オオクチバス（Micropterus salmoides）の腸内バリア改善に対する食餌性胆汁酸の直接的および腸内細菌叢を介した影響
動物栄養学
第14巻、2023年9月、32-42ページ
オリジナル研究論文
オオクチバス（Micropterus salmoides）の腸内バリア改善に対する食餌性胆汁酸の直接的および腸内細菌叢を介した影響
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405654523000410?via%3Dihub
著者リンク open overlay panelRui Xia a 1, Qingshuang Zhang a 1, Dongmei Xia a 1, Qiang Hao a b, Qianwen Ding a b, Chao Ran c, Yalin Yang c, Aizhi Cao d, Zhen Zhang c, Zhigang Zhou a e
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引用元
https://doi.org/10.1016/j.aninu.2023.03.008Get 権利と内容
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オープンアクセス
要旨
集約的な養殖モデルにおいて、魚類の腸管バリアーの損傷は養殖産業にとって重要な懸念事項である。本研究では、Micropterus salmoidesの腸管バリアに及ぼす胆汁酸（BA）の影響を調査することを目的とした。BAsの直接的な刺激と腸内細菌叢が介在する間接的な制御が腸管バリア機能に及ぼす影響を明らかにするために、無菌（GF）ゼブラフィッシュモデルを採用した。BAsを0、150、300、450 mg/kgで添加した4種類の飼料を調製し、これら4種類の飼料をそれぞれコントロール、BA150、BA300、BA450と定義した。給餌実験5週間後、BA300飼料を与えた魚の生存率が上昇した（P < 0.05）。組織学的分析により、BA150およびBA300群では、腸の構造的完全性が改善された。対照群と比較して、BA150およびBA300群では、化学的バリア（ムチン、リゾチーム、補体1）および物理的バリア（オクルディン、クラウディン-4）に関連する遺伝子の発現量が増加した（P＜0. 05）、免疫学的バリアに関する遺伝子（インターロイキン［IL］-6、腫瘍増殖因子β、IL-10、マクロファージガラクトース型レクチン、免疫グロブリンM［IgM］）の発現はBA300群で有意に上昇した（P＜0. 05）、化学的バリア（ヘプシジン）および免疫的バリア（IL-1β、腫瘍壊死因子-α、IL-6、アルギナーゼ）に関連する遺伝子の発現は、BA450群で有意に減少した（P＜0.05）。腸内細菌叢組成解析の結果、BA150群とBA300群では、ファーミキューテス属の存在量が顕著に増加し（P < 0.05）、アクチノバクテリウム属とプロテオバクテリア属は減少傾向を示した（P > 0.05）．腸内細菌叢移植実験の結果、BA300群から移植した腸内細菌叢によって、免疫グロブリンZ/T（IgZ/T）、IL-6、IL-1β、IL-10などの腸管バリア関連遺伝子がコントロールと比較して上昇することが示された（P＜0.05）。BA300飼料をGFゼブラフィッシュに直接与えたところ、IgM、IgZ/T、リゾチーム、オクルディン-2、IL-6、IL-10の発現が促進された（P < 0.05）。結論として、BA類は腸内細菌叢を介した直接的および間接的な効果により、魚類の腸内バリアーを改善することができると考えられる。
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キーワード
胆汁酸
腸管バリア
腸内細菌叢（ちょうないさいきんそう
ラージマウスバス
無菌ゼブラフィッシュ
はじめに
水産物には、人間にとって良質な食物タンパク質が大量に含まれており、フードサプライチェーンにおいて重要な役割を担っている。捕獲漁業資源の漸減に伴い，水産物の半分以上は養殖に由来する（Dauda et al., 2013; Hu et al., 2021）。養殖は、世界で増大する水産物へのニーズを満たす唯一の解決策です（Brugère et al., 2019; Food and Nations, 2020; Phillips et al., 2016）。スペースと水資源を節約できるという利点から、集約型養殖システムが急速に開発されています。集約型養殖は養殖密度が高いことが特徴で、魚の成長を満たすために高エネルギー飼料が必要となる（Ngoc et al.、2021）。しかし、集約型養殖システムでは、魚は高密度でエネルギーの過剰摂取によるストレスにさらされ続け、魚の健康、特に栄養の消化吸収の主要器官で体内最大の免疫器官である腸の健康に影響を及ぼす（Dawood et al., 2019; Rohani et al., 2021; Schumann and Brinker, 2020; Sundh et al., 2010; Wang et al., 2020）. したがって、現在の集約的な養殖システム下で魚の腸の健康を改善できる飼料添加物を見つけることが急務である。
腸は、食物の消化、栄養素の取り込み、免疫に重要な器官である一方、水生動物と外部環境との間のバリアとして機能する（Gao et al., 2016）。腸のバリア機能は、化学的、物理的、免疫的、微生物的バリアに依存している（Andersonら、2012；Clayburghら、2004；Cuiら、2019）。腸の化学的バリアは、リゾチーム、ムコ多糖類、胃酸、ムチン、消化酵素、糖タンパク質など、腸内に分泌されるさまざまな物質で構成されています（de Aguiar Vallim et al.、2013）。化学的バリアの主な機能は、消化酵素などの化学物質による侵食から腸粘膜を保護することです（Cui et al., 2019）。腸の物理的バリアは、主に腸粘膜層と上皮細胞からなる、完全かつ緊密に連結した腸上皮構造である。タイトジャンクション、デスモソーム、アドヘレンスジャンクション、ギャップジャンクションは、主に上皮細胞間に存在する細胞間接合複合体です（Ulluwishewa et al.、2011）。腸上皮タイトジャンクションの働きにより、病原体の侵入を防ぐことができる一方、多くの栄養素を体内に取り込むことができることから、腸上皮タイトジャンクションは腸上皮の選択的透過性とバリア機能を保持するための構造基盤であると考えられる（Mu et al., 2017; Suzuki, 2013; Ulluwishewa et al., 2011）. 腸の免疫バリアは、主に腸管関連リンパ組織（GALT）で構成されている（Martinez-Lopez et al.、2019）。魚類では、腸はサイトカイン、酸性フォスファターゼおよびその他の体液性免疫因子の産生を介して免疫学的バリア機能を担っている（Pan et al.、2017）。腸の免疫学的バリアは、病原性微生物の侵入に抵抗し、アレルギー反応に抵抗し、免疫反応を抑制することによって、免疫系が宿主を保護するためのバリアを構築することを可能にし得る（Corthésy、2010；Kamadaら、2013；Liuら、2019；Russellら、2015）。腸内細菌バリアは、腸内共生微生物で構成されています。共生微生物は、互いに依存し合うだけでなく制約し合い、微生物間の拮抗を通じて宿主の生体防御ラインを構築しています。その上、腸内細菌バリアは、腸上皮細胞の代謝や増殖に影響を与えることがあります（Soderholm and Pedicord, 2019）。腸のバリアは、感染や環境ストレスに対する宿主の最初の重要な防御線であり、腸の形態、構造、機能、微生物組成、粘液免疫化合物の完全性に関連しています（Huang et al., 2018; Jutfelt, 2011）。したがって、腸のバリアは、魚の全身免疫系のバランスを保つ上で極めて重要な役割を担っています。
