-T n＝10、HC-T、n＝10を3つの独立した実験にわたって調べた）。b,c、糞便微生物群マウスレシピエントにおける視床下部（b）および鼠径部白色脂肪組織（c）の表示マウス遺伝子のmRNAレベル（AN-T n = 10, HC-T, n = 10, 3回の独立実験にわたって検討）。2つのグループ間の有意性は、対にならない両側スチューデントのt-testを用いて検定した。データは平均値±s.e.m.で示した（a-c）。 d, ヒトのドナーとGFマウスのレシピエントの間で同定および移植されたASVのベン図。 e, 左：ヒトドナーの84保存ASVのヒートマップ。中：AN-TおよびHC-T GFマウスレシピエント間の糞便内容物由来の84個の保存されたASVの差異（AN-T n = 10、HC-T、n = 10、3回の独立実験にわたって調べた）。移植された微生物の変化は、青色で示されている。右：ASVの分類学的情報。
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FMT後の視床下部遺伝子発現解析を実施した。ANを移植したレシピエントとHCを移植したレシピエントでは、食行動やエネルギー消費の制御に関わるいくつかの視床下部遺伝子の発現が異なっていた（図6b）。AN FMTレシピエントでは、食欲抑制因子Bdnf46とCartpt47、およびセロトニンの受容体Htr1b（セロトニンの下流制御に関与）の発現が増加したことが確認された。また、いくつかの神経変性疾患に関連する神経細胞タンパク質α-シヌクレインをコードするSncaの発現は、AN移植マウスで高くなった48。さらに、脂肪組織の熱産生を制御するタンパク質をコードする遺伝子のメッセンジャーRNA（mRNA）レベルを分析した。その結果、Ucp1、Elovl3、Pgc1αのmRNA量がAN移植マウスの鼠径部脂肪で増加しており、このグループのマウスでは脂肪組織の熱産生が促進されていることがわかった（図6c）。
ヒトドナーの便とGFマウスレシピエントの大腸内容物の16Sリボソームリボ核酸（rRNA）遺伝子アンプリコン配列決定により、重複する85個のアンプリコン配列変異（ASV；図6d）が特定され、そのうちドナーの改変ASV45個（53％）がレシピエントに移行した（図6e）。血清メタボロームプロファイリングにより、ドナーおよびレシピエント間で31の保存代謝物が検出され、これらのうち19の代謝物（61％）の変化がヒトからマウスに移行した（拡張データ図10c）。我々は3つのASVを同定しました： ASV_021、ASV_229、ASV_002の3つのASVは、属レベルでBacteroidesとアノテーションされました。これらのASVの相対存在量とUcp1を含む褐変遺伝子の発現量（拡張データ図10d）は強い正の相関を示し、これらのASVが脂肪の褐変促進を通じて体重減少や低体重化に関与する可能性を示唆しました。また、Akkermansia属と注釈されたASV_122の相対存在量と視床下部の食欲抑制遺伝子Htr1bとの逆相関も注目され、食欲調節におけるASV_122の役割の可能性を示唆しています（Extended Data Fig. 10d）。以上のことから、マウスにおける視床下部および脂肪組織の遺伝子発現の変化と体重の経時変化は、ヒトANにおける腸内細菌叢の乱れが、ANの複雑な病態のいくつかの要素に寄与している可能性を示唆している。
考察
シーケンサーとメタボロミクスを組み合わせて、ヒトとマウスの腸内細菌叢とメタボロームの特徴を明らかにすることで、健常者と比較してAN患者では細菌とウイルスの微生物叢成分、血清メタボロームが変化していることを明らかにした。また、細菌種のSVがANと健常者コントロールで異なることを見出し、インシリコ因果推論解析により、細菌代謝物が腸内細菌叢の変化がAN行動に及ぼす影響の一部を媒介することを示唆しました。最後に、エネルギー制限食でANの便を移植したGFマウスは、健常者の便を移植したマウスと比較して、当初は体重が減少し、時間の経過とともに体重増加が緩やかになりました。これは、AN便を移植したマウスの視床下部における食欲抑制遺伝子の高発現と脂肪組織における熱発生関連遺伝子の高発現と関連していた。
FMT実験とin silico推論解析の両方で、グリシン-チェノデオキシコール酸、インドール-3-プロピオン酸、タウリン-α-ムリコール酸、タウリン-ヒデオキシコール酸の循環レベルの変化が観察された。これらの代謝物は、AN表現型のいくつかの潜在的なメディエーターとして働く可能性があることを提案する。例えば、インドール-3-プロピオン酸はトリプトファンの代謝物で、セロトニン活性に関与している49。ヒデオキシコール酸は6α-水酸化胆汁酸で、体重増加を抑えるムリコール酸とも呼ばれている50。この胆汁酸は満腹感の調節に関与している51。食欲調節だけでなく、セロトニン活性もAN症候群の発症および／または維持に関与している可能性がある。今後の研究では、これらの代謝産物のエネルギー代謝に対する個別効果および複合効果を調べる必要がある。また、活動性食欲不振モデル20,52で報告されているように、ヒトやマウスで観察されるAN形質には、さらに多くの腸内細菌種や由来代謝産物が介在している可能性がある。
腸内細菌種の欠失型および可変型SVの解析から、細菌の遺伝がANに関連する行動形質や病態生理に影響を与える可能性があることが示された。特に興味深いのは、B. uniformisゲノムの10kbpの欠失で、過食症や自己否定の推定値と関連していた。この欠失により、チアミン一リン酸キナーゼをコードする遺伝子が失われ、微生物が産生するチアミンが相対的に欠乏することが予想された。このことは、様々な精神的・腸的健康問題がチアミン欠乏と関連していることが知られているため、AN病態の文脈で興味深いものである33。
ANにおけるウイルス性腸内細菌叢の研究では、脳生物学に影響を与えるウイルス種と短鎖産生細菌種との生態学的相互作用の一部が非連結であることが示された53。さらに、ANサンプルは、既知の細菌L. lactisを宿主とするLactococcusファージに富んでいた。ANに関連するLactococcus phagesの濃縮は、食品発酵の中断をもたらし、将来的にAN治療に発酵食品を使用する可能性を示唆している。Lactococcusファージが濃縮される理由は不明であるが、我々の発見は、L. lactisを含むマルチストレインプロバイオティクスをAN青年54に試験することを正当化するかもしれない。
(1)デンマークの横断的なANコホートを用いたため、他の民族への一般化には限界がある。(2)専門センターで治療中のAN患者を用いた場合も同様の限界があり、これらの患者は軽度のANを代表しているとは限らない。(3) 複数の共変量の影響を除外したが、腸内細菌叢に影響を与える食事と身体活動に関する情報は得られなかった。