胆汁酸（BA）は両親媒性分子であり、宿主において複数の生理的機能を有する（Kortner et al., 2013; Romański, 2007）。脂質を乳化し、胆汁酸塩のリパーゼの活性を向上させることにより、腸内での食事脂質の吸収と消化を促進することができる（Hofmann and Hagey, 2008; Li et al., 2013）。さらに、BAsは腸内細菌群集の形成に関与し、腸内の病原菌の増殖を抑制する（Hagey et al., 2010; Ridlon et al., 2014; Romano et al., 2020）。近年、多くの魚類でBAsの機能が研究されている。これまでの研究で、BAsは、ニジマス（Oncorhynchus mykiss）の幼魚（Adhami et al.、2017）、ナイルティラピア（Oreochromis niloticus）（Jiang et al、 2018）、グラスコイ（Ctenopharyngodon idella）（Zhouら、2018）、ブラックシーブリーム（Acanthopagrus schlegelii）幼魚（Jinら、2019）、スネークヘッド（Channa argus）（Houら、2019）、大イバラ（Larimichthys crocea）幼魚（Dingら、2020）およびオオクチバス（Micropterus salmoides）幼魚（Yinら、2021）。しかし、魚類の腸管バリアに対するBAsの機能や作用機序は未知のままである。
オオクチバス（M. salmoides）は、中国において経済的に重要な淡水魚種である。その特徴は、成長が早く、病気に強く、味が良いことである。その生産量は2020年に619,519トンに達した（Fisheries Administration Burrau, 2021）。オオクチバスの推奨される食事脂肪量は80～130g/kgであり、オオクチバスにおける高脂肪食の悪影響を調べるために、粗脂肪を15％含む飼料がよく用いられている（Brightら、2005；Huangら、2017a；Liuら、2022）。ここでは、粗脂肪を15％含む飼料を用い、実験環境下で腸管障害を誘発させた。オオクチバスの腸内における化学的、物理的、免疫学的、微生物学的障壁を含む腸内障壁損傷の防止に対する食餌性BAsの重要性について調査するために、5週間の培養試験を実施した。また、無菌ゼブラフィッシュモデルを用い、BAsの直接的な刺激と腸内細菌叢による間接的な制御が腸管バリアに及ぼす影響を明らかにした。材料と方法
2.1. 動物倫理に関する声明
全実験期間中、すべての実験および動物飼育手順は、中国農業科学院飼料研究所に準拠し、中国動物飼育委員会の承認（保証番号2020-AFFRI-CAAS-001）を受けて実施されました。
2.2. 実験用飼料
4種類の等窒素・等エネルギー飼料を、飼料用BA（山東龍昌動物衛生有限公司、中国・徳州市より提供、その組成は以下の通り）を用いて配合した： ヒオコール酸8.00%、ヒオデオキシコール酸70.67%、チェノデオキシコール酸19.61%）をそれぞれ0mg/kg（Control）、150mg/kg（BA150）、300mg/kg（BA300）、450mg/kg（BA450）配合しました。まず、各食品の全成分を正確に計算し、秤量した。第二に、すべての原料を段階的に混合し、混合した原料に適量の水を加えて飼料とした。第三に、すべての飼料を90℃のオーブンで60分間乾燥させた。すべての飼料は密封され、室温で保存された。ダイエットの処方と化学組成を表1に示す。
表1. オオクチバス用飼料の配合と化学組成（g/kg、空気乾燥基準）。
ItemGroupsControlBA150BA300BA450IngredientsCassava starch100.00100.00100.00100.00Soybean meal120.00120.00120.00120.00Groundnut meal100.00100.00100.00100.00Fish meal400.00400. 00400.00400.00Chicken meal150.00150.00150.00150.00Bile acid10.000.150.300.45Bentonite6.005.855.705.55Lys-HCl8.008.008.008.00Methionine2.002.002.002.00Choline chloride3.003. 003.003.00Ca(H2PO4)210.0010.0010.0010.00Soybean oil60.0060.0060.0060.00Phosphatide oil20.0020.0020.0020.00Vitamin C1.001.001.001.00Vitamin premix210.0010.0010.0010.00Mineral premix310. 0010.0010.0010.00Total1000100010001000Chemical compositionCrude protein516.80520.00515.10517.20Crude fat147.10142.10144.90145.80Gross energy, MJ/kg18.7218.7218.7218.72
1
Shandong Longchang Animal Health Care Co., Ltd., Dezhou, Chinaから提供され、その組成は以下の通りであった： ヒョウコール酸8.00%、ヒデオキシコール酸70.67%、チェノデオキシコール酸19.61%。
2
以下のものを含むビタミンプレミックス（g/kg ビタミンプレミックス）：チアミン、0.438、リボフラビン、0.632、ピリドキシン・HCl、0.908、D-パントテン酸、1.724、ニコチン酸、4.583、ビオチン、0。 211; 葉酸, 0.549; ビタミンB12, 0.001; イノシトール, 21.053; メナジオン重亜硫酸ナトリウム, 0.889; 酢酸レチニル, 0.677; コレカシフェロール, 0.116; DL-α-tocopherol-acetate, 12.632.
3
下記を含むミネラルプレミックス（g/kgミネラルプレミックス）： CoCl2・6H2O, 0.074; CuSO4・5H2O, 2.5; FeSO4・7H2O, 73.2; NaCl, 40.0; MgSO4・7H2O, 284.0; MnSO4・H2O, 6.50; KI, 0.68; Na2SeO3、 0.10; ZnSO4・7H2O、 131.93; Cellulose, 501.09.
2.3. 実験魚、給餌、実験条件
河北養魚場（中国）からラージマウスバスの群れを購入した。すべての魚は，実験給餌開始前に2週間，基本飼料で馴化させた。その後、サイズが近いラージマウスバス（5.05 ± 0.02 g、n = 360）をランダムに4群に割り付けた。各グループに6つの複製水槽を設定し、90L水槽あたり15匹の魚を入れた。魚は1日3回（07:00、12:00、18:00）、5週間にわたって給餌された。給餌実験は、屋内の循環水システムで行った。給餌期間中、水温は24.0〜26.0℃、水槽水の流量は60L/h、溶存酸素は6mg/L以上、亜硝酸濃度は0.01mg/L以下、アンモニア性窒素の含有量は0.02mg/L以下に維持された。水質パラメータは毎日モニタリングされた。
2.4. 成長性能
各群のオオクチバスの個体数と体重を数え、体重増加率（WG）、飼料摂取量（FI）、飼料転換率（FCR）および生存率（SR）を含む成長性能のパラメータを算出するために5週間飼育後、すべての魚は24時間絶食した。対応する計算式は以下の通りである： WG（％）＝100×［（最終体重、g）-（初期体重、g）］／（初期体重、g）］；FI＝（総飼料摂取量、g）／［（初期魚数＋最終魚数）／2］；FCR＝（飼料摂取量、g）／（魚の体重増加、g）；SR（％）＝（最終魚数／初期魚数）×100.
2.5. 肝臓および腸の組織学
実験期間終了後、サンプリング前に、3-アミノフェノイン酸エステルメタンスルホン酸塩を100 mg/Lの濃度で使用し、魚に麻酔をかけた。肝臓と後腸のサンプルはすべて採取し、組織学的分析のために4％パラホルムアルデヒドで固定化した。すべての肝臓と後腸のサンプルを脱水し、パラフィンに包埋した。スライドはヘマトキシリンとエオシン（H&E）で染色し、中性樹脂でマウントした。画像はLeica DMIL LED light microscope (Leica, Wetzlar, Germany)を用いて調べた。スライスの画像解析は、K-Viewerソフトウェア（バージョン1.5.3.1、KFBIO Co., Nigbo, China; http://www.kfbio.cn ）を用いて行った。
2.6. 透過型電子顕微鏡(TEM)による腸の観察
すべての後腸サンプルを採取し、2.5%グルタルアルデヒドで一晩固定した後、PBS（pH = 7）により3回洗浄した。サンプルを脱水し、アラルダイトで後埋め込み、ウルトラミクロトーム（Leica EMUC7, Hernalser Hauptstrasse, Germany）で切片化（50-70 nm）した。切片は3％酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色した。画像は透過型電子顕微鏡（JEM-1230、日本、JEOL 1010、日本電子株式会社、東京、日本）を用いて調べた。微絨毛の高さは、ImageJソフトウェア（National Institutes of Health, Bethesda, MD）を用いて測定した。
2.7. 定量的リアルタイムPCR解析
すべての後腸サンプルを採取し、遠心分離管に入れ、直ちに液体窒素に入れ、遺伝子発現作業のために-80℃で保存した。Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) を用いて全RNAを抽出した。抽出したRNAを50μLのRNaseフリー水に再懸濁し、分光光度計Nano Drop 2000を用いて定量し、アガロースゲル電気泳動で評価した。市販のキット（TianGen、北京、中国）の指示に従い、2μgのRNAをcDNAに逆転写し、SYBR Green Supermix（TianGen、北京、中国）を用いてLightCycler 480（F. Hoffmann-La Roche AG、バーゼル、スイス）上でRT-qPCR反応を実行した。プライマー配列は、表S1に記載した。
2.8. 腸内細菌叢の解析