結論として、今回のマルチオミクス研究により、AN患者における腸内細菌叢の深遠かつ複雑な障害が明らかになり、機能的な影響や血清代謝物の変化が認められました。これらの化合物は、血液循環を介して、あるいは腸内細菌叢-脳神経シグナル伝達経路を介して、食欲、感情、行動の脳内制御に影響を及ぼす可能性があります。ヒトANドナーからGFマウスにFMTを行い、エネルギー制限食を与えたところ、体重増加が少なく、行動やエネルギー恒常性の制御に関わる視床下部および脂肪組織遺伝子の発現に多くの変化が見られた。マルチオミクスとin vivo実験の組み合わせは、因果関係推論解析を補完し、ヒトの宿主AN形質を潜在的に媒介する特定の細菌代謝物を同定することを可能にしました。この結果は、腸内細菌叢の深刻な乱れがANの病因のいくつかの段階に寄与しているという仮説を支持するものである。
研究方法
研究参加者
AN患者はすべて経験豊富なコンサルタント精神科医によって診断され、AN1の制限型または暴飲暴食型のサブタイプのDSM-5基準を満たした。ANと診断された人の90～95％は女性であるため、本研究では女性のみを対象とすることにし、民族性が腸内細菌叢に影響を与える可能性があるため、12014年9月1日から2016年7月31日までにデンマークの3つの専門センターから集められたAN症例のデンマーク人白人女性のみを対象としました。そのセンターは以下の通りである： 摂食障害センター（オーデンセ大学病院）、児童・思春期精神医学ユニット（オーフス大学病院）、精神医学研究ユニット（オールボー大学病院）。除外基準は、過去3ヶ月以内に抗生物質または抗真菌剤による治療を受けていること、急性または慢性の身体疾患や感染症があることであった。対象患者はすべて専門センターで治療を受けており、治療開始時に経験豊富な専門の心理学者または精神科医による面接を受けた。インタビューには、有効なEating Disorder Inventory（EDI、詳細はSupplementary Note 2に記載）を用い、訓練を受けた医療専門家が記入する質問票とした21。年齢を合わせた健康な対照女性の除外基準は、BMIが18.5未満または25kg m-2以上、避妊薬以外の何らかの常用薬、過去3ヶ月以内の抗生物質でした。対照となる女性は、公共広告および医療スタッフ、医学生、その親族への直接接触によって募集された。健康な対照者のBMIとその他の臨床的特徴は、補足表2に記載されている。
研究プロトコルはClinicalTrials.gov（NCT02217384）に登録され、本研究はヘルシンキ宣言に従って行われ、南デンマークの地域科学倫理委員会（ファイル番号42053 S-20140040）により承認されました。本研究に参加したすべての参加者は、書面によるインフォームドコンセントを提供した。
入院患者。以下に述べるすべての測定は、重度のAN患者の身体的・心理的安定化のための専門ユニットでの日常治療中に行われた。週2.0～3.0％の安全かつ効果的な体重回復が、入院病棟での治療の目標である。ケアは学際的なチームによって行われ、国際的なガイドラインに則っています。個々にカスタマイズされた食事は、訓練を受けた看護師または栄養士の監督のもと、予定された時間に与えられました。食事が決められた時間（おやつは15分、主食は30分）内に摂取できない場合は、経口または十二指腸チューブで栄養ドリンクを追加しました。個人の嗜好を考慮し、3種類の食事から選択できるようにした。大栄養素の含有量は一定で、推奨されるエネルギー割合の範囲内であった： 炭水化物40～50％（糖質は最大10％）、脂質30～40％、タンパク質20～25％。1日のエネルギー摂取量は、体重の経過に応じて個別化した。1週間の体重増加率が2％に達しない場合は、1日のメニューのエネルギー含有量を増やしました。食事の後は、座ったままの姿勢で30分から60分の間、監視付きの休息がとられた。休憩の間は、散歩などの軽い運動が可能であったが、運動トレーニングは禁止であった。過剰な運動への衝動や、行動ルールの遵守が不十分な患者には、行動監視を延長し、必要であれば1日24時間体制とした。
外来患者 AN患者は定期的に外来を訪れ、医師、看護師、心理学者、健康行動教育者を含む学際的なチームによるケアが行われました。
彼らは、上記の入院患者と同じマクロ栄養素組成を持つ、個別の食事計画を与えられていた。入院患者と同様に、すべての外来患者も認知行動療法的治療コースに登録された。
身長は壁に取り付けたスタディオメーターで、体重は朝、朝食前に較正済みのプラットフォームスケールで測定した。BMIは、体重を身長の2乗で割った値（＝kg/m2）として算出した。
生化学的分析
血液サンプルは、一晩絶食した後の朝に採取された。血液サンプルは氷上に集められ、血清と血漿を得るために処理され、その後-80℃で保存された。血清中のナトリウム、カリウム、アルブミン、クレアチニンの濃度は、Roche/Hitachi cobas cシステムで酵素アッセイにより測定された。血清中の総コレステロール、高密度リポタンパク質コレステロール、低密度リポタンパク質コレステロールの濃度は、リンタングステン酸塩化マグネシウム沈殿法を用いて測定した。血清中の免疫反応性インスリン濃度は酵素結合免疫吸着法を用いて測定し、血清中のアラニンアミノトランスフェラーゼ濃度はピリドキサールリン酸活性化を含む酵素的クーロメトリック法を用いて分析した。
血漿中のClpBの分析は、以前に記載された方法で行った55。
糞便サンプル採取とDNA抽出
便は、国際ヒトマイクロバイオーム基準（IHMS）のガイドライン（SOP 03 V1）に従い、AN例とHCが自宅でキットで採取し、ドライアイスで輸送し4-24時間後にバイオバンクでプラスチックチューブに入れて-80℃で凍結するまで直ちに-20℃にて冷凍した。糞便サンプルのアリコートからのDNA抽出は、IHMS SOP P7 V256に従って行われた。
バクテリアの細胞数測定
細菌細胞計数（補足図7）のために、0.08-0.12 gの凍結（-80 ℃）糞便サンプルをpH 7.2 Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) (Sigma-Aldrich) で15倍希釈し、組織ライザー（40分、12.5回/秒；QIAGEN）を用いて機械的に均質化したのち2％パラホルムアルデヒド（10分、部屋温度；Biotum）で固定しました。その後、サンプルをろ過した染色バッファー（1 mM EDTA, 0.01% Tween20, pH 7.2 DPBS, 1% BSA (Sigma-Aldrich) ）で120倍希釈した。塊を最小限に抑えるため、サンプルは、染色バッファであらかじめ濡らしたセルストレーナー（孔径5μm；pluriSelect）で濾過した。次に、細菌細胞懸濁液をDMSO（Sigma-Aldrich）中のSYBR Green I（1:200,000; Thermo Fisher）で染色し、暗所で30分間インキュベートした。細菌細胞数を正確に測定するため、分析前に既知濃度の123count eBeads（Invitrogen）をサンプルに添加した。測定はBD Fortessa LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）を用いて行い、データはBD FACSDiVaTMソフトウェアで取得した。FITC（530/30nm）チャンネルには200の閾値を適用した。緑（530/30 nm, FITC）、青（450/50 nm, Pacific Blue）、黄（575/26 nm, PE）、赤（695/40 nm, PerCP-Cy5-5 ）蛍光チャンネルの蛍光強度、および前方散乱光と側方散乱光（FSCとSSC）強度を収集しました。測定は、あらかじめ設定した0.5μl s-1の流速で実施した。データは、R（v4.1.2）のflowcoreパッケージ（v1.11.20）57を使用してRで処理された。固定ゲーティング戦略により、微生物の蛍光イベントを糞便サンプルのバックグラウンドから分離した。