5週間給餌した後、最後の給餌から4〜6時間後にオオクチバスの腸内内容物を採取した。各水槽からランダムに3尾の腸内容物を抽出し、液体窒素で急速凍結し、-80℃に置いてから細菌DNA抽出に使用した。製造元の指示に従い、Fast DNA SPIN Kit for Soil（MP Biomedicals, Solon, OH, USA）を用いて、プールした各サンプルのDNAを抽出した。微生物相分析は、ハイスループットシーケンスを用いてV3-V4領域の16S rRNAを同定することにより行った。プライマー338F_806R-F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）および338F_806R-R（5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′）はこの領域を増幅するために使用されました。16s rRNA遺伝子のシーケンスは、Shanghai Majorbio Bio-pharm Technology Co., Ltd（中国、上海）のIlluminaプラットフォームで行った。USEARCH (version 7.0.1090, http://www.drive5.com/uparse/)を用いて、適格リードをクラスタリングし、類似度97%の運用分類単位（OTU）を生成した。各OTUの代表配列は、RDP classifier (version 2.11, http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/) を用いて、Ribosomal Database Project (RDP) データベースの分類レベルに割り当てた。主成分分析は、Rソフトウェア（バージョン3.3.1）を用いて実施した。
2.9. GFゼブラフィッシュの調製と腸内細菌叢の移植
GFゼブラフィッシュは、以前の研究（Guo et al., 2017）に従って準備した。GFゼブラフィッシュに対するBAsの直接的な影響を検出するために、ゼブラフィッシュ幼虫の飼料を照射（20 kGyガンマ線、Beijing Hongyi Sifang Radiation Technology Co., Ltd, Beijing）により滅菌した。飼料配合および化学パラメータは、表S2に示す。
ゼブラフィッシュ幼生は、受精後3日目（dpf）に不妊を確認した。Gnotobioticゼブラフィッシュ培地（GZM）は4dpfで更新された。5dpfでGFゼブラフィッシュにコントロールまたはBA300飼料を与えた。5日間の給餌後、GFゼブラフィッシュを24時間絶食させてからRNAを抽出し、腸のバリア機能に関連する遺伝子の発現を解析するために回収した。遺伝子の発現に使用したプライマーを表S3に示す。
オオクチバスの腸内細菌叢は、先に記載したようにGFゼブラフィッシュに移植した（Guo et al.、2017）。4dpfで、腸内細菌叢を106CFU/mL懸濁液の濃度でGZMに添加した。GFゼブラフィッシュの1つのグループは何も処理を受けず（ネガティブコントロール）、GFゼブラフィッシュの他の2つのグループは、コントロールまたはBA300飼料を与えた魚の腸内細菌叢を移植した（n = 6）。コロニー形成3日後にゼブラフィッシュ幼生を採取し、腸内バリア解析用のRNAを抽出し、プライマーを表S3に示す。
2.10. 統計解析
すべてのデータは、SPSS 24.0 (SPSS Inc., United States)を用いて分析した。すべての結果は、平均値±SEMで示した。複数のグループ間の比較は、一元配置分散分析に続いてダンカン検定を用い、2グループ間の比較はスチューデントのt検定を用いて分析した。P < 0.05は統計的に有意であるとみなした。グラフィックスは、Graph Prism 8ソフトウェア(GraphPad Software Inc. San Diego, USA)を用いて描画した。結果
3.1. オオクチバスの成長成績および肝組織観察結果
成長性能の結果を表2に示す。FIおよびFCRは、各処理群間で有意な差は認められなかった（P＞0.05）。対照飼料と比較して、BA150およびBA300飼料を与えた魚の生存率は向上した（P＜0.05）。BA150およびBA300飼料と比較して、BA450飼料を与えた魚のWGは増加した（P < 0.05）。図1に示すように、肝細胞のびまん性脂質空胞化は、BA補充により減少した。
表2. コントロール、BA150、BA300およびBA450飼料を5週間摂取させたオオクチバスの成長性能
成長パラメータコントロールBA150BA300BA450IBW, g/fish5.06 ± 0.015.06 ± 0.015.06 ± 0.015.04 ± 0.02WG, %108.77 ± 5.84ab103.99 ± 5.79a103.42 ± 2.96a115.57 ± 5. 84bFI, g/fish6.37 ± 0.026.37 ± 0.016.37 ± 0.016.35 ± 0.02FCR1.28 ± 0.061.25 ± 0.041.21 ± 0.051.21 ± 0.03SR, %80.00 ± 11.55a96.67 ± 3.33b98.33 ± 2.89b85.00±7.26ab
IBW＝初期体重、WG＝体重増加、FI＝飼料摂取量、FCR＝飼料換算率、SR＝生存率。
a, b 同じ行の異なる上付き文字は有意差を示す（ダンカン検定；P < 0.05）.
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図1. いずれかの実験飼料を5週間摂取したオオクチバスの肝臓の組織像（スケールバー＝50μm）。黒矢印は、肝細胞の膨潤と空胞変性の存在を示す。
3.2. オオクチバスの腸内ケミカルバリア
5週間の給餌実験後、コントロール飼料と比較して、BA150およびBA300飼料を与えた魚では、ムチン、リゾチームおよび補体1の発現レベルが明らかに増加した（P < 0.05, Fig.2）。対照食と比較して、BA450食を与えた魚のヘプシジンの発現レベルは低下した（P < 0.05, Fig. 2）。
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Fig. 2. いずれかの実験飼料を5週間摂取したオオクチバスの腸内における腸管分泌物関連遺伝子の発現量。結果は、平均値（±SEM）で示した（n = 6）。文字が異なるバーは有意に異なる（Duncanの検定；P < 0.05）。
3.3. オオクチバスの腸管物理バリア
オオクチバスの腸の組織形態に対するBAsの効果をH&E染色で評価した（図3A）。対照飼料を与えた魚の腸では、基底膜の緩みと炎症性細胞の浸潤が観察された。BA150およびBA300飼料を摂取したオオクチバスでは、対照群に比べ、腸の構造が整然となり、腸絨毛構造の障害が改善され、炎症細胞の浸潤が減少した（図3A）。TEM解析の結果、コントロール群と比較して、BA150およびBA300群では、腸の微絨毛の構造が改善された（図3B）。微絨毛はBA300群でコントロール群より高かった（P < 0.05, Fig. 3C）。
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図3. 実験用飼料の一つを5週間与えたオオクチバスの腸に及ぼす胆汁酸の影響。(A）組織検査のためのヘマトキシリン・エオシン（H&E）染色（スケールバー＝100μm）。(B）透過型電子顕微鏡（TEM）顕微鏡写真（黒矢印：不完全な微絨毛の質感または腸の微絨毛が剥がれた状態）（スケールバー＝1μm）。(C) オオクチバスの微絨毛の高さ。結果は、平均値（±SEM）で示した（n = 6）。異なる文字を持つバーは、有意に異なる（Duncanの検定；P < 0.05）。
オオクチバスの腸管タイトジャンクション関連遺伝子の発現に及ぼす食事性BAsの影響を図4に示す。その結果、BA150群は、zona occludens-1（ZO-1）およびclaudin-1の発現に顕著な影響を与えなかったが（P＞0.05、図4）、対照食と比較して、occludinおよびclaudin-4のレベルが増加した（P＜0.05、図4）。さらに、BA300飼料を摂取したオオクチバスでは、ZO-1、オクルディン、クローディン-1、クローディン-4の相対mRNAレベルが、コントロール飼料と比較して明らかに増加した（P < 0.05, Fig. 4）。BA450グループのものは、コントロール飼料と比較して変化がなかった。
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図4. いずれかの実験飼料を5週間摂取したオオクチバスの腸内におけるタイトジャンクション遺伝子の遺伝子レベルの影響。結果は、平均値（±SEM）で示した（n = 6）。文字が異なるバーは有意に異なる（Duncanの検定；P < 0.05）。
3.4. オオクチバスの腸管免疫バリアー
実験飼料を摂取したオオクチバスの炎症関連遺伝子の発現を図5に示す。BA150およびBA300群では炎症性遺伝子であるインターロイキン-6（IL-6）の相対発現量が有意に増加し、BA450飼料を与えたオオクチバスでは、コントロール飼料を与えたものに比べて炎症性遺伝子（インターロイキン-1β［IL-1β］、腫瘍壊死因子-α［TNF-α］、IL-6）の相対mRNA量が減少した（P < 0.05, Fig.5 A）。
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図5. いずれかの実験飼料を5週間摂取したオオクチバスにおける炎症関連遺伝子の腸内発現レベル。結果は、平均値（±SEM）で示した（n = 6）。文字が異なるバーは、有意に異なる（Duncanの検定；P < 0.05）。
さらに、対照食と比較して、BA150食を与えた魚では、腸の抗炎症遺伝子（アルギナーゼ、マクロファージガラクトース型レクチン［MGL］）の相対mRNA量が増加し（P < 0.05, Fig. 5B）、腸の抗炎症遺伝子（インターロイキン10［IL-10］、腫瘍増殖因子β2［TGF-β2］、TGF-β3、MGL）の相対mRNAレベルは、BA300飼料を与えた魚で増加した（P < 0.05, Fig.5B）。しかし、BAsの用量レベルを450 mg/kgまで増加させると、抗炎症遺伝子（アルギナーゼ）の相対mRNAレベルは、コントロール飼料と比較して減少した（P < 0.05, Fig. 5B）。また、コントロール飼料と比較して、BA300飼料を与えた魚では、免疫グロブリンM（IgM）の相対mRNAレベルが有意に増加した（P＜0.05、図5C）。
3.5. オオクチバスの腸内細菌叢（微生物的バリア）について
ラージマウスバスの腸内細菌叢を検出するためにハイスループットシーケンスを使用し、約2,172,859の配列を取得し、平均配列長は418bpであった。BAsの補充により、処理群間でShannon indexとSimpson indexに明らかな差は見られなかった。対照食と比較して、BA添加群ではAce指数とChao指数が有意に低下し（P < 0.05, 表3）、BAsの添加により腸内細菌叢の豊かさが低下することが示された。
表3. コントロール、BA150、BA300、BA450飼料を5週間与えたオオクチバスの腸内細菌叢のα多様性に及ぼす影響
推定値ControlBA150BA300BA450Shannon3.54 ± 0.633.05 ± 1.892.96 ± 1.103.17 ± 1.15Simpson0.12 ± 0.080.29 ± 0.410.24 ± 0.240.18 ± 0. 14Ace788.28 ± 54.14c463.85 ± 206.75b436.05 ± 98.39a485.36 ± 81.75aChao789.12 ± 53.04c452.79 ± 244.71b443.19 ± 97.71a480.32 ± 92.64a
a, b, c 同じ行の異なる上付き文字は有意差を示す（Duncanの検定；P < 0.05）.