ショットガンシーケンス
DNAはQubit蛍光定量法（Thermo Fisher）を用いて定量し、フラグメントアナライザー（Agilent）を用いてDNAサイズプロファイリングで定性した。ライブラリーの構築には、高分子量DNA（>10 kbp; 3 µg）を使用しました。超音波発生装置（Covaris）を用いてDNAを約150 bpの断片に剪断し、Ion Plus Fragment LibraryおよびIon Xpress Barcode Adaptersキット（Thermo Fisher）を用いてDNA断片ライブラリーの構築を実施した。精製・増幅したDNAフラグメントライブラリーは、Ion Proton Sequencer（Thermo Fisher）を用いて、1ライブラリあたり150bp（平均）の高品質リードを最低2000万本生成し、塩基配列を決定した。
遺伝子カウントテーブルの構築
遺伝子数表を作成するために、METEORソフトウェアを使用した58：まず、AlienTrimmer59でリードを低品質にフィルタリングした。低品質リードとヒトDNAリードを除去した後、糞便DNAの75.7%±2.7%の高品質メタゲノミクスシーケンスリードを、Bowtie2（文献61）を用いて、1040万遺伝子からなる統合腸カタログ2（IGC2）60にマップした。カタログのユニークな遺伝子にマッピングされたリードは、その対応する遺伝子に帰属させた。次に、カタログの複数の遺伝子に同じアライメントスコアでマッピングされたリードは、捕捉された遺伝子に対するそのユニークなマッピングカウントの比率に従って帰属された。得られたカウント表は、RパッケージMetaOMineR v1.3162を用いてさらに処理した。サンプル間のシーケンスの深さとマッピング率の違いを考慮し、1400万マッピングリードでダウンサイジングされました。次に、ダウンサイジングしたマトリックスを遺伝子長で正規化し、100万フラグメントマップあたりの転写物のキロベースあたりのフラグメントで正規化して頻度マトリックスに変換した。遺伝子数は、頻度マトリックスに存在する（アバンダンスが厳密に正）遺伝子の数として計算された。
MSPと腸管タイプのプロファイリングとアノテーション
IGC2は、公開されている最新のMSPデータセット64を用い、MSPminer63で1,990個のMSPに整理されたことがある。MSPの相対的な存在量は、その100個の「マーカー」遺伝子（つまり、最も高度な相関を持つ遺伝子）の平均存在量として計算されました。この方法はMetaHIT62とMetacardis65のコンソーシアムで使用されたもので、サンプルに含まれる「マーカー」遺伝子が10%未満の場合、MSPの存在量は0に設定された。コア遺伝子が100個未満の4つのMSPについては、利用可能なすべてのコア遺伝子を使用した。
より高い分類学的ランクでの存在量は、与えられた分類群に属するMSPの合計として計算された。MSP数は、サンプルに存在するMSPの数（すなわち、その存在量が厳密に正である）として評価した。Enterotypesプロファイリングは、以前に実証されたように実施された66。
腸内細菌叢の機能モジュールの推定
IGC2カタログの遺伝子をdiamond67でKEGGデータベース68（v8.9）のKEGG orthologue（KO）にマッピングした。各遺伝子は、e-value < 10 × 10-5、bit score >60のヒットのうち、最もランクの高いKOに割り当てられた。次に、メタゲノムサンプル中のGMMs28とGBMs29の存在と存在量を、既述のようにRパッケージomixerRpm（v0.3.2）に実装したパイプラインによって評価した28,29．
メタゲノミックサンプルからの細菌の動的増殖速度の見積もり
メタゲノミックサンプルから腸内細菌の増殖ダイナミクスを推測するために、既述の通り計算パイプラインを使用した27。シーケンスリードは、1,509の微生物種に属する2,991株の完全ゲノムリファレンスを含むデータベースにマッピングされた。各細菌種について、サンプル全体で100％の有病率を持つ参照株が選択された。次に、参照ゲノムにアラインされたリードに基づいて、カバレッジマップを作成した。ゲノムセグメントは10kbpの領域にビニングされ、得られたビンのカバレッジが計算され、平滑化されました。複製の起源と終端の位置は、複数のサンプルにわたる同一株のフィットによって予測された。最後に、PTRは、予測されたピーク位置における代表株の平滑化されたシーケンスカバレッジを、予測されたトラフ位置におけるカバレッジで割ったものとして、すべてのサンプルの各細菌種について計算されました。
細菌の構造的変異の研究
SVs分類の前に、反復カバレッジベースのリード割り当てアルゴリズムによるパイプラインを実行し、曖昧なリードを最も可能性の高い参照に高精度で再割り当てした31,32。proGenomesデータベース（http://progenomes1.embl.de/）で提供される参照ゲノムを連結した後、ゲノム1kbpビンに分割し、高変動ゲノムセグメントの検出に適用した。SGV-Finderパイプライン31を使用して、(1)集団全体のゲノムセグメントの欠失率が25%未満（可変SV、vSV）、(2)欠失率が25%から75%の間（欠失SV、dSV；この特定のゲノムセグメントの欠如または存在を保持）または(3)欠失率が75%以上（このゲノムセグメントは分析から除外）のいずれかのSVを検出しました。SVを呼び出したすべての細菌種は、全サンプルの少なくとも10%に存在し、その後の解析に使用されました。
メディエーション解析
Rパッケージ「mediation」69（v4.5.0）を用いて、腸内微生物の特徴、極・微生物関連代謝物、代謝形質と摂食障害スコアの因果関係を推論した。検定数を減らすため、互いに強く関連する変数からなる候補群のみを残した。つまり、微生物特徴-メタボライト-表現型変数の因果関係候補群では、腸内微生物特徴と血清代謝物の関連が有意（Padj＜0.1）、代謝物と表現型変数の関連が有意（Padj＜0.1）、微生物特徴と表現型変数の関連が有意（Padj＜0.1）、だった。媒介分析を行った後、方向1で有意な候補グループのみを残し、サンケイ図法で可視化した。
ウイルス性腸内細菌叢のプロファイリングと解析