門レベルでは（図6A；表4）、オオクチバスの腸内では、ファーミキューテス、プロテオバクテリア、アクチノバクテリオタが支配的な門であった。対照飼料と比較して、BA150およびBA300飼料を与えた魚の腸内では、明らかにFirmicutesの存在量が増加し（P < 0.05）、ProteobacteriaとActinobacteriotaの存在量は減少傾向にあった（P > 0.05）。また、BA450群では、対照群と比較して、ファーミキューテス属の存在量は増加傾向を示し、アクチノバクテリオタ属の存在量は減少傾向を示した（P > 0.05）。さらに、プロテオバクテリアに対する（ファーミキューテス＋フソバクテリア＋バクテロイデーテス）の比率は、BA150群およびBA300群でコントロール群と比較して有意に高かった（P＜0.001、図6C）。属レベルでは（図6B；表5）、分類不能_f__Peptostreptococcaceae、StaphylococcusおよびAcinetobacterが優勢であった。BA150およびBA300飼料を与えた魚では、コントロール飼料と比較して、unclassified_f__Peptostreptococcaceaeの存在量が有意に増加し（P < 0.05）、Acinetobacterの存在量はかなり減少した（P > 0.05）。主座標分析（PCoA）により、BA添加飼料を与えたオオクチバスの腸内細菌叢は、属レベルで有意に変化していることが示された（図6D）。
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図6. オオクチバスの腸内細菌叢に対するBAsの補給の効果（（A）門レベル、（B）属レベル、（C）（Firmicutes + Fusobacteria + Bacteroidetes）とProteobacteriaの相対比、（D）主座標分析（PCoA）分析、4種類の飼料で5週間飼育（BA150およびBA300群n = 4、コントロールおよびBA450グループn = 5）。文字が異なる棒グラフは有意に異なる（ダンカン検定；P < 0.05）。
表4. コントロール、BA150、BA300およびBA450飼料を5週間与えたオオクチバスにおける優勢な腸内細菌門（％）。
細菌門ControlBA150BA300BA450Firmicutes41.95 ± 9.36a73.13 ± 18.55b77.91 ± 15.80b54.03 ± 20.66aProteobacteria32.61 ± 14.8012.68 ± 10.5210.62 ± 9.6630.37 ± 23. 06アクチノバクテリオタ22.71 ± 8.619.46 ± 7.158.87 ± 7.559.57 ± 6.37Verrucomicrobiota0.56 ± 0.310.78 ± 1.200.58 ± 0.782.17 ± 4.72Chloroflexi0.58 ± 0.310.64 ± 0. 830.33±0.371.17±2.35Fusobacteriota0.06±0.061.31±1.480.66±0.820.51±1.05Patescibacteria0.17±0.070.79±0.920.51±0.520.49±0.50Cyanobacteria0. 42 ± 0.440.28 ± 0.180.20 ± 0.130.59 ± 1.00Bacteroidota0.14 ± 0.110.42 ± 0.640.08 ± 0.050.22 ± 0.17Bdellovibrionota0.14 ± 0.070.21 ± 0.210.10 ± 0.160.35± 0.60
a, b 同じ行の異なる上付き文字は有意差を示す（ダンカン検定；P < 0.05）.
表5. コントロール、BA150、BA300およびBA450飼料を5週間与えたオオクチバスの優勢な腸内細菌属（％）。
細菌属ControlBA150BA300BA450Peptostreptococcaceae1.05 ± 0.93a32.71 ± 43.22b38.96 ± 29.11b12.28 ± 20.53aStaphylococcus18.19 ± 10.0715.16 ± 11.9313.00 ± 7.2015. 10 ± 15.25Acinetobacter16.54 ± 18.571.65 ± 2.190.98 ± 0.7617.29 ± 25.71Weissella4.23 ± 2.655.73 ± 4.215.14 ± 2.373.81 ± 2.23Bacillus6.57 ± 10.301.28 ± 0.881.19 ± 0. 153.90 ± 5.19Corynebacterium2.69 ± 1.523.10 ± 2.052.49 ± 1.422.45 ± 2.81Rhizobiales_Incertae_Sedis2.72 ± 2.131.82 ± 2.692.03 ± 1.872.23 ± 2.02Rhodococcus7.84 ± 6. 07a0.06 ± 0.04b0.05 ± 0.04b0.05 ± 0.05bClostridium_sensu_stricto_71.08 ± 0.601.96 ± 1.332.42 ± 1.122.25 ± 1.20Planococcus0.02 ± 0.030.04 ± 0.072.03± 3.754.19± 8.34
a, b 同じ行の異なる上付き文字は有意差を示す（ダンカン検定；P < 0.05）.
3.6. GFゼブラフィッシュモデルにおけるBAsの直接摂取が腸の化学的、物理的、免疫学的バリアに与える影響
BAsがオオクチバスの腸内バリアをどのように改善するかを調べるために、GFゼブラフィッシュモデルを使用した。実験では、オオクチバスの正常な成長には、300mg/kgのBAsが最適な投与量であることが確認された。そこで、BAsが腸管バリアに与える影響とその潜在的な調節作用機構を調べるために、コントロールとBA300のグループを比較した。
これに基づき、BAsを300mg含む飼料を無菌ゼブラフィッシュに5日間与え、腸内バリアの転写レベルを解析した。その結果、ゼブラフィッシュ幼生における腸管分泌遺伝子（リゾチーム）（P < 0.01, 図7A）およびタイトジャンクション遺伝子（オクルディン-2）（P < 0.01, 図7B）のレベルが上昇していることが判明した。さらに、炎症促進遺伝子（IL-6）、抗炎症遺伝子（IL-10）、IgMおよび免疫グロブリンZ/T（IgZ/T）のレベルが上昇した（P < 0.05, Fig. 7C）。この結果から、BAsの直接摂取は、GFゼブラフィッシュの腸管バリア機能を明らかに改善することが示された。