MiCoP70は、メタゲノミクスのバルクシーケンスリードから直接ウイルスを呼び出し、ビロームデータセット内の相対存在量を計算するために最適化された手法であるため、我々はMiCoPを使用してウイルス腸内細菌叢をプロファイリングしました。MiCoPは、参照データセットとして、NCBIのRefSeq Viralデータベース71を利用しています。データセットに含まれる147人（AN77人対HC70人）において、有病率が10%以上、相対存在率が0.01%以上のウイルス209種を同定しました。Rパッケージ「fossil」72および「vegan」73を用いて、豊かさ、アルファおよびベータ多様性を計算した。両側Wilcoxonの順位和検定は、グループ間のリッチネスとアルファ多様性指数の統計的有意差の判定に使用した。キャンベラ距離については、n = 999での順列多変量分散分析（PERMANOVA）を実施した。AN-RSとAN-BPの両方のマイクロバイオームデータにおけるウイルス-細菌相互作用は、Sparse Correlations for Compositional（SparCC）74アルゴリズムを用いて計算された。SparCC解析の前に、AN細菌とウイルスのマイクロバイオームデータセットをAN-RSとAN-BPデータセットにサブセットし、それらを別々にSparCC解析に提出した。
ガスクロマトグラフ飛行時間型質量分析計による血清極性代謝物の分析
腸内細菌関連代謝物として挙げた代謝物は、文献マイニング75,76に基づくものである。血清サンプルはランダム化し、サンプル調製は既述の通り行った43,77。簡単に言うと、内部標準物質（ヘプタデカン酸、重水素標識DL-バリン、重水素標識コハク酸、重水素標識グルタミン酸、1μg ml-1）を含むメタノール（MeOH）400μlを血清サンプル30μlに加え、ボルテックス混合して氷上に30分インキュベートした。その後、サンプルを遠心分離（9,400×g、3分）し、遠心分離後の上清を350μl採取した。溶媒を蒸発乾固し、25μlのMOX試薬を加え、サンプルを45℃で60分間インキュベートした。N-メチル-N-（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミド（25μl）を加え、45℃で60分間インキュベートした後、保持指標標準混合物（n-アルカン、10μg ml-1）25μlを添加した。
分析は、Agilent 7200四重極飛行時間型質量分析計に結合したAgilent 7890Bガスクロマトグラフを使用して行いました。以下のパラメータを使用した：注入量は1μlで、70℃のPTVで100：1分割し、120℃min-1で300℃まで加熱；カラム： 長さ20m、内径0.18mm、膜厚0.18μmのZebron ZB-SemiVolatiles、初期ヘリウム流量1.2ml min-1で、16分後に2.4ml min-1に増加した。オーブン温度プログラム： 50 ℃（5分）、その後20 ℃ min-1で270 ℃、40 ℃ min-1で300 ℃（5分）。EI源：250℃、70eV電子エネルギー、35μAエミッション、溶媒遅延3分。質量範囲55～650amu、取得速度5スペクトル/秒、取得時間200ms/スペクトル。クアッド温度150℃、N2コリジョンフロー1.5 ml min-1、Aux-2温度280 °C。
アラニン、クエン酸、フマル酸、グルタミン酸、グリシン、乳酸、リンゴ酸、2-ヒドロキシ酪酸、3-ヒドロキシ酪酸、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、コレステロール、フルクトース、グルタミンを用いて検量線を作成した、 インドール-3-プロピオン酸、イソロイシン、ロイシン、プロリン、コハク酸、バリン、アスパラギン、アスパラギン酸、アラキドン酸、グリセロール-3-リン酸、リジン、メチオニン、オルニチン、フェニルアラニン、セリンおよびスレオニンSigma-Aldrichから濃度範囲0.で購入。 1-80μg ml-1である。各サンプルのアリコートを採取し、プールして、社内プール血清サンプルであるNational Institute of Standards and Technology (NIST) CRM1950血清サンプルとともに、品質管理サンプルとして使用した。濃度の相対標準偏差は、プールされた品質管理サンプルで平均16％、NISTサンプルで10％であった。
血清胆汁酸および血清半極性代謝産物の分析
サンプル調製手順は、以前に説明したように実施した78。プレートを450 μlのアセトニトリルで前処理した後、100 μlのサンプルと10 μlのポリフルオロアルキル物質（PFAS）と胆汁酸（BAs）の内部標準混合物（それぞれ200 ng ml-1と1000 ng ml-1）を添加しました。その後、1%ギ酸を含むアセトニトリル450μlを各ウェルに加え、10″真空マニホールドを使用してサンプルを抽出した。溶出液を窒素ガスフロー下で蒸発乾固し、80μlのMeOH/2mM水性エタン酸アンモニウムに再沈殿させた。
クロマトグラフィー分離は、C18プレカラム（Waters）を装着したAcquity UPLC BEH C18カラム（内径100 mm×2.1 mm、粒径1.7 µm）を用いて行った。移動相AはH2O：MeOH（v/v 70：30）、移動相BはMeOHからなり、両相ともイオン化剤として2mM酢酸アンモニウムを含む。流速は0.4ml min-1に設定し、溶出勾配は次のようにした： 0-1.5分、移動相Bを5%から30%に増加、1.5-4.5分、移動相Bを70%に増加、4.5-7.5分、移動相Bを100%に増加、5.5分間保持した。ポストタイム5分で、次の分析のための初期条件に戻した。1サンプルあたりの総実行時間は18分であった。デュアルエレクトロスプレーイオン化源の設定は、キャピラリー電圧4.5kV、ノズル電圧1,500V、ネブライザー内のN2圧力21psi、シースガスとしてのN2流量と温度はそれぞれ11l min-1と379℃であった。質量分析（MS）スキャンで正確なマススペクトルを得るため、マイナスイオンモードでm/z範囲を100〜1,700に設定した。すべてのデータ取得には、MassHunter B.06.01 ソフトウェア (Agilent) を使用しました。
化合物の同定は、MS（およびリテンションタイム）、タンデム質量分析情報を用いた社内スペクトルライブラリで行いました。定量は、ネイティブ化合物をスパイクしたマトリックスマッチの検量線に基づいて行われました。検量線は、BAsについて0〜1,600 ng ml-1の範囲の濃度から構成されていた。BAsの相対標準偏差は、品質管理サンプルで平均17.8%、NISTサンプルで19.4%でした。
動物実験
動物プロトコルは、デンマーク・コペンハーゲン首都圏の科学倫理委員会の承認を得ている。雌の無菌スイス・ウェブスターマウスを繁殖させ、コペンハーゲン大学実験医学部で実験開始までフレキシブルフィルムのgnotobioticアイソレーターで維持した。マウスは、12時間明暗サイクル（午前7時30分点灯）、温度（21〜22℃）と湿度（55±5％）を一定にした状態で、オートクレーブドチャウ食（単糖7%、脂肪3%、多糖類50%、タンパク質15%（w/w）、エネルギー 3.5 kcal g-1 ）と水を自由摂取させました。