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図7. GFゼブラフィッシュにおける胆汁酸の直接摂取が腸内バリアに及ぼす影響：（A）化学的バリア、（B）物理的バリア、（C）免疫学的バリア、。結果は、平均値（±SEM）で示した（n = 6）。アスタリスクで示した値は、有意に異なる（＊P＜0.05、＊＊P＜0.01、＊＊＊P＜0.001）。
3.7. オオクチバス由来腸内細菌がGFゼブラフィッシュの腸内化学的、物理的、免疫学的バリアに与える影響
移植した腸内細菌叢がGFゼブラフィッシュの腸内バリアに与える影響を評価するため、オオクチバスの腸内細菌叢をGFゼブラフィッシュに移植し、その影響を比較しました。その結果を図8A-Cに示す。BA300飼料を与えたオオクチバスの腸内細菌叢をコロニー形成した処理群では、炎症促進遺伝子（IL-6、IL-1β）、抗炎症遺伝子（IL-10）、IgZ/Tのレベルが上昇した（P < 0.05, Fig. 8C）。しかし、化学的・物理的バリアに関連する遺伝子の発現には有意な差は見られなかった（P > 0.05; 図8AおよびB）。
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図8. コントロールまたはBA300グループの腸内細菌叢をコロニー形成したGFゼブラフィッシュにおける腸内バリア関連遺伝子：（A）化学的バリア、（B）物理的バリア、（C）免疫的バリアの発現。結果は、平均値（±SEM）で示した（n = 6）。アスタリスクで示された値は、有意に異なる（＊P＜0.05、＊＊＊＊P＜0.001）。考察
BAsは安全で効率的な飼料添加物として評価されている。実際、数多くの研究が、BAsが魚の成長を促進する上で重要な役割を果たすことを示している（Yu et al., 2019b; Zhai et al., 2020）。しかし、異なる魚種における食事性BA補充は、全く異なる効果をもたらす可能性がある。我々の研究は、BAを補充した飼料を与えたオオクチバスの成長特性に有意な差がないことを示した。また、300mg/kgのBAを添加した高脂肪食を与えた同じ魚種でも同様の結果が得られた（Yin et al.、2021）。しかし、300 mg/kgのBAsを添加した飼料がオオクチバスのWGRとSGRを有意に改善できるという逆の結果も報告されている（Yu et al.、2019b）。このように成長成績が異なる結果になった原因は、主にBAsのレベルや種類、飼料組成に関係しているのではないかと推測している。
BAsは、肝トリグリセリド沈着を減少させ、肝臓の健康を守る重要な効果があります（Cipriani et al., 2010; Jain et al., 2012; Watanabe and Fujita, 2014）。したがって、BAを強化した飼料は、魚の肝細胞の空胞化を減少させた。同様の知見は、C. idella (Zeng et al., 2017), A. schlegelii (Jin et al., 2019), Scophthalmus maximus (Sun et al., 2014) and Schizothorax prenanti (Zheng et al., 2016) でも観察されており、BAsを添加した飼料が魚体内の脂質蓄積を減少（Sun et al, 2014）または魚体内の脂質異化を増加（Hu et al., 2015）することが立証されている。
魚類の腸粘膜および粘液層は、身近な環境に存在する脅威に対する宿主防御において重要な役割を果たす（Jin et al., 2018; Wei et al., 2019; Yang et al., 2017）。さらに、このバリア機能は、ムチン、補体タンパク質、リゾチーム、抗菌ペプチドに密接に依存しています（Rauta et al., 2012; Salinas, 2015）。本研究では、BAsを添加した飼料がムチン、リゾチーム、補体1という遺伝子の発現を増加させたことから、BAsを添加した飼料が魚類の腸管化学バリア機能を損ねる可能性があることが示された。また、BAsがニジマスのリゾチーム活性と代替補体活性を高めること（Deng et al., 2013）、オオクチバスのリゾチーム活性を高めること（Guo et al., 2020）についても、他の実験で同様の結果が検出されました。
腸は、魚類の栄養素の吸収と消化の主な場所である。腸の構造的完全性は、動物の消化能力に重要な影響を与える。研究では、魚に高脂肪食を長期間与えると、腸の構造の完全性が損なわれる可能性があると報告されているが、BAsの添加はその悪影響を減衰させる可能性がある（Maら、2018；Pengら、2019）。本研究では、食事性BAsは対照食と比較して腸の完全性を有意に改善することが示され、これは以前の知見と一致しました（Jiang et al.、2018）。細胞質タンパク質であるZO-1や、クローディンやオクルディンを含む膜貫通タンパク質などのタイトジャンクションタンパク質も、腸の物理的障壁の機能に関連しています（Chen et al., 2018; Yu et al., 2019a）。さらに、魚類における腸管透過性の変化を制御するために、タイトジャンクションタンパク質も重要であることを示す研究が数多くある（Ding et al., 2019; Oshima et al., 2008; Suzuki, 2013）。しかし、オオクチバスの腸のタイトジャンクションタンパク質の機能に対するBAsの重要性を検討した研究はほとんどない。本研究では、300 mg/kgのBAsを含む飼料を与えたオオクチバスにおいて、ZO-1、オクルディン、クローディン-1、クローディン-4を含む遺伝子の発現が増加することを明らかにした。これらの結果から、オオクチバスの飼料にBAsを補充することで、腸の物理的バリアが改善され、腸の透過性が低下し、魚の腸内環境が改善されることが示唆されました。本研究は、魚類における腸の物理的バリアの完全性の調節にBAsが関与していることを示す参考資料となった。
腸管免疫バリアは、腸から魚の体内への病原体の侵入を防ぐために重要な役割を担っています。炎症は、細胞損傷の最初の原因を除去し、組織の修復を開始する保護反応である。炎症性サイトカインは、このプロセスにおいて顕著な効果を発揮する（Karin and Clevers, 2016）。ある程度、サイトカインは水生動物における宿主の免疫状態の良い指標となる。サイトカインは、腸粘膜の上皮層と薄層前膜に存在するリンパ組織から分泌される重要な低分子タンパク質の一種で、魚類の保護に関与している（Dalmo et al., 1997; McMillan and Secombes, 1997）. サイトカインは、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-βなど、水生動物の炎症反応や免疫機能の調節に重要な影響を及ぼす（Standen et al.、2016）。その結果、BA300群では炎症促進遺伝子（IL-6）と抗炎症遺伝子（IL-10、TGF-β、MGL）の両方のレベルが上昇し、BA450群では炎症促進遺伝子（IL-6）と抗炎症遺伝子（アルギナーゼ）の両方のレベルが低下しており、一定量のBAs添加により腸の炎症反応を低下できることが示されました。先行研究でも同様に、300mg/kgのBAsを含む飼料を与えた魚では、炎症促進遺伝子（TNF-α、IL-8）と抗炎症遺伝子（IL-10、IL-1β、TGF-β1）の両方のレベルが上昇した（Yu et al.、2019b）。しかし、Jiangら（2018）は、高濃度のBAsを摂取したfishが慢性的な炎症に寄与する可能性があると報告しています。我々の調査結果でも、高レベルのBAsの添加は、腸の炎症反応を抑制しないことがわかりました。この違いの理由として考えられるのは、魚体へのコレステロールの蓄積に関係している可能性があります。BAsの高濃度添加は血清コレステロールの蓄積につながることが研究で示唆されています。高濃度のコレステロールは、魚の免疫力を低下させ、魚の炎症反応を乱す可能性があります（Jiang et al., 2018; Wang et al., 2018）。同様の結果がグラスコイで観察され、高レベルのBAsを補充すると、低レベルのBAsと比較して腸管免疫が損なわれ、血清コレステロール値が上昇した（Peng et al.、2019年）。
BAsは、様々な方法で腸内細菌叢の組成に影響を与えることができます。腸内細菌叢は、魚類において不可欠な代謝「器官」と考えられており、BAsの生体内変換に関与している可能性があります（Molinero et al.、2019）。我々の結果は、対照食を与えたオオクチバスの腸内細菌叢が、門レベルで主にFirmicutes、Proteobacteria、Actinobacteriaで構成されていることを示し、これは他の淡水魚種で報告された結果と一致する（Merrifieldら、2009； Navarreteら、2008；Roeselersら、2011）。門レベルでは、本結果は、BA補給が腸内細菌叢の構造を有意に変化させることを示した。BA150およびBA300群では、ファーミキューテス属の存在量が有意に増加し、プロテオバクテリアおよびアクチノバクテリアの存在量は減少した。これは、Islam et al. (2011)が発表した、ラットにおけるBA濃度の上昇により、ファーミキューテス属の存在量が増加し、アクチノバクテリア属の存在量が減少するという結果と一致する。さらに、グラスコイを用いた研究でも、BAの添加によりProteobacteriaの存在量が抑制されることが示されました（Zhou et al.、2018）。酪酸は腸内細菌叢と免疫系産生との間の重要なシグナル分子であり、その産生はFirmicutesと関連している（Huang et al.、2017b）。したがって、Firmicutesの存在量が増加し、したがって腸内の酪酸レベルが高くなると、高脂肪食によって誘発される腸の炎症を減衰させることができる可能性があります。属レベルでは、BAsを添加した飼料は、未分類の_f__Peptostreptococcaceaeの存在比を有意に増加させた。先に述べたように、ペプトストレプトコッカスの一部のメンバーは、タンパク質の消化吸収とアンモニアやその他の化合物の生成に重要であると考えられる（Attwood et al., 1998; Whitehead and Cotta, 2004）。
これらの結果は、BAsが腸内細菌叢の構造に影響を与えることを明確に示しています。BAsの腸管バリアへの影響、特に腸内細菌叢がBAsの制御を媒介するかという疑問についてさらに検討するため、GFゼブラフィッシュモデルを用いて腸管バリア関連遺伝子の発現を解析しました。BAsの直接的な作用と腸内細菌叢が媒介する変化の両方について検討した。したがって、本研究では、BA300飼料を与えたオオクチバスの腸内細菌叢をBA300飼料を与えたGFゼブラフィッシュに移植すると、BA300細菌叢によって、IL-6、IL-1β、IL-10、IgZ/Tなどの腸管バリア関連遺伝子が有意に増加し、主に免疫バリアを介して腸内細菌叢が働くことが示されました。また、BAsをGFゼブラフィッシュに直接投与すると、リゾチーム、オクルディン-2、IL-6、IL-10、IgM、IgZ/Tなどの遺伝子の発現が増加し、BAsが直接腸のバリアを刺激することが示された。したがって、BAsは、直接的な作用だけでなく、腸内細菌の組成を変化させることによって、腸のバリア機能に大きな影響を及ぼすと考えられる。なお、BAを介した腸内細菌叢がオオクチバスの腸管バリアに及ぼす影響を検証した研究は、我々の知る限り、本研究が初めてである。結論
オオクチバスの飼料に150～300 mg/kgのレベルでBAを補充すると、腸の非特異的免疫を改善し、腸のタイトジャンクション機能を高め、腸内細菌叢の組成を改善し、それによって魚の腸の健康を著しく改善できる。しかし、BAを450 mg/kgと、おそらく最適な補給範囲外のレベルで補給すると、腸の化学的、物理的、免疫的バリアの機能が著しく破壊された。300mg/kgのBAを飼料に添加することで、腸内細菌叢を介した直接的・間接的な腸内化学的・物理的・免疫的バリアに影響を与えることがわかった。
著者による貢献
Zhigang ZhouとZhen Zhang：研究の設計と実験資源の提供を行った。Rui XiaとQingshuang Zhang：実験と生化学的分析を実施した。Dongmei Xia：改訂に参加した。Qiang Hao、Qianwen Ding、Chao Ran、Yalin Yang、Aizhi Cao：方法論を開発した。Rui Xia、Qingshuang Zhang、Zhen Zhang：データを分析した。すべての著者が原稿の執筆、レビュー、編集に参加した。最終原稿は全著者が読み、承認した。
競合する利益の宣言
私たちは、私たちの仕事に不適切な影響を与える可能性のある他の人々や組織との金銭的および個人的な関係はなく、本論文の内容に影響を与えると解釈され得るいかなる製品、サービスおよび/または企業に対しても、いかなる性質または種類の専門的またはその他の個人的な関心も存在しないことを宣言します。
謝辞
本研究は、中国国家自然科学基金（NSFC 32061133004および31925038）の資金援助を受けた。
付録 補足データ
以下は、本論文の補足データである。
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マルチメディアコンポーネント1.
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中国畜産獣医学会の責任において査読を行った。
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