症例と対照の代表であるAN患者3人（女性20歳、22歳、20年、BMIがそれぞれ10.3、11.5、11.7 kg m-2）およびHC3人（女性20歳、22歳、21年、BMIがそれぞれ22.6、21.1、21.2 kg m-2） からランダムに選んだ部分集合から糞便試料を用いて6週齢雌GF子実体にコロナリングした。簡単に説明すると、250mgの糞便サンプルを、20%グリセロールで希釈したLYBHI培地（還元剤として0.05%システインと0.2%ヘミンを添加）5ml（糞便の20ml g-1）に嫌気性クライオバイアルで懸濁し、これらの接種サンプルを5分間ボルテックスし、その後5分間放置して粒子を沈澱させた。その後、糞便スラリーを1mlクライオバイアルに移し、直ちに-80℃で凍結した。日目に、マウスの両グループをオートクレーブ処理した個別換気ケージに収容し、そこで糞便スラリーの最初の投与量（200μl）を受けた。その後、マウスにオートクレーブ処理したチャウ食と水を2日間自由摂取させ、摂餌量を記録した。3日目に、マウスに、前回と同じマッチしたANおよびHCドナーからの糞便物質の2回目の投与量をガバメントで投与した。その後、両群のマウスを単独飼育し、30％エネルギー制限オートクレーブドチャウ食（与える餌の量は各マウスの自力摂取量の70％とした）を3週間与え、水は自由摂取させた。食欲不振移植マウス（AN-T）および正常対照移植マウス（HC-T）は、エネルギー制限食開始後5日ごとに体重を測定した。
試験終了後、マウスをイソフルランで麻酔し、大静脈からの血液をEDTAを含むチューブに採取した。血液サンプルは、4℃で4,032gで6分間遠心分離した。血漿を分離し、その後の生化学的試験のために-80℃で保存した。各マウスの鼠径皮下白色脂肪組織、盲腸および視床下部を正確に解剖し、定量的PCR分析のために収集した。本研究から除外された動物やデータポイントはない。
Trizol試薬（Invitrogen）を用いて、製造者の指示に従って組織から全RNAを抽出し、その後、濃度を測定した。1μgのRNAを、Reverse Transcription System（Promega）を用いて、相補的なDNAに転写した。リアルタイムPCRは、LC480検出システム（Roche Diagnostics）およびSYBR Green I Supermix（Takara）を用いて実施した。すべてのqPCRは、95℃で10分間、その後95℃で0.01秒、60℃で20秒のサイクルを45回繰り返すサーマルサイクルで実行された。データは、脂肪組織のハウスキーピングRpl36遺伝子および視床下部のRplp0遺伝子79に対して正規化し、デルタデルタCT法に従って分析した。本研究で使用したオリゴヌクレオチドの配列は、補足表8に記載した。
マウス実験におけるDNA抽出、16S rRNAの塩基配列決定およびデータ解析
微生物DNAは、NucleoSpin soil mini kit（MACHEREY-NAGEL）を用いて、ヒトドナーおよびマウスレシピエントの便サンプル（〜250 mg）から分離・精製した。次に、Phusion High-Fidelity PCRマスターミックス（New England Biolabs）を用いて、16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を標的とするPCRによりDNAを増幅した（プライマー配列は補足表8に記載）。以下のPCRプログラムを使用した： 98℃、30秒、25×（98℃、10秒、55℃、20秒、72℃、20秒）、72℃、5分。増幅は、生成物をアガロースゲルにかけることで確認した。イルミナNexteraキットを使用し、以下のPCRプログラムで、その後のPCRでインデックスを付加した： 98 ℃ 30秒、8×（98 ℃ 10秒、55 ℃ 20秒、72 ℃ 20秒）、72 ℃ 5分。インデックスの付着は、生成物をアガロースゲルにかけることで確認した。ネステッドPCRからの産物をバンド強度に基づいてプールし、得られたライブラリーを磁気ビーズで洗浄した。プールされたライブラリーのDNA濃度は、蛍光法で測定された。配列決定は、イルミナMiSeqデスクトップシーケンサーで、MiSeq試薬キットV3（イルミナ）を用いて2×300bpペアエンドシーケンスで行った。ペアエンドリードはその後、DADA2（v1.16.0）パイプライン80を用いてトリミング、マージ、解析された。
統計解析
本研究では、統計解析前に除外されたデータはない。本研究は観察研究であるため、割り付けや無作為化は含まれていない。本研究では、拒食症患者および健常者の利用可能なすべてのサンプル（n = 147）が含まれています。サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかったが、本研究のサンプルサイズは、過去の論文で報告されたものと同様である43,81. サンプルは、メタゲノミクスとメタボロミクスのバッチ間でランダムに分配されました。メタゲノム解析、生化学解析、メタボロミクス解析のデータ収集中、研究者はグループ分けを盲検化した。ヒトサンプルの解析はすべてR（v4.1.2）を用いて行われた。動物実験の遺伝子発現解析および体重比較は、GraphPad Prism（v9.3.0）を使用して実施した。
(1)
差分解析
RパッケージmetadeconfoundR（v0.1.8；https://github.com/TillBirkner/ metadeconfoundRまたはhttps://doi.org/10.5281/zenodo.4721078参照）に実装されているmetadeconfoundRパイプラインを用いて差分解析を実施し、マイクロバイオームまたはメタボローム解析においてANとHC参加者の間で観察された差が、年齢、BMI、喫煙、投薬などの共変量によってどの程度交絡されるか評価しました。このパイプラインは、まず単変量統計を使ってマイクロバイオームの特徴と病気の状態との関連を見つけ、次に入れ子線形モデル比較ポストホックテストで潜在的な共変量の交絡効果をチェックし、最後に状態ラベルを返します。
(2)
アソシエーション解析
AN群におけるオミックス機能と食行動・心理特性との関連・媒介分析については、まずシャピロ・ウィルク正規性検定で連続変数の正規性を確認したところ、ほとんどの変数が正規分布していないことが判明しました。そこで、関連性分析の前に、経験的正規分位変換を用いて連続変数を標準化し、標準正規分布（N〜（0，1））に従わせた。そして、交絡因子を共変量として加えた以下の式を用いて、オミックス機能と食行動および心理的特徴との関連を評価するために、線形回帰モデルを実装した。
begin{array}{l}{{mathrm{Eating}},{mathrm{behavior}}。- {\mathrm{and}},{\mathrm{psychological}},{\mathrm{traits}}\sim {\mathrm{omics}},{\mathrm{features}} \ ʕ-̫͡-ʔ-̫͡-ʔ-̫͡-ʔ-̫͡-ʔ ʕ-̫͡-ʔ ʕ-̫͡-ʔ + {mathrm{BMI}}。+ {mathrm{Smoking}}。+ {mathrm{Medication}}end{array}$$.
薬物療法では、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、抗精神病薬、ベンゾジアゼピン系薬剤を使用しました。
(3)
オミックス機能と宿主代謝特性との関連解析では、線形回帰分析の前に、正規性チェックとデータの標準化も実施した。線形回帰モデルでは、BMIを除く上記の交絡因子を共変数として含めたが、BMIはAN患者においてHC患者と比較して極端に低いことが最も顕著な表現型の変化であるためである。
$$\begin{array}{l}{\mathrm{Metabolic}},{\mathrm{traits}}( {\mathrm{for}},{\mathrm{example,}}, {\mathrm{BMI/plasma}},{\mathrm{glucose}} ) \sim { {mathrm{omics}},{mathrm{features}} ( {mathrm{for}},{mathrm{example,}}, {mathrm{metabolite/msp/SV}}) + {mathrm{Age}} . + {mathrm{Smoking}}。+ {mathrm{Medication}}end{array}$$.
ANとHCの腸内微生物の多様性（遺伝子リッチ、種数、分類学的組成）の差はWilcoxon検定で算出し、複数群間の差の有意性の評価にはKruskal-Wallis検定を使用した。特に断りのない限り、すべてのP値はBenjamini-Hochberg法を用いて補正し、Padj < 0.05を統計的に有意とみなした。
報告書の要約
研究デザインの詳細については、本記事にリンクされている「Nature Portfolio Reporting Summary」をご参照ください。
データの入手方法
Odense Patient Data Explorative（ファイル番号OP_153）を介してSharepointに保存されている匿名化された臨床データは、rene.stoeving@rsyd.dk に連絡すればアクセスでき、補足表2にも記載されています。本研究の知見を裏付けるショットガンシーケンスの生データおよび16s rRNA遺伝子アンプリコンシーケンスデータは、それぞれアクセッション番号PRJEB51776およびPRJEB60103でEuropean Nucleotide Archiveに寄託されています。メタボロミクスデータは、Metabolomics Workbenchリポジトリからリンク先（https://doi.org/10.21228/M8KT5B）で入手できます。KEGG Databaseは、https://www.genome.jp/kegg/ で利用可能です。ソースデータは本論文で提供しています。
コードの入手方法
データ解析と可視化に関連するコードは、https://github.com/fjw536/AnorexiaGutMicrobiome.git で公開されています。
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リファレンスのダウンロード
謝辞
Y.F.は本研究に特化したMarie Skłodowska-Curie Individual Fellowship (797267)を受けた。ノボ ノルディスク財団基礎代謝研究センターは、コペンハーゲン大学の独立した研究機関で、一部はノボ ノルディスク財団からの無制限寄付金によって賄われている。R.K.S.はOdense University Hospital Research Fund (R15-A800)の支援を受けました。
著者情報
著者ノート
これらの著者は同等に貢献した： Yong Fan、René Støving、Samar Berreira Ibraim。
著者と所属
ノボノルディスク財団基礎代謝研究センター、コペンハーゲン大学健康医学部、コペンハーゲン、デンマーク
Yong Fan、Tulika Arora、Liwei Lyu、Evelina Stankevic、Tue Haldor Hansen、Fredrik Bäckhed & Oluf Pedersen
オーデンセ大学病院摂食障害センター、および南デンマーク地域の精神衛生サービス、オープン患者データ探索ネットワーク（OPEN）、南デンマーク大学臨床研究所（デンマーク、オーデンセ）医学内分泌学研究ユニット
ルネ・クリンクビー・ストーヴィング
パリ・サクレー大学、INRAE、MGP、ジュイ＝アン＝ジョザス、フランス
サマル・ベレイラ・イブライム、フローレンス・ティリオン、ニコラ・ポン、ナタリー・ガレロン、ブノワ・キンキス、フローレンス・ルヴェネス、ユーゴ・ルーメ＆S・ダスコ・エールリッチ
エーレブロー大学科学技術学部（スウェーデン・エーレブロー市
Tuulia Hyötyläinen、Tim Sinioja、Oddny Ragnarsdottir。
デンマーク、コペンハーゲン大学医学部およびヘレブ・ゲントフテ大学病院、コペンハーゲン
リウェイ・リュウ＆オルフ・ペデルセン
INSERM U1073研究ユニットおよびTargEDys（ルーアン大学、ルーアン、フランス
ピエール・デクロット（Pierre Déchelotte
レガ・インスティテュート・ク・ルーヴェン、微生物学・免疫学部門、分子細菌学研究室（ベルギー、ルーヴェン
グウェン・ファロニー、サラ・ヴィエイラ＝シルヴァ、イェルーン・レーズ
ベルギー、ルーベン、VIB、微生物学センター
グウェン・ファロニー、サラ・ヴィエイラ＝シルヴァ、イェルーン・レーズ
ヨハネス・グーテンベルク大学マインツ校大学医療センター医療微生物・衛生研究所および免疫療法研究センター（FZI）、マインツ、ドイツ
グウェン・ファロニー＆サラ・ヴィエイラ＝シルヴァ
分子生物学研究所（IMB）、ドイツ、マインツ
グウェン・ファロニー＆サラ・ヴィエイラ＝シルヴァ
オーフス大学病院児童・青年精神科（デンマーク、オーフス市
ロア・クラウゼン
オーフス大学保健学部臨床医学科（デンマーク、オーフス市
ロア・クラウゼン
オールボー大学病院精神科研究室（デンマーク、オールボー市
Gry Kjaersdam Telléus
オールボー大学社会科学・人文科学部コミュニケーション・心理学科（デンマーク、オールボー市
Gry Kjaersdam Telléus
ヨーテボリ大学医学部分子・臨床医学科ワレンベリ研究所（スウェーデン・ヨーテボリ
Fredrik Bäckhed
ヴェストラ・ゲータランド地方サハルグレンカ大学病院臨床生理学科（スウェーデン・ヨーテボリ
Fredrik Bäckhed
エーレブロー大学医学部、スウェーデン、エーレブロー
マテイ・オレシッチ
トゥルクバイオサイエンスセンター、トゥルク大学、Åbo Akademi大学、トゥルク、フィンランド
マテイ・オレシッチ
ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン、臨床・運動神経科学科（英国、ロンドン
S. ドゥスコ・エールリッヒ
貢献度
O.P.は、研究コンセプトの考案と設計、プロトコルの詳細を行い、論文執筆を含む研究プロトコルの全フェーズを監修した。Y.F.、R.K.S.、S.B.I.、F.T.はデータ解析、結果の解釈を行い、論文の草稿作成に貢献した。T.H.、T.S.、O.R.はメタボロームプロファイリングをサポートしました。Y.F.は、T.A.とL.L.のサポートのもと、すべての動物実験を計画・実施した。L.L.とE.S.は細菌の細胞カウントを行った。R.K.S.とT.H.H.は研究参加者のフェノタイピングを実施した。P.D.、N.P.、N.G.、B.Q.、F.L.、H.R.、G.F.、S.V.-S.、J.R.、L.C.、 G.K.T, F.B, M.O および S.D.E が技術プロジェクトの開発および指導に貢献するとともに論文の原稿を改定した。すべての著者は、論文のレビューと編集に貢献した。
筆者
Oluf Pedersenに対応します。
倫理に関する宣言
競合する利益
F.B.は、Implexion Pharmaの株主である。他の著者は、競合する利害関係はないことを宣言している。
ピアレビュー
ピアレビュー情報
Nature Microbiologyは、Tom Hildebrandtとその他の匿名の査読者の方々の本作品の査読への貢献に感謝します。
追加情報
出版社からのコメント Springer Natureは、出版された地図や機関所属の管轄権の主張に関して中立を保っています。
拡張データ
Extended Data 図1 研究のワークフローと研究結果のグラフィカルな要約。
ワークフローはBioRender.comで作成した。
Extended Data 図2 健常女性と比較したAN症例における門、科、属レベルの分類学的差異と腸内型の違い。
a,b,e AN（金、n=77）とHC（青、n=70）の比較のボックスプロット（線は中央値、ボックスは四分位範囲（IQR）、ひげは1.5×IQR） 個体数の少なくとも10％で検出された12の細菌門の相対存在量（a）、最も多い細菌科20（b）および上位30属（e）。特徴は平均存在量の少ない順に並べた。ゼロ値は1e-10に設定されている。青で着色された特徴はHCグループで濃縮されており、金色はANグループで濃縮されている。有意性は、両側Wilcoxon順位和検定、薬物捨象、Benjamini-Hochberg法による多重検定補正により、すべての特徴について判定した（a、b、e、正確なp値はソースデータ参照）。 c、f、薬物捨象後にANとHCで対比した科（c）と属（f）のクリフΔ効果量の絶対値（調整p値下0.1）。d,gは、AN（金、n=77）とHC（青、n=70）の間で、腸内細菌群の属レベルのβ多様性（キャンベラ距離）（d）およびメタゲノム種パンゲノムの豊富さ（g）を示す箱ひげ図（線、中央値；箱、IQR；ひげ、1.5×IQR）。h,上段はAN（n=77）とHC（n=70）における腸型有病率を示し、下段はHCとAN患者をAN-RS（n=56）とAN-BP（n=21）グループに分けた場合の腸型有病率を示している。
出典データ
Extended Data 図3 AN症例（左）と健常対照（右）で濃縮された細菌種から、薬剤デコンファウンド後に演繹された共起ネットワーク（Co-occurrence network）。
ノードのサイズとノードの色はそれぞれ、与えられたMSPの平均存在量と属を表す。MSPが1つだけ表す属はグレーで色分けされている。赤線と青線はそれぞれ正の相関と負の相関を示す。線の太さは相関係数の絶対値を表す。0.4以上の相関を持つMSPのみを表示し、閾値以上の相関を持たないMSPは非表示とした。
Extended Data 図4 薬物デコンファウンド後のAN症例において、腸内細菌属が摂食障害スコアと関連していることを示すヒートマップ。
特定の摂食障害尺度の変数は青で、一般的な心理尺度の変数は赤で表示されている。+, 調整後p < 0.05（正確なp値については出典データを参照）。
出典データ
Extended Data 図5 コントロール被験者とANサブタイプにおけるカゼイン溶解性プロテアーゼB（ClpB）の空腹時血漿濃度。
a、対照群（n=70）とAN群（n=77）における腸内細菌科の相対的存在量 b、対照群（n=70）とAN群（n=77）の空腹時血漿ClpB濃度のログスケール変換 c、制限的AN（AN-RS n=56）と暴食AN（AN-BP n=21）の空腹時血漿ClpB濃度のログスケール変換．有意性は、2群間の両側Wilcoxon順位和検定により算出した（a-c）。箱ひげ図は中央値と四分位範囲（IQR）を示し、ひげは1.5×IQRを示す（a-c）。
出典データ
Extended Data 図6 AN群（n=77）とコントロール群（n=70）の間で変化した細菌種の動的増殖速度。
箱ひげ図は中央値と四分位範囲（IQR）、ひげは1.5×IQRを示す。有意性は、両側ウィルコクソン順位和検定により判定した。
出典データ
Extended Data 図7 AN症例の腸内細菌叢におけるSVと食欲不振関連形質との関連。
a-c, A. putredinisゲノムに1kbpの変異を持つ個体（n = 147）におけるHOMA-IR、空腹時血漿インスリンおよびグルコースを示す散布図である。有意性は、Benjamini and Hochberg法による偽発見率で補正した両側スピアマン相関検定によって決定した。エラーバンドは95%信頼帯を持つ線形回帰線である（a-c）。d, 上段は、A. putredinisのゲノム領域（x軸）に沿った標準化された変動（y軸）。下段、注目する遺伝子の位置（青棒）。
出典データ
Extended Data 図8 双方向性仲介推論を用いたインシリコ解析。
a, ANサブタイプ、AN-BP（binge/purge anorexia）、AN-RS（restrictive anorexia）の血清メタボロームの主成分分析（PCA）プロット。 b, 方向1（腸内細菌の特徴→血清代謝物が介する摂食障害スコア）、方向2（腸内細菌の特徴→摂食障害スコアが介する血清代謝物）に対する推測される仲介関係の要約番号。c, 全コホートについて、方向1（腸内微生物の特徴→血清代謝物が介在する表現型）、方向2（腸内微生物の特徴→表現型が介在する血清代謝物）の推論された媒介関係の概要数. d,菌種、腸脳・代謝モジュール、菌遺伝を含む腸内微生物の特徴を因果因子、血清代謝物を媒介因子、代謝形質を結果とした方向1の推定因果関係ネットワークを示すサンケイ図。 e,腸内微生物の特徴、代謝物、宿主代謝形質間の推定因果関係例。微生物の特徴→血清代謝産物を媒介とする代謝形質を意味する方向1は黒線、微生物の特徴→血清代謝産物を媒介とする代謝形質を意味する方向2は規定の赤線で示されている。リングチャートの中央には、媒介効果の割合が示されている。GDCA、グリコデオキシコール酸、GHCA、グリコヒオコール酸、GHDCA、グリコヒデオキシコール酸、GUDCA、グリコルソデオキシコール酸、HCA、ヒオコール酸、HOMA-IRインスリン抵抗性の恒常性モデル評価、P-、プラズマ、S-、血清．
出典データ
Extended Data 図9 ヒトドナーから無菌マウス同腹子への糞便微生物叢移植のワークフロー図。
a, 糞便微生物叢スラリーの調製に関するワークフロー。食欲不振（AN）とコントロール（HC）の両方の便（250 mg）をドライアイス上で切断し、嫌気槽に移し、20％グリセロールで希釈した5 mlのLYBHI培地で再懸濁した。再懸濁した糞便スラリーは、クライオチューブに分注し、さらに使用するまで-80℃で素早く再凍結させた。一致したANおよびHCドナーのすべての便サンプルを同日中に調製し、凍結アリコートをマウスへのガベージ用に凍結保存した。 b、GFマウス移植研究の実験スキームを示す。それぞれの独立した子実験において、6週齢のGF雌の子実体を飼育隔離器から取り出し、3匹のAN症例または3匹のHC対象者の糞便スラリー200μlを受けるようにランダムに割り当てた。両群のマウスをオートクレーブ処理した個別換気ケージに収容し、オートクレーブ処理したチョウ飼料と水を2日間自由に与えた。日後、マウスに、前回と同じマッチしたANおよびHCドナーからの糞便物質を2回目に投与した。その後、両群のマウスを単独飼育し、30％カロリー制限したチャウ食を3週間摂取させた。この間、水は自由摂取で与えた。食欲不振移植マウス（AN-T）および正常対照移植マウス（HC-T）は、エネルギー制限食開始後5日ごとに体重を測定した。Biorender.comで作成した。
Extended Data 図10 ANおよびコントロールから雌GFマウス同腹子へのFMTの効果。
a, 無菌（GF）マウス同腹子（n = 21）の体重変化および脂肪率（ad libitum chow dietを与え、食欲不振患者からの微生物叢を移植） b, エネルギー制限食後0日目の体重と比較した体重変化（独立したバッチについて、それぞれn = 8、6、6） 3つの独立した実験について. データは平均値±s.e.m.(a,b)で表される。有意性は、二元配置分散分析（ANOVA）、Benjamini-Hochbergポストホックテストにより算出した。 c, 30%エネルギー制限食を与えたヒトドナーおよびGFマウスレシピエントの血清メタボロームプロファイル。データは、AN群とコントロール群の間の対数変換された倍数変化（log2FC）として表された。log2FC値が正の場合はANが濃縮された代謝物、負の場合はHCが濃縮された代謝物であることを示しています。ヒトドナーおよびGFマウスレシピエントにおいて、AN群とHC群の間で持続的に変化した血清代謝物を青いバーで表示した。CA、コール酸；DCA、デオキシコール酸；FFA、遊離脂肪酸；w/a-MCA、ω/α-ムリコール酸；HDCA、ヒデオキシコール酸；TaMCA、タウリン-α-ムリコール酸；CDCA、チェルノデオキシコール酸；LCA、リトコール酸；UDCA、ウルソードキシコール酸；G、グリシン共役胆汁酸；T、タウリン共役胆汁酸．d, 視床下部または皮下白色脂肪組織におけるASVと定量化された遺伝子との相関を示す左パネルのヒートマップです。ASVの分類学的情報は右のパネルに記載されている。+, Benjamini-Hochberg法で補正したp < 0.05 (正確なp値はSource Dataを参照)。
出典データ
補足情報
補足情報
補足説明、図1～7、参考文献。
報告書の概要
補足表
補足表1-8.
補足データ
補足図1～6のソースデータです。
出典データ
ソースデータ 図1
統計的なソースデータ。
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出典データ 拡張データ Fig.4
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ソースデータ拡張データ Fig.8
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ソースデータ拡張データ Fig.
統計の元となるデータです。
権利と許諾
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Fan, Y., Støving, R.K., Berreira Ibraim, S. et al. 腸内細菌叢はヒトおよびマウスにおける神経性食欲不振症の病因に寄与する。Nat Microbiol (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5
引用元：ダウンロード
2022年6月23日受理
2023年3月3日受理
2023年4月17日発行
DOIhttps://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5
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ネイチャー・マイクロバイオロジー（Nat Microbiol）ISSN2058-5276（オンライン版）
